CN111235131B

CN111235131B - 一种壳聚糖酶及其应用

Info

Publication number: CN111235131B
Application number: CN202010045525.2A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 孙建安; 苏海鹏; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111235131A

Abstract

本发明公开了一种壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码该壳聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的壳聚糖酶，来源于糖苷水解酶的GH5家族，能够降解壳聚糖产生GlcN‑(GlcN)₄，可以用于制备新组分的酶解COS混合物。本发明的壳聚糖酶，具有良好的生物催化活性，能水解壳聚糖产生氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖和壳四糖，产物纯度较高；在pH 10和50℃时其相对酶活为898.6U/mg，高于其它已知的大部分壳聚糖酶，可高效降解壳聚糖，反应条件温和，易控制，效率高，环境友好，具有生产新型酶解壳寡糖混合物的工业化应用价值。

Description

一种壳聚糖酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖酶及其应用，具体涉及一种能够降解壳聚糖生成GlcN-(GlcN)₄的壳聚糖酶及其在制备壳寡糖中的应用，属于功能基因发掘克隆表征技术领域。

背景技术

壳聚糖是由甲壳素完全或部分脱乙酰而来，由D-氨基葡萄糖(GlcN，D)和N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺(GlcNAc，A)通过β-1，4糖苷键无规连接而成。虽然壳聚糖具有独特而优异的聚合物结构多样性，但其高分子量和低生物利用度极大地限制了其应用。然而，壳聚糖的降解产物壳寡糖(COS)由于其优越的溶解性和生物学功能，广泛应用于食品工业、医药、农业以及化妆品行业中。

壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)是专一性降解壳聚糖生成COS的水解酶，根据氨基酸序列的相似性，可将糖苷键水解酶(GH)分为6个家族:GH5、GH7、GH8、GH46、GH75、GH80。目前GH5家族中只对一个壳聚糖酶进行了研究。不同聚合度的壳寡糖组成的COS混合物展现了独特的生理作用。因此，在确定壳寡糖的生物学效应时有必要研究不同聚合度组成COS混合物的生理功能。

目前，壳聚糖酶的降解产物大多是(GlcN)₂-(GlcN)₄和(GlcN)₂-(GlcN)₆，也有产物是少见的GlcN-(GlcN)₅和GlcN-(GlcN)₃，但还没有能够降解产生GlcN-(GlcN)₄的壳聚糖酶。因此，挖掘出一种能够生成GlcN-(GlcN)₄的壳聚糖酶具有重要的应用价值。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种能够降解壳聚糖生成GlcN-(GlcN)₄的壳聚糖酶，其在制备壳寡糖中有着重要的应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种能够降解壳聚糖生成GlcN-(GlcN)₄的壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MHQRPTPPTSPTEPTAAPTTGRRRFTRKALLAASALGVVTALLTPVQAGAAPAPAEPATARAATPLAANGQLRVCGLQLCNASGQAIALNGMSTHGTQWYAQCVTDGSLNALAQDWRADVLRVSTYVQEGGYETDPAGFTARAQKFIDAAHARGMYAVIDWHMLTPGDPNANLDRAKTFFTAMAKRYKDHPGVLYEIANEPSGVSWSAIKSYSEQIIPVIRAQDPDAVVLVGTRAWSSFGVSEGSNESEVVNNPVRASNIMYTFHFYAASHREAYLATLDRASDRLPVFVTEFGTQNYAGEGANDFAMSQRYLDLMKRKKISWTNWNYSDDHRSGAVFKTGTCSGTNWTGTGVLKEAGVWIRERIRQ。

一种编码上述壳聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

5’-ATGCACCAGCGCCCCACTCCCCCCACGTCCCCCACCGAACCCACGGCCGCCCCCACGACCGGCCGGCGCCGCTTCACCCGTAAGGCCCTGCTCGCCGCTTCCGCGCTCGGCGTGGTCACCGCGCTCCTGACCCCCGTCCAGGCCGGAGCCGCCCCCGCTCCCGCCGAGCCCGCCACGGCCAGGGCCGCCACCCCGCTCGCGGCCAACGGCCAGCTCCGCGTCTGCGGTCTCCAGCTCTGTAACGCCTCGGGCCAGGCGATCGCCCTCAACGGCATGAGCACCCACGGCACCCAGTGGTACGCCCAGTGCGTCACCGACGGGTCCCTGAACGCCCTCGCCCAGGACTGGCGCGCCGACGTGCTGCGTGTCTCCACCTACGTACAGGAGGGAGGGTACGAGACCGACCCGGCCGGATTCACCGCGCGGGCGCAGAAGTTCATCGACGCGGCGCACGCGCGCGGGATGTACGCGGTCATCGACTGGCACATGCTCACGCCGGGCGATCCGAACGCCAACCTCGACCGGGCGAAGACGTTCTTCACCGCGATGGCGAAGAGGTACAAGGACCACCCGGGCGTGCTCTACGAGATCGCCAACGAGCCCTCGGGGGTGAGCTGGTCGGCCATCAAGTCCTACTCCGAGCAGATCATCCCGGTGATCCGGGCGCAGGACCCGGACGCGGTGGTCCTGGTCGGGACGCGGGCCTGGTCCTCGTTCGGGGTGTCGGAGGGATCGAACGAGTCCGAGGTCGTCAACAACCCGGTCCGCGCCTCGAACATCATGTACACCTTCCACTTCTACGCGGCCTCGCACCGCGAGGCGTATCTCGCGACGCTGGACCGGGCCTCGGACCGGCTCCCCGTCTTCGTCACCGAGTTCGGGACGCAGAACTACGCGGGCGAGGGCGCCAACGACTTCGCGATGTCGCAGCGTTACCTCGACCTGATGAAGCGCAAGAAGATCTCCTGGACCAACTGGAACTACTCCGACGACCACCGCTCCGGTGCCGTCTTCAAGACCGGCACGTGCAGCGGCACCAACTGGACCGGGACCGGGGTCCTGAAGGAGGCCGGGGTCTGGATCCGCGAGCGCATCCGCCAGTGA-3’。

本发明的壳聚糖酶，来源于糖苷水解酶的GH5家族，能够降解壳聚糖产生GlcN-(GlcN)₄，可以用于制备新组分的酶解COS混合物，用于下一步研究。

本发明的壳聚糖酶，具有良好的生物催化活性，能水解壳聚糖产生氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖和壳四糖，产物纯度较高；在pH 10和50℃时其相对酶活为898.6U/mg，高于其它已知的大部分壳聚糖酶，可高效降解壳聚糖，反应条件温和，易控制，效率高，环境友好，具有生产新型酶解壳寡糖混合物的工业化应用价值。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：本发明的壳聚糖酶纯化后的纯酶SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker；1为粗酶蛋白；2为纯化后的壳聚糖酶蛋白。

图2：温度变化对相对酶活的影响示意图。

图3：pH变化对相对酶活的影响示意图。

图4：本发明的壳聚糖酶酶解产物的TLC图。

图5：本发明的壳聚糖酶酶解产物的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1壳聚糖酶基因Csn-gly的克隆

为了挖掘到一个能够产生GlcN-(GlcN)₄的壳聚糖酶，发明人通过以能够生成(GlcN)₂-(GlcN)₄的来源于Streptomyces griseus HUT 6037的壳聚糖酶为模版，通过分子生物学手段发掘一个同模版的氨基酸序列相似度为88.28％的壳聚糖酶，该壳聚糖酶来源于链霉菌Streptomyces bacillaris SDUM420012(购买自山东大学威海海洋微生物资源中心)，通过克隆表达该酶的基因，从而促成了本发明。其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。Blast结果表明Csn-gly是糖苷水解酶类5家族的新成员。

以链霉菌Streptomyces bacillaris SDUM420012的基因组为模板，在壳聚糖酶基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增，得Csn-gly基因片段。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-CAAATGGGTCGCGGATCCATGAGCAATGCCCGCC-3’，如SEQ ID NO.3所示；

下游引物：5’-CGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTTCATTTCCCAATCGGTCAC-3’，如SEQ ID NO.4所示。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KOD Fx酶1μl，无菌水10μl，总体系50ul。

PCR的反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸60s，反应30个循环，72℃后延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳后回收1100Kb的PCR产物片段。

实施例2含壳聚糖酶基因的表达载体构建

基因片段与PET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞。使含硫酸卡那霉素抗性的LB平板进行阳性转化子筛选,将克隆子使用T7通用引物进行菌落PCR验证后，挑取阳性克隆测序。

实施例3含壳聚糖酶基因的重组质粒及工程菌的构建

提取测序正确的重组质粒，并转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出。

实施例4利用大肠杆菌工程菌制备重组壳聚糖酶

挑取大肠杆菌重组菌株接种在5ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12小时后按1％的接种量接入含有硫酸卡那霉的ZYP-5052培养基，20℃，200rpm培养48h，自诱导表达壳聚糖酶。

4℃，8000g离心10分钟，收集菌体，细胞重悬于50mM pH 8.0Tirs-HCl缓冲液中，超声破碎30min后12000g离心15min，上清液即为粗酶液。粗酶液使用Ni^-NTA柱进行亲和层析纯化，使用10mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)平衡柱子，然后用40mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱结合力弱的杂蛋白，80mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，将得到的溶液进行SDS-PAGE检测(图1)，使用Bradford法测定蛋白浓度。

实施例5测定重组壳聚糖酶的最适反应条件

反应条件为：选取35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃在10uL纯酶+190uL胶体壳聚糖体系中反应15min测定最适温度；在pH 3.0～6.0柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液，pH 8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液和pH 9.0～10.0的甘氨酸-NaOH缓冲液中测定最适pH，反应体系为10ul纯酶+190uL胶体壳聚糖+800ul缓冲液50℃反应15min，用DNS法测定酶活。结果如图2，图3所示，重组壳聚糖酶的最适反应温度为50℃，最适pH为10。

实施例6利用重组壳聚糖酶制备壳寡糖

利用实施例4制备的重组壳聚糖酶制备壳寡糖。将10g壳聚糖溶于3％的醋酸溶液100ml中，配制成胶体壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液与pH10的甘氨酸-NaOH溶液混合，配制成2％的溶液。按重量比0.1：100加入壳聚糖酶，在50℃200rpm反应3h。浓缩后加入乙醇沉淀后，10000rpm离心10min取上清液冻干，即为产物GlcN-(GlcN)₄。利用TLC(图4)和质谱(图5)进行产物鉴定，确定产物为GlcN-(GlcN)₄。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种壳聚糖酶及其应用

<141> 2020-01-16

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 367

<212> PRT

<213> Streptomyces bacillaris

<400> 1

Met His Gln Arg Pro Thr Pro Pro Thr Ser Pro Thr Glu Pro Thr Ala

1 5 10 15

Ala Pro Thr Thr Gly Arg Arg Arg Phe Thr Arg Lys Ala Leu Leu Ala

20 25 30

Ala Ser Ala Leu Gly Val Val Thr Ala Leu Leu Thr Pro Val Gln Ala

35 40 45

Gly Ala Ala Pro Ala Pro Ala Glu Pro Ala Thr Ala Arg Ala Ala Thr

50 55 60

Pro Leu Ala Ala Asn Gly Gln Leu Arg Val Cys Gly Leu Gln Leu Cys

65 70 75 80

Asn Ala Ser Gly Gln Ala Ile Ala Leu Asn Gly Met Ser Thr His Gly

85 90 95

Thr Gln Trp Tyr Ala Gln Cys Val Thr Asp Gly Ser Leu Asn Ala Leu

100 105 110

Ala Gln Asp Trp Arg Ala Asp Val Leu Arg Val Ser Thr Tyr Val Gln

115 120 125

Glu Gly Gly Tyr Glu Thr Asp Pro Ala Gly Phe Thr Ala Arg Ala Gln

130 135 140

Lys Phe Ile Asp Ala Ala His Ala Arg Gly Met Tyr Ala Val Ile Asp

145 150 155 160

Trp His Met Leu Thr Pro Gly Asp Pro Asn Ala Asn Leu Asp Arg Ala

165 170 175

Lys Thr Phe Phe Thr Ala Met Ala Lys Arg Tyr Lys Asp His Pro Gly

180 185 190

Val Leu Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Ser Gly Val Ser Trp Ser Ala

195 200 205

Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Gln Ile Ile Pro Val Ile Arg Ala Gln Asp

210 215 220

Pro Asp Ala Val Val Leu Val Gly Thr Arg Ala Trp Ser Ser Phe Gly

225 230 235 240

Val Ser Glu Gly Ser Asn Glu Ser Glu Val Val Asn Asn Pro Val Arg

245 250 255

Ala Ser Asn Ile Met Tyr Thr Phe His Phe Tyr Ala Ala Ser His Arg

260 265 270

Glu Ala Tyr Leu Ala Thr Leu Asp Arg Ala Ser Asp Arg Leu Pro Val

275 280 285

Phe Val Thr Glu Phe Gly Thr Gln Asn Tyr Ala Gly Glu Gly Ala Asn

290 295 300

Asp Phe Ala Met Ser Gln Arg Tyr Leu Asp Leu Met Lys Arg Lys Lys

305 310 315 320

Ile Ser Trp Thr Asn Trp Asn Tyr Ser Asp Asp His Arg Ser Gly Ala

325 330 335

Val Phe Lys Thr Gly Thr Cys Ser Gly Thr Asn Trp Thr Gly Thr Gly

340 345 350

Val Leu Lys Glu Ala Gly Val Trp Ile Arg Glu Arg Ile Arg Gln

355 360 365

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> Streptomyces bacillaris

<400> 2

atgcaccagc gccccactcc ccccacgtcc cccaccgaac ccacggccgc ccccacgacc 60

ggccggcgcc gcttcacccg taaggccctg ctcgccgctt ccgcgctcgg cgtggtcacc 120

gcgctcctga cccccgtcca ggccggagcc gcccccgctc ccgccgagcc cgccacggcc 180

agggccgcca ccccgctcgc ggccaacggc cagctccgcg tctgcggtct ccagctctgt 240

aacgcctcgg gccaggcgat cgccctcaac ggcatgagca cccacggcac ccagtggtac 300

gcccagtgcg tcaccgacgg gtccctgaac gccctcgccc aggactggcg cgccgacgtg 360

ctgcgtgtct ccacctacgt acaggaggga gggtacgaga ccgacccggc cggattcacc 420

gcgcgggcgc agaagttcat cgacgcggcg cacgcgcgcg ggatgtacgc ggtcatcgac 480

tggcacatgc tcacgccggg cgatccgaac gccaacctcg accgggcgaa gacgttcttc 540

accgcgatgg cgaagaggta caaggaccac ccgggcgtgc tctacgagat cgccaacgag 600

ccctcggggg tgagctggtc ggccatcaag tcctactccg agcagatcat cccggtgatc 660

cgggcgcagg acccggacgc ggtggtcctg gtcgggacgc gggcctggtc ctcgttcggg 720

gtgtcggagg gatcgaacga gtccgaggtc gtcaacaacc cggtccgcgc ctcgaacatc 780

atgtacacct tccacttcta cgcggcctcg caccgcgagg cgtatctcgc gacgctggac 840

cgggcctcgg accggctccc cgtcttcgtc accgagttcg ggacgcagaa ctacgcgggc 900

gagggcgcca acgacttcgc gatgtcgcag cgttacctcg acctgatgaa gcgcaagaag 960

atctcctgga ccaactggaa ctactccgac gaccaccgct ccggtgccgt cttcaagacc 1020

ggcacgtgca gcggcaccaa ctggaccggg accggggtcc tgaaggaggc cggggtctgg 1080

atccgcgagc gcatccgcca gtga 1104

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

caaatgggtc gcggatccat gagcaatgcc cgcc 34

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cgagtgcggc cgcaagcttt ttcatttccc aatcggtcac 40

Claims

1.一种降解壳聚糖制备GlcN-(GlcN)₄的方法，其特征在于：采用氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的壳聚糖酶降解壳聚糖，降解条件为：温度50℃，pH 10，降解产物中含有氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖和壳四糖。