CN111500555B

CN111500555B - 壳聚糖酶OUC-CsnCA及其应用

Info

Publication number: CN111500555B
Application number: CN202010491043.XA
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 孙建安; 苏海鹏
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-06-02
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-06-02
Also published as: CN111500555A

Abstract

本发明公开了一种壳聚糖酶OUC‑CsnCA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了编码该壳聚糖酶OUC‑CsnCA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述壳聚糖酶OUC‑CsnCA在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用，在制备降解壳聚糖的酶制剂中的应用。本发明的壳聚糖酶OUC‑CsnCA，用于降解壳聚糖产生壳寡糖，其最适pH为8.0，最适反应温度为55℃，比酶活为1786.227U/mg；酶活和产酶水平高，纯化后蛋白浓度为1.284mg/ml,相较于已报道的壳聚糖酶具有一定的优势。本发明的壳聚糖酶OUC‑CsnCA具有重要的工业应用价值及经济价值。

Description

壳聚糖酶OUC-CsnCA及其应用

技术领域

本发明涉及一种高表达量的壳聚糖酶OUC-CsnCA，及其在降解壳聚糖、制备壳寡糖中的应用,属于功能酶技术领域。

背景技术

壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)作为专一性水解酶是水解壳聚糖生成寡糖产物的关键酶，可特异性地作用于糖苷键，并使其断裂，从而成为分子量较低的壳寡糖。壳寡糖在提高免疫能力、抑制肿瘤细胞生长、降低胆固醇和抗氧化等方面具有较强活性,在功能食品、医药、化妆品及农作物生物制剂领域具有独特而重要的应用。

目前主要采用化学法、物理法和酶解法制备壳寡糖。化学法是工业化生产中应用最早、最常用的方法，包括酸解法和氧化降解法；酸解法一般采用HCl、HNO₂等使壳聚糖主链上的β-1,4糖苷键断裂，氧化降解法采用的是HNO₂、H₂O₂、过硼酸钠等试剂将壳聚糖的β-1,4糖苷键氧化断裂。物理降解法主要有微波法。化学法和物理法都对壳聚糖的降解起到一定的作用，但是存在反应剧烈、产物分子量不易控制，单糖及高分子量的壳聚糖占比例较大等缺陷。相对于化学法，壳聚糖酶可以特异性地、选择性地切断壳聚糖链上的β-1,4糖苷键，降解过程容易控制，产物寡糖含量高，并且不会引起结构的破坏，功能性更好；且酶法降解是在较温和的条件下进行的，降解过程不需要加入大量的反应试剂，产物不仅安全性高，并且不易造成环境污染，目前酶解法已成为工业生产壳寡糖的主要手段。但是现有的壳聚糖酶普遍存在活力较低、表达水平低、使用成本高等问题，难以用于工业化生产，如公开号为CN101397552A的中国发明专利中的重组壳聚糖酶的表达量为0.5mg/ml，比酶活只能达到700U/mg，再如公开号为CN 107586768A的中国发明专利申请中的壳聚糖酶摇瓶发酵产生的粗酶液的蛋白含量仅能达到0.77mg/ml。因此，需要活性和表达量更高的壳聚糖酶。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种壳聚糖酶OUC-CsnCA，其能高效、专一地降解壳聚糖产生小分子的壳寡糖，具有活性高、表达量高的优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

壳聚糖酶OUC-CsnCA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MMLSGLGLLAGACNAQGSAAGSSARHAARAEACSAGPHCTVAAARTAANPDDNFSPATLKFLKANTGLDGEQWNNIMKLINKPEQDSLDWTKFYGYCEDIGDKRGYTIGIFGATTGGPNDEGPDGPTLFKEFDAASGAANPSIEGGLSRIGAHGKMQGSILKISDSSKVFCGKIGGLQANAAWRQAMWNTFYKVYIQYSVSQARQRGFNSALTIGSFVDTALNQGAAGDSGTLQGLLSRSGNSADEKTFMTTFYAQRSKIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSTLLNMGETDLKNADAAVAKVTDWEMK。

一种编码上述壳聚糖酶OUC-CsnCA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

所述壳聚糖酶OUC-CsnCA在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用，在制备降解壳聚糖的酶制剂中的应用。

一种酶制剂，包含有上述壳聚糖酶OUC-CsnCA。该酶制剂在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。

一种降解壳聚糖的方法：采用上述壳聚糖酶OUC-CsnCA降解壳聚糖，优选的降解条件为：pH8.0，反应温度55℃。

一种重组工程菌，其基因组中插入有上述编码壳聚糖酶OUC-CsnCA的基因，能表达壳聚糖酶OUC-CsnCA。该重组工程菌在制备壳聚糖酶OUC-CsnCA中的应用。

本发明的壳聚糖酶OUC-CsnCA，用于降解壳聚糖产生壳寡糖，其最适pH为8.0，最适反应温度为55℃，比酶活为1786.227U/mg；用于水解10％的高浓度胶体壳聚糖，壳寡糖得率>80％,水解时间仅需4小时；酶活和产酶水平高，纯化后蛋白浓度为1.284mg/ml,相较于已报道的壳聚糖酶具有一定的优势。本发明的壳聚糖酶OUC-CsnCA具有重要的工业应用价值及经济价值。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：本发明的壳聚糖酶纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker，泳道1为粗酶蛋白，泳道2为纯化后的壳聚糖酶蛋白。

图2：本发明的壳聚糖酶最适pH示意图。

图3：本发明的壳聚糖酶最适温度示意图。

图4：本发明克隆壳聚糖酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为DNAMarker，泳道1为PCR扩增产物。

图5：本发明的壳聚糖酶水解壳聚糖产物薄层层析分析结果示意图，其中，Std为标准品，由壳一糖、壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖、壳六糖组成。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：壳聚糖酶基因的克隆

本发明的发明人通过基因组数据库挖掘的方法分析了一些基因组序列，候选了一批在一些生物信息学上被预测为壳聚糖酶或假定壳聚糖酶基因序列。所述的挖掘方法具体为：以来自Paenibacillus dendritiformis的壳聚糖酶Csn-PD的氨基酸序列为模板探针，在NCBI数据库中进行BLAST搜索，筛选出与壳聚糖酶Csn-PD同源性在30％-80％的壳聚糖酶或假定壳聚糖酶序列。

依据上述方法从数据库中筛选出一个来自Chromobacteriumsp.ATCC 53434的候选基因，根据Genbank数据库中已提交的该菌的序列信息，以其中编码壳聚糖酶的目的基因序列为模板序列，经密码子优化后，进行全基因合成。

设计上游引物CA-F和下游引物CA-R，以合成基因为模板，进行PCR扩增。

上游引物CA-F：5’-GCAAATGGGTCGCGGATCCATGATGCTGAGTGGCCT G-3’，如SEQ IDNO.3所示；

下游引物CA-R：5’-CGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTTCATTTCCCAATCGGTAAC-3，如SEQ IDNO.4所示。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KOD FxDNA聚合酶1μl，加无菌水至终体积为50μl。PCR的反应条件为：94℃预变性10min，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸65s，变性、退火、延伸三步进行三十个循环，循环结束后68℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳表明在900bp位置附近有明显的单一条带，如图4所示，回收PCR目的基因片段。

实施例2：含壳聚糖酶基因的表达载体构建

将回收获得的目的基因和质粒pET-28a(+)进行无缝连接反应。

连接结束后，采用热激发转化，将连接好的体系，转化入DH5α感受态细胞中，使用含卡那霉素抗性的LB平板进行阳性转化子筛选，将克隆子使用T7通用引物进行PCR验证，琼脂糖凝胶电泳表明在接近1000bp位置有条带，再将其菌液进行测序比对，结果一致性为100％，说明重组子构建成功。

实施例3：重组壳聚糖酶的表达及纯化

将构建好的重组质粒转入BL21表达菌株中表达，使用含卡那霉素抗性的LB平板进行筛选，将阳性转化子活化后按1％的接种量加入到ZYP-5052培养基中，在20℃、220rpm震荡培养48h，诱导表达壳聚糖酶,壳聚糖酶命名为OUC-CsnCA。在8000rpm、4℃下离心20min，收集菌体，向菌体沉淀中加入10mL50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液，超声破碎30min。在8000rpm、4℃下离心20min，取上清即为粗酶液，测定上清液酶活。

用镍柱对重组表达壳聚糖酶进行纯化，使用10mM咪唑溶液(500mM NaCl，50mMTris-HCl)平衡柱子，上样后依次用20mM、40mM、80mM、100mM、150mM、200mM、500mM洗脱蛋白并收集，使用考马斯亮蓝G250溶液检测蛋白，得到纯化的重组壳聚糖酶溶液。经SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，结果如图1所示，重组蛋白表达量较高，约在34kDa处有清晰条带。

实施例4：重组壳聚糖酶OUC-CsnCA的酶活测定

将实施例3中制备得到的纯化后的重组壳聚糖酶采用DNS法进行酶活测定。

反应体系：0.01mL酶液，0.19mL底物，0.8mL pH8.0 Tris-HCl缓冲液，50℃反应10min。反应结束后取200μl反应液加入300μl DNS溶液，煮沸10min，冷却后8000rpm离心5min，取200μl上清液加入1mL水稀释，取200μl稀释后的溶液测定OD₅₄₀。利用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，结果见表1。

表1壳聚糖酶酶活测定结果

实施例5：重组壳聚糖酶OUC-CsnCA的酶学性质及水解产物分析

取等量的酶液在55℃下，分别选用pH为3.0-10.0的缓冲液作为酶促反应的不同pH环境，与等量底物反应15min，采用DNS法进行酶活测定，确定壳聚糖酶的最适pH。取等量的酶液，与等量底物在pH为8.0的缓冲液环境下，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应15min，采用DNS法进行酶活测定，确定壳聚糖酶的最适温度。根据壳聚糖酶的酶活，确定该酶的最适pH为8.0，最适温度为55℃，如图2、图3。

采用TLC薄层层析法确定壳聚糖酶水解壳聚糖的产物。使用壳寡糖混合物(1-6糖，分子量≤1000)作为标准品，将0.1mL底物与0.01mL酶液置于50℃摇床中，分别反应30min、1h、4h、8h、12h、24h，其中反应时间超过3h的体系每隔3h补加0.01mL酶液，以保证反应的持续进行。毛细管点样于硅胶板，于展开液中展开，展开结束后吹干，并用茚三酮乙醇溶液进行染色，110℃下显色5min，结果如图5。该酶水解壳聚糖得到的最终产物为单糖-壳六糖，主要产物为单糖-三糖。

实施例6：重组壳聚糖酶OUC-CsnCA在制备壳寡糖中的应用

(1)壳聚糖预处理

10％浓度的壳聚糖用3％浓度的醋酸溶液溶解，超声并搅拌至观察到无壳聚糖粉末后放置过夜。

(2)酶解胶体壳聚糖

水解壳聚糖反应条件参照酶的最适反应条件：pH8.0，温度：55℃，底物90％脱乙酰度的壳聚糖，加酶量0.5U/ml,水解时间4h,搅拌速度150rpm。

(3)壳寡糖处理

经离心过滤后，对上清进行喷雾干燥处理即得到壳寡糖制品。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 壳聚糖酶OUC-CsnCA及其应用

<141> 2020-06-02

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 306

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Met Leu Ser Gly Leu Gly Leu Leu Ala Gly Ala Cys Asn Ala Gln

1 5 10 15

Gly Ser Ala Ala Gly Ser Ser Ala Arg His Ala Ala Arg Ala Glu Ala

20 25 30

Cys Ser Ala Gly Pro His Cys Thr Val Ala Ala Ala Arg Thr Ala Ala

35 40 45

Asn Pro Asp Asp Asn Phe Ser Pro Ala Thr Leu Lys Phe Leu Lys Ala

50 55 60

Asn Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gln Trp Asn Asn Ile Met Lys Leu Ile

65 70 75 80

Asn Lys Pro Glu Gln Asp Ser Leu Asp Trp Thr Lys Phe Tyr Gly Tyr

85 90 95

Cys Glu Asp Ile Gly Asp Lys Arg Gly Tyr Thr Ile Gly Ile Phe Gly

100 105 110

Ala Thr Thr Gly Gly Pro Asn Asp Glu Gly Pro Asp Gly Pro Thr Leu

115 120 125

Phe Lys Glu Phe Asp Ala Ala Ser Gly Ala Ala Asn Pro Ser Ile Glu

130 135 140

Gly Gly Leu Ser Arg Ile Gly Ala His Gly Lys Met Gln Gly Ser Ile

145 150 155 160

Leu Lys Ile Ser Asp Ser Ser Lys Val Phe Cys Gly Lys Ile Gly Gly

165 170 175

Leu Gln Ala Asn Ala Ala Trp Arg Gln Ala Met Trp Asn Thr Phe Tyr

180 185 190

Lys Val Tyr Ile Gln Tyr Ser Val Ser Gln Ala Arg Gln Arg Gly Phe

195 200 205

Asn Ser Ala Leu Thr Ile Gly Ser Phe Val Asp Thr Ala Leu Asn Gln

210 215 220

Gly Ala Ala Gly Asp Ser Gly Thr Leu Gln Gly Leu Leu Ser Arg Ser

225 230 235 240

Gly Asn Ser Ala Asp Glu Lys Thr Phe Met Thr Thr Phe Tyr Ala Gln

245 250 255

Arg Ser Lys Ile Val Asp Thr Asn Asp Tyr Asn Gln Pro Pro Asn Gly

260 265 270

Lys Asn Arg Val Lys Gln Trp Ser Thr Leu Leu Asn Met Gly Glu Thr

275 280 285

Asp Leu Lys Asn Ala Asp Ala Ala Val Ala Lys Val Thr Asp Trp Glu

290 295 300

Met Lys

305

<210> 2

<211> 918

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgatgctga gtggcctggg tctgctggca ggcgcctgca atgcacaggg tagcgcagca 60

ggtagcagcg cccgtcatgc agcccgtgcc gaagcatgca gcgcaggccc tcattgtacc 120

gttgccgccg cacgtaccgc agcaaatccg gatgataatt ttagcccggc caccctgaaa 180

tttctgaaag caaataccgg cctggatggc gaacagtgga ataatattat gaaactgatc 240

aacaagccgg aacaggatag tctggattgg accaaatttt atggttattg tgaagatatc 300

ggcgataaac gtggctatac cattggcatt tttggtgcca ccaccggcgg cccgaatgat 360

gaaggtccgg atggtccgac cctgtttaaa gaatttgatg ccgccagcgg cgcagcaaat 420

cctagcattg aaggcggtct gagccgtatt ggtgcccacg gtaaaatgca gggcagtatt 480

ctgaaaatta gcgatagcag taaagtgttt tgcggtaaaa ttggcggtct gcaggccaat 540

gcagcatggc gtcaggccat gtggaatacc ttttataaag tgtatatcca gtacagcgtt 600

agccaggcac gtcagcgtgg ttttaatagt gccctgacca ttggcagttt tgtggatacc 660

gccctgaatc agggtgccgc aggcgatagt ggcaccctgc agggtctgct gagccgcagc 720

ggcaatagcg cagatgaaaa aacctttatg accacctttt atgcacagcg cagcaaaatt 780

gttgatacca atgattataa ccagccgccg aatggcaaaa atcgtgtgaa acagtggagc 840

accctgctga atatgggcga aaccgatctg aaaaatgccg atgccgcagt tgccaaagtt 900

accgattggg aaatgaaa 918

Claims

1.一种降解壳聚糖获得单糖-三糖的方法，其特征在于：采用SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶OUC-CsnCA降解壳聚糖，降解条件为：pH 8.0，反应温度55℃，时间4小时以内。