CN108330119B

CN108330119B - 一种壳聚糖酶及其在壳寡糖制备中的应用

Info

Publication number: CN108330119B
Application number: CN201810370251.7A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 郭娜; 孙建安; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2038-04-23
Also published as: CN108330119A

Abstract

本发明提供一种壳聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。此酶具有良好的热稳定性，最适反应温度和pH分别为50℃、8.0，比酶活达330U/mg。该壳聚糖酶属内切、外切混合型，其最小能降解的底物是壳二糖，并且能将壳聚糖水解成葡萄糖胺、壳二糖。有望将本发明壳聚糖酶用于壳寡糖的生产，具有实际应用价值。

Description

一种壳聚糖酶及其在壳寡糖制备中的应用

技术领域

本发明属于功能基因克隆表达技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶及其在壳寡糖制备中的应用。

背景技术

壳寡糖是壳聚糖经水解后聚合度小于20，分子量小于3900的寡糖，是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GLcNAc)和D-氨基葡萄糖(GLcN)通过β-l,4-糖苷键连接而成。由于更低的分子量、更好的溶解性使得壳寡糖相较壳聚糖有着更为广泛的应用。此外，壳寡糖还具备抗肿瘤、降血压、增强免疫力等独特的药理功能活性，Jonge等人报道壳寡糖具有抑制植物病原菌的生长，诱导高等植物体内产生相关抗体等功能；Park等人发现壳寡糖对动物肿瘤细胞也有抑制效果，这使得壳寡糖在医药、保健品、食品、养殖等领域有了更大的应用价值。

壳聚糖能被多类酶水解。包括非专一性酶类：脂肪酶、蛋白酶、碳水化合物分解酶等，能将壳聚糖水解成聚合度低的壳寡糖。但是非专一性酶类水解到一定程度时，加大酶量也难以提高水解程度，而且水解产物较复杂、难以分离。

而使用壳聚糖酶(EC：3.2.1.132)水解壳聚糖来制备寡糖的方法具有反应条件温和、反应过程容易控制等优点，且产物纯度较高，利用基因工程构建高产壳聚糖酶的工程菌是工业化制备壳寡糖的有效途径。

发明内容

本发明目的在于克服了传统化学法水解壳聚糖的特异性低、设备要求高、污染环境、产品质量差等优点现有技术中的不足，提供了一种壳聚糖酶及其在壳寡糖制备中的应用，使用该壳聚糖酶降解大分子量的壳聚糖而制备小分子量的壳寡糖。

本发明所提供的壳聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

用于编码本发明的壳聚糖酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供一种表达载体，用于表达上述的壳聚糖酶；

本发明的壳聚糖酶用于降解壳聚糖；

本发明提供一种制备壳二糖的方法，用本发明的壳聚糖酶制备壳二糖，最适反应pH和温度分别为pH8.0、50℃，反应时间为2h。

本发明的壳聚糖酶能降解壳聚糖，该酶的酶活高，且有较好的温度稳定性，此外，相较于已报道的壳聚糖酶，可高效的降解壳聚糖来制备壳二糖。

附图说明

图1：本发明的壳聚糖酶纯化后的纯酶SDS-PAGE电泳图，M为标准蛋白Marker；1为粗酶蛋白；2为纯化后的壳聚糖酶蛋白，

图2：本发明的壳聚糖酶，温度变化对相对酶活的影响，

图3：本发明的壳聚糖酶，pH变化对相对酶活的影响，

图4：本发明的壳聚糖酶，酶解产物的质谱图。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明的方法做进一步的说明。

实施例1产壳聚糖酶基因片段的克隆

申请人通过分子生物学软件分析白长链霉菌Streptomyces albolongus基因组，发现其中存在新型的壳聚糖酶基因，通过克隆该基因，从而促成了本发明。

以白长链霉菌Streptomyces albolongus基因组为模板，在壳聚糖酶基因的上、下游设计分别含有BamHI和HindIII限制性酶切位点的上游引物Csn-F 5'-CGCGGATCCATGGGCGCCGGCCGGGCC-3'和下游引物Csn-R 5'-CCCAAGCTTGTCGTACGGGTAGTGACG-3'，进行PCR扩增Csn基因片段。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 5μl，引物各1μl，模板(白长链霉菌全基因组DNA)1μl，KOD Fx DNA聚合酶(TOYOBO，KFX-101)1μl，加无菌水至终体积为50μl。PCR的反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸60s，反应30个循环，68℃后延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳表明在800bp位置有明显的单一条带，回收PCR目的基因片段，对目的片段进行测序，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，blast结果表明该酶是糖苷水解酶类46家族的新成员，与已报道的壳聚糖酶相比，最高序列相似性仅为79％。

实施例2含壳聚糖酶基因的表达载体构建

回收PCR目的基因片段。分别往目的基因和质粒pET-28a中加入BamHI酶和HindIII酶，进行双酶切。电泳跑胶回收酶切质粒，试剂盒(Omega)纯化目的基因。将纯化得到的目的基因片段与回收到的质粒进行连接反应。

连接结束后，采用热激法转化，将连接好的体系，转入至DH5α感受态细胞中。使用含氨苄青霉素抗性的LB平板进行阳性转化子筛选，将克隆子使用T7通用引物进行PCR验证，条带显示大小介于800～1000bp之间，再将其菌液送测序比对，测序比对结果一致性为100％，证明壳聚糖酶基因序列已全部克隆至表达载体中，即为阳性克隆子，将此重组质粒命名为pETC。

实施例3含壳聚糖酶基因的重组质粒的表达及工程菌的构建

提取测序正确的阳性克隆子中的重组质粒，并转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中(转化过程省去菌液浓缩操作)，具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子即为克隆成功的目的工程菌。

将产壳聚糖酶工程菌株接种至5mL含抗性的LB培养基(100μg/mL氨苄青霉素抗性)中，37℃，180rpm过夜培养12h，将菌种进行活化。菌液活化好后，按1％接种量加入到ZYP-5052培养基(100μg/mL氨苄青霉素抗性)，20℃，220rpm低温培养48h，诱导表达壳聚糖酶。

壳聚糖酶表达之后，8000rpm，20min，4℃下离心，收集菌体沉淀。菌体沉淀中加入50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液，超声破碎。8000rpm，离心20min取上清，即为粗酶液。粗酶使用Ni²⁺柱进行亲和层析纯化，使用10mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)平衡柱子，然后用40mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱结合力弱的杂蛋白，有酶活的蛋白组份则用80mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱出来，并收集。使用考马斯亮蓝G-250溶液检测蛋白，收集的洗脱液用SDS-PAGE检测蛋白纯度(如图1)，使用Bradford法测定蛋白浓度。

实施例4测定壳聚糖酶的最适反应条件

壳聚糖酶酶活测定使用DNS显色法。

反应体系：0.25mL底物，0.01mL酶液，0.25mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。50℃反应15min。反应结束后，沸水浴10min，5000rpm离心5min，取200μL上清与300μL DNS反应，测定OD₅₄₀。

取等量的酶液在50℃下，分别选用pH为3.0-10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，根据壳聚糖酶的酶活力，确定壳聚糖酶的最适pH。取等量的酶液在缓冲液pH为8.0时，选用30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃作为酶反应的温度，根据壳聚糖酶的酶活力，确定该酶的最适温度为50℃，最适pH为8.0，如图2、图3。

实施例5利用壳聚糖酶制备壳寡糖

利用实施例3中制备得到的壳聚糖酶水解壳聚糖制备壳寡糖。将壳聚糖溶于1％的醋酸溶液中，配制成20g/L的壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液与pH8.0的Tris-HCl盐酸混合，配制成0.2％的溶液。按重量比10:1加入壳聚糖酶，混合均匀后，在50℃下温浴6h。5000rpm离心5min取上清液冻干，即为氨基葡萄糖和壳二糖。利用质谱进行产物鉴定，如图4。本发明的壳聚糖酶能水解壳聚糖产生氨基葡萄糖和壳二糖，其他聚合度壳寡糖非常少，产物纯度较高。本发明的壳聚糖酶的最适反应温度为50℃，最适pH为8.0，反应条件温和，易控制好操作，对环境污染少，这些优点使得本发明制备得到的壳聚糖酶具有生产壳寡糖的工业化应用价值。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种壳聚糖酶及其在壳寡糖制备中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Val Val Arg Arg Arg Thr Ala Ile Thr Gly Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ala Val Ser Leu Ser Leu Val Gly Gly Thr Ser Ala Gln Ala Ala Gly

20 25 30

Ala Gly Leu Asp Asp Pro Ala Lys Lys Glu Ile Ala Met Lys Leu Val

35 40 45

Ser Ser Ala Glu Asn Ser Ser Leu Asp Trp Lys Ala Gln Tyr Lys Tyr

50 55 60

Ile Glu Asp Ile Lys Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Ala Gly Ile Ile Gly

65 70 75 80

Phe Cys Ser Gly Thr Gly Asp Met Leu Asp Leu Val Glu His Tyr Thr

85 90 95

Asp Leu Lys Pro Gly Asn Ile Leu Ala Lys Tyr Leu Pro Ala Leu Arg

100 105 110

Lys Val Asn Gly Thr Glu Ser His Ser Gly Leu Gly Ser Ala Phe Glu

115 120 125

Arg Asp Trp Ala Thr Ala Ala Lys Asp Ser Val Phe Gln Gln Ala Gln

130 135 140

Asn Asp Glu Arg Asp Arg Val Tyr Phe Asn Pro Ala Val Lys Gln Ala

145 150 155 160

Lys Ser Asp Gly Leu Arg Ala Leu Gly Gln Phe Ala Tyr Tyr Asp Ala

165 170 175

Ile Val Met His Gly Asn Gly Gly Asp Ser Thr Ser Phe Ser Asn Ile

180 185 190

Arg Lys Arg Ala Leu Ala Lys Ala Lys Thr Pro Ala Gln Gly Gly Asp

195 200 205

Glu Thr Thr Tyr Leu Asn Ala Phe Leu Asp Ala Arg Val Trp Ala Met

210 215 220

Gln Gln Glu Glu Ala His Ser Asp Thr Ser Arg Val Asp Thr Ala Gln

225 230 235 240

Arg Val Phe Leu Lys Ala Lys Asn Phe Asp Leu Asn Pro Pro Leu Lys

245 250 255

Trp Lys Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ile Asn Ser

260 265

<210> 2

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcctgtcg tgcgccgtcg taccgcgatc accggcctcc tcgccgccgc cgtctccctc 60

tccctggtgg gcggtacctc cgcccaggcc gccggggccg ggctggacga cccggcgaag 120

aaggagatcg cgatgaagct ggtctccagc gccgagaact cctcgctgga ctggaaggcc 180

cagtacaagt acatcgagga catcaaggac ggccggggct acaccgccgg gatcatcggt 240

ttctgttccg gcaccggcga catgctcgac ctggtcgagc actacaccga cctcaagccc 300

ggcaacatcc tggccaagta cctcccggcc ctgcgcaagg tgaacggcac cgagtcgcac 360

tccggcctcg gctccgcctt cgagcgggac tgggccaccg cggccaagga ctcggtcttc 420

cagcaggccc agaacgacga gcgcgaccgc gtctacttca acccggcggt caagcaggcc 480

aagtccgacg gcctgcgcgc gctcggccag ttcgcgtact acgacgccat cgtgatgcac 540

ggcaacggcg gcgactccac cagcttctcc aacatccgca agcgcgccct cgccaaggcc 600

aagaccccgg cccagggcgg cgacgagacc acctacctga acgccttcct ggacgcccgg 660

gtctgggcga tgcagcagga ggaggcgcac agcgacacca gccgggtgga caccgcccag 720

cgggtcttcc tcaaggccaa gaacttcgac ctgaacccgc cgctgaagtg gaaggtctac 780

ggcgacagct tcagcatcaa cagc 804

Claims

1.一种壳聚糖酶，其特征在于，所述的壳聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的壳聚糖酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的壳聚糖酶。

5.权利要求1所述的壳聚糖酶在降解壳聚糖制备壳二糖中的应用。

6.一种制备壳二糖的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的壳聚糖酶来降解壳聚糖制备壳二糖。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，降解壳聚糖时的pH和温度分别为pH8.0、50℃，反应时间为2h。