CN111607580B

CN111607580B - 壳聚糖酶chi3、其编码基因及其制备方法

Info

Publication number: CN111607580B
Application number: CN202010493304.1A
Authority: CN
Inventors: 朱丹
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2040-06-03
Also published as: CN111607580A

Abstract

本发明公开了壳聚糖酶CHI3、其编码基因及其制备方法，所述壳聚糖酶CHI3具有如Seq ID No:1所示的氨基酸序列，属于壳聚糖酶GH46家族。上述壳聚糖酶的编码基因具有如Seq ID No:2所示的核苷酸序列。生产上述壳聚糖酶的方法包括以下步骤：在适合与所述壳聚糖酶生产的条件下，对上述能表达壳聚糖酶的培养物进行发酵，并对发酵产物进行分离和纯化，得到壳聚糖酶。本发明提供的壳聚糖酶的活性高、稳定性高，可通过工程菌发酵进行该酶的大批量生产，以便于将该壳聚糖酶应用于工业化寡聚糖生产中，将普遍存在的低成本的壳聚糖降解为更具应用价值的寡聚糖。

Description

壳聚糖酶CHI3、其编码基因及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种壳聚糖酶CHI3、其编码基因及其制备方法。

背景技术

壳聚糖 (chitosan)，又名甲壳胺、脱乙酰甲壳素等，甲壳素的主要来源是节肢动物的表皮和软体动物的壳，也存在于真菌、细菌、低等藻类的细胞壁中。几丁质还是除蛋白质外含氮量最高的有机再生资源，其储量的丰富程度仅次于纤维素。但是由于甲壳素分子量大、不溶于水而不能被有效开发利用，造成了巨大的资源浪费。壳寡糖 (oligochitosan)是壳聚糖经过物理、化学降解或酶法降解生成的聚合度为2-20的低聚糖。与壳聚糖相比，壳寡糖分子量低，作为一种功能性低聚糖在医药、食品、化妆品和农业等领域有着非常广泛的应用。在医药方面，如：降低胆固醇、抗肿瘤、降血压、治疗烧、烫伤、止血、免疫调节、调节肠道菌群等；在食品应用方面，如：抑菌作用，直接作为保健食品、功能性食品添加剂、食品保鲜剂和防腐剂等；此外，还可在化妆品和农业方面进行应用。由于壳聚糖的许多独特功能只有被降解为壳寡糖才会显现出来。因此，选择高效降解壳聚糖的方法十分关键。

目前，甲壳低聚糖和壳低聚糖的制备大致分为化学法、生物法和物理法。由于物理法、化学法在生产过程中会产生大量废水、废物，还会消耗大量水资源，不符合国家节能减排的政策针。从环保、节能、高效的角度出发，生物酶法降解壳聚糖制备壳寡糖具有物理法和化学法无法比拟的优点酶法降解条件温和，且水解过程和产物分布容易控制，无污染，已经成为人们研究的热点。

壳聚糖酶的来源广泛，在细菌、真菌、蓝细菌、病毒和植物中都有发现，并且研究者们相继从多种微生物中分离得到壳聚糖酶，如WangS，ChaoC等人于2009年筛选出的Bacillus cereus TKU006产几丁质酶活力仅为0.14U/mL，夏祥在《产壳聚糖酶/甲壳素酶菌株的选育、发酵及壳聚糖酶分离纯化与酶学性质研究》中利用透明圈法从污水处理厂废水中筛选出活力最高的菌株Bacillus cereusHMX-21，其活力仅为0.56U/mL，WangS, TsengW等于2011年筛选出的产壳聚糖酶菌株Acinetobacter calcoaceticusTKU024，粗酶液最大活力为0.39U/mL。胡远亮等《产壳聚糖酶菌株的筛选与鉴定》公开了一种从土壤样品中筛选出的酶活力最高的一株Mitsraria，其酶活力仅为0.729μ/mL。

由于常规的菌株筛选不仅工作量极大，并且该方法会漏掉大量的基因信息，巨大的微生物基因资源无法被挖掘和充分利用，难以获得新颖度高的壳聚糖酶基因，而宏基因组方法，从新的角度更全面的进行基因筛选，有望获得新颖的、活力更高的壳聚糖酶，基于宏基因组的文库筛选可以避免常规方法的不足，有利于挖掘新基因和产生新的蛋白质。但是，目前还未出现有研究通过宏基因组文库构建筛选方法获得新的高应用价值的壳聚糖酶。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种基于宏基因组文库和功能筛选方法筛选得到的全新的、高活性的壳聚糖酶CHI3及其编码基因，这种壳聚糖酶属于糖苷水解酶GH46家族，热稳定性和pH稳定性高，可广泛应用于寡聚糖生产中。本发明还提供了可大量表达这种壳聚糖酶的工程菌和该酶的生产方法，可利用该类工程菌进行工业发酵，大批量的生产壳聚糖酶CHI3。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种壳聚糖酶CHI3，该酶具有如Seq ID No:1所示的氨基酸序列，或具有与Seq ID No:1所示的序列同源性大于95%、且具有壳聚糖水解活性的氨基酸序列。上述酶不仅包括序列为Seq ID No:1的酶，还包括在这该酶的氨基酸序列上进行进一步的修饰形成，但是依然具有基本相同酶活的其他酶。所述酶修饰包括酶的用于提高酶稳定性的分子内交联、以及侧链基团修饰、或者序列两端添加纯化标签等。

由于自然进化状态下，蛋白的氨基酸序列在某些位点会随机发生一定的突变，如某个氨基酸的缺失、替换等，但是该极少量位点的突变（尤其是非活性位点）对蛋白的酶活基本无影响，因此，本申请要保护的壳聚糖酶CHI3也包括与Seq ID No:1所示的序列同源性大于95%、且具有壳聚糖水解活性的的蛋白酶变体。更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的上述壳聚糖酶的天然序列相同。上述酶突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的蛋白序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6 个、7个、8个、9个、10个或更多氨基酸可发生变化。

本申请中序列如Seq ID No:1所示壳聚糖酶被命名为CHI3；这种酶是申请人基于宏基因组文库方法，从小黄鱼肠道宏基因组中挖掘出的新的优质壳聚糖酶。

通过序列分析，筛选出的这个壳聚糖酶基因CHI3，与其他序列相似度仅为32%，其长度为789bp，编码酶CHI3的分子量约为28.33kDa，属于糖苷水解酶GH46家族。该酶的最适反应温度为35℃，最适pH值为10.0，最适胶体壳聚糖浓度为1.5%，但CHI3对粉末几丁质和CMC没有水解能力，其Km值为2.03mg/mL，Vmax值为5.33 μmol/min，比活力2.98U/mg。

优选地，所述壳聚糖酶的编码基因来源于小黄鱼消化道内容物宏基因组。

本发明还提供上述壳聚糖酶的编码基因，该编码基因具有如Seq ID No:2所示的核苷酸序列或具有与Seq ID No:2所示的核苷酸序列至少95%的序列同一性的序列，该序列编码上述的壳聚糖酶CHI3。所述编码基因可以是序列仅为如Seq ID No:2所示的核苷酸序列，还可以是在Seq ID No:2所示的核苷酸序列的基础上进行修饰加工得到的衍生序列，如在基因序列两端添加酶切位点或调控序列等，还可以是与该壳聚糖酶CHI3天然序列的同源性至少达到95%突变序列。更优选的，所述突变序列有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的上述壳聚糖酶的天然序列相同。上述突变序列可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的核苷酸序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6 个、7个、8个、9个、10个或更多核苷酸可发生变化。

本发明还提供一种重组表达载体，该重组表达载体是通过将所述的壳聚糖酶编码基因连接到表达载体所形成。可用于转化宿主表达菌株，用于生产壳聚糖酶CHI3。

优选地，所述表达载体为pEASY系列载体、pET系列载体或pGEM系列载体。

一种工程菌，该工程菌是通过将上述的重组表达载体转化表达载体（宿主菌）得到，能高效表达上述的壳聚糖酶。

本发明还提供一种生产上述壳聚糖酶的方法，其包括以下步骤：在适合与所述壳聚糖酶生产的条件下，对上述能表达壳聚糖酶的培养物进行发酵，并对发酵产物进行分离和纯化，最终得到壳聚糖酶。

优选地，利用所述工程菌生产壳聚糖酶的方法包括以下步骤：

（1）工程菌的构建：利用特异引物扩增壳聚糖酶目的基因，并回收目的基因后将其连接到表达载体上，构建形成重组表达载体，将重组表达载体转化到宿主菌后，得到生产高活性壳聚糖酶的工程菌。

其中，扩增采用的模板是携带有所述壳聚糖酶的编码序列的重组载体。

优选地，用于扩增两种壳聚糖酶编码基因特异引物为：

Chi3-F:ATGCGTTCTGACCCTCTGACGC；

Chi3-R:ACTGGGCGACCCTTGACTTT。

（2）工程菌的发酵：将筛选出的工程菌培养成种子液，以1%接种量接种于含氨苄青霉素 (50 μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，250 r/min振摇培养至OD600=0.6时，加入终浓度为1 mM 的IPTG，20℃低温诱导，250 r/min振摇培养16小时，进行菌体沉淀，或者进一步的扩大培养。

（3）壳聚糖酶的分离和纯化：将菌体沉淀进行破壁处理，迅速将细胞破壁液于4℃，12000 r/min离心20分钟，收集上清液。采用过Ni-NTA柱的方法对上清液进行纯化，再进行透析后，得到高纯度的重组壳聚糖酶液。

其中，所述细胞破壁采用超声破壁，超声波仪参数设定为：功率400W，工作5秒，间隔5秒，工作60次。

透析袋采用截留分子量为20 kDa。

优选地，上述方法中采用的表达载体为pEASY系列载体、pET系列载体或pGEM系列载体。具体实施例中，以pEASY系列载体为例。

作为表达菌株的宿主菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌Rosetta。由于这两种大肠杆菌为模式菌株，高密度发酵条件成熟，产酶周期短，被广泛应用于微生物发酵工业领域，通过上述表达载体和宿主菌的配合，便于对目标壳聚糖酶进行高效表达，提高产量，达到工业生产的要求。

本发明还提供上述壳聚糖酶在寡聚糖制备的应用。由于本发明提供的壳聚糖酶的活性高，可利用上述工程菌进行壳聚糖酶的大批量生产后，便于将该壳聚糖酶应用于寡聚糖生产过程中，提高将壳聚糖的应用价值，化费为宝。

所述壳聚糖酶还可用于制备真菌原生质体，便于将制备的真菌原生质体直接应用于菌种的遗传学杂交实验，特别对那些细胞壁成分是脱乙酰几丁质的接合菌更有效。所述壳聚糖酶还可以应用于抑制植物病原菌，由于大多数植物病原真菌的细胞壁主要成分是壳聚糖，可通过利用壳聚糖酶降解植物病原真菌的细胞壁，应用于致病菌危害的防治研究。

此外，本发明还提供用于扩增上述的壳聚糖酶CHI3的编码基因的特异引物，这对引物的序列如Seq ID No:3和Seq ID No:4所示。可采用这对引物对携带有目标基因的微生物或工程菌进行快速鉴定。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的壳聚糖酶CHI3，酶活性高，比活力为2.98U/mg，普遍高于现有的壳聚糖酶活性；该酶具有较好的温度稳定性和pH稳定性，其最适反应温度为35℃，最适pH值为10.0，对碱性环境的耐受能力强，该壳聚糖酶的高pH稳定性在生产中具有应用优势。CHI3对具有多种底物水解活性，对酪蛋白、胶体壳聚糖、胶体几丁质具有较高的水解活性，应用范围更广。

2、所述壳聚糖酶CHI3属于糖苷水解酶GH46家族，与现有最接近的序列相似度仅为32%，与现已知序列相似性很低，新颖度高，是从全新领域获得的新壳聚糖酶。

3、通过重组表达以及工程菌的构建，使壳聚糖酶CHI3的编码基因在工程菌中进行大量表达，不仅大幅度提高壳聚糖酶的产量，并且保护高酶活，满足工业化生产的需要；可广泛应用于寡聚糖生产过程中，将普遍存在的低成本的壳聚糖降解为更具应用价值的寡聚糖。

附图说明

图1为小黄鱼消化道内容物的宏基因组DNA的电泳图；

图2为壳聚糖酶CHI3与GH46家族壳聚糖酶多序列的比对结果；

图3为壳聚糖酶CHI3疏水性预测结果；

图4为壳聚糖酶CHI3的三维结构模型；

图5为基因CHI3的PCR扩增产物纯化后的电泳结果；

图6为CHI3的诱导表达和纯化的SDS-PAGE电泳结果；其中，（A）M，Marker；1，CHI3未诱导结果；2，CHI3诱导表达结果；3，平衡缓冲液洗脱结果；4，CHI3的纯化结果；

图7为CHI3的最适pH的测定结果；

图8为CHI3的最适温度的测定结果；

图9为不同金属离子处理对CHI3活力的影响；

图10为CHI3的底物特异性测试结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1小黄鱼肠道内容物宏基因组DNA的提取及质量检测

1. 小黄鱼肠道内容物宏基因组DNA的提取

（1）样品前处理和DNA提取

在无菌操作台上进行鱼样处理，先用75%酒精擦拭鱼体表及镊子等用具，用解剖剪沿肛门向上朝前呈弧形剪开。75%酒精擦拭消化道外壁，无菌冲洗液 (0.9%灭菌生理盐水)冲洗数遍。用无菌剪刀分离出消化道，用无菌冲洗液冲洗并收集消化道内容物。接着，利用CTAB法对小黄鱼消化道内容物的宏基因组DNA进行提取，并对提取的宏基因组DNA进行电泳检测。

提取DNA后通过纯化试剂盒进行纯化，再通过电泳检测纯化后的DNA质量，电泳检测结果见图1。对DNA样品的检测主要包括3个方面：

①琼脂糖凝胶电泳分析DNA的纯度和完整性；

②Nanodrop检测DNA的纯度（OD260/280、OD230/280比值）和浓度。

实验结果：从图1的结果可知，提取的DNA条带清晰明亮、略有弥散现象，总体来说所提取的DNA质量较好，检测其OD260/OD280为1.87，OD260/OD230为2.05，通过核酸浓度检测仪测定其核酸浓度为351.78ng/ μL，符合送样检测条件。

实施例2小黄鱼肠道宏基因组文库构建和壳聚糖酶的筛选

2.1 宏基因组文库的构建

2.1.1 DNA酶切及回收

（1）按照以下酶切反应体系对提取的鱼肠道内容物DNA进行酶切处理。酶切反应体系为：鱼肠道内容物DNA88 μL；Sau3AI2 μL；10×Sau3AI buffer 10 μL。

酶切反应条件：37℃，2小时，75℃灭活5分钟。再用电泳检测酶切效果。

（2）酶切后DNA回收：使用胶回收试剂盒切胶回收1000-4000bp的片段。

2.1.2载体的酶切

同时对载体也进行相应的酶切处理，其中，酶切反应体系为：

pUC1986 μL；BamHI2 μL；10×BamHI buffer10 μL。酶切反应条件：37℃，2小时，75℃灭活5分钟。电泳检测。

2.1.3载体的CIAP处理

为了去除载体DNA片段的末端的磷酸基团，减少载体自连，进行CIAP处理，具体操作如下：

（1）在微量离心管中配制下列反应液，定容至50 μL，其中：

DNA Fragment 15pmol，

10×Alkaline Phophatase buffer 5 μL；

CIAP（10-30U/μL）1-2 μL；

加ddH₂O补足至50 μL。

（2）先于37℃反应15分钟，再于50℃反应15分钟。最后于75℃进行10分钟处理，以灭活酶。

2.1.4 DNA与质粒载体的连接

将BamHI酶切去磷酸化的克隆载体和不完全酶切的基因组片段用T4DNALigase进行连接处理，16℃过夜。

50 μL的连接反应体系为：单酶切后的DNA30 μL；酶切后pUC19载体3 μL；10×T4DNA Ligase buffer5 μL；T4 DNA Ligase2.5 μL；ddH₂O9.5 μL。

2.1.5 转化大肠杆菌E.coilBlue2载体

将上述连接产物转化大肠杆菌E.coilBlue2载体，并涂布相应的平板，构建宏基因组文库。

2.2壳聚糖酶的筛选

（1）筛选方法：从文库的众多克隆中，挑选白色阳性菌落，并将且点接到含1%胶体壳聚糖的LB（Amp+IPTG+X-gal）培养基平板上，37℃培养1-2天，观察菌落周围是否有水解圈。当长出菌落后，将用1mg/mL的刚果红溶液静置染色10-15分钟后脱色，出现透明圈的菌落即为目标菌落，将目标菌落通过划线纯化，得到目标菌的单菌落。将上述具有水解圈的克隆子，提质粒，质粒测序由上海生工生物工程有限公司完成。

（2）实验结果：经过大量筛选后，发现有1个文库克隆子能产生直径最大的透明圈，具有壳聚糖降解能力，将这个文库克隆子所编码基因分别命名为CHI3，基因CHI3的序列信息具体见序列表中的Seq ID No:2。

实施例3壳聚糖酶CHI3生物信息学分析

按照下表1中的不同工具进行壳聚糖酶基因CHI3的各种生物学信息分析：

表1生物信息学分析工具

3.1多序列比对

经过测序得到：CHI3序列长度为798bp，序列信息见序列中的SEQ ID 2，将CHI3编码的壳聚糖酶表示为CHI3，CHI3的序列见序列表中的SEQ ID 1；将壳聚糖酶CH3的蛋白序列分别与现有壳聚糖酶的多序列进行比对，结果见图2。比对结果说明：壳聚糖酶CH3属于family46糖苷水解酶家族，通过一级结构的比较发现：与CH3最为相近的序列为WP-025849975.1，是来自Paenibacillus ehimensis的壳聚糖酶，相似度为33%，说明CHI3与现已知序列相似性较低，是一个新壳聚糖酶基因。

3.2 CHI3的蛋白理化性质分析

CHI3的理化性质具体见表2，其预测分子量为28.33 kDa，预测等电点为8.65。CHI3中20中常见氨基酸都含有，氨基酸组成含量最高的为丙氨酸A，达11.8%，其次是赖氨酸K，含量为11.0%。含有29个酸性氨基酸（D+E），34个碱性氨基酸（R+K），脂肪族氨基酸指数为76.88。原子组成C₁₂₆₃H₁₉₈₃N₃₃₉O₃₇₇S₁₂，氨基酸序列的不稳定系数为13.14，说明此蛋白是稳定的；亲水性指数为-0.259，表明其为亲水性蛋白。

表2 壳聚糖酶CHI3的理化性质

蛋白质名称	氨基酸数量	分子量	等电点	正电荷残基数	负电荷残基数	不稳定指数	亲水性指数
								CHI3	263	28333.40	8.65	34	29	13.14	-0.259

3.3疏水性分析结果

蛋白质的疏水性在保持蛋白质三级结构的形成和稳定中起着重要作用。利用ProtScale分析壳聚糖酶序列，预测结果见图3，整体来看，CHI3亲水性氨基酸分布比较均匀，且数量比例与疏水氨基酸相似，表明该蛋白亲水性较好，推测该酶属于可溶性蛋白，与理化性质分析结果一致。

3.4信号肽分析结果

表3CHI3信号肽基于神经网络算法预测数据

测量项目 Measurement	CHI3氨基酸位置 Position	CHI3分值 Value
			最大剪切位点分值 Max.C	26	0.175
最大综合剪切位点分值 Max.Y	11	0.178
			最大信号肽分值 Max.S	1	0.363
平均信号肽分值 Meanx.S	1-10	0.228
			T-mean和Y-mean的平均值 D	1-10	0.205

信号肽基于神经网络算法预测结果显示，壳聚糖酶CHI3的D剪切值为0.450，有无信号肽显示NO，S平均值为0.228<0.5；这表明该蛋白不含有信号肽序列。

3.5蛋白质二级结构和三级结构预测结果

I-TASSER预测结果显示，CHI3蛋白质主要部分为14个α-螺旋，43.35%，4个β-折叠组成，7.22%，其余为无规则卷曲。本文去除预测蛋白质的信号肽后，用I-TASSER进行三级结构预测，这是目前较为精确的蛋白质预测程序。通过Ramachandranplot分析模建结果，筛选最合理的模建结构。采用Autodockvina进行柔性分析对接，结果见图4，发现参与底物结合的氨基酸残基为：Arg69、Thr79、Gly77、Gly74、Tyr150、Tyr58、Gly182，与多序列比对结果一致。

实施例4壳聚糖酶基因CHI3克隆和表达载体构建

4.1引物设计

根据上述测序得到的壳聚糖酶CHI3序列，使用PrimerPremier5.0软件，分别设计引物CHI3-F、CHI3-R，以阳性克隆子的质粒为模板，利用上述两引物和高保真pfu酶，特异性扩增壳聚糖酶基因CHI3。

Chi3-F: ATGCGTTCTGACCCTCTGACGC；

Chi3-R: ACTGGGCGACCCTTGACTTT。

4.2壳聚糖酶基因表达载体的构建

（1）PCR产物纯化：参照凝胶DNA回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收。

（2）PCR产物与载体连接

将以下试剂加入0.2 mL的EP小管中，PCR仪控温37℃反应10分钟。

表5连接反应体系

试剂	5 μL体系
		PCR产物	3
pEASYE2Blunt	1
		ddH2O	1

（3）阳性克隆的筛选

将5 μL连接产物加入50 μL大肠杆菌感受态TransT1中，冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μL平衡至室温的LB液体培养基，200 r/min，37℃孵育1h。取40 μL均匀涂于含氨苄青霉素的固体培养基（终浓度为30 μg/mL），37℃培养8-10h。挑取白色纯菌落作为模板，引物为T7 Promoter Primer和T7 Terminator Primer，按照如下程序进行扩增94℃预变性，94℃变性2分钟，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存，扩增产物进行电泳分析（结果见图5），以进一步确定阳性克隆，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

（4）转化表达载体筛选正确的克隆，参照质量提取试剂盒提取质粒并转化至大肠杆菌感受态E.coli BL21（DE3）中。

实验结果：扩增得到的PCR产物明亮，条带单一，说明采用的引物特异性好；经过连接转化后，通过菌落PCR筛选合格克隆子，经测序验证，最终得到正确的克隆子，保藏菌株并提取质粒转化到表达体统E.coli BL21 (DE3)，重组表达载体构建完成，以待下一步表达。

实施例5重组壳聚糖酶CHI3的诱导表达和纯化

5.1重组壳聚糖酶的诱导过程

（1）挑取转化有正确表达载体的单菌落接种于10 mL含氨苄青霉素 (50 μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，250 r/min振摇培养过夜。

（2）次日将培养过夜的菌液按照1%接种量，接种于100 mL含氨苄青霉素 (50 μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，250 r/min振摇培养至OD600=0.6时，取出10 mL样本作为未诱导样品，10000 r/min离心1分钟收集菌体沉淀后立即进行细胞破碎和蛋白提取，防冷胁迫对基因表达的诱导。

（3）在剩余菌液中加入终浓度为1 mM 的IPTG，20℃低温诱导，250 r/min振摇培养16小时，此菌液作为诱导后样本，同（2）法收集菌体沉淀，20℃冻存备用。

（4）将诱导后沉淀用一定量的磷酸缓冲溶液(pH8.0)重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，加热煮沸10分钟，SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮染色3h后脱色观察诱导结果。

（5）选取诱导表达成功的细菌克降，扩大培养收集菌体沉淀，于20℃保存，准备做下一步分析及纯化。

5.2目标壳聚糖酶的提取、纯化和检测

5.2.1重组菌的破壁和胞内蛋白的提取

（1）将重组菌的培养液 (100 mL)，5000 r/min，常温离心20分钟，分别收集菌体，在重组菌中加入4 mL平衡缓冲液（pH8.0），涡旋混匀。

（2）将上述菌体悬浮液盛放在10 mL小烧杯中，在冰浴条件下，用超声波仪进行细胞破壁，超声波仪参数设定：功率400W，工作5秒，间隔5秒，工作60次。

（3）迅速将细胞破壁液于4℃，12000 r/min离心20分钟，取上清液验证酶活后于-20℃保存。

5.2.2重组蛋白质的纯化

采用过Ni-NTA柱的方法纯化重组壳聚糖酶，多次制备大量含目的蛋白质的细胞破壁液上清，上Ni-NTA柱，经洗涤、洗脱等方式，最终获得高纯度的目的蛋白质，具体操作如下：

（1）装柱：重悬介质，根据待纯化蛋白量，将适量介质加入层析柱，静置。

（2）平衡：用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡层析柱。对于结合能力强的His标签重组蛋白，或为了提高特异性结合平衡缓冲液中可加入低浓度咪唑 (10-20 mM )。

（3）上样：样品缓冲液与平衡缓冲液一致。样品经离心或使用0.45 μm过滤器过滤，避免堵塞层析柱。

（4）洗涤：上样完毕后，用5-10倍柱体积平衡缓冲液洗涤层析柱，收集流出液。

（5）洗脱：用不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白。用平衡缓冲液配制不同浓度的咪唑，进行梯度洗脱。

5.2.3透析处理

由于过柱后的蛋白质洗脱液中含有高浓度咪唑，通过透析去除咪唑，具体操作如下：

（1）将透析袋剪成适当长度 (10-20cm)的小段。在大体积2% (W/V)碳酸氢钠和10mM EDTA (pH8.0）中将透析袋煮沸10分钟。

（2）用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在1 mM EDTA (pH8.0)中煮沸10分钟后用蒸馏水清洗干净。冷却后，存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋必须戴手套。

（3）将待蛋白溶液转入到袋子中，用透析袋夹夹紧置于纯水或缓冲溶液中进行4℃透析。每1h更换溶液一次。

5.2.4重组壳聚糖酶CHI3表达产物的SDS-PAGE检测

分别对诱导前的表达产物、诱导后的表达产物、以及纯化后的表达产物一同进行常规的SDS-PAGE检测，分析表达产物的产量和纯度。

5.2.5实验结果及分析

对表达产物的电泳检测结果：如图6所示，诱导后CHI3的表达量有明显变化，目标条带粗，无拖尾等现象，目的条带在25 kDa和35 kDa之间，符合预测大小。其次，经Ni-NAT纯化后，目标条带更清晰，单一，无杂带，说明上述纯化方法对CHI3纯化效果较好。

实施例6 重组壳聚糖酶CHI3酶学性质的研究

6.1最适pH值和pH稳定性

（1）实验方法：

①最适pH值的测定：取0.1 mL前述分离纯化的酶液和0.9 mL胶体壳聚糖混合均匀，测定反应体系在不同pH（3-11）值下对壳聚糖酶活的影响，按照实施例1中的方法测酶活力。将最高酶活定为100%，分别计算不同pH值条件下壳聚糖酶的相对酶活。

②pH值稳定的测定：将壳聚糖酶和不同pH的缓冲液混合放置1h后，测定残余壳聚糖活力，将最高酶活力作为100%，计算壳聚糖酶的相对酶活。

（2）实验结果：

如图7所示，CHI3的最适pH为10，在pH为11时，活力下降明显，与大部分壳聚糖酶最适pH不同，偏碱性，更适用于碱性作业条件；CHI3在pH9.0和10.0条件下1小时后剩余活力约为57.91%，pH稳定性较好。

6.2最适反应温度和温度稳定性

（1）实验方法：

①最适反应温度的测定：取0.1 mL酶液和0.9 mL胶体壳聚糖混合均匀，于30-80℃不同温度下测定酶活，以最适温度的壳聚糖酶活作为100%，分别计算不同温度条件下壳聚糖酶的相对酶活。

②温度稳定性测定：将酶液于最适温度下放置1小时，测定剩余酶活力，将原来酶活力作为100%，计算壳聚糖酶的相对酶活。

（2）实验结果：

如图8的测定结果可知，CHI3的最适温度约为35℃，最适温度较低，若应用在工业化生产，说明消耗较少能源，即可达到最适反应温度，有利于节约能源。在最适温度下，处理1小时后，该酶还能保持60.39%的活力，该酶热稳定性较好。

6.3金属离子和表面活性剂

（1）实验方法：将酶液与浓度为0.5M不同金属离子缓冲液（Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺、Li⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺）混合，空白为灭活的酶液，以不含金属离子的缓冲液作为对照组。表面活性剂选取SDS和EDTA，浓度为0.5M。分别计算不同处理下壳聚糖酶的相对酶活。、

（2）实验结果：如图9所示，Mn²⁺对CHI3活力有明显的促进作用，约为对照的146.39%，Li⁺离子可使酶活力提高到104.80%；Zn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等离子均不同程度抑制CHI3酶活力。表面活性剂SDS、EDTA明显抑制了酶活力。

6.4底物特异性

（1）实验方法：将0.9 mL不同底物，和0.1 mL壳聚糖酶液混合测定壳聚糖酶活力，不同底物包括胶体壳聚糖、胶体几丁质、粉末壳聚糖、粉末几丁质、羧甲基纤维素钠（CMC）、酪蛋白。将最高的酶活作为100%，分别计算不同底物下壳聚糖酶的相对酶活。

（2）实验结果：见图10所示，CHI3具有多种底物水解能力，但对粉末几丁质和CMC没有水解能力。当底物为胶体壳聚糖时，其最适底物浓度为1.5%。

6.5重组壳聚糖酶动力学常数

利用双倒数作图法测定动力学常数，以1/S (mg/ml)为横坐标，1/V (min/ μmol)为纵坐标做出Lineweaver-Burk双倒数图，根据双倒数图计算相应的动力学常数。计算得到，当底物为胶体壳聚糖时，CHI3的Km值为2.03mg/mL，Vmax值分别为5.33 μmol/min，比活力2.98U/mg，属于内切壳聚糖酶。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 新型壳聚糖酶CHI3、其编码基因及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 壳聚糖酶CHI3(chitosanase 3)

<400> 1

Met Arg Ser Asp Pro Leu Thr Pro Asp Val Leu Ala Met Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ala Thr Gly Ile Ala Ser Lys Glu Ala Trp Thr Asn Ile Trp Phe Leu

20 25 30

Ile Ser Lys Thr Glu Gln Gly Asn Asp Asp Ile His Lys Thr Trp Leu

35 40 45

Thr Asp Lys Gly Thr Ser Leu Phe Thr Tyr Ala Ser Ala Leu Ser Tyr

50 55 60

Asp Arg His Lys Arg Gly Val Thr Ile Gly Cys Val Gly Trp Thr Thr

65 70 75 80

Ala Asn Asp Gly Lys Asp Gly His Gly Asp Ala Pro Ala Leu Phe Ala

85 90 95

Gln Tyr Lys Ala Leu Gly Gly Val Asp Leu Ala Pro Tyr Val Lys Gly

100 105 110

Cys Cys Ala Ser Gln Asp Ala Cys Lys Lys Leu Ile Ala Lys Ile Lys

115 120 125

Thr Leu Asp Asp Asp Pro Thr Trp Ala Gln Ala Gln Phe Lys Asn Leu

130 135 140

Val Thr Gly Asp Gly Tyr Leu Lys Lys Thr Met Asp Ala Trp Lys Lys

145 150 155 160

Val Gly Ile Ala Lys Pro Ser Ala Leu Ala Val Gly Val Val Phe Asp

165 170 175

Thr Ser Leu Asn Gln Gly Phe Asp Gly Pro Asp Gly Gly Cys Thr His

180 185 190

Leu Val Lys Leu Ala Val Lys Gly Asn Glu Ala Ala Thr Leu Glu Lys

195 200 205

Tyr Cys Ala Trp Lys Thr Lys Val Ala Gly Thr Ser Glu Tyr Asn Asp

210 215 220

Pro Lys Ile Asn Gly Thr Asn Arg Gly Lys Met Trp Ala Ala Leu Val

225 230 235 240

Asp Ala Lys Cys Phe Ser Leu Val Gly Cys Asp Lys Asp Ile Ala Lys

245 250 255

Val Thr Arg Trp Glu Leu Lys

260

<210> 2

<211> 789

<212> DNA

<213> 壳聚糖酶基因chi3(gene of chitosanase 3)

<400> 2

atgcgttctg accctctgac gccagacgtt ctggctatgc tgggtgctgc aactggtatc 60

gcatctaaag aagcatggac taacatctgg ttcctgatct ccaagaccga acagggtaac 120

gacgacatcc acaagacctg gctgaccgac aaaggcactt ccctgttcac ctacgcaagc 180

gcactgtctt acgaccgtca caaacgtggt gtcactatcg gttgcgtggg ttggactact 240

gctaacgacg gtaaagacgg tcatggcgac gcaccggctc tgttcgcaca atacaaagct 300

ctgggtggcg tagatctggc tccgtatgtt aaaggttgtt gcgcttctca ggatgcttgc 360

aagaaactga tcgccaaaat caagacgctg gacgatgacc cgacgtgggc tcaggcgcag 420

ttcaaaaacc tggtaactgg cgatggttac ctgaagaaaa ccatggacgc ctggaagaaa 480

gtgggcattg ccaaaccgag cgccctggcc gttggtgtag tctttgatac ctccctgaac 540

cagggtttcg atggtccgga tggcggctgt acccacctgg ttaaactggc ggttaaaggc 600

aatgaagcgg cgaccctgga gaaatactgt gcgtggaaaa ccaaagttgc gggcacctcc 660

gaatataatg atccgaaaat taacggcacc aaccgcggca aaatgtgggc ggcgctggtt 720

gatgcgaaat gctttagcct ggtgggctgc gataaagata ttgcgaaagt gacccgctgg 780

gaactgaaa 789

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列Chi3-F( Synthetic sequence Chi3-F)

<400> 3

atgcgttctg accctctgac gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列Chi3-R( Synthetic sequence Chi3-R)

<400> 4

actgggcgac ccttgacttt 20

Claims

1.壳聚糖酶CHI3，其特征在于，该酶的氨基酸序列如SeqIDNo:1所示。

2.如权利要求1所述的壳聚糖酶CHI3的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列为如Seq ID No:2的核苷酸序列。

3.重组表达载体，其特征在于，是将权利要求2所述的编码基因或将权利要求1所述的氨基酸序列的编码基因连接到表达载体所形成。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pEASY系列载体、pET系列载体或pGEM系列载体。

5.工程菌，其特征在于，所述工程菌中转化有如权利要求3所述的重组表达载体，其表达权利要求1所述的壳聚糖酶CHI3。

6.一种如权利要求1所述的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在适合于所述壳聚糖酶生产的条件下，对权利要求5所述的工程菌进行发酵，并对发酵产物进行分离和纯化，最终得到壳聚糖酶。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pEASY系列载体、pET系列载体或pGEM系列载体；宿主菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌Rosetta。

8.如权利要求1所述的壳聚糖酶在寡聚糖制备中的应用。