CN113388597A - 一种具有抗真菌活性的几丁质酶及其基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有抗真菌活性的几丁质酶及其基因。所述几丁质酶为几丁质酶Chi136787，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码几丁质酶Chi136787的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。几丁质酶Chi136787对真菌具有显著的抑制作用。

Description

一种具有抗真菌活性的几丁质酶及其基因

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有抗真菌活性的几丁质酶及其基因。

背景技术

几丁质酶（EC 3.2.1.14，glycoside hydrolases chitinases）是1905年Benecke首次在芽孢杆菌（Bacillus chitinovrous）发现的一类可催化几丁质水解的糖苷水解酶。几丁质酶可水解几丁质的β-1, 4糖苷键产生壳寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）单体，它由微生物、哺乳动物、昆虫、植物等生物体合成，其中微生物是几丁质酶的主要来源。大多数几丁质酶基本结构包括信号肽（Signal Peptide，SP）、催化域（Catalytic domain，CaD）、几丁质结合域（Chitin-binding domain，ChtBD），其中催化域是几丁质酶催化几丁质水解的关键结构，催化域结构由8个α螺旋和8个平行的β链组成的桶状结构（TIM-barrel），含有天冬氨酸/谷氨酸残基保守基序。几丁质酶可以有效催化真菌细胞壁的几丁质水解为可溶性低聚糖，从而阻断真菌菌丝延伸和抑制孢子萌发，达到抗真菌的效果。几丁质酶具有环境相容性且无毒无害，因此，几丁质酶在植物病原真菌的生物防治方面具有巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗真菌活性的几丁质酶及其基因。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种几丁质酶Chi136787，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种几丁质酶基因，所述几丁质酶基因编码上述几丁质酶Chi136787，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的几丁质酶，是从福建省福州市闽侯县收集的一份环境样品中，通过宏基因组学技术，用提取宏基因组DNA，并直接对提取好的DNA进行PCR扩增得到。

上述几丁质酶Chi136787在抑制真菌中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明的几丁质酶Chi136787，属于中性几丁质酶；是嗜温几丁质酶，在35-45℃环境能稳定发挥酶活。几丁质酶Chi136787对卷枝毛霉、少孢根霉、尼琦青霉、米黑根毛霉、绿木霉的孢子萌发均具有抑菌作用；对米黑根毛霉、里氏木霉、绿木霉的菌丝顶端伸长均具有显著抑制作用。几丁质酶Chi136787对真菌具有显著抑制作用。

附图说明

图1 PCR扩增chi136787和pET15b单酶切验证及重组质粒pET15b-chi136787的菌落PCR验证的电泳图。泳道M: takara 250bp DNA marker, 泳道1: PCR扩增chi136787基因片段条带（1023bp）, 泳道2: 原始pET15b质粒, 泳道3: BamH I消化的线性pET15b载体,泳道4: 重组质粒菌落PCR验证pET15b-chi136787的基因chi136787。

图2 Chi136787的SDS-PAGE分析。泳道M: Blue Plus II Protein Marker; 泳道1和2: 包含pET15b (对照) and pET15b-chi136787载体的ER2566诱导菌的全蛋白; 泳道3:pET15b-chi136787的ER2566诱导菌沉淀经高压破碎后的蛋白上清液; 泳道4: pET15b-chi136787的ER2566诱导菌沉淀经高压破碎后的细胞沉淀; 泳道5-9: 50/75/100/150/200mM咪唑浓度洗脱液的洗脱蛋白条带; 泳道10:纯化Chi136787。

图3 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线。

图4 pH对Chi136787酶活的影响（A）和Chi136787的pH稳定性（B）。

图5 温度对Chi136787酶活的影响（A）和Chi136787的温度稳定性（B）。

图6 Linewaeaver-Burk图。

图7 Chi136787对真菌孢子萌发抑制试验。

图8 Chi136787对真菌孢子萌发抑制效果的统计图。

图9 Chi136787对真菌菌丝延伸抑制试验。

图10 Chi136787对真菌菌丝延伸抑制效果的统计图。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

一种几丁质酶基因Chi136787，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述几丁质酶基因Chi136787编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的几丁质酶，是从福建省福州市闽侯县收集的一份环境样品中，通过宏基因组学技术，用提取宏基因组DNA，并直接对提取好的DNA进行PCR扩增得到。

实施例1 重组质粒pET15b-chi136787的构建

选取pET15b作为克隆载体，用BamH I内切酶将其切开备用。设计特异性引物（chi136787-F/R）PCR扩增chi136787基因，利用Ready-to-Use Seamless Cloning Kit将BamH I单酶切后回收的线性化载体和目的片段chi136787进行连接，构建pET15b-chi136787表达载体，通过抗性筛选阳性克隆，并送测序验证。引物序列如下：

chi136787-F：5’-ATATGCTCGAGGATCCCCAACCGCAAAAGGCTTTCAATGT-3’；

chi136787-R：5’-GTTAGCAGCCGGATCTTAATGGTGGTGATGGTGGTGCT-3’。

1、质粒提取

使用接种针蘸取含有质粒的大肠杆菌菌株，划线于LB固体平板（氨苄青霉素抗性，100 μg/mL），37℃恒温培养箱培养12 h，待单菌落长出后，挑取单菌落于5 mL LB液体培养基（氨苄青霉素抗性，100 μg/mL），放于37℃，220 rpm摇床振荡培养12-16 h后用于提取质粒。本试验采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒提取，步骤如试剂盒说明书（https://www.sangon.com/product）。

2、 chi136787目的基因PCR及切胶回收

扩增目的片段chi136787，PCR扩增体系如表1；PCR程序如下：94℃预变性10min；(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1 min)，并设置30个循环；最后72℃延伸5min。

表1 PCR扩增体系

将PCR产物全部上样于1%琼脂糖凝胶孔中，以Takara 250 bp DNA ladder marker为参照，85 V电泳15 min，通过紫外凝胶成像仪观察电泳条带。使用GeneJET GelExtraction and DNA Cleanup Micro Kit 回收目的基因片段。

3、pET15b质粒单酶切及纯化回收

根据Thermo Scientific FastDigest BamH I的说明书，1 μL FastDigest BamHI的最佳反应温度为37℃，酶切反应体系如表2。

表2 pET15b质粒DNA酶切体系

配置好上述体系并混匀后置于PCR仪37℃恒温反应3 h。使用GeneJET GelExtraction and DNA Cleanup Micro Kit对上述酶切产物进行纯化回收。

4、 pET15b-chi136787重组质粒的连接与转化

将切胶回收的几丁质酶基因片段chi136787与纯化回收的线性化载体通过Ready-to-Use Seamless Cloning Kit进行连接反应，将连接体系转化至大肠杆菌NEB-10β感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素抗性平板进行筛选，培养12-16 h至平板有数个单菌落长出。根据Ready-to-Use Seamless Cloning Kit的说明书配制合适体系，其中插入片段与线性化载体按照摩尔比3：1加入至体系中。连接体系如表3。

表3 pET15b-Chi136787重组质粒连接体系

5、pET15b-chi136787重组质粒的阳性克隆子验证

选取平板筛选长出的5个单菌落，用扩增目的基因的引物进行菌落PCR验证，验证正确后摇菌送测序公司测序，选用通用引物T7/T7-TER(_T7：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’；T7-TER：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’)进行双向测序，测序正确后进行摇菌并保菌。菌落PCR扩增体系如表4；PCR程序如下：94℃预变性10min；(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1 min)，并设置30个循环；最后72℃延伸5min。

表4 菌落PCR扩增体系

6、 结果

PCR扩增目的基因chi136787和BamH I单酶切pET15b的验证结果如图1，目的条带与理论大小相符，将线性载体与目的基因连接构建重组载体pET15b-chi136787，以chi136787-F/R引物验证重组载体，将验证正确的阳性克隆菌株使用通用引物T7/T7-TER进行测序，测序结果无碱基突变，可进行后续几丁质酶的表达。

实施例2 几丁质酶的原核表达与纯化

1、 重组质粒转化表达宿主菌ER2566

将重组质粒pET15b-chi136787转化ER2566感受态中，涂布于LB固体平板（氨苄青霉素抗性，100 μg/mL）上，37℃培养12-16 h至单菌落长出，挑取单菌落摇菌于10 mL LB液体培养基（氨苄青霉素抗性，100 μg/mL），终浓度10%甘油保藏于-80℃，该表达菌株用于后续表达。

2、诱导表达几丁质酶

（1）划线pET15b- chi136787表达菌株于LB固体平板（氨苄青霉素抗性，100 μg/mL），挑取单菌落于10 mL LB液体培养基（氨苄青霉素抗性，100 μg/mL）。

（2）按照1: 100接上述菌液于200 mL的LB液体培养基（氨苄青霉素抗性，100 μg/mL）中，于37℃ 220 rpm摇床培养约2-3 h后测OD₆₀₀=0.3-0.5时加入0.1mM IPTG，空白组为上述同等条件诱导不包含目的基因的空载pET15b，于16℃ 180 rpm摇床培养20 h。

（3）称重50 mL离心管，记录初重m₀，将诱导菌液装于50 mL离心管中，于4℃，10,000 ×g离心10 min弃上清，收集菌体。

（4）用超纯水清洗菌体，于4℃ 10,000 ×g离心10 min，弃上清，称次重m₁，计算菌体湿重，每100 mg菌体加入1 mL 1×Binding buffer重悬菌体。

（5）使用Constant高压细胞破碎仪将细胞进行破碎（压力25 Kpsi），使用高压破碎可以更高效率的破碎菌体，释放出目标蛋白，先将空白组进行破碎，再将样品组破碎，4℃10,000 ×g离心30 min收集上清液，得到上清蛋白组分。

3、 几丁质酶Chi136787的纯化

Ni-Agarose Resin（Ni琼脂糖凝胶）对6×His-tag标签具有显著特异性吸附能力，能够高效纯化带有6个组氨酸标签的蛋白，每毫升填料可以结合20-30 mg标签蛋白。以镍柱亲和层析法，对上一步获得的上清蛋白组分进行纯化。使用SDS-PAGE法对收集的纯化产物进行蛋白电泳检测。

4、结果

将测序正确的重组质粒pET15b-chi136787转化大肠杆菌表达宿主菌ER2566，通过小量诱导表达，SDS-PAGE验证结果（图2）显示有明显大量目标蛋白在细胞破碎的上清和沉淀中，与目标蛋白理论大小39.3 kDa一致，且大部分目的蛋白以包涵体的形式存在，而对照空载体pET15b无明显条带。镍柱层析纯化Chi136787的最佳洗脱液的咪唑浓度为200 mM，由于蛋白过柱后部分蛋白流失，为了提高蛋白回收率，纯化时将上清液连续过柱两次减少蛋白流失。使用200 mM咪唑的洗脱液洗脱蛋白，成功洗脱蛋白Chi136787。将纯化蛋白保存4℃，后续用于酶活测定。

实施例3 几丁质酶酶活测定方法

1、采用3, 5-二硝基水杨酸（3,5 - Dinitrosalicylic acid, DNS）法测定几丁质酶活性。将酶液适当稀释，使得最后的酶液中含有0.8-1.0 U/mL的酶活力，取0.1 mL稀释后的酶液与0.1 mL胶体几丁质混合于1.5 mL EP管，涡旋混匀，使几丁质保持悬浊状态，45℃水浴反应30 min。反应结束后加入40 μL DNS溶液，沸水浴10 min，冷水浴冷却至室温，离心取上清于96孔板中测定在540 nm下的吸光度值，记作A₅₄₀。根据N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。以空质粒作为对照管，pET15b-chi136787作为测定管。

酶活力定义：在合适条件下，每小时分解几丁质产生1 μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（U）。

酶活力计算公式：U/mL=（x×V_样×N）/（T×V_样）

x：测定值=（A测定管-A对照管），代入标曲得出x值（μmol/mL）；T：反应时间（h）；N：稀释倍数；V_样：反应液体积。

2、标准曲线绘制

配制0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 μmol/mL的0-10号管N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液用于测定标准曲线，各取不同浓度的标准溶液0.1 mL于不同离心管中，加入0.1mL胶体几丁质混合，50℃反应30 min，加入40 μL DNS溶液，沸水浴10 min，冷却至室温，离心取上清于96孔板中测定在540 nm下的吸光度值，记作A₅₄₀。ΔA₅₄₀为1-10号管A₅₄₀与0号管A₅₄₀的差值，以N-乙酰氨基葡萄糖浓度为横坐标，ΔA₅₄₀为纵坐标，根据所测数据绘制标准曲线。标准曲线如图3所示，酶活计算U/mL=X*N。

实施例4 酶学性质测定

1、 pH

不同pH缓冲液分别为pH 3.0-6.0为0.2 M磷酸盐-柠檬酸缓冲液；pH 7.0-9.0为0.2 M Tris-HCl缓冲液；pH 10.0-12.0为0.2 M甘氨酸-NaOH缓冲液。

几丁质酶最适pH测定：将酶液加入到不同pH缓冲液中，于45℃下测定几丁质酶Chi136787在不同pH缓冲液的酶活力，以测定的最高酶活力为100%，计算其他条件下的相对酶活力，从而确定最适pH。将酶液置于不同pH缓冲液中37℃孵育1 h，于45℃下测定几丁质酶残余酶活力，以未处理组的酶活力为100%，计算各条件下的残余酶活力百分比。

结果如图4所示。在pH 3.0-12.0范围内，于45℃条件测定了不同pH对Chi136787酶活性的影响，如图4-A，Chi136787在pH 6.0时酶活性最高，在pH 7.0时有60%的相对酶活，pH8.0-10.0相对酶活在30%-40%之间，在pH 5.0时酶活急剧下降，pH 12.0时完全没有酶活，在强酸强碱条件下不适合该酶发挥活性。几丁质酶酶液在37℃孵育1 h，测定其在不同pH环境下的稳定性，如图4-B，Chi136787在pH 6.0-9.0时保持超过80%的残余酶活力，pH 5.0和pH10.0残余酶活力只有40%。说明该酶在pH 6.0-9.0是相对稳定的，且pH 6.0是最适pH，属于中性几丁质酶。

2、 温度

在最适pH条件下，分别在测定几丁质酶Chi136787在30-70℃下的酶活力，以测定的最高酶活力为100%，计算其余相对酶活力，确定最适反应温度。

将几丁质酶Chi136787分别置于35、40、45、50、60℃下分别保温不同时间（0、20、40、60、80、100、120 min），在最适温度和最适pH下测定残余酶活力，以未处理组酶活力为100%，计算各温度条件下的残余酶活百分比。

几丁质酶Chi136787在最适pH 6.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液条件下，于30-70℃测定几丁质酶发挥活性的最佳温度，如图5-A所示最佳反应温度40℃，在35-45℃时相对酶活超过60%。几丁质酶酶液于35℃、40℃、45℃、50℃、60℃条件下孵育0、20、40、60、80、100、120min，计算残余酶活力测定酶的热稳定性，结果如图5-B，35℃和40℃的酶活几乎保持不变，相比较下，40℃是最稳定的，酶活几乎没保持不变，而35℃放置2 h后酶活有轻微下降，45℃孵育20 min后残余酶活缓慢减少，2 h后残余酶活72%。而50℃和60℃孵育20 min后酶活急剧下降，但50℃随后保持酶活在20%左右，60℃下孵育时间越长，酶慢慢失活至没有活性。Chi136787在35-45℃环境下比较稳定，说明Chi136787是嗜温几丁质酶，在正常环境中可以稳定发挥酶活。

3、 金属离子及化学试剂

在最适pH和温度下，比较浓度为1 mM和5 mM的14中金属离子（Na⁺、Ag⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Li⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺）和4种化学试剂（1 mM EDTA、1% SDS、1%Tween 20、1% β-巯基乙醇）对几丁质酶Chi136787酶活力的影响，以未加金属离子和化学试剂的酶活力为100%，计算其余条件下的相对酶活力。

1 mM和5 mM金属离子对几丁质酶活性影响如表5，Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺通过提高金属离子浓度，会促进酶促反应，其中Mn²⁺、Fe³⁺的酶活性相对最高，通过提高金属离子浓度，Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺提高了约25%-40%活性；而Mg²⁺、Ni²⁺、Li⁺、Zn²⁺离子浓度升高会导致酶活性降低，这说明几丁质酶对金属离子比较敏感，低浓度金属离子对酶活性有一定促进作用，但是高浓度会起到抑制作用。Cu²⁺轻微抑制，因为Cu²⁺催化半胱氨酸氧化形成分子内二硫键或者磺酸，从现象反应Cu²⁺可能使结构发生轻微变化或者形成磺酸体系pH减少而起到抑制的作用。Hg²⁺强烈抑制，使由于Hg²⁺与蛋白质链半胱氨酸残基中的巯基（-SH）发生反应，使蛋白的3D结构遭到破坏，说明结构的破坏对酶活的影响是巨大的。Ag⁺是完全抑制作用。化学试剂中SDS强烈抑制酶促反应，Tween 20作为表面活性剂促进活性提高，β-巯基乙醇中度抑制，EDTA对活性没有影响，因为EDTA是一种能结合溶液中金属离子的螯合剂，如果EDTA对活性没有较大改变的话，说明Chi136787不属于依赖金属的酶。综上，5 mM Mn²⁺、Fe^{3 +}、Fe²⁺对几丁质酶活具有较好的促进作用，提高了约36%的酶活。

表5 14种金属离子与4种化学试剂对Chi136787酶活的影响

注：相对酶活数据由平均值±标准差表示。

4、底物特异性及K_m值

配制浓度为0.5%（w/v）的胶体几丁质、壳寡糖、壳寡糖、虾壳粉、羧甲基壳聚糖、CMC-Na等，在最适条件下纯化酶于底物共同孵育测定酶活力。以底物为胶体几丁质的酶活力为100%，计算其余底物的相对酶活力。

分别配制0、1、1.5、2、3、4、5 mg/mL的胶体几丁质在最适条件下加入定量的纯化酶，测定酶活力，使用Linewaeaver-Burk双倒数法测定动力学常数K_m和V_max值。

纯化蛋白在pH 6.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液中于40℃条件下测定Chi136787对不同底物的酶活性，统计数据如表6。该酶对胶体几丁质具有严格的底物特异性，对壳聚糖观察到微弱酶活，在虾粉、壳寡糖、CMC-Na、羧甲基壳聚糖是非常微弱的活性。如图6，使用Lineweaver-Burk曲线测定Chi136787的动力学常数K_m和V_max分别为5.30 mg/mL、17.76 μmol/min/mL。K_m值反映几丁质酶的底物结合能力，K_m值越小表示底物亲和力越高。

表6 Chi136787的底物特异性

注：相对酶活数据由平均值±标准差表示。

5、 Bradford蛋白浓度及比活力测定

采用改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒（Modified Bradford ProteinAssay Kit）测定纯化后酶液蛋白含量。

纯化蛋白经浓度测定和酶活测定与粗酶液对比，结果如表7。经测定纯化蛋白比活力15.69 U/mg，纯化倍数2.28，回收率31.4%。

表7 Chi136787纯化表

实施例5 几丁质酶的抗真菌活性

1、 真菌的培养

从-80℃冰箱取出保藏的卷枝毛霉、少孢根霉、里氏木霉、尼琦青霉、绿木霉、米黑根毛霉，用接种针蘸取菌液划线于PDA平板，28℃恒温恒湿培养箱生长，培养至长出较大单菌落，4℃保存。挑取菌丝于200 μL超纯水混合涂布于无抗PDA平板，28℃恒温恒湿培养箱生长，待菌丝铺满平板后取出，4℃保存。

2、抑制孢子萌发

倒入无菌超纯水用涂布棒刮取真菌平板的孢子，通过血球计数板进行计数，制备3×10⁶ CFU/mL的孢子悬浮液，取200 μl涂布于无抗PDA平板，分区放置牛津杯，加入2 U酶活力的纯化酶Chi136787，培养48 h后观察抑菌效果并拍照，并从三个角度分别测量抑菌圈直径长度（单位：cm），对照组的长度记作牛津杯直径大小（0.6 cm），对数据进行统计学分析。

孢子萌发抑制试验结果如图7，培养48 h后，分别测量Chi136787对不同真菌的抑菌圈直径大小，通过统计学分析绘制直观统计图（图8）及统计显著性（表8），结果表明Chi136787对卷枝毛霉、少孢根霉、尼琦青霉、米黑根毛霉、绿木霉均具有抑菌作用，其中对米黑根毛霉的抑菌效果最佳。

表8 Chi136787对真菌孢子萌发抑制效果的数据分析

数据以平均值±标准差显示，*表示具有统计学显著性，P分别<0.05(*)，<0.01(**)，<0.0001(****)。

3、 抑制菌丝延伸

分别打孔真菌于无抗PDA平板中央，放置28℃恒温恒湿培养箱生长，待菌丝延伸至直径1-2 cm的范围，在距离菌丝0.5 cm的位置放置牛津杯，加入2 U酶活力的纯化几丁质酶Chi136787，培养24 h后观察抑制效果并拍照，测量真菌菌落中心点至各样品对应的菌落边缘的直线距离（单位：cm），对数据进行统计学分析。

几丁质酶对真菌菌丝延伸的抑制作用的试验结果如图9，通过统计学分析绘制直观统计图（图10）及统计显著性（表9），结果显示Chi136787对米黑根毛霉、里氏木霉、绿木霉的菌丝顶端伸长均具有显著抑制作用，可以明显看出对照的菌落边缘呈现完美圆弧状，而Chi136787对应的菌落边缘呈现凹陷状，且Chi136787对米黑根毛霉的菌丝延伸抑制效果最佳。

表9 Chi136787对真菌菌丝延伸抑制效果的数据分析

数据以平均值±标准差显示，*表示具有统计学显著性，P分别<0.01(**)，<0.001(***)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种具有抗真菌活性的几丁质酶及其基因

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Asn Thr Val Pro Leu Phe Asn Ser Lys Ala Ser Thr Phe Ser

1 5 10 15

Ala Val Leu Val Phe Cys Ile Val Leu Leu Ala Gly Leu Ser Thr Pro

20 25 30

Ala Phe Leu Ser Ala Gln Pro Gln Lys Ala Phe Asn Val Ile Ala Tyr

35 40 45

Phe Ala Gly Gly Pro Ser Lys Val Ser Thr Ile Arg Pro Lys Met Leu

50 55 60

Thr His Val Ile Tyr Ser Phe Cys Gly Leu Lys Gly Asn Lys Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Asp Thr Val Thr Val Arg Arg Leu Val Ala Leu Lys Lys Gln

85 90 95

Asn Pro Gln Leu Lys Val Leu Leu Met Leu Gly Gly Trp Gly Gly Cys

100 105 110

Glu Thr Cys Ser Asp Leu Phe Arg Ser Ala Val Asn Arg Glu Ala Phe

115 120 125

Ala Leu Ser Val Lys Lys Ala Cys Glu Lys Leu Lys Val Asp Gly Leu

130 135 140

Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Val Val Glu Gly Tyr Pro Gly His Lys

145 150 155 160

Tyr Ser Pro Asp Asp Arg His Thr Phe Thr Leu Leu Val Gln Gln Leu

165 170 175

Arg Lys Thr Leu Gly Trp Gln Tyr Glu Val Ser Phe Ala Ala Gly Gly

180 185 190

Phe Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Ile Asp Trp Pro Leu Val Met Lys

195 200 205

Glu Val Asp Arg Val Asn Ile Met Ser Tyr Asp Leu Val Asn Gly Tyr

210 215 220

Ser Lys Val Thr Gly His His Thr Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Gln Leu

225 230 235 240

Lys Glu Ser Val Asp Asn Ala Val Ser Tyr Leu Leu Ala Gln Gly Val

245 250 255

Pro Ala Gly Lys Ile Ala Ile Gly Ala Ala Phe Tyr Ala Arg Val Trp

260 265 270

Gln Asn Val Ser Pro Ala Asn Asn Gly Leu Tyr Gln Ala Ala Thr Phe

275 280 285

Arg Asn Thr Ala Ala Ile Ser Ser Val Asp Ser Trp Tyr Thr Ala Val

290 295 300

Asn Gly Tyr Gln Tyr Phe Trp Asp Asp Ile Ala Lys Ala Pro Phe Leu

305 310 315 320

Tyr Asn Ala Thr Lys Lys Leu Phe Val Thr Phe Asp Asn Asn Glu Ser

325 330 335

Ile Arg Ala Lys Thr Asn Tyr Met Met Asn Lys Asn Leu Asn Gly Ile

340 345 350

Met Phe Trp Gln Ile Ala His Asp Lys Lys Lys Glu Ser Leu Leu Gly

355 360 365

Thr Ile Asp Glu Val Ile Lys Gly His Gln

370 375

<210> 2

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaacaaca cggtaccatt attcaactct aaagcctcca ctttttctgc cgttttagtc 60

ttttgtatag tccttctcgc tggcttgtct actccagctt ttttatccgc acaaccgcaa 120

aaggctttca atgtcattgc ttattttgca ggggggccta gtaaagtgag caccattcgg 180

cctaaaatgc tgacccacgt catctactcc ttctgtgggc ttaagggtaa taagctgtac 240

cttcgcgaca ccgtgactgt tcgtcgtctc gtcgcgctga aaaagcaaaa tcctcaattg 300

aaggttttgt tgatgctggg gggctggggg ggatgtgaaa catgtagtga cttgttccgt 360

tctgctgtaa acagagaagc cttcgcgctt tcagtgaaaa aagcatgcga gaaactcaaa 420

gttgatggac tcgacttgga ctgggagtac ccagtagtag agggctatcc tggccacaaa 480

tatagcccag acgaccgtca tacatttacg ctgttagtgc aacagcttag aaagacatta 540

ggctggcagt acgaggtcag ttttgcggct ggggggttcc aggaatacct tgagaagagt 600

atcgactggc ctctcgttat gaaggaagta gatcgcgtaa atatcatgtc ctatgattta 660

gtaaacggtt atagcaaagt aacaggccac cataccccac tttattcaac tccacagctt 720

aaagaatcag tcgacaacgc cgtctcatac ctcctggcgc aaggcgtccc ggctggcaaa 780

attgccatag gagctgcgtt ttacgcaaga gtgtggcaaa acgtctcccc agcaaacaac 840

ggtttatatc aggccgccac gttcagaaac actgcggcta tttcatctgt cgactcctgg 900

tatacagcgg taaacggcta ccaatatttt tgggatgaca tcgccaaggc tccgttcctc 960

tataacgcta ccaaaaaact gtttgtgact tttgataata atgagtctat tagagctaag 1020

acaaactaca tgatgaacaa aaatttaaat ggtattatgt tctggcaaat cgcccacgac 1080

aaaaaaaagg aaagtttatt aggtaccatt gacgaggtga taaagggcca tcagcaccac 1140

catcaccacc attaa 1155

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atatgctcga ggatccccaa ccgcaaaagg ctttcaatgt 40

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttagcagcc ggatcttaat ggtggtgatg gtggtgct 38

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taatacgact cactatagg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctagttatt gctcagcgg 19

Claims (3)

1.一种几丁质酶Chi136787，其特征在于：所述几丁质酶Chi136787，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种几丁质酶基因，其特征在于：所述几丁质酶基因编码权利要求1所述几丁质酶Chi136787，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述一种几丁质酶Chi136787在抑制真菌中的应用。

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