CN112662653A

CN112662653A - 一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用

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Publication number: CN112662653A
Application number: CN202110101443.XA
Authority: CN
Inventors: 张娟; 李江华; 周冠宇; 陈坚; 堵国成; 冒鑫哲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN112662653B

Abstract

本发明公开了一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明对角蛋白酶基因的前肽与主酶进行易错PCR突变，构建筛选得到低温酶解活性突变重组菌，得到角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D。研究结果显示角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D在20℃的剩余酶活提升至野生亲本角蛋白酶的2.28倍，在30℃的剩余酶活提升至野生亲本角蛋白酶的1.95倍。

Description

一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如角质，皮屑，羽毛等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物以角蛋白为单一碳源生长时产生。角蛋白酶作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，广泛地运用于日化行业、畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中，具有巨大的研究与应用价值。

但是，目前研究发现的野生角蛋白酶多属于高温碱性蛋白酶，它们的最适反应温度一般为60℃左右，在20℃～40℃条件下的酶活一般不高。而且，在目前的研究当中，大多数都是针对其在较高的最适条件温度下进行酶活和热稳定性的研究，少有从角蛋白酶的实际应用环境出发，针对其低温性能进行改造的研究。

然而，在工业化与实际应用中，对角蛋白酶在较低温度下的性能有比较苛刻的要求，如制革工业中的浸水工艺要求角蛋白酶在室温条件(20℃～30℃)下有良好的酶解性能；在日化行业中，角蛋白酶相关的酶制剂及其衍生产品在应用时的温度也不高于40℃。虽然目前对角蛋白酶性质的研究日益成熟，但由于目前角蛋白酶的在低温条件下的酶活总体偏低，难以在需要较低反应温度的工业生产工艺和日常的大众化产品中实现大规模的应用。

虽然发明人课题组前期已经构建获得一株具有高角蛋白水解酶活的角蛋白酶重组菌，其在15L发酵罐上角蛋白酶活力达到426.60kU/mL(该角蛋白酶记载于文献Biotransformation of keratin waste to amino acids and active peptides basedon cell-free catalysis中)，并且随后发明人课题组也优化了一种高效生产角蛋白酶的方法，其在3L发酵罐水平酶活达到704.4kU/mL，是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高水平，且优化后发酵原料成本较优化前降低了96％(该产角蛋白酶方法记载于文献枯草芽孢杆菌高产角蛋白酶发酵条件优化中)；但是该酶是野生型角蛋白酶，其最适反应温度为65℃，在20～30℃时的酶活仅仅只有最适温度时的10～15％(在摇瓶水平下，野生型角蛋白酶在30℃的酶活为20.26kU/mL)。虽然该野生型角蛋白酶摇瓶发酵液在较低的反应温度下与现有报道中其他角蛋白酶在摇瓶水平发酵液相比具有高酶活，但其的低温酶活依然具有非常巨大的改进空间。

由于提高角蛋白酶的低温酶解性能有助于降低实际应用时的加热能耗而有效节省成本，降低反应温度从而防止角蛋白酶在高温环境下工作而快速失活，有效拓宽角蛋白酶在需要较低温度的工艺中或实际生活中的应用前景。因此，在实际应用中急需一种在低温条件下具有良好性能的角蛋白酶。

发明内容

技术问题

本发明要解决的技术问题是为了得到一种在低温条件下具有良好性能的角蛋白酶及其应用。

技术方案

为解决上述技术问题，本发明提供了一种角蛋白酶突变体，以提高角蛋白酶的低温酶解性能。

本发明提供了一种角蛋白酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的第3位、第45位和第100位同时变得到的；其中，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的角蛋白酶的序列包含前肽，组氨酸标签，和主酶；而本发明的突变体是从氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的第111位开始算起的，即，从主酶的第一个氨基酸开始算起进行突变的。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的第3位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第45位的缬氨酸突变为天冬氨酸及第100位的丝氨酸突变为天冬氨酸得到的；将其命名为：T3I/V45D/S100D。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种编码上述突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，以pHT01质粒或pP43NMK质粒为表达载体。

本发明还提供了一种携带上述基因，或上述载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，以细菌或真菌为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800N或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168。

本发明还提供了一种构建上述重组细胞的方法，所述方法为，将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。

本发明还提供了一种降解角蛋白的方法，所述方法为，将上述突变体，或上述重组细胞添加至以含有角蛋白的物质为底物的反应体系中进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述含有角蛋白的物质包括但不限于以下一种或者多种物质：皮肤角质、毛发、酪蛋白、弹性蛋白、毛料、皮革、指甲、鳞片、纤维、毛发、羽毛。

在本发明的一种实施方式中，上述反应条件为：向反应体系中添加至少1000U·mL^-1经纯化后的突变体T3I/V45D/S100D，在20℃～60℃，pH 7～11条件下反应4～12h。

在本发明的一种实施方式中，向反应体系中添加10000U·mL^-1纯化后的突变体T3I/V45D/S100D，在37℃条件下反应4h。

本发明还提供了一种脱毛制剂，所述脱毛制剂中上述角蛋白酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述脱毛制剂中角蛋白酶突变体的含量为1000～100000U·mL^-1。

在本发明的一种实施方式中，所述脱毛制剂为液体或固体。

本发明还提供了上述脱毛制剂在动物或者人体中脱去毛发中的应用，其中，在人体中脱去毛发是不以治疗为目的。

本发明还提供了上述角蛋白酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞在日化行业，畜牧业、饲料业、制革业、医药领域降解角蛋白中的应用。

本发明还提供了上述角蛋白酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞在制备含有降解角蛋白的产品中的应用。

本发明还提供了上述角蛋白酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞在降解皮肤角质、毛发、酪蛋白、弹性蛋白、毛料、皮革、指甲、鳞片、纤维、毛发、羽毛角蛋白中的应用。

有益效果

(1)本发明构建得到一种角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D，该角蛋白突变体在低温条件下仍然可以有较高的酶活；低温反应研究结果显示角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D在20℃和30℃的酶活分别为亲本酶的2.28倍和1.95倍，使其能在室温反应条件下提供更高的酶活，在摇瓶条件下发酵生产的粗酶液在室温条件的酶活可达到约40kU/mL，而具有现有报道中最高酶活的亲本酶在该条件下发酵酶活仅约20kU/mL，因此，该角蛋白酶突变体在应用时可以降低加热工艺要求或免去加热步骤而降低成本，同时也避免了酶长时间在高温环境下工作而导致的活力丧失。因此，该角蛋白酶突变体能在在禽畜废弃物降解，脱毛方面具有应用价值与潜力。

(2)同时将本发明构建得到的角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D及购自百斯杰生物工程有限公司的角蛋白酶稀释至20000U·mL^-1进行羊皮脱毛处理4h，结果两种角蛋白酶均有效脱毛，但目视观察被角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D脱毛的羊皮皮质完整，毛孔清晰，柔软富有弹性，胶原层未受损害，被百斯杰角蛋白酶脱毛的羊皮皮质软烂，毛孔粗大，柔软粘稠，伤皮明显，胶原层受到了损伤。因此角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D具有良好的脱毛效果，且不会皮质造成损伤。

附图说明

图1：角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D的枯草芽孢杆菌上清与纯酶的SDS-PAGE凝胶电泳；其中，M代表蛋白分子量标准，泳道1代表突变角蛋白酶T3I/V45D/S100D发酵上清，泳道2代表纯化的突变角蛋白酶T3I/V45D/S100D，箭头指示目的蛋白条带位置。

图2：角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D与其他突变体在不同温度下的酶活力比较。

图3：角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D降解羽毛图；其中，a为反应0h的反应体系；b为反应4h后的反应体系。

图4：角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D脱毛实验图；其中，a为0h的未脱毛羊皮(左为角蛋白酶T3I/V45D/S100D突变体组，右为百斯杰角蛋白酶组)；b为4h后的反应体系左为角蛋白酶T3I/V45D/S100D突变体组，右为百斯杰角蛋白酶组)；c为反应4h后的皮质情况(左为角蛋白酶T3I/V45D/S100D突变体组，右为百斯杰角蛋白酶组)。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109 Competent Cells购自Takara；下述实施例中涉及的pP43NMK质粒购自丰晖生物；下述实施例中涉及的QuickMutation^TM基因随机突变试剂盒购自碧云天生物，GeneJET Gel Extraction Kit试剂盒购自赛默飞；下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600记载于公开号为CN102492645A的专利申请文本中。

下述实施例中涉及的培养基为：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1。

LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉16.6g/L。

发酵培养基：蛋白胨20g·L^-1、酵母粉10g·L^-1、蔗糖30g·L^-1、KH₂PO₄ 3g·L^-1、Na₂HPO₄ 6g·L^-1、MgSO₄ 0.3g·L^-1、卡那霉素50mg·L^-1。

实施例中涉及的检测方法如下：

角蛋白酶酶活的测定：取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL，pH 10.0的50mMGly/NaOH溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的水溶性角蛋白(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，产品编码：K0043)作为底物，混匀后分别于20℃～80℃下反应20min；加入200μL 400mM的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温12000r·min^-1离心2min。取上清200μL，加入1mL 5％(w/v)的Na₂CO₃和200μL的福林酚试剂，混匀后50℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于660nm下测定清液吸光值；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上。

酶活的定义：在该条件下OD₆₆₀每升高0.001所需酶量为一个酶活力单位(1U)。

实施例1：角蛋白酶易错PCR突变体的构建

具体步骤如下：

1、重组质粒pP43NMK-kerB的构建

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的可用于生产角蛋白酶的基因(由编码信号肽的基因、编码前导肽的基因、6×His标签以及编码角蛋白酶的基因依次串联而得)；并使用同源重组试剂盒(Clonexpress II One Step Cloning Kit)将获得的基因与pP43NMK质粒进行连接，得到连接产物。

(2)将连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养12～14h，在LB固体培养基上挑取4个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养12h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-kerB。

2、角蛋白酶易错PCR突变体的构建

(1)根据角蛋白酶的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示)，分别设计突变引物，对携带角蛋白酶基因的重组质粒pP43NMK-kerB进行易错PCR扩增，以扩增角蛋白酶前肽及主酶，同时对携带角蛋白酶基因的载体质粒pP43NMK进行扩增，以高保真扩增质粒pP43NMK及原始角蛋白酶酶信号肽。

其中，易错PCR扩增原始角蛋白酶前肽及主酶所用引物如下：

正向引物：5’-TTCAGCGATTCCGCGTCTGCT-3’(SEQ ID NO.4)；

反向引物：5’-GATTACGCCAAGCTTTCATCATTATTGAGC-3’(SEQ ID NO.5)；

PCR扩增质粒pP43NMK及原始酶信号肽所用引物如下：

正向引物：5'-TAATGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGT-3'(SEQ ID NO.6)；

反向引物：5'-AGCAGACGCGGAATCGCTGAA-3'(SEQ ID NO.7)。

(2)易错PCR反应使用QuickMutation^TM基因随机突变试剂盒，反应体系为：RandomMut buffer(10×)2μL，Mutation enhancer(10×)2μL，dNTP(2.5mM each)2μL，2pg·μL^-1模板DNA 1μL，10μM正向引物0.2μL，10μM反向引物0.2μL，RandomMut DNApolymerase0.4μL，加入双蒸水至20μL；

易错PCR产物扩增条件为：94℃预变性3min；随后进行94℃30sec，55℃30s，72℃2min，30个循环；最后72℃保温10min；

PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，加入双蒸水至50μL；

PCR扩增条件为：98℃预变性3min；随后进行98℃10s，57℃5s，72℃2min，30个循环；最后72℃保温10min；

PCR扩增产物均用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向20μL扩增产物中加入1μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1h，随后于70℃条件下灭活5min；得到Dpn I消化产物。

(3)Dpn I消化产物使用GeneJET Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，向20μL消化产物中加入20μL Binding Buffer，枪头吹吸进行混匀后全部移入吸附柱中，9000rpm离心1min，弃去吸附柱下方管内废液，随后向吸附柱中加入1mL Wash Buffer，9000rpm离心30sec，弃去吸附柱下方管内废液，重复两次，随后用20μL双蒸水洗脱纯化产物；

(4)将原始角蛋白酶前肽及主酶片段的纯化产物与质粒pP43NMK及原始酶信号肽片段的纯化产物按等摩尔比进行混合，取2.5μL加入到7.5μL Gibson连接反应体系中，枪头吹吸进行混匀，50℃反应1h。

其中Gibson连接反应体系为：5×Reaction buffer 100μL,T5 exonuclease(10U/μL)0.31μL,Phusion polymerase(2U/μL)6.25μL,Taq ligase(40U/μL)50μL,H₂O 218.44μL。

(5)将Gibson反应后的连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L^-1)的LB固体培养基，于37℃培养8～10h，用添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L^-1)的LB液体培养基将LB固体平板上的单菌落清洗下转移到15mL摇菌管中，于37℃、220rpm培养3～4h后提取质粒，并送公司测序，获得含有突变基因的重组质粒。

实施例2：重组菌的构建与突变体的筛选

具体步骤如下：

(1)分别将实施例1获得的含有突变基因的重组质粒及含有野生型酶的重组质粒pP43NMK-kerB转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600，分别得到转化产物，分别将转化产物涂布于添加卡那霉素(终浓度50mg·L^-1)的LB固体培养基，于37℃培养8h，分别将获得的大量单菌落接种到含有发酵培养基的96深孔板中，在37℃、220rpm培养24h，分别得到含有突变体的发酵液和含有野生型角蛋白酶的发酵液；

(2)分别将步骤(1)获得的发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min后，分别获得发酵上清液。

(3)分别将步骤(2)得到的发酵上清液于40℃反应条件下，检测角蛋白酶酶活，保留酶活高于野生型角蛋白酶酶活相近的突变重组菌。

(4)将步骤(3)得到的筛选出的重组菌株分别接种至50mL添加卡那霉素(终浓度50mg·L^-1)的LB液体培养基中，以含有野生型角蛋白酶的重组菌株为对照，37℃、220rpm培养24h，分别得到发酵液。将发酵液于12000rpm条件下离心2min，后于40℃反应条件检测发酵上清液中的角蛋白酶酶活，筛选低温酶解性能提升的角蛋白酶。

(5)分别检测步骤(4)得到的上清液中的酶活，结果如表1所示。其中，KERB代表野生型角蛋白酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，T3I/V45D/S100D(KERBM-1)与KERBM-2～9分别代表步骤(3)中筛选出来的突变角蛋白酶经步骤(4)摇瓶发酵得到的含突变体T3I/V45D/S100D上清液与含其他突变体上清液。

表1原始酶与突变酶发酵上清液的酶活

(6)通过步骤(5)显示的酶活，选取40℃酶活最高的突变体T3I/V45D/S100D(KERBM-1)为易错PCR筛选出的低温活性提升的突变角蛋白酶，经测序，其第3位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第45位的缬氨酸突变为天冬氨酸及第100位的丝氨酸突变为天冬氨酸。突变体KERBM-9由于后续测量的30℃酶活低于突变体T3I/V45D/S100D，因此未选取该突变体进行后续实验。

实施例3：角蛋白酶突变体的分离纯化

具体步骤如下：

角蛋白酶的纯化：采用AKTAavant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。由于角蛋白酶突变体都添加有组氨酸标签，所以可以使用镍离子亲和层析纯化柱进行分离纯化，具体步骤如下：

(1)平衡：用5倍体积的20mmol/L pH 7.4Tris-HCl缓冲液平衡纯化柱；

(2)上样：预先处理好的样品以0.5ml/min的流速上样，上样体积一般不超过柱体积的5倍；

(3)洗脱：包括洗脱未吸附物质、杂蛋白和目的蛋白，流速2.0mL/min，洗脱液为含有50mM咪唑的20mmol/L pH 7.2的Tris-HCl缓冲液，以10％的洗脱液浓度进行洗脱，检测波长为280nm，收集含角蛋白酶酶活的洗脱液；洗脱过程只出现一个目的蛋白洗脱峰，后续测酶活及SDS-PAGE蛋白电泳发现，无论是原始酶，还是突变酶，峰顶收集的酶液为最纯的部分。

(4)分别将实施例2的步骤(4)中得到的含有野生型角蛋白酶的上清液、含有突变体T3I/V45D/S100D的上清液按照上述步骤分别进行纯化，分别得到野生型角蛋白酶纯酶和突变体T3I/V45D/S100D纯酶，对纯化后的酶的酶活进行检测，野生型角蛋白酶纯酶和突变体T3I/V45D/S100D纯酶在60℃的酶活分别为：15.5kU/mL、14.7kU/mL。

分别将得到的野生型角蛋白酶纯酶和突变体T3I/V45D/S100D纯酶进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示，其中，角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D的分子量为28kDa。

实施例4：角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D的低温酶解活性

具体步骤如下：

(1)对照纯酶的制备：

按照公开号为CN111575265A的专利申请文件中记载的方法制备突变体T78C纯酶和突变体T78E纯酶，所述T78C纯酶的氨基酸序列如本申请序列表中SEQ ID NO.8所示，T78E纯酶的氨基酸序列如本申请序列表中SEQ ID NO.9所示。

(2)评价角蛋白酶突变前后在不同反应温度酶解活性实验，具体步骤如下：

分别将实施例3得到的野生型角蛋白酶纯酶和突变体T3I/V45D/S100D纯酶与步骤(1)得到的T78C纯酶与突变体T78E纯酶分别在20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃反应条件下测定角蛋白酶活并绘制曲线(如图2所示)。

结果如表2所示，突变体T3I/V45D/S100D与野生型角蛋白酶、突变体T78C、突变体T78E纯酶对照相比，在20℃至60℃的反应活性得到了提高，突变角蛋白酶T3I/V45D/S100D在20℃的酶活由突变前的14kU/mL提高至突变后30.75kU/mL，为野生型角蛋白酶的2.20倍；

突变角蛋白酶T3I/V45D/S100D在30℃条件下的酶活由突变前的20.26kU/mL提高至突变后38.1kU/mL，为野生型角蛋白酶的1.88倍；

突变角蛋白酶T3I/V45D/S100D在40℃条件下的酶活由突变前的37.83kU/mL提高至突变后62.55kU/mL，为对照的1.65倍。

同时，突变体T3I/V45D/S100D的最适反应温度由原来的65℃降低至60℃。分别以突变体和野生酶的最适温度时的酶活为阳性对照(100％)，突变角蛋白酶T3I/V45D/S100D在20℃的剩余酶活由突变前的8.72％提高至突变后19.88％，是野生酶剩余酶活的2.28倍，是突变体T78C剩余酶活的3.62倍，是突变体T78E剩余酶活的3.82倍；

在30℃的剩余酶活由突变前的12.62％提高至突变后24.64％，是野生酶剩余酶活的1.95倍，是突变体T78C剩余酶活的2.20倍，是突变体T78E剩余酶活的1.52倍；

在40℃的剩余酶活由突变前的23.56％提高至突变后40.45％，是野生酶剩余酶活的1.72倍，是突变体T78C剩余酶活的2.44倍，是突变体T78E剩余酶活的1.89倍；具体结果如表3所示。

表2原始酶与突变酶的在不同温度下的酶解活性

表3原始酶与突变酶的在低温条件下下的剩余酶活

实施例5：角质酶突变体T3I/V45D/S100D在降解角蛋白中的应用

具体步骤如下：

将实施例3得到的经纯化后的角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D配置成2000U/mL的酶液，然后取10mL酶液加入到含有0.25g羽毛的50mL离心管中得到反应体系；

将反应体系置于37℃、220rpm反应4h，观察羽毛的酶解情况。

结果如图3所示，反应结束后，与反应前相比含有角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D体系中羽毛被完全降解。

实施例6：角质酶突变体T3I/V45D/S100D在脱毛中的应用

具体步骤如下：

(1)分别将实施例3得到的经纯化后的角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D与购自百斯杰的角蛋白酶配使用pH 10.0的50mM Gly/NaOH缓冲液制成20000U/mL的酶液；

(2)分别采用步骤(1)得到的酶液对约5mm×5mm的带毛羊皮进行脱毛处理(图4a)，其中羊皮购自菜市场；处理条件如下：在37℃，220rpm，pH 10.0的条件下处理4h，反应结束后使用轻微机械力清理少部分残余羊毛；

结果如图4所示，角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D组与百斯杰角蛋白酶组羊皮上的羊毛均被全部去除(图4b)，目视观察，被角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D脱毛羊皮皮张纹路完整富有弹性，毛孔清晰，胶原层未受损害(图4c左)，而被百斯杰角蛋白酶脱毛的羊皮皮质软烂，毛孔粗大，柔软粘稠，起皮明显，胶原层受到了损伤(图4c右)。

因此角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D具有良好的脱毛效果，且不会皮质造成损伤。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用

<130> BAA210020A

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaggaaaa agagtttttg gcttgggatg ctgacggcct taatgctcgt gttcacgatg 60

gccttcagcg attccgcgtc tgctgctcag ccggcgaaaa atgttgaaaa ggattatatt 120

gtcggattta agtcaggagt gaaaaccgca tccgtcaaaa aggacatcat caaagagagc 180

ggcggaaaag tggacaagca gtttagaatc atcaacgcgg caaaagcgaa gctagacaaa 240

gaagcgctta aggaagtcaa aaatgatccg gatgtcgctt atgtggaaga ggatcatgtg 300

gcccatgcct tgcatcatca ccatcaccac gcgcaaaccg ttccttacgg cattcctctc 360

attaaagcgg acaaagtgca ggctcaaggc tttaagggag cgaatgtaaa agtagccgtc 420

ctggatacag gaatccaagc ttctcatccg gacttgaacg tagtcggcgg agcaagcttt 480

gtggctggcg aagcttataa caccgacggc aacggacacg gcacacatgt tgccggtaca 540

gtagctgcgc ttgacaatac aacgggtgta ttaggcgttg cgccaagcgt atccttgtac 600

gcggttaaag tactgaattc aagcggaagc ggatcataca gcggcattgt aagcggaatc 660

gagtgggcga caacaaacgg catggatgtt atcaatatga gccttggggg agcatcaggc 720

tcgacagcga tgaaacaggc agtcgacaat gcatatgcaa gaggggttgt cgttgtagct 780

gcagcaggga acagcggatc ttcaggaaac acgaatacaa ttggctatcc tgcgaaatac 840

gattctgtca tcgctgttgg tgcggtagac tctaacagca acagagcttc attttccagt 900

gtgggagcag agcttgaagt catggctcct ggcgcaggcg tatacagcac ttacccaacg 960

aacacttatg caacattgaa cggaacgtca atggcttctc ctcatgtagc gggagcagca 1020

gctttgatct tgtcaaaaca tccgaacctt tcagcttcac aagtccgcaa ccgtctctcc 1080

agcacggcga cttatttggg aagctccttc tactatggga aaggtctgat caatgtcgaa 1140

gctgccgctc aataa 1155

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met Leu

1 5 10 15

Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro Ala

20 25 30

Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val Lys

35 40 45

Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys Val

50 55 60

Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp Lys

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Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val Glu

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Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala

115 120 125

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145 150 155 160

Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His

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210 215 220

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225 230 235 240

Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val

245 250 255

Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn

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275 280 285

Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu

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Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val

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<210> 3

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met Leu

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Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro Ala

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Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly

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355 360 365

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcagcgatt ccgcgtctgc t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taatgatgaa agcttggcgt aatcatggt 29

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<211> 21

<212> DNA

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<400> 7

agcagacgcg gaatcgctga a 21

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

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<210> 9

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<213> 人工序列

<400> 9

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355 360 365

Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

370 375

Claims

1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的第3位、第45位和第100位同时变得到的。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的角蛋白酶的第3位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第45位的缬氨酸突变为天冬氨酸及第100位的丝氨酸突变为天冬氨酸得到的。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的载体。

5.携带权利要求3所述基因，或权利要求4所述载体的重组细胞。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，以细菌或真菌为宿主细胞。

7.一种降解角蛋白的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的突变体，或权利要求5或6所述的重组细胞添加至以含有角蛋白的物质为底物的反应体系中进行反应。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含有角蛋白的物质包括但不限于以下一种或者多种物质：皮肤角质、毛发、酪蛋白、弹性蛋白、毛料、皮革、指甲、鳞片、纤维、毛发、羽毛。

9.一种脱毛制剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的角蛋白酶突变体。

10.权利要求1或2所述的突变体，或权利要求3所述的基因，或权利要求4所述的载体，或权利要求5或6所述的重组细胞在制备含有降解角蛋白产品中的应用。