CN110079512A - 一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22、基因、重组载体和菌株、制备方法和应用 - Google Patents

一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22、基因、重组载体和菌株、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22，所述木聚糖酶Xyn22的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本木聚糖酶Xyn22性质优良的、适合于在饲料、造纸、食品工业中应用新的木聚糖酶，是一种新的GH11家族高温耐盐耐酸碱木聚糖酶，与其他GH11耐盐木聚糖酶相比，本发明的木聚糖酶Xyn22的最适pH偏中性；在酸性和碱性条件下具有更良好的稳定性；具有更优良耐盐特性和盐稳定性，可使其应用于高盐食品加工，污水的处理以及将海藻降解转化为生物乙醇等行业。

Description

一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22、基因、重组载体和菌株、 制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22、基因、重组载体和菌株、制备方法和应用。
背景技术
木聚糖是自然界中含量最丰富的半纤维素，β-1,4-D-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是半纤维素降解的关键酶，它负责切割木聚糖主链产生木寡糖，可以应用于造纸、食品和饲料等多个行业中。具有耐酸碱耐盐木聚糖酶可以应用在咸味饼干、面包、海产品等含盐量较高的食品加工，可以用于污水的处理以及将海藻降解转化为生物乙醇等等，具有良好的应用潜力。
木聚糖酶可根据氨基酸序列的相似性主要分为具有不同蛋白质结构和催化机制的糖苷水解(GH)家族GH5,8,10,11,30,43,51和98。与其他家族的木聚糖酶相比，GH11家族木聚糖酶具有严格的底物特异性和高催化效率，它们在工业应用中具有许多优点。GH11家族木聚糖酶的较低的分子量(<30kDa)的特性使它们更容易渗透材料。然而目前仅发现了少数几个GH11家族的耐盐木聚糖酶，如来自Phoma sp.MF13的XynMF13A和来自盐碱地的Xyn11和来自Bacillus subtilis cho40的Xyn40。同时在实际工业应用中，高温和耐酸碱也是耐盐木聚糖酶应用所需要的重要特性，因此迫切需要发掘具有高温耐盐耐酸碱性的GH11木聚糖酶。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22、基因、重组载体和菌株、制备方法和应用，该木聚糖酶Xyn22性质优良的、适合于在饲料、造纸、食品工业中应用新的木聚糖酶，是一种新的GH11家族高温耐盐耐酸碱木聚糖酶，与其他GH11耐盐木聚糖酶相比，本发明的木聚糖酶Xyn22的最适pH偏中性；在酸性和碱性条件下具有更良好的稳定性；具有更优良耐盐特性和盐稳定性，可使其应用于高盐食品加工，污水的处理以及将海藻降解转化为生物乙醇等行业。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22，所述木聚糖酶Xyn22的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
一种编码如权利要求1所述的高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因。
而且，所述编码基因的基因组序列为SEQ ID NO.2。
包含如上所述的编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组载体。
而且，所述重组载体为重组载体pET28(a)-22。
而且，所述重组载体pET28(a)-22的制备如下：
将木聚糖酶Xyn22的编码基因插入到质粒pPET28a上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pET28a-22。
包含如上所述的编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组菌株。
如上所述的包含编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
一种如上所述的高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的制备方法，步骤如下：
⑴用包含编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
⑵培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；
⑶回收并纯化所表达的木聚糖酶Xyn22，即得高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22。
如上所述高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22在木聚糖降解方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明提供一种性质优良的、适合于在饲料、造纸、食品工业中应用新的木聚糖酶，是一种新的GH11家族高温耐盐耐酸碱木聚糖酶，与其他GH11耐盐木聚糖酶相比，本发明的木聚糖酶Xyn22的最适pH偏中性；在酸性和碱性条件下具有更良好的稳定性；具有更优良耐盐特性和盐稳定性，可使其应用于高盐食品加工，污水的处理以及将海藻降解转化为生物乙醇等行业。
2、本发明的木糖苷酶Xyn22具有以下性质：最适温度为60℃，在50℃-70℃之间保持61.19％的相对酶活力；最适pH为7.0，在pH6.0-8.0范围内保持84.28％以上的相对酶活；具有很好的酸碱耐受性，在pH4.0-pH11.0处理1h后仍保持49.46％以上剩余活力；具有优良的耐盐性，在2M和5M的NaCl条件下，其相对酶活为84.66％和51.20％；具有很好的盐稳定性，在3.0M的NaCl条件下处理1h后，其酶活力基本保持不变，在4.0M的NaCl条件下处理10min和1h后，仍然保持93.25％和65.58％的相对活性。本发明的木聚糖酶Xyn22是一种新的GH11家族高温耐盐耐酸碱木聚糖酶，可广泛用于造纸、生物能源以及食品等等行业中。
3、本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶Xyn22，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶Xyn22基因开放阅读框架序列(ORF)全长690bp。
成熟蛋白理论分子量为25.19kDa，将木聚糖酶Xyn22序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与XlnB2有一致性为74％。
附图说明
图1为本发明中重组木聚糖酶的蛋白图；
图2为本发明中重组木聚糖酶的最适温度图；
图3为本发明中重组木聚糖酶的最适pH图；
图4为本发明中重组木聚糖酶的pH稳定性图；
图5为本发明中重组木聚糖酶的耐盐性图；
图6为本发明中重组木聚糖酶的盐离子稳定性图。
具体实施方式
下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
本发明中所使用的试验材料、试剂和方法可以如下：
1、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
2、培养基：
大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH 7.0)。
3、未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22，所述木聚糖酶Xyn22的氨基酸序列为SEQ IDNO.1：
ATGAACGACACCCCCAGACCCCCGTTCAGCCGCAGGAACTTCATCGGCCTCACCGGGGCCGGAGCGCTGGCGGCGGCGGCGCCCTCGCTGCTGCTGCCCGGTACCGCGCACGCGCAGACCATCACCGAGAACCAGACCGGAACCCACGACGGCTACTTCTACTCCTTCTGGACCGACGGCGGCGGCTCGGTGTCCATGACCCTGGGCAACGGCGGAAACTACAGCACGTCCTGGACCAACACCGGAAACTTCGTCTGCGGCAAGGGATGGAGCAACGGGGGACGCAGGAGCGTGAACTACTCCGGAAGCTTCAACCCGTCCGGCAACGGTTACCTGTGCCTGTACGGCTGGACCTCGAACCCGCTCGTGGAGTACTACGTCGTCGACAACTTCGGGACCTACCGGCCCGAGGGGGAGTACCGGGGCACCGTGTACAGCGACGGCGGCACCTACGACCTCTACCGCACGATGCGCTACAACGCCCCGTCGGTGGAAGGCGACAGCGAGACGTTCCCGCAGTACTGGAGCGTTCGCCAGTCCACGCGAACCGGCGGGACCATCACCAGCGGAAACCACTTCGACGCCTGGACCGGCGCGGGAATGCAGCTGGGCTCCTTCAGCCACTACATGATCCTGGCGACCGAGGGCTACCAGAGCAGTGGTACCTCCAACCTCTACATGAACGGCTAA
其中，该酶基因编码229个氨基酸和一个终止密码子，其前38个氨基酸为信号肽，因此，成熟的木聚糖酶Xyn22的理论分子量为25.19kDa。
本发明的木糖苷酶Xyn22具有以下性质：最适温度为60℃，在50℃-70℃之间保持61.19％的相对酶活力；最适pH为7.0，在pH6.0-8.0范围内保持84.28％以上的相对酶活；具有很好的酸碱耐受性，在pH4.0-pH11.0处理1h后仍保持49.46％以上剩余活力；具有优良的耐盐性，在2M和5M NaCl条件下，其相对酶活为84.66％和51.20％；具有很好的盐稳定性，在3.0M的NaCl条件下处理1h后，其酶活力基本保持不变，在4.0M的NaCl条件下处理10min和1h后，仍然保持93.25％和65.58％的相对活性。
一种编码如权利要求1所述的高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因。
较优地，所述编码基因的基因组序列为SEQ ID NO.2：
MNDTPRPPFSRRNFIGLTGAGALAAAAPSLLLPGTAHAQTITENQTGTHDGYFYSFWTDGGGSVSMTLGNGGNYSTSWTNTGNFVCGKGWSNGGRRSVNYSGSFNPSGNGYLCLYGWTSNPLVEYYVVDNFGTYRPEGEYRGTVYSDGGTYDLYRTMRYNAPSVEGDSETFPQYWSVRQSTRTGGTITSGNHFDAWTGAGMQLGSFSHYMILATEGYQSSGTSNLYMNG。
本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶Xyn22，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶Xyn22基因开放阅读框架序列(ORF)全长690bp。
成熟蛋白理论分子量为25.19kDa，将木聚糖酶Xyn22序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与XlnB2有一致性为74％。
包含如上所述的编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组载体。
将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作地与表达调控序列相连接。
较优地，所述重组载体为重组载体pET28(a)-22。
较优地，所述重组载体pET28(a)-22的制备如下：
优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPET28a上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pET28a-22。
包含如上所述的编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组菌株。
如上所述的包含编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
一种如上所述的高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的制备方法，步骤如下：
⑴用包含编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
⑵培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；
⑶回收并纯化所表达的木聚糖酶Xyn22，即得高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22。
如上所述高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22在木聚糖降解方面中的应用。
具体地，相关步骤如下：
一、木聚糖酶编码基因Xyn22的克隆
提取盐碱土壤微生物的基因组DNA。
根据第11家族木糖苷酶基因的保守区序列设计合成了简并引物Xl1F，Xl1R。
X11-F：5′-AACTGCTACCTGKCNITNTAYGGNTGG-3′
X11-R：5′-CCGCACGGACCAGTAYTGNKIRAANGT-3′
以盐碱土壤微生物的基因组DNA为模板进行PCR扩增。得到一约576bp片段，将该片段回收后测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为lsp1D,lsp2D,lsp3D(上游特异性引物),lsp1U,lsp2U,lsp3U(下游特异性引物)见表1。
表1.木聚糖酶基因xyn22的TAIL-PCR特异性引物
通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送测序。拼接后xyn22木聚糖酶基因全长690bp，编码229个氨基酸和一个终止密码子。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为25.19kDa。结果如图1所示。
二、重组木聚糖酶的制备
将表达载体pET28a进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码木聚糖酶的基因xyn22双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pET28a连接，获得含有木聚糖酶基因xyn22的重组质粒pET28a-Xyn22并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/Xyn22。
取含有质粒的BL21(DE3)菌株，接种于100mL LB培养液中，37℃、220rpm振荡培养约2h后，加入1mM IPTG，置于25℃、220rpm进行诱导，约20h后测定胞内和胞外的木聚糖酶活力。在胞内检测到木聚糖酶酶的活性，经过镍柱纯化，SDS-PAGE结果表明，重组木聚糖酶得到了表达。
三、重组木聚糖酶的活性分析
DNS法：具体方法如下：在pH7.0，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化的酶液中的蛋白的含量，其次是在最适条件下测得重组酶的酶活，再由酶活除以蛋白的浓度来得到酶的比活。在pH 7.0和60℃的条件下，重组木聚糖酶的比活力为220.22U/mg。
四、重组木聚糖酶Xyn22的性质测定
1、木聚糖酶的最适温度测定方法如下：
在最适pH条件下，测定重组酶在不同温度下(30℃-80℃)的酶活。结果如图2所示，结果表明纯化的Xyn22的最适合的反应温度是60℃，当温度高于60℃时酶活慢慢下降，当温度达到80℃时，还剩余20.19％的相对酶活，在30℃时该酶剩余22.13％的相对酶活。
2、重组木聚糖酶Xyn22的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将本发明纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中37℃下进行木聚糖酶活力测定。结果如图3所示，结果表明，重组酶Xyn22的最适pH为7.0，在pH 8.0条件下还有84.28％的相对酶活性。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中将纯化后的酶在不同pH值的缓冲液进行稀释后，在37℃处理1h，然后用最适pH缓冲液稀释至少50倍以上，然后在最适pH下测定剩余酶活。结果如图4所示，结果表明木聚糖酶Xyn22的pH稳定性优异，在pH 5.0-11.0处理1h后仍能保证最低60.68％的相对酶活。
3、重组木聚糖酶的盐离子影响和盐离子稳定性
盐离子影响：在酶促反应底物中分别加入终浓度0、0.25、0.5、1、2、3、4、4.5、5M的NaCl，以研究其对酶活性的影响。在最适pH和最适温度的条件下测定酶活性，以同样条件下未加NaCl的酶促反应作为对照。结果如图5所示，结果显示：可见底物中不同浓度的盐离子对酶活性的影响，在0-3M的NaCl浓度下Xyn22酶活剩余为80.04％以上，4.5-5的NaCl条件下相对酶活为51.19％，可见其具有很好的嗜盐性。盐离子稳定性：在酶液中分别加入终浓度3和4M的NaCl各自预孵不同时间(0、10、30、60min)，以研究其对酶活性的影响。在最适pH和最适温度的条件下测定酶活性，以同样条件下未加NaCl的酶促反应作为对照。结果如图6所示，结果显示：缓冲液中用不同浓度NaCl预孵酶液不同的时间，检测残余酶活力，3M的NaCl处理1h后，Xyn22-1的酶活保持不变，在4M的NaCl条件下处理10min后，Xyn22-1保持93.25％的相对活性，处理1h后仍保持有64.40％的相对活性。
4、不同金属离子化学试剂对Xyn22酶活的影响测定如下：
在酶促反应体系中分别加入不同的两个浓度(终浓度为5mM和10mM)的金属离子及化学试剂，包括：K+、Na+、Ca2+、Li+、Co+、Ni2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、EDTA、SDS和巯基乙醇，以研究其对酶活性的影响。在最适pH和最适温度的条件下测定酶活性，以同样条件下未加金属离子和化学试剂的酶促反应作为对照。
表2显示不同金属离子和化学试剂对Xyn22酶活性的影响。在5mM的浓度下，多数对酶的影响不大，其中Cu2+对该酶具有明显抑制作用；金属离子Co2+在低浓度下有促进作用，但是在高浓度下，对该酶作用不大；Ca2+在低浓度下有抑制作用，但是在高浓度下，对该酶具有促进作用。10mM浓度下，Mg2+、Fe3+、EDTA和SDS也进一步抑制了酶的活性。不管高浓度还是低浓度下，β-Mercaptoethanol对酶的活性都有很强的促进作用。其它离子和试剂不论低浓度还是在高浓度下或对该酶的活性影响不大或有一定的抑制作用。
表2金属离子化学试剂对Xyn22的影响
6、重组木聚糖酶的底物特异性
纯化的重组酶的底物特异性的测定是通过纯化的酶液与浓度为1％(w/v)的燕麦木聚糖，桦木木聚糖，榉木木聚糖，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，地衣多糖和葡聚糖在最适反应条件下测定活力。重组酶对4-硝基苯基纤维二糖苷(pNPC)和4-硝基木单苷(p-nitrophenyl xyloside)这两种底物是在终浓度为5mM的最适反应条件下测定的。以榉木木聚糖作为底物所测得的相对活性定义为100％。Xyn22对榉木木聚糖的酶活最高，对葡聚糖，地衣多糖，微晶纤维素，pNP-cellobiose和pNP-xyloside都没有酶活。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22、基因、重组载体和菌株、制备方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 690
<212> PRT
<213> 木聚糖酶Xyn22的氨基酸序列(Unknown)
<400> 1
Ala Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys Ala
1 5 10 15
Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Cys Gly
20 25 30
Cys Ala Gly Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys
35 40 45
Cys Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly
50 55 60
Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys
65 70 75 80
Gly Cys Cys Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly
85 90 95
Cys Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Cys Gly Cys Ala Cys Gly
100 105 110
Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala
115 120 125
Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys
130 135 140
Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Thr
145 150 155 160
Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Gly Ala
165 170 175
Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Gly Gly Thr Gly
180 185 190
Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala
195 200 205
Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Gly
210 215 220
Cys Ala Cys Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys
225 230 235 240
Ala Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Gly Thr Cys Thr
245 250 255
Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly Ala Gly
260 265 270
Cys Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Cys Ala Gly Gly
275 280 285
Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly
290 295 300
Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Cys Cys Gly Thr Cys
305 310 315 320
Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Thr Gly
325 330 335
Thr Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala
340 345 350
Cys Cys Thr Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Thr Cys Gly Thr
355 360 365
Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Thr Cys Gly Thr Cys
370 375 380
Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr
385 390 395 400
Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala
405 410 415
Gly Thr Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly
420 425 430
Thr Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala
435 440 445
Cys Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Thr Cys Thr Ala Cys Cys Gly
450 455 460
Cys Ala Cys Gly Ala Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys
465 470 475 480
Gly Cys Cys Cys Cys Gly Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly
485 490 495
Gly Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Ala Cys Gly Thr Thr
500 505 510
Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys
515 520 525
Gly Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Ala Cys Gly Cys
530 535 540
Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr
545 550 555 560
Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys
565 570 575
Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Gly
580 585 590
Gly Cys Gly Cys Gly Gly Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr
595 600 605
Gly Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys
610 615 620
Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala
625 630 635 640
Cys Cys Gly Ala Gly Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly
645 650 655
Cys Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys
660 665 670
Cys Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys Thr
675 680 685
Ala Ala
690
<210> 2
<211> 179
<212> DNA/RNA
<213> 编码基因的基因组序列(Unknown)
<400> 2
mndtrsrrng tgagaaaaas gtahattntg thdgyyswtd gggsvsmtgn ggnystswtn 60
tgnvcgkgws nggrrsvnys gsnsgngycy gwtsnvyyvv dngtyrgyrg tvysdggtyd 120
yrtmrynasv gdstywsvrs trtggttsgn hdawtgagmg sshymatgys sgtsnymng 179
<210> 3
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> X11-F(Unknown)
<400> 3
aactgctacc tgkcntntay ggntgg 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> X11-R(Unknown)
<400> 4
ccgcacggac cagtaytgnk raangt 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 1sp1D(Unknown)
<400> 5
gctcgtgggg tactacgtcg tcgaca 26
<210> 6
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 1sp2D(Unknown)
<400> 6
cgtcgtcgac aacttcggga cctac 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 1sp3D(Unknown)
<400> 7
cctctaccgc acgatgcgct acaac 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 1sp1U(Unknown)
<400> 8
gttgtagcgc atcgtgcggt agagg 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 1sp2U(Unknown)
<400> 9
atcgtgcggt agaggtcgta ggtgc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 1sp3U(Unknown)
<400> 10
tgtcgacgac gtagtacccc acgag 25

Claims (10)

1.一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22，其特征在于：所述木聚糖酶Xyn22的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.一种编码如权利要求1所述的高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因，其特征在于：所述编码基因的基因组序列为SEQ ID NO.2。
4.包含如权利要求2或3所述的编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的包含编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组载体pET28(a)-22。
6.根据权利要求5所述的包含编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体pET28(a)-22的制备如下：
将木聚糖酶Xyn22的编码基因插入到质粒pPET28a上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pET28a-22。
7.包含如权利要求2或3所述的编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组菌株。
8.根据权利要求7所述的包含编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组菌株，其特征在于：所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
9.一种如权利要求1所述的高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴用包含编码高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
⑵培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；
⑶回收并纯化所表达的木聚糖酶Xyn22，即得高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22。
10.如权利要求1所述高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22在木聚糖降解方面中的应用。
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