CN113528556A - 一种角蛋白酶的异源表达及其在羊皮脱毛中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌角蛋白酶的异源表达与表征及其在羊皮脱毛中的应用，属于生物技术领域。本发明所述的角蛋白酶基因全长是通过挖掘Bacillus sp. LCB12全基因数据而获得，其基因全长1140bp，编码379个氨基酸，并通过PCR体外扩增了该基因。本发明为首次实现角蛋白酶VT104K基因在枯草芽孢杆菌SCK6中的异源表达、纯化和表征，并将重组角蛋白酶应用于山羊皮脱毛。该角蛋白酶具有良好的酶学特性，且脱毛性能优异，在制革工艺中拥有广阔的应用前景。

Description

一种角蛋白酶的异源表达及其在羊皮脱毛中的应用
技术领域
本发明涉及一种角蛋白酶的异源表达、表征及其在羊皮脱毛中的应用。
背景技术
角蛋白酶是一类能够降解角蛋白的蛋白酶类，其底物适用范围非常广，如纤维蛋白、乳清蛋白和酪蛋白等，并在饲料、皮革、医药业、食品等工业及环境治理方面具有广阔的应用前景。
皮革工业是一个拥有悠久历史的传统行业，其满足了社会对皮革制品的需求，创造了大量就业岗位，产生了巨大的社会和经济效益。但是，皮革工业也被认为是造成环境污染最严重的行业之一。而在制革工艺中，污染物主要来源于常规灰碱脱毛工艺，其产生的污染占BOD的40%、COD的50%、总污染的60~70%、高碱废水的100%。近十几年来，随着环保压力的增大，以及皮革清洁化生产的推广，酶法脱毛技术受到了越来越多的关注。酶法脱毛得到的裸皮粒面完整，成革的物理性能和机械性能良好。此外，脱毛废水中的BOD、COD、TSS和TDS也大幅度降低。
近年来，角蛋白酶脱毛引起了人们的广泛关注。与普通碱性蛋白酶相比，角蛋白酶具有更好的脱毛性能，且对皮革的损伤较低。同时，某些角蛋白酶对还原剂（S2-、2-巯基乙醇和DTT）和极端环境表现出极强的抗性，而且角蛋白酶可以快速去除纤维间蛋白。因此，角蛋白酶脱毛在脱毛工序中展现了巨大的应用潜力。
发明内容
本发明首先提供了一种编码枯草芽孢杆菌角蛋白酶的基因，其是以一株分离自新疆维吾尔族自治区莎车县盐碱土壤样品的Bacillus sp. LCB12为出发菌株，并对菌株LCB12基因组数据进行基因挖掘，获得角蛋白酶基因。角蛋白酶基因全长1140bp（GenbankID：MG738728 ），编码379个氨基酸，其中1-29位氨基酸为信号肽，30-105位氨基酸为前肽，106-379位氨基酸为成熟肽。
本发明通过设计特异性引物，PCR扩增获得角蛋白酶基因，并通过酶切连接手段构建了重组质粒pMA0911-VT104K。将重组质粒转化至Bacillus subtilis SCK6实现了角蛋白酶的异源表达，并对重组菌发酵液进行硫酸铵分级沉淀和离子交换层析纯化获得了重组角蛋白酶。
本发明所得到的角蛋白酶的分子量约为30.95 kDa，该酶最适反应温度60 oC，最适反应pH为平pH 10，且在pH 4.5~11稳定性较好；PMSF完全抑制酶活，而EDTA微弱地抑制酶活；此外，还原剂DTT和β-ME对酶活有一定的促进作用。在蛋白酶用量为100U/mL，温度为33~35oC的条件下，重组角蛋白酶VT104K能在6h内完成脱毛。角蛋白酶脱毛获得的裸皮洁白、光滑、柔软，粒面干净，毛孔清晰、完整。
附图说明
图1为重组质粒pMA0911-VT104K酶切鉴定：M：DNA Marker；1：pMA0911-vt104k；2：基因片段；3：酶切后质粒。
图2为角蛋白酶的电泳分析：M：蛋白Marker；1：纯化后的角蛋白酶。
图3为pH对角蛋白酶酶活(A)和稳定性(B)的影响。
图4为温度对角蛋白酶酶活(A)和稳定性(B)的影响。
图5为酶法脱毛效果。
具体实施方式
实施例一：角蛋白酶VT104K基因的获得
提取Bacillus sp. LCB12的基因组DNA，进行全基因组序列测序。对得到基因组数据进行分析，获取角蛋白酶VT104K基因。
实施例二：角蛋白酶VT104K的异源表达
设计特异性引物扩增角蛋白酶VT104K基因,上游引物(5'-GGAATTCCATATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTG-3')，下游引物(5'-GGAATTCTTATTGAGCGGCAGCTTCG-3')，通过PCR获得扩增角蛋白酶基因，并提取质粒pMA0911。对角蛋白酶基因和质粒pMA0911进行Nde I和EcoR I酶切，并进行连接。然后，将连接产物转化至E. coli DH5α，提取重组质粒pMA0911-VT104K，转化至B. subtilis SCK6。
实施例三：重组枯草芽孢工程菌培养条件
将重组菌B. subtilis SCK6/pMA0911-VT104K接种至50µg/mL卡那霉素的100 mL LB抗性培养基中，37°C摇床过夜培养，次日取上述种子液以2%的接种量接种于带有相同抗性的发酵培养基中（培养基成分：燕麦粉40g/L，大豆蛋白胨70g/L，NaCl 15g/L，pH 7），37°C，220rpm摇床培养72h；离心，收集发酵上清液，并测定上清液中角蛋白酶活性。
实施例四：角蛋白酶活性测试
对发酵液进行适当稀释后，取100μL稀释液加至700μL 50mM Gly-NaOH pH 10缓冲液中，再加入200μL 2% (w/v)的可溶性角蛋白（来源于羊毛）混匀，60oC反20min，然后加入200μL 6.56% (w/v)的三氯乙酸终止反应。12000rpm离心10min，取400μL上清液，依次加入2mL4.24% (w/v)的碳酸钠和400μL Folin-酚，40oC显色20min，测定660nm的吸光值，以先加三氯乙酸后加酶液的反应液作为空白对照。
实施例五：角蛋白酶的纯化
先添加硫酸铵至饱和度达到30%对离心上清进行初步沉淀去除部分杂蛋白，4oC 静置过夜，离心收集上清，弃沉淀。然后，缓慢加入硫酸铵粉末至硫酸铵饱和度达到50%，4oC静置过夜，离心收集沉淀，弃上清，进一步去除杂蛋白。随后，用适量的缓冲液(50mM HAc-NaAc，20mM NaCl，pH 5)对沉淀进行充分溶解，离心收集上清，用于后续纯化操作。
以平衡缓冲液(50mM HAc-NaAc，20mM NaCl，pH 5)平衡层析柱，上样，然后先以100%的平衡缓冲液洗脱杂蛋白，再以40%的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，获得纯化的角蛋白酶。
实施例六：角蛋白酶酶学性质的研究
在pH 4~11的pH值范围内检测角蛋白酶酶活；将角蛋白酶置于不同pH缓冲液中，室温下保温1h，测定残余酶活；在不同温度20~75oC测定角蛋白酶酶活；将重组酶置于20~75oC 条件下，保温1h，测定残余酶活。
实施例七：角蛋白酶脱毛
取浸水脱脂后的山羊皮一块，称重，作为后续操作的依据。
按照液比1.0量取100mM Gly-NaOH，pH 10缓冲液加至转鼓中，加热，10~12rpm，转5min，测定转鼓内温度约33~35oC，将浸水皮块加入，添加角蛋白酶100U/mL，转60min，停30min，转速10~12rpm，反复4次，观察脱毛情况及皮的状态。
水洗：用充足水洗涤皮块2次，每次转动5min。
浸灰：按照液比0.4加入水，添加0.3% NaOH碱膨胀30min，之后补液至液比1.0，添加4%石灰，转30min，再添加4%石灰，转30min，检查皮的状态，补液至2.5，转动30min，停鼓过夜。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种角蛋白酶的异源表达及其在羊皮脱毛中的应用
<141> 2020-04-16
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> Bacliius sp. LCB12(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttaatgct cgtgttcacg 60
atggccttca gcgattccgc gtctgctgct cagccggcga aaaatgttga aaaggattat 120
attgtcggat ttaagtcggg agtgaaaacc gcatccgtca aaaaggacat catcaaagag 180
agcggcggaa aagtggacaa gcagtttaga atcatcaacg cggcaaaagc gaagctagac 240
aaagaagcgc ttgaggaagt caaaaatgat ccggatgtcg cttatgtgga agaggatcac 300
gtagctcatg ctttggcgca aaccgttcct tacggcattc ctctcattaa agcggacaaa 360
gtgcaggctc aaggctacaa gggagcgaac gtaaaagtcg ccgtcctgga tacaggaatc 420
caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gctttgtggc tggcgaagct 480
tataacaccg acggcaacgg acacggcaca catgttgccg gtacagtagc tgcgcttgac 540
aatacaacgg gtgtattagg cgttgcgcca agcgtatcct tgtacgcggt taaagtactg 600
aattcaagcg gaagcggatc atacagcggc attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacaaca 660
aacggcatgg atgttatcaa tatgagcctt gggggagcat caggctcgac agcgatgaaa 720
caggcagtcg acaatgcata tgcaagaggg gttgtcgttg tagctgcagc agggaacagc 780
ggatcttcag gaaacacgaa tacaattggc tatcctgcga aatacgattc tgtcatcgct 840
gttggcgcgg tagactctaa cagcaacaga gcttcatttt ccagtgtggg agcagagctt 900
gaagtcatgg ctcctggcgc aggcgtatac agcacttacc caacgaacac ttatgcaaca 960
ttgaacggaa cgtcaatggc ttctcctcat gtagcgggag cagcagcttt gatcttgtca 1020
aaacatccga acctttcagc ttcacaagtc cgcaaccgtc tctccagcac ggcgacttat 1080
ttgggaagct ccttctacta tgggaaaggt ctgatcaatg tcgaagctgc cgctcaataa 1140
<210> 2
<211> 379
<212> PRT
<213> Bacliius sp. LCB12(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met
1 5 10 15
Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val
35 40 45
Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys
50 55 60
Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp
65 70 75 80
Lys Glu Ala Leu Glu Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val
85 90 95
Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly
100 105 110
Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly
115 120 125
Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His
130 135 140
Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val
165 170 175
Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val
180 185 190
Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr
195 200 205
Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp
210 215 220
Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys
225 230 235 240
Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala
245 250 255
Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro
260 265 270
Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser
275 280 285
Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala
290 295 300
Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala
325 330 335
Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn
340 345 350
Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly
355 360 365
Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
370 375

Claims (2)

1.一种角蛋白酶VT104K的编码基因及其枯草芽孢杆菌中的异源表达。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌角蛋白酶VT104K，编码该胰蛋白酶基因由1140个核苷酸组成，编码379个氨基酸，其中1-29位氨基酸为信号肽，30-105位氨基酸为前肽，106-379位氨基酸为成熟肽；通过构建重组质粒pMA0911-VT104K，在枯草芽孢杆菌SCK6中实现了胞外活性表达，经纯化后的该胰蛋白酶的特征为：分子量约为30.95kDa，该酶最适反应温度60oC，最适反应pH为10，且在pH 4.5~11.0稳定性较好；PMSF完全抑制酶活，而EDTA微弱地抑制酶活；此外，还原剂DTT和β-ME对酶活有一定的促进作用；在蛋白酶用量为100 U/mL，温度为33~35oC的条件下，重组角蛋白酶VT104K能在6h内完成脱毛；角蛋白酶脱毛获得的裸皮洁白、光滑、柔软，粒面干净，毛孔清晰、完整；其在制革脱毛工艺中拥有广阔的的应用前景。
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