CN114214302A

CN114214302A - 琼胶酶、编码基因、重组载体和宿主细胞及其应用以及新琼寡糖及其制备方法

Info

Publication number: CN114214302A
Application number: CN202111622716.1A
Authority: CN
Inventors: 张春毅; 侯艳平; 谢化宏; 何雄飞; 王斐; 郑松春
Original assignee: Lannao Technology Xiamen Co ltd
Current assignee: Lannao Technology Xiamen Co ltd
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114214302B

Abstract

本发明属于酶工程技术领域，公开了一种琼胶酶、编码基因、重组载体和宿主细胞及其应用以及新琼寡糖及其制备方法。该琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；用于编码上述琼胶酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明的琼胶酶催化琼胶酶解产物为新琼寡糖，在50℃下保温24h，酶活力仍保持在95％以上，在pH为5.0‑10.0范围内保温24h，残余酶活力仍在85％以上，具有优越的稳定特性；以凝胶强度为1300g/cm²的琼胶为底物时，琼胶酶粗酶液的酶活力为446U/mL，具有高酶活力。本发明提供的琼胶酶具有良好的实用性，为新琼寡糖的工业化生产提供了优异的酶资源，具有广泛的应用前景。

Description

琼胶酶、编码基因、重组载体和宿主细胞及其应用以及新琼寡糖及其制备方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种琼胶酶、编码基因、重组载体和宿主细胞及其应用以及新琼寡糖及其制备方法。

背景技术

琼胶又称为琼脂、洋菜、燕菜、冻粉等，是一种从江篱、石花菜等红藻中提取出来的水溶性多糖物质，由琼胶糖和硫琼胶两部分组成。其中，琼胶糖经降解得到琼胶寡糖，由于琼胶寡糖具有多种的生理活性功能而倍受关注，其最主要的生理功能为抑制癌细胞增殖作用、增强免疫以及抗氧化作用等，因此广泛应用于生化、医药和食品等领域。

传统制备琼胶寡糖的方法是采用酸水解法，该方法反应条件剧烈，需要在高温高压下进行而存在安全隐患，所得产物专一性较差且所使用的酸性物质会对周围环境造成严重污染；而酶解法相对于酸水解法具有降解条件温和、高度专一、环境友好等优势，因而酶解法逐渐代替了传统的酸水解法。然而，目前利用琼胶酶制备琼胶寡糖的研究多限于科研工作中，能够实现产业化生产的琼胶酶极少。这是由于多数琼胶酶的酶稳定性和酶活性未达到工业化的标准，从而导致琼胶寡糖的应用受到极大的限制。因此，开发一种具有高稳定性和高酶活力的琼胶酶具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一目的是为了克服现有的琼胶酶酶稳定性差、酶活性低的缺陷，而提供一种高稳定性和高酶活力的琼胶酶，为新琼寡糖的工业化制备提供新的酶源。

本发明的第二目的在于提供一种编码基因，其中，所述编码基因用于编码上述琼胶酶。

本发明的第三目的在于提供一种重组载体，其中，所述重组载体含有上述编码基因。

本发明的第四目的在于提供一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞含有上述编码基因或重组载体。

本发明的第五目的在于提供所述琼胶酶在生产新琼寡糖中的应用。

本发明的第六目的在于提供一种新琼寡糖的制备方法，其中，该方法采用上述琼胶酶酶解琼胶底物。

本发明的第七目的在于提供由上述方法制备得到的新琼寡糖。

本发明具有以下技术效果：

(1)本发明提供的琼胶酶包含631个氨基酸序列，其氨基酸序列与已有的琼胶酶氨基酸序列相似度仅为43.67％，是一个新的酶源。

(2)本发明的琼胶酶具有高稳定性，琼胶酶粗酶液在40℃下保温48h，酶活力几乎无损失，在50℃下保温24h，酶活力仍在95％以上；在50℃下，琼胶酶于pH5.0-10.0的缓冲液中保温24h，残余酶活力仍在85％以上；本发明的琼胶酶具有高酶活力，以凝胶强度为1300g/cm²的琼胶为底物时，琼胶酶粗酶液的酶活力为446U/mL(酶活力单位(U)的定义：最适条件下，每分钟产生1umol还原糖所需的酶量，定义为1个酶活力单位)；如此稳定的性质能够促进其工业化的应用。

(3)本发明的琼胶酶酶解产物为新琼四糖和新琼六糖混合低聚糖，酶解产物的纯度高达98％，因此本发明所述的琼胶酶具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为不同温度条件对琼胶酶活性的影响；

图2为不同pH条件对琼胶酶活性的影响；

图3为40℃和50℃条件下不同时间点的琼胶酶相对酶活；

图4为将琼胶酶在不同pH条件下于50℃温浴24h后的相对酶活；

图5为薄层层析法检测琼胶酶的酶解产物。

具体实施方式

第一方面，本发明提供了一种琼胶酶，所述琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

SEQ ID NO:1：

MRDKYLQAHVSPTENYWDWRSGAYNLRDDLIRKFDVYVGHRKNKGGITWHLSNDQHFLIMVSPTAYNKDESRLVGGQEKPFWPWAYSTVFLPTAYKGTATGEFMAHYIKEFDEIVKNYVPGIYEPYNEPFVHASSPTVLLIFAYNSITKLFEFHSTIAAQVWSTARGDMKVGGYCTNFPDFENPKFGRWNARWKQFIDIAGLRSDGFSVHLYDGIVEDKKQFRSRIEATFDMMEQYSQVRFGKITPMLVTEYSTQAHRYMSTCKYPIENAQAVRSQNSMLMQFMERTDNICYAMPFAMLKSEWGYSRTVFMKNTSVIHFRPTSYNDEKVTTWRLNDKAKFYQLWATGSVNPATVVKGATTQLVIGIFTNSFTWTSNQEATVDGLLSVQGLAIGKAVKVISEGSEFIIEAENFNAVGGTATSRVRKDVLGFNWSGDNINYNTLADYTDYQINVPTAGNYNVSAFAATPEVGGQVELSVKNGYVGKKAVPAGHWWETYENQNGGSVYLSPGNYNFRVQSAGGFMWQWNLDSISFTPNFSIPNVETNKDADVGEGILRVVVGRKHDMSKKPTLTMNGTQVGVPNNWMGGDQAARAQYFGMLEIPVPDDLLSTNNTVDVDFKHFPVTYTTVSLQV

第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因用于编码上述琼胶酶。在一种具体实施方式中，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

SEQ ID NO:2：

ATGCGAGACAAATATCTACAGGCGCATGTTTCACCTACTGAGAACTATTGGGATTGGCGGTCAGGAGCGTATAATCTTCGTGACGACCTTATACGAAAGTTTGATGTGTATGTTGGACACCGTAAAAATAAGGGTGGTATCACGTGGCATCTGTCTAACGATCAGCATTTTCTAATTATGGTTTCTCCGACTGCTTACAACAAAGATGAATCACGGCTAGTTGGTGGACAAGAGAAGCCTTTTTGGCCGTGGGCGTATTCTACAGTTTTTCTTCCGACAGCATATAAAGGGACTGCTACTGGAGAGTTCATGGCGCACTACATCAAGGAGTTTGATGAGATAGTGAAAAACTATGTGCCAGGAATATATGAACCTTATAACGAGCCTTTTGTGCACGCATCTTCGCCTACAGTACTTCTTATTTTTGCGTATAACTCTATTACAAAGCTATTCGAGTTTCATTCTACTATAGCTGCACAAGTATGGTCGACGGCACGTGGTGATATGAAGGTTGGAGGTTACTGCACGAATTTTCCGGACTTTGAAAATCCAAAGTTCGGTCGTTGGAATGCTCGATGGAAGCAGTTTATCGACATTGCAGGGCTGCGTTCTGACGGTTTTTCGGTACATCTATATGACGGGATTGTAGAAGATAAGAAGCAGTTTCGTTCTCGAATCGAGGCTACGTTTGACATGATGGAGCAGTACTCTCAAGTACGTTTTGGTAAAATCACACCGATGCTGGTTACTGAGTATTCTACACAGGCACATCGATATATGTCGACTTGCAAGTACCCTATAGAAAATGCTCAAGCGGTGCGATCACAGAATTCTATGCTTATGCAGTTTATGGAGCGAACTGACAACATTTGTTATGCAATGCCGTTTGCGATGCTGAAATCAGAATGGGGATACTCTCGTACTGTGTTCATGAAGAACACATCAGTGATTCATTTTCGTCCAACTTCTTACAACGATGAAAAAGTAACTACATGGCGGCTGAATGACAAGGCGAAGTTCTACCAGCTTTGGGCAACAGGTTCTGTTAATCCAGCAACTGTGGTTAAAGGAGCTACTACTCAGCTAGTGATCGGGATATTTACGAACTCATTTACTTGGACTTCGAATCAGGAGGCTACAGTAGACGGTCTGCTTTCTGTTCAAGGTCTTGCGATCGGAAAAGCAGTTAAAGTTATCTCAGAGGGTTCAGAGTTTATTATAGAGGCGGAAAATTTCAACGCGGTTGGTGGAACTGCGACGTCTCGAGTTCGTAAAGACGTTCTGGGGTTTAATTGGTCAGGAGACAATATAAACTATAATACTCTTGCTGACTATACAGACTATCAGATTAATGTACCTACGGCGGGAAATTACAACGTATCTGCTTTTGCTGCAACACCTGAGGTGGGGGGACAGGTAGAACTTTCTGTGAAAAATGGTTATGTGGGAAAGAAGGCTGTTCCAGCTGGGCACTGGTGGGAGACATACGAAAATCAAAATGGGGGTTCTGTATACCTTTCTCCGGGTAACTATAATTTCCGTGTACAGTCAGCTGGTGGATTCATGTGGCAGTGGAATCTGGATTCGATCTCTTTTACACCAAACTTCTCTATACCTAATGTGGAGACAAATAAAGATGCAGACGTGGGTGAAGGTATTCTACGAGTAGTTGTGGGGCGAAAGCACGATATGTCTAAGAAGCCTACGCTAACAATGAATGGTACGCAAGTTGGTGTACCGAATAACTGGATGGGTGGGGACCAAGCAGCACGTGCTCAGTATTTTGGGATGCTAGAGATACCTGTTCCTGACGACCTACTATCGACGAACAATACAGTAGATGTTGACTTTAAGCACTTTCCTGTGACGTATACAACTGTGTCTCTTCAAGTGTAA

本发明提供的编码基因是经过密码子优化后的，可在宿主细胞中进行高度表达，且由此所得琼胶酶具有较高的稳定性和酶活力，可直接用于工业化生产。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据该核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。此外，一旦获得了有关核苷酸序列，便可以用重组法大批量获得有关氨基酸序列，通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入宿主细胞，之后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有上述编码基因。

在本发明中，所述重组载体中使用的“载体”可以选用本领域已知的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，优选选用大肠杆菌的pCold II质粒。所述重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。

第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述编码基因或重组载体。

本发明可以通过本领域常规的方法将重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如采用氯化钙化学转化、高压电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌Transetta(DE3)细胞或枯草芽孢杆菌1012细胞。

在本发明的一种具体实施方式中，将目的编码基因片段克隆至表达载体中，构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞中，培养所述宿主细胞，诱导编码所述琼胶酶的基因的表达，最后分离纯化所表达的琼胶酶。其中，重组载体构建以及重组载体转化宿主细胞的方法已经在上文中有所描述，在此不作赘述。此外，所述培养的方式可以为本领域的常规选择。具体地，当所述宿主细胞为大肠杆菌时，所述培养通常采用LB液体培养基，所述培养的方式优选为在35-37℃、150-250rpm下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，之后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4-0.6mmol/L，并在14-20℃下诱导表达。当所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌时，所述培养采用YT液体培养基，所述培养的方式优选为在35-37℃、150-250rpm下培养至对数期，之后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8-1.2mmol/L，并在35-37℃、150-250rpm的条件下诱导表达。

第五方面，本发明提供了上述琼胶酶在生产新琼寡糖中的应用。

第六方面，本发明提供了一种新琼寡糖的制备方法，其中，该方法采用上述琼胶酶酶解琼胶底物。

具体地，所述琼胶底物的浓度优选为0.8-1.5％，如0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％。所述琼胶酶的添加量优选为0.5-1‰v/v，如0.5‰v/v、0.6‰v/v、0.7‰v/v、0.8‰v/v、0.9‰v/v、1‰v/v。

本发明对所述酶解的条件没有特别的限定，例如，酶解温度可以为40-55℃，如40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃；时间可以为3-6h，如3h、4h、5h、6h。

第七方面，本发明还提供了由上述方法制备得到的新琼寡糖。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实验材料和试剂

大肠杆菌Escherichia coli BL21与pCold II质粒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；氨苄青霉素钠和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自北京索莱宝科技有限公司；琼胶购自绿新(福建)食品有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

本发明实施例所用到的实验条件可以根据已有的现有技术进行选择，对实施中未标明的实验方法或条件通常按常规方法操作，如J.萨姆布鲁克等编写的《分子克隆实验指南》中所述的实验条件或按制造厂商所建议的条件运行。

实施例1琼胶酶AgaP1896的异源表达

以太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica WPAGA1)的DNA基因组为模板，采用PCR技术扩增出琼胶酶AgaP1896的基因序列(SEQ ID NO:2)，将其连接到pCold II质粒上获得重组载体，并将重组载体导入至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)宿主细胞中；

将重组大肠杆菌菌株接入到LB液体培养基中，于37℃条件下培养至OD₆₀₀至0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于16℃条件下诱导12h；

诱导结束后，采用高速离心收集菌体，然后将菌体重悬于PBS缓冲液中(50mM,pH7.4)于冰浴条件下进行超声破碎，高速离心收集破碎上清液，即得琼胶酶粗酶液。

实施例2琼胶酶AgaP1896酶活力验证

采用DNS法对按实施例1制得的琼胶酶粗酶液的酶活力进行验证：将50μL琼胶酶粗酶液与950μL 2g/L的琼胶水溶液混合后置于40℃水浴反应10min，然后立即将其与3mL的DNS试剂混合，置于沸水浴中10min，观察反应液的颜色变化。结果显示，反应液的颜色逐渐由亮黄色变为棕红色，证明反应体系中有还原糖产生，说明该琼胶酶AgaP1896有酶活。

实施例3琼胶酶AgaP1896的最适反应温度测定

将50μL实施例1制得的琼胶酶粗酶液与950μL 0.2％w/v琼胶水溶液混合后分别置于不同温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃和80℃)下反应10min，加入DNS试剂停止反应，沸水中煮沸10min，充分冷却后进行还原糖含量的检测，记录550nm处的吸光值，计算相对酶活并绘制图表。结果如图1所示，从图1可以看出，琼胶酶AgaP1896的最适反应温度为50℃。

实施例4琼胶酶AgaP1896的最适反应pH测定

用不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.6)的缓冲溶液配制0.2％w/v琼胶水溶液，将50μL实施例1制得的琼胶酶粗酶液与950μL不同pH值的0.2％w/v琼胶水溶液混合后分别置于最适反应温度(50℃)下反应10min，记录550nm处的吸光值，计算相对酶活并绘制图表。结果如图2所示，从图2可以看出，琼胶酶AgaP1896的最适反应pH为8.0。

实施例5琼胶酶AgaP1896的稳定性测定

将按实施例1制得的琼胶酶粗酶液分别在40℃和50℃进行保温，在不同的时间点(24h,48h,72h,96h,120h,144h)取样检测琼胶酶的相对酶活，检测结果如图3所示；将按实施例1制得的琼胶酶粗酶液分别在pH＝3、4、5、6、7、8、9、10、10.6的缓冲液中于50℃下温浴24h后取样检测琼胶酶的相对酶活。检测结果如图4所示。从图3可以看出，琼胶酶AgaP1896具有优越的温度稳定性，在40℃下保温48h以内，酶活力几乎没有损失，保温96h以内，剩余酶活力在95％以上，保温144h以内，剩余酶活力在80％以上；当琼胶酶在50℃下保温24h以内，剩余酶活力在95％以上，保温48h以内，剩余酶活力在80％以上，保温96h以内，剩余酶活力在60％以上。从图4可以看出，琼胶酶AgaP1896具有良好的pH稳定性，在50℃下，pH为5.0-10.0的范围内保温24h，残余酶活力仍在85％以上。

实施例6琼胶酶AgaP1896粗酶液的酶比活力的测定

将50μL按实施例1制得的琼胶酶粗酶液加入到含有50mL琼胶水溶液(10g/L,pH＝8.0，凝胶强度为1300g/cm²)的锥形瓶中，置于50℃震荡5min，立即置于沸水浴中灭活10min。以半乳糖为标准品，采用DNS法测定还原糖含量，记录550nm处的吸光值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算还原糖的产量。酶活力单位(U)的定义：最适条件下，每分钟产生1umol还原糖所需的酶量，定义为1个酶活力单位。

按照上述方法，检测出琼胶酶AgaP1896粗酶液对琼胶的酶比活力为446U/mL。

实施例7琼胶酶AgaP1896酶解产物薄层层析分析

将50μL实施例1制得的琼胶酶粗酶液与950μL 2g/L的琼胶水溶液混合后置于50℃水浴反应，于不同反应时间点(0min,10min,0.5h,2h,4h,6h,24h)进行取样并立即置于沸水浴中进行灭活，待所有时间点的取样完成后进行薄层层析法(TLC)分析，以新琼四糖(NA4)、新琼六糖(NA6)作为标准品，选用的展开剂为正丁醇:冰乙酸:水＝1:2:1(v/v/v)，显色剂为浓硫酸:无水乙醇＝1:9(v/v)，显色温度为110℃。TLC分析结果如图5所示，琼胶酶AgaP1896的降解产物为新琼四糖和新琼六糖的混合物，同时从实验结果可知酶解反应在4h内就能够反应完全。

实施例8琼胶酶AgaP1896的应用

向1吨酶解罐中加入8kg食品级琼胶，加水至800L，酶解罐升温至110℃并保温20min，使琼胶完全溶解，然后边搅拌边降温至50℃，向酶解罐中加入800mL按实施例1制得的琼胶酶AgaP1896粗酶液，反应4h后，放罐，采用管式离心机和陶瓷膜过滤进行离心纯化，纯化后的液体进行减压浓缩后，输送至喷雾干燥机中进行干燥，收集干燥后的粉末，进行理化检测。经检测，按此方法制备得到的新琼寡糖纯度达到98％以上。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 蓝脑科技（厦门）有限公司

<120> 琼胶酶、编码基因、重组载体和宿主细胞及其应用以及新琼寡糖及其制备方

法

<130> 20211213

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 631

<212> PRT

<213> Flammeovirga pacifica WPAGA1

<400> 1

Met Arg Asp Lys Tyr Leu Gln Ala His Val Ser Pro Thr Glu Asn Tyr

1 5 10 15

Trp Asp Trp Arg Ser Gly Ala Tyr Asn Leu Arg Asp Asp Leu Ile Arg

20 25 30

Lys Phe Asp Val Tyr Val Gly His Arg Lys Asn Lys Gly Gly Ile Thr

35 40 45

Trp His Leu Ser Asn Asp Gln His Phe Leu Ile Met Val Ser Pro Thr

50 55 60

Ala Tyr Asn Lys Asp Glu Ser Arg Leu Val Gly Gly Gln Glu Lys Pro

65 70 75 80

Phe Trp Pro Trp Ala Tyr Ser Thr Val Phe Leu Pro Thr Ala Tyr Lys

85 90 95

Gly Thr Ala Thr Gly Glu Phe Met Ala His Tyr Ile Lys Glu Phe Asp

100 105 110

Glu Ile Val Lys Asn Tyr Val Pro Gly Ile Tyr Glu Pro Tyr Asn Glu

115 120 125

Pro Phe Val His Ala Ser Ser Pro Thr Val Leu Leu Ile Phe Ala Tyr

130 135 140

Asn Ser Ile Thr Lys Leu Phe Glu Phe His Ser Thr Ile Ala Ala Gln

145 150 155 160

Val Trp Ser Thr Ala Arg Gly Asp Met Lys Val Gly Gly Tyr Cys Thr

165 170 175

Asn Phe Pro Asp Phe Glu Asn Pro Lys Phe Gly Arg Trp Asn Ala Arg

180 185 190

Trp Lys Gln Phe Ile Asp Ile Ala Gly Leu Arg Ser Asp Gly Phe Ser

195 200 205

Val His Leu Tyr Asp Gly Ile Val Glu Asp Lys Lys Gln Phe Arg Ser

210 215 220

Arg Ile Glu Ala Thr Phe Asp Met Met Glu Gln Tyr Ser Gln Val Arg

225 230 235 240

Phe Gly Lys Ile Thr Pro Met Leu Val Thr Glu Tyr Ser Thr Gln Ala

245 250 255

His Arg Tyr Met Ser Thr Cys Lys Tyr Pro Ile Glu Asn Ala Gln Ala

260 265 270

Val Arg Ser Gln Asn Ser Met Leu Met Gln Phe Met Glu Arg Thr Asp

275 280 285

Asn Ile Cys Tyr Ala Met Pro Phe Ala Met Leu Lys Ser Glu Trp Gly

290 295 300

Tyr Ser Arg Thr Val Phe Met Lys Asn Thr Ser Val Ile His Phe Arg

305 310 315 320

Pro Thr Ser Tyr Asn Asp Glu Lys Val Thr Thr Trp Arg Leu Asn Asp

325 330 335

Lys Ala Lys Phe Tyr Gln Leu Trp Ala Thr Gly Ser Val Asn Pro Ala

340 345 350

Thr Val Val Lys Gly Ala Thr Thr Gln Leu Val Ile Gly Ile Phe Thr

355 360 365

Asn Ser Phe Thr Trp Thr Ser Asn Gln Glu Ala Thr Val Asp Gly Leu

370 375 380

Leu Ser Val Gln Gly Leu Ala Ile Gly Lys Ala Val Lys Val Ile Ser

385 390 395 400

Glu Gly Ser Glu Phe Ile Ile Glu Ala Glu Asn Phe Asn Ala Val Gly

405 410 415

Gly Thr Ala Thr Ser Arg Val Arg Lys Asp Val Leu Gly Phe Asn Trp

420 425 430

Ser Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Asn Thr Leu Ala Asp Tyr Thr Asp Tyr

435 440 445

Gln Ile Asn Val Pro Thr Ala Gly Asn Tyr Asn Val Ser Ala Phe Ala

450 455 460

Ala Thr Pro Glu Val Gly Gly Gln Val Glu Leu Ser Val Lys Asn Gly

465 470 475 480

Tyr Val Gly Lys Lys Ala Val Pro Ala Gly His Trp Trp Glu Thr Tyr

485 490 495

Glu Asn Gln Asn Gly Gly Ser Val Tyr Leu Ser Pro Gly Asn Tyr Asn

500 505 510

Phe Arg Val Gln Ser Ala Gly Gly Phe Met Trp Gln Trp Asn Leu Asp

515 520 525

Ser Ile Ser Phe Thr Pro Asn Phe Ser Ile Pro Asn Val Glu Thr Asn

530 535 540

Lys Asp Ala Asp Val Gly Glu Gly Ile Leu Arg Val Val Val Gly Arg

545 550 555 560

Lys His Asp Met Ser Lys Lys Pro Thr Leu Thr Met Asn Gly Thr Gln

565 570 575

Val Gly Val Pro Asn Asn Trp Met Gly Gly Asp Gln Ala Ala Arg Ala

580 585 590

Gln Tyr Phe Gly Met Leu Glu Ile Pro Val Pro Asp Asp Leu Leu Ser

595 600 605

Thr Asn Asn Thr Val Asp Val Asp Phe Lys His Phe Pro Val Thr Tyr

610 615 620

Thr Thr Val Ser Leu Gln Val

625 630

<210> 2

<211> 1896

<212> DNA

<213> Flammeovirga pacifica WPAGA1

<400> 2

atgcgagaca aatatctaca ggcgcatgtt tcacctactg agaactattg ggattggcgg 60

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ggagagttca tggcgcacta catcaaggag tttgatgaga tagtgaaaaa ctatgtgcca 360

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gtatggtcga cggcacgtgg tgatatgaag gttggaggtt actgcacgaa ttttccggac 540

tttgaaaatc caaagttcgg tcgttggaat gctcgatgga agcagtttat cgacattgca 600

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cagtttcgtt ctcgaatcga ggctacgttt gacatgatgg agcagtactc tcaagtacgt 720

tttggtaaaa tcacaccgat gctggttact gagtattcta cacaggcaca tcgatatatg 780

tcgacttgca agtaccctat agaaaatgct caagcggtgc gatcacagaa ttctatgctt 840

atgcagttta tggagcgaac tgacaacatt tgttatgcaa tgccgtttgc gatgctgaaa 900

tcagaatggg gatactctcg tactgtgttc atgaagaaca catcagtgat tcattttcgt 960

ccaacttctt acaacgatga aaaagtaact acatggcggc tgaatgacaa ggcgaagttc 1020

taccagcttt gggcaacagg ttctgttaat ccagcaactg tggttaaagg agctactact 1080

cagctagtga tcgggatatt tacgaactca tttacttgga cttcgaatca ggaggctaca 1140

gtagacggtc tgctttctgt tcaaggtctt gcgatcggaa aagcagttaa agttatctca 1200

gagggttcag agtttattat agaggcggaa aatttcaacg cggttggtgg aactgcgacg 1260

tctcgagttc gtaaagacgt tctggggttt aattggtcag gagacaatat aaactataat 1320

actcttgctg actatacaga ctatcagatt aatgtaccta cggcgggaaa ttacaacgta 1380

tctgcttttg ctgcaacacc tgaggtgggg ggacaggtag aactttctgt gaaaaatggt 1440

tatgtgggaa agaaggctgt tccagctggg cactggtggg agacatacga aaatcaaaat 1500

gggggttctg tatacctttc tccgggtaac tataatttcc gtgtacagtc agctggtgga 1560

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Claims

1.一种琼胶酶，其特征在于，所述琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因用于编码权利要求1所述的琼胶酶。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:2。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2或3所述的编码基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2或3所述的编码基因或权利要求4所述的重组载体。

6.权利要求1所述的琼胶酶在生产新琼寡糖中的应用。

7.一种新琼寡糖的制备方法，其特征在于，该方法采用权利要求1所述琼胶酶酶解琼胶底物。

8.根据权利要求7所述新琼寡糖的制备方法，其特征在于，所述琼胶底物的浓度为0.8-1.5％；所述琼胶酶的添加量为0.5-1‰v/v。

9.根据权利要求7所述新琼寡糖的制备方法，其特征在于，所述酶解的条件包括温度为40-55℃，时间为3-6h。

10.由权利要求7-9中任意一项所述的方法制备得到的新琼寡糖。