CN105316306A - 一种利用重组大肠杆菌高效生产角蛋白酶的发酵方法 - Google Patents

一种利用重组大肠杆菌高效生产角蛋白酶的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌高效生产角蛋白酶的发酵方法，属于发酵工程领域。本发明构建了一株可以高效分泌高活性角蛋白酶的重组大肠杆菌，并实现其在摇瓶或者发酵罐中生产制备角蛋白酶。最后通过培养基优化和发酵策略改进，实现高效制备角蛋白酶制剂，发酵酶活从原来的412U/mL提升到4500U/mL(发酵时间48h)。本发明的角蛋白酶制剂，在洗涤、纺织、饲料消化、医药等领域具有很好的应用前景。

Description

一种利用重组大肠杆菌高效生产角蛋白酶的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种利用重组大肠杆菌高效生产角蛋白酶的发酵方法，属于发酵工程领域。
背景技术
角蛋白酶(Keratinase)为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅氏症的阮蛋白(Prion)的降解。
目前已经报道的角蛋白酶基因主要来自国外的一株地衣芽胞杆菌的kerA基因。虽然角蛋白酶有着巨大的应用和研究价值，但是从野生菌发酵制备角蛋白酶产量低，活性不稳定，大大降低了角蛋白酶的开发和运用。
发明内容
本发明将来自嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)BBE11-1的角蛋白酶进行分子改造，获得一种新的高活性的角蛋白酶并对其基因序列在大肠杆菌中高效分泌表达，然后通过一系列的培养优化，确定其在3L发酵罐中的最佳发酵培养基和发酵培养策略，获得角蛋白酶高产。这对角蛋白酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。
本发明的第一个目的是提供一种高活性角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
本发明的第二个目的是提供表达权利要求1所述角蛋白酶的基因工程菌或细胞系。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coliBL21(DE3)为宿主、pET22b(+)为表达载体，表达SEQIDNO.4所示的角蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶基因连接在pET22b(+)的NcoI和XhoI位点之间。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程大肠杆菌的构建方法，具体方案如下：
(1)根据来自嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)BBE11-1的一种角蛋白酶的多次分子改造获得的一种活性较高突变体的基因，设计引物克隆获得，或者通过化学合成获得基因；氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；
(2)将该基因连入pET22b(+)质粒，双酶切位点为NcoI和XhoI，得到重组表达载体；
(3)将该重组表达载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)，获得具有高效分泌角蛋白酶的重组大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供一种高效生产角蛋白酶的方法。
所述方法是以表达SEQIDNO.4所示的角蛋白酶的基因工程菌为生产菌株，在发酵罐上采用溶氧偶联的补料方式获得高密度菌体并高效诱导产角蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coliBL21(DE3)为宿主、pET22b(+)为表达载体，表达氨基酸序列为SEQIDNO.4所示的角蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将基因工程菌活化后接种至含有氨苄青霉素的发酵罐基础培养基中，通过溶氧值与补料偶联的流加策略，于37℃培养至OD600＝30，然后降温至20℃培养并加入最终浓度0.2mM的诱导剂IPTG诱导，发酵48h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵罐基础培养基含有glycerol8g/L、(NH4)2HPO45g/L、K2HPO43g/L、NaH2PO4·12H2O7g/L、sodiumcitrate3g/L、MgSO41.5g/L、2mL微量元素，pH7.2；微量元素，按g/L计，含有：FeSO4·7H2O10；ZnSO4·7H2O5.25；CuSO4·5H2O3；MnSO4·4H2O0.5；Na2B4O7·10H2O0.23；CaCl22；(NH4)6Mo7O240.1；
在本发明的一种实施方式中，所述溶氧值与补料偶联是指补加流加培养基并控制溶氧值不大于30且不小于10。
在本发明的一种实施方式中，所述补料是流加培养基中含有甘油200g/L、酵母粉5g/L、MgSO410g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述方法在发酵罐的流加培养过程中，控制发酵液pH为7.0-7.2。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是在3L发酵罐上进行，3L发酵罐的发酵条件：初始培养温度37℃，接种量2％，搅拌速度400-800rpm，初始装液量1L，通气量1vvm。
本发明还要求保护所述角蛋白酶和所述基因工程菌在食品、饲料、化工、制革或者制备药物方面的应用，尤其是在制备日化洗涤产品、在皮革领域或者在饲料消化中的应用。
本发明的有益效果：
本发明构建了一株可以高效分泌高活性角蛋白酶的重组大肠杆菌，并实现其在摇瓶或者发酵罐中生产制备角蛋白酶。本发明的重组大肠杆菌发酵生产的角蛋白酶酶活可达4500U/mL(发酵时间48h)。本发明的角蛋白酶制剂，在洗涤、纺织、饲料消化、医药等领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1：原始角蛋白酶重组大肠杆菌和本发明角蛋白酶重组菌的摇瓶发酵对比。
图2：大肠杆菌的恒速碳源补料法发酵生产角蛋白酶；
图3：大肠杆菌的与DO值偶联的变速补料法产角蛋白酶。
具体实施方式
培养基：
(1)种子培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，琼脂20(固体培养基)，121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
(2)发酵基础培养基：glycerol8g/L，(NH4)2HPO45g/L，K2HPO43g/L，NaH2PO4·12H2O7g/L，sodiumcitrate3g/L，MgSO41.5g/L，2mL微量元素，氨苄青霉素终浓度100μg/mL，pH7.2；微量元素(g/L)：FeSO4·7H2O10；ZnSO4·7H2O5.25；CuSO4·5H2O3；MnSO4·4H2O0.5；Na2B4O7·10H2O0.23；CaCl22；(NH4)6Mo7O240.1。
(3)流加培养基是：甘油200g/L，酵母粉5g/L，MgSO410g/L；
角蛋白酶酶活测定方法：
(1)原理：角蛋白酶水解角蛋白底物，释放出酪氨酸，通过酪氨酸与福林酚显色，在660nm下测定吸光度值。吸光值的大小直接与酶活力的高低成正比。
(2)测定步骤：0.1mL经适当稀释的酶液，加入0.1mL的1％(w/v)可溶性角蛋白底物(使用前和0.1mol/L的pH9.0的Gly-NaOH缓冲液混合)，在50℃反应20min，每个反应样品中加入0.2mLTCA反应终止蛋白沉淀剂，摇匀后10,000r/min离心5min，取0.2mL上清液加入1mL的4％(w/v)Na2CO3，再加入0.2mL上海生工公司购买的福林酚试剂(预先稀释3倍)在50℃下反应15分钟。使用0.5cm的石英比色杯测定清液在660nm处的吸光值。空白对照是在加入底物之前已经加入同等体积的TCA终止酶活，其他步骤相同。酶活定义为每毫升酶液每分钟释放出多少微克酪氨酸。
实施例1高效分泌角蛋白酶能力的重组大肠杆菌的构建
(1)根据本实验多次分子改造获得的一种高活性角蛋白酶突变体的基因序列模版SEQIDNO.1，或通过化学合成得到模版，进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5min后进入一下循环：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸7min50s，30个循环；72℃延伸1min50s，然后再降温到12℃得到最终反应液。使用的DNA扩增酶为TaKaRa公司的PrimerSTAR，使用配方参照产品说明书。
(2)将扩增后的PCR产物和pET22b(+)质粒用NcoI和XhoI内切酶处理，得到粘性末端的DNA序列，再使用DNA连接酶在16℃下连接过夜。
(3)将连接液直接进行转化感受态大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落验证，将此质粒进行序列测定。选择正确的测序结果即为我们所需要的重组质粒。
(4)正确的突变质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃培养过夜，挑取单菌落即为本发明的产重组角蛋白酶工程菌。
表1角蛋白酶的PCR引物序列
实施例2重组大肠杆菌在摇瓶培养基上的发酵优化
将所得基因工程菌在含有100μg/L的氨苄青霉素的50mL培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/L的氨苄青霉素的50mL液体培养基37℃培养至OD600＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导培养，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液，并测定酶活。
选择五种基础培养基，对比大肠杆菌在摇瓶中发酵生产角蛋白酶的效率和产量。这五种培养基分别是LB，2×YT，SOC，TB，SB。这五种培养基主要区别在于有无碳源及不同氮源浓度或者盐离子差异。
LB(g/L):peptone,yeastextract,NaCl；
2×YT(g/L):peptone,yeastextract,NaCl；
SOC(g/L):peptone,yeastextract,NaCl,2.5mMKCl,10mMMgCl2；
TB(g/L):peptone,yeastextract,glycerol,17mMKH2PO4,72mMK2HPO4；
SB(g/L):peptone,yeastextract,glucose,NaCl.
表2摇瓶基础上使用不同培养基产角蛋白酶的对比。
通过表2，发明人发现TB和SB的菌浓度很高，但是产酶量却不是最高，尤其使用葡萄糖为碳源的SB培养基，产酶最低，而且酶活72h后下降也很快。2×YT获得最高角蛋白酶产量，而SOC的残余酶活稳定性最好。盐离子成分不同对角蛋白酶产量影响不大，而碳源的添加虽然可以增加菌体浓度但是会造成酶活不稳定，尤其葡萄糖为碳源明显抑制产酶。
在前面的基础上发明人采用2×YT培养及添加不同浓度的甘油培养大肠杆菌来分配发酵角蛋白酶(表3)。发现添加甘油有一定抑制产酶的作用。
表3添加不同浓度甘油的2×YT培养基生产角蛋白酶对比。
通过摇瓶优化，发明人得出不添加甘油的2×YT培养基为最佳培养基，在48h得到最高酶活510U/ml。所以后续在发酵罐上生产角蛋白酶暂时采用2×YT培养基为基础培养基。
此外，本发明还发现，同样的发酵条件下，来源于嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)BBE11-1的野生角蛋白酶(氨基酸序列在NCBI上的登录号AGK12420)在同样的载体、宿主中表达，其酶活比本发明的SEQIDNO.1的角蛋白酶所表达的酶活低20％，本发明的重组菌生产角蛋白酶效率上也明显高于原始重组菌(图1)。
由此可见，本发明的角蛋白酶，与嗜麦芽窄食单胞菌来源的野生型角蛋白酶相比，具有更高的分泌效率和表达活性。
实施例3重组大肠杆菌在3L发酵罐上产角蛋白酶
3L发酵罐发酵条件：初始培养温度37℃，接种量2％，氨苄青霉素含量100μg/l，搅拌速度400-800rpm，初始装液量1L，通气量1vvm，采用NewBrunswick公司的BioFlo/CelliGen115发酵罐。
在2×YT培养基的基础上，恒速流加碳源培养基(g/l，甘油500，酵母粉15，蛋白胨30，MgSO415)，并在溶氧第一次反弹时进行流加，流加速度为0.8ml/min。当菌体浓度达到10OD600，添加IPTG至终浓度200mM进行20摄氏度低温诱导，期间通过流加氨水控制培养基pH值不小于7.0。实验结果表明(如图2)，采用流加策略，大肠杆菌的确可以在16h达到12.6OD600，但是诱导后6个小时菌体浓度呈现明显下滑趋势，此时发酵液也开始表现角蛋白酶活性，酶活最高达到415U/ml。
采用改进的流加培养基(g/L，甘油200，酵母粉5，MgSO410)和基础培养基(g/L,glycerol8，(NH4)2HPO45，K2HPO43，NaH2PO4·12H2O7，sodiumcitrate3，MgSO41.5，2ml微量元素，pH7.2)进行大肠杆菌高密度培养。同样采用溶氧第一次反弹时进行流加，流加速度与DO值偶联，使得溶氧值不大于30并且不小于10，也就是当发酵罐中溶解氧DO值大于30时，开始缓速流加，直到溶氧值下降低于10，停止流加，等待溶氧回升。期间搅拌转速稳定在500-800rpm之间。在菌浓OD600为32左右(发酵培养24h)时开始降温到20℃，并诱导(诱导剂IPTG終浓度200mM)，并立即停止流加碳源，通气量和转速保持不变。结果表明(如图3)，该种流加方式可以很大促进角蛋白酶产量。最高酶活达到4500U/ml，在发酵48小时后就可以达到。该方法可作为一种高效制备角蛋白酶制剂的有效策略，为实现角蛋白酶工业化提供极大的潜力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种高活性角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
2.一种高效生产角蛋白酶的发酵方法，其特征在于，所述方法是以表达权利要求1所述角蛋白酶的基因工程菌为生产菌株，在发酵罐上采用溶氧偶联的补料方式获得高密度菌体并高效诱导产角蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是将基因工程菌活化后接种至含有氨苄青霉素的发酵罐基础培养基中，通过溶氧值与补料偶联的流加策略，于37℃培养至OD600＝30至32，然后降温至20℃培养并加入最终浓度0.2mM的诱导剂IPTG诱导，发酵48h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵罐基础培养基含有glycerol8g/L、(NH4)2HPO45g/L、K2HPO43g/L、NaH2PO4·12H2O7g/L、sodiumcitrate3g/L、MgSO41.5g/L、2mL微量元素，pH7.2；微量元素，按g/L计，含有：FeSO4·7H2O10；ZnSO4·7H2O5.25；CuSO4·5H2O3；MnSO4·4H2O0.5；Na2B4O7·10H2O0.23；CaCl22；(NH4)6Mo7O240.1；所述补料是补加流加培养基，流加培养基中含有甘油200g/L、酵母粉5g/L、MgSO410g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法在发酵罐的流加培养过程中，控制发酵液pH为7.0-7.2，并通过流加培养基控制溶氧值不大于30且不小于10。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵是在3L发酵罐上进行。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌以E.coliBL21(DE3)为宿主、pET22b(+)为表达载体，表达氨基酸序列为SEQIDNO.4所示的角蛋白酶。
8.表达权利要求1所述角蛋白酶的基因工程菌或细胞系。
9.权利要求1所述角蛋白酶在食品、饲料、化工、制革或者制备药物方面的应用。
10.权利要求3所述基因工程菌在食品、饲料、化工、制革或者制备药物方面的应用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106361589A (zh) * 2016-09-29 2017-02-01 泰山医学院 一种生物酶法去角质化面膜制作及使用方法
CN108728392A (zh) * 2018-05-30 2018-11-02 江南大学 一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌
CN108753671A (zh) * 2018-06-05 2018-11-06 江南大学 一种高产角质酶的重组大肠杆菌工程菌及其发酵工艺
CN111202868A (zh) * 2020-01-17 2020-05-29 重庆大学 用于制备角蛋白凝胶敷料的组合物及其制备方法和应用
CN112662653A (zh) * 2021-01-26 2021-04-16 江南大学 一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864115A (zh) * 2012-06-15 2013-01-09 江南大学 一种产角蛋白酶大肠杆菌基因工程菌及其应用
CN103589705A (zh) * 2013-10-29 2014-02-19 江南大学 一种角蛋白酶及其编码基因
CN103602653A (zh) * 2013-11-20 2014-02-26 江南大学 一种热稳定性及比酶活提高的角蛋白酶及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864115A (zh) * 2012-06-15 2013-01-09 江南大学 一种产角蛋白酶大肠杆菌基因工程菌及其应用
CN103589705A (zh) * 2013-10-29 2014-02-19 江南大学 一种角蛋白酶及其编码基因
CN103602653A (zh) * 2013-11-20 2014-02-26 江南大学 一种热稳定性及比酶活提高的角蛋白酶及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FANG,Z.等: "GenBank: AGK12420.1", 《GENBANK》 *
ZHANG,L.: "GenBank: EMI51341.1", 《GENBANK》 *
刘柏宏 等: "地衣芽胞杆菌来源角蛋白酶N 端对活力及其热稳定性的影响", 《微生物学通报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106361589A (zh) * 2016-09-29 2017-02-01 泰山医学院 一种生物酶法去角质化面膜制作及使用方法
CN106361589B (zh) * 2016-09-29 2019-04-05 泰山医学院 一种生物酶法去角质化面膜制作及使用方法
CN108728392A (zh) * 2018-05-30 2018-11-02 江南大学 一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌
CN108753671A (zh) * 2018-06-05 2018-11-06 江南大学 一种高产角质酶的重组大肠杆菌工程菌及其发酵工艺
CN111202868A (zh) * 2020-01-17 2020-05-29 重庆大学 用于制备角蛋白凝胶敷料的组合物及其制备方法和应用
CN112662653A (zh) * 2021-01-26 2021-04-16 江南大学 一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用
CN112662653B (zh) * 2021-01-26 2022-03-04 江南大学 一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用

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