CN106811451B

CN106811451B - 一种低温壳聚糖酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN106811451B
Application number: CN201710177429.1A
Authority: CN
Inventors: 赵黎明; 秦臻; 陈启明; 邱勇隽
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2037-03-23
Also published as: CN106811451A

Abstract

本发明公开了一种根际细菌Gynuella sunshinyii来源的壳聚糖酶(GsCho46A)及其编码基因与应用。本发明的壳聚糖酶是如下a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQ ID NO.2中第1‑266位氨基酸残基编码的蛋白质；b)在SEQ ID NO.2第1‑266位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID NO.2中第1‑266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。本发明所公开的壳聚糖酶具有优良的酶学性质：低温条件下活性较高，对酶解设备要求较低；可通过温度控制高效制备聚合度(DP)2‑7的高聚合度壳寡糖；反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生。在酶法制备壳寡糖中具有重要的应用价值，具有重要的经济价值。

Description

一种低温壳聚糖酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，尤其是涉及一种根际细菌Gynuella sunshinyii来源的低温壳聚糖酶(GsCho46A)及其编码基因与应用。

背景技术

壳寡糖(Chitooligosaccharides,COS)是由海洋虾蟹壳来源的壳聚糖降解生成的小分子寡糖。壳寡糖分子内的D-氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)通过β-1,4-糖苷键连接，聚合度(DP)通常介于2-10之间，分子量一般不超过3kDa。壳寡糖具有良好水溶性和丰富的生理活性，不同的DP的壳寡糖生理功能有所差异，其中DP6-8的壳寡糖在提高巨噬细胞吞噬能力、抑制肿瘤细胞生长、降低胆固醇、抗氧化和植物免疫诱抗等方面具有较强活性，在功能食品、抗癌药物、免疫增强剂及作物生物制剂领域具有独特而重要的应用。

目前，常用的壳寡糖制备方法分别有：酶法水解、酸法水解、氧化降解和物理降解法。其中酶法降解壳聚糖具有反应条件温和、不添加其他化学试剂、无副产物、低环境污染、产物分子量易于控制、产品的食用安全性高等优点，是目前应用前景最广、最为理想的壳聚糖降解方法，近年来已经逐渐用于工业化生产，并且取得了良好的经济效益。

酶法降解壳聚糖涉及到的专一性酶主要为壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)。壳聚糖酶遵从内切反应机制随机催化水解壳聚糖中的β-1,4-糖苷键，可有效地将壳聚糖降解为水溶性的低分子壳聚糖或壳寡糖。国内外研究者对于壳聚糖酶均展开了大量探索性研究，已报道的壳聚糖酶主要来源于细菌、真菌、部分植物及宏基因组。由于微生物来源的壳聚糖酶具有生产周期快、酶活力稳定、生产容易放大等优点，目前已成为壳聚糖酶研究的最重要来源。一些微生物来源的壳聚糖酶能够高效水解壳聚糖制备壳寡糖，具有良好应用前景。如：Purpureocillium lilacinum来源的壳聚糖酶水解壳聚糖可以制备得到DP 2–6的活性壳寡糖，反应12h水解率达到85.8％，产物中壳二糖到壳六糖的比例分别为3.8％，43.91％，50.36％，0.46％，0.77％(Carbohyd.Polym.,2015,121:1–9.)。Aspergillus sp.来源壳聚糖酶具有良好的热稳定性及pH稳定性，能够水解壳聚糖生成DP2-7的壳寡糖(Int.J.Biol.Macromol.,2015,81:362–369.)。

尽管酶法制备壳寡糖存在许多优势，但现有的壳聚糖酶普遍存在活力较低、应用性能较差、产物聚合度不可控、使用成本高等问题，目前尚无商品化专一性制备壳寡糖的壳聚糖酶制剂(Mar.Drugs,2014,12:5328–5356.)。此外，由于DP6-8的壳寡糖具有较高的生理活性，控制水解条件制备DP6-8的壳寡糖含量较高的壳寡糖产品具有重要的经济价值和应用前景。制备特定DP或DP区间的壳寡糖也是定性、定量研究壳寡糖构效关系的关键前提。目前规模化生产壳寡糖产品主要通过优化酶解条件来控制壳寡糖产物聚合度。常用的方法主要通过加热灭酶、调节水解液pH、加入蛋白变性剂等方式来控制酶解时间，使得反应终产物中DP6-8的壳寡糖含量达到最优。但目前报道较多的壳聚糖酶均为高温酶(50-60℃)，对反应容器控制条件要求较高，不利于工业生产精确控制酶解过程(公开号：CN102154241A；CN102250858A；CN102392035A；CN104371989A和CN105602921A)。而调节水解液pH、蛋白变性剂等工艺由于额外的化学试剂添加，对后续分离纯化步骤带来较大压力。相比之下，低温壳聚糖酶在此方面具有独特优势，包括：(1)可缩短酶解过程加热、冷却时间，有效节约能耗；(2)无需高温灭酶步骤，减少反应设备投资成本，可精准控制酶解过程；(3)整个酶解过程在温和、低温条件下进行，避免高温造成的壳寡糖产品发黄、产品品质下降等问题。目前低温壳聚糖酶的报道较少，部分公开的产低温壳聚糖酶天然菌株产酶活力较低，不利于工业化应用(公开号：CN102653749A)。因此，发掘在低温下具有较高活性的壳聚糖酶，探索低温壳聚糖酶制备壳寡糖的酶解工艺，具有重要的工业应用价值和潜力。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质，将其命名为GsCho46A，

a)氨基酸序列是SEQ ID NO.2中第1-266位氨基酸残基编码的蛋白质；

b)在SEQ ID NO.2第1-266位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将SEQ ID NO.2中第1-266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO.2第1-266位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.1第1-801位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的生物材料为下述B1)-B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3)所述重组载体的细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)核苷酸序列是SEQ ID NO.1第1-801位所示的DNA分子；

2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

4)利用密码子优化后获得的编码SEQ ID NO.2所示相同氨基酸序列及a)或b)所述条件的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GsCho46A的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GsCho46A的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsCho46A且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID NO.2第1-266位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码GsCho46A的核酸分子的表达盒(GsCho46A基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GsCho46A的DNA，该DNA不但可包括启动GsCho46A转录的启动子，还可包括终止GsCho46A转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

本发明的另一个目的是提供上述蛋白质的新用途。

本发明提供了上述蛋白质在作为壳聚糖酶中的应用。

本发明还提供了上述蛋白质在水解壳聚糖中的应用。

上述应用中，所述壳聚糖包括壳聚糖以及脱乙酰度为20-100％的脱乙酰几丁质。

本发明还提供了上述蛋白质在制备壳寡糖以及几丁寡糖中的应用。

上述应用中，所述壳寡糖以及几丁寡糖聚合度为2-10，脱乙酰度为20-100％。

本发明的另一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌是将上述蛋白质的编码基因导入宿主菌中得到的菌。

上述重组菌中，所述蛋白质的编码基因是通过重组载体导入宿主菌；

所述重组载体为将上述蛋白质的编码基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体。所述重组载体具体为在载体pET-28a(+)的NheⅠ和XhoⅠ位点间插入了SEQ ID NO.1中第1-801位所示的DNA片段，且保持载体pET-28a(+)的其他序列不变得到的载体。

上述重组菌中，所述蛋白质的编码基因是SEQ ID NO.1第1-801位所示的DNA分子。

上述重组菌中，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还有一个目的是提供一种壳聚糖酶的制备方法。

本发明提供的壳聚糖酶的制备方法包括如下步骤：诱导培养上述重组菌，得到壳聚糖酶。

本发明的最后一个目的是提供一种生产高聚合度(DP2-7)壳寡糖的方法。

本发明提供的生产高聚合度壳寡糖的方法包括如下步骤：用上述蛋白质水解壳聚糖，得到高聚合度壳寡糖。

上述方法中，第一个发明目的所述的蛋白质的浓度为0.1U/mL。

上述方法中，β-1,3-葡聚糖的质量分数为0.1-4％。

上述方法中，水解的条件为：pH 4.5-6.0，20-30℃水解20-50min；所述水解的条件具体为：pH 5.5，30℃水解20min。

本发明所公开的壳聚糖酶具有优良的酶学性质：低温条件下活性较高，对酶解设备要求较低；可通过温度控制高效制备聚合度(DP)2-7的高聚合度壳寡糖；反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生。在酶法制备壳寡糖中具有重要的应用价值，具有重要的经济价值。

本发明进一步通过下面的实施例进行阐述。

附图说明

图1显示了大肠杆菌重组GsCho46A经Ni-IDA亲和层析纯化的纯化图。其中，泳道M代表低分子量标准蛋白，泳道1代表破壁后的上清液，泳道2代表经Ni-IDA亲和层析后的蛋白。

图2显示了温度变化对GsCho46A酶活力的影响。所用缓冲液为：醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.5)。

图3显示了温度变化对GsCho46A酶活稳定性的影响。所用缓冲液为：醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.5)。

图4显示了GsCho46A对壳聚糖的水解特性。

图5显示了GsCho46A水解壳聚糖产物的MALDI-TOF MS分析图谱。水解时间为15min，图中显示水解产物的聚合度分布在2-7。

图6显示了GsCho46A水解壳聚糖产物的MALDI-TOF MS分析图谱。水解时间为120min，图中显示水解产物的聚合度分布在2-5。

实施发明的最佳方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、基因GsCho46A及蛋白GsCho46A的获得

依据Genbank数据库中已提交的Gynuella sunshinyii全基因组序列信息(在文献“Int.J.Syst.Evol.Micr.2015,65,1038–1043”中公开)，以其中编码Glycoside Hydrolase(GH)46家族未知假想蛋白(hypothetical Protein；Genbank ID:AJQ97965)的目的基因序列为模板序列，全基因合成目的基因。

设计上游引物GsCho46A-up(5’-ATTCTAGCTAGCATGAATCCGTTCTGGCATTTTG-3’，下划线示NheⅠ酶切位点)和下游引物GsCho46A-down(5’-ATTCCGCTCGAGTTAACGGATCGGCAGGATGAAAAC-3’，下划线示XhoⅠ酶切位点)，以全基因合成的目的基因为模板，PCR扩增得到目的DNA片段。

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸5min。

PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以NheⅠ和XhoⅠ双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的原核表达载体pET-28a(+)(美国Novagen公司，产品编号：69864-3)片段以T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒，并将其转化至宿主大肠杆菌DH5α。挑选菌落PCR(PCR所用的引物和扩增条件与本段前述PCR的相同)验证为阳性的转化子测序。

测序结果表明：重组质粒为在载体pET-28a(+)的NheⅠ和XhoⅠ位点间插入了SEQ IDNO.1中第69-801位所示的DNA片段，阳性转化子即为含有上述重组质粒的大肠杆菌DH5α。

将SEQ ID NO.1中第1-801位所示的基因命名为基因GsCho46A，将该基因所编码的蛋白命名为蛋白GsCho46A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2中第1-266位所示。

实施例2、重组壳聚糖酶(GsCho46A)的表达和纯化及其性质检测

一、重组壳聚糖酶(GsCho46A)的表达和纯化

将实施例1中的重组质粒转化表达至宿主大肠杆菌BL21(DE3)(北京博迈德基因技术有限公司，产品编号：BC201-01)，得到重组菌，并将其接种至1L LB液体培养基(含50μgmL^-1卡那霉素)，在37℃，200rpm条件下培养至OD₆₀₀在0.6-0.8之间，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃诱导过夜。离心收集菌体后，将菌体按照1:10(v/v)的比例，用缓冲液A(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑,pH 7.9)重悬浮，然后于冰水浴中超声破碎(200W，超声3s，间歇4s，120次)，再离心收集上清液即为粗酶液，粗酶液中含有重组蛋白GsCho46A，即重组壳聚糖酶(GsCho46A)。

基于pET28-a(+)质粒中有编码His-Tag标签蛋白的序列，使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组蛋白GsCho46A(即在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的N端连接了His-Tag标签序列(HHHHHH)的重组蛋白)。具体纯化步骤如下：

将粗酶液上样于Ni-IDA柱进行纯化。纯化的具体步骤为(流速为1mL min^-1)：先用缓冲液A(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.9)洗脱至OD₂₈₀小于0.05，然后用缓冲液B(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，50mM咪唑，pH 7.9)洗脱至OD₂₈₀小于0.05，最后用缓冲液C(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH 7.9)洗脱。收集缓冲液C洗脱部分，得到纯化的重组壳聚糖酶(GsCho46A)的溶液。

经SDS-PAGE(Laemmli，U.K.Nature，1970，227(5259):680-685)检测蛋白纯度(图1)。结果显示重组蛋白GsCho46A经Ni-IDA亲和柱一步纯化可得电泳纯蛋白，分子量大小约为30kDa。

二、重组壳聚糖酶(GsCho46A)的性质检测

1、GsCho46A的酶活力

步骤一制备得到的重组壳聚糖酶(GsCho46A)的比酶活为260U mg^-1。壳聚糖酶的酶活力的测定方法具体如下：在1.5mL离心管中先后加入350μL壳聚糖底物(0.5％,W/V；pH5.5，100mM醋酸-醋酸钠缓冲液)及50μL适当稀释的酶液，30℃反应10min，随后采用DNS法测定反应液中的还原糖含量。酶活力单位(1U)定义为：在上述反应条件下，每分钟生成1μmol的氨基葡萄糖所需要的酶量。其中，壳聚糖底物制备方法：将0.5g壳聚糖用适量100mM醋酸溶液溶解。随后用100mM醋酸钠溶液调节pH至5.5。经过这一处理，壳聚糖即形成均一、透明的溶液。

2、GsCho46A的最适反应温度测定

将步骤一制备得到的纯化的重组壳聚糖酶溶液在100mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.5)中适当稀释，然后分别在不同温度下：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃按照步骤1中的方法测定壳聚糖酶的酶活力，以酶活力的最高值作为100％，结果如图2所示。图2显示重组壳聚糖酶(GsCho46A)的最适温度为30℃，在20-40℃均具有较高活性。

3、GsCho46A的温度稳定性测定

将步骤一制备得到的纯化的重组壳聚糖酶溶液在100mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.5)中适当稀释，然后分别在不同温度下：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，保温30min，随后在冰水浴中冷却30min，最后在30℃和pH 5.5条件下按照步骤1中的方法测定壳聚糖酶的酶活力，以未经热处理的酶液作为对照，分别计算不同热处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。结果如图3所示。图3显示重组壳聚糖酶(GsCho46A)在35℃以下较为稳定，酶活力能保持80％以上。

实施例3、重组壳聚糖酶(GsCho46A)在酶法制备壳寡糖中的应用

重组壳聚糖酶(GsCho46A)水解壳聚糖反应条件参照酶的最适反应条件：pH5.5，30℃，底物浓度1％，加酶量0.5U/mL，水解时间2h。水解液体积5L，搅拌转速80-120rpm/min。分别于0，5，10，15，30，60，120min取样，50度保温10min灭酶终止反应。

(1)薄层层析法(thin layer chromatography，TLC)监测水解产物

采用Kieselgel 60硅胶板(Merck)分析水解产物，展层液为正丁醇：甲醇：氨水：水(5:4:2:1，v/v/v)。样品点样2μL于硅胶板点样点，将硅胶板用展层剂展开，吹干后在其表面均匀用显色剂硫酸：甲醇(5:95,v/v)溶液浸湿，然后在130℃烘箱中烘烤5min显色。

(2)基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，Maldi-tof-MS)分析水解产物

为了鉴定GsCho46A的最终水解中寡糖组成，采用MALDI-TOFMS法分析GsCho46A水解壳聚糖水解产物。取反应液稀释100倍，与等体积10mg/mL 2,5-羟基苯甲酸水溶液混合均匀。样品(1μL)上样于Maldi载片使用AB SCIEX TOF/TOF^TM 4800系统采用阳离子模式分析样品。

实验结果显示，GsCho46A能够水解壳聚糖生成一系列的低聚糖(图4)，随着反应进行，反应液中的壳寡糖聚合度主要分布在DP2-7(图5)。经过两小时的水解，底物中的壳聚糖糖几乎被完全水解为壳二糖-壳四糖(图6)。利用GsCho46A的这一低温反应特点，可以有效通过控制酶解温度(30℃反应15min后，50℃终止反应)制备DP6-8含量较高的壳寡糖混合物。

(3)壳寡糖产品精制

1、工艺一

将上述制备的壳寡糖水解液泵入离子交换柱，采用阴阳离子交换树脂(大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(D301型)；强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂(001×7型))脱去料液中的盐离子。将脱离子后的料液旋转蒸发(60-70℃)浓缩至糖液固形物含量30-60％，喷雾干燥得到壳寡糖粉末。

2、工艺二

将上述制备的壳寡糖水解液经膜过滤系统(纳滤膜：截留量150；操作压力0.4-0.8mP)浓缩，将料液浓缩至糖液固形物含量20-30％，期间脱去料液中的大部分离子，得到壳寡糖糖浆。最后将壳寡糖糖浆喷雾干燥得到壳寡糖粉末。

工业应用

本发明所提供的蛋白质(在实施例中具体为重组蛋白GsCho46A)具有壳聚糖酶活性，具有260U mg^-1的比酶活，最适反应pH为5.5，最适反应温度为30℃，并且在35℃以下保持较高酶活力；该蛋白质作为壳聚糖酶可以高效水解壳聚糖制备高聚合度(DP6-8)壳寡糖含量较高的壳寡糖混合物。本发明提供的蛋白质具有良好的壳聚糖酶酶学性质，在低聚糖制备以及食品、饲料等行业中具有良好的应用价值。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

<110>华东理工大学

<120>一种低温壳聚糖酶及其编码基因与应用

<160>2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> Gynuella sunshinyii

<400> 1

atgaatccgt tctggcattt ggcaatcact ctgacgtgcc tgagtttcct tgttatgccg 60

gtacaggcgg cacagttaac ggcgcagcaa cgtctgttgg ccgatcagat catcagtatt 120

ttcgaaaata acacgccgga gctgcagtat gggtatgccg aggtactcga tgatggtcgt 180

ggcataaccg ccggccgggc cggttttacc tctgcgaccg gtgatatgct cgaagtgatt 240

caacgttaca gccgccttcg tcccgataat attctggtgc cgtttttgcc gcgtctgcaa 300

cagctggcgg catcggaaga tggcagtatc gaagggttgc agggattacc gcaacgctgg 360

gccgatgcca gccagaaccc tgtgtttcgt caggttcagg atgacgtggt ggatgagttg 420

tattttcaac cggccatgga acgggcagcg gaactgggag cacaaatgcc tctgactctg 480

ctggctctgt atgacgccat tatccagcat ggtgagggtg acgatggcga tggtctgccc 540

gccatgattg cccgtaccac ggcgaaagtg aacggtattc ctgctgaagg tgtcgatgaa 600

cgacgctggt taaaaacctt tctcaaaatc cgcaaacagg ttttgcggca tccggccaat 660

cttgaaacag aggacgagtg gtctgaatcc accggccggg tggatagtct gatgaaatta 720

ttgaaacagg gtaataccga tcttcacccc ccgatacgca tatcaacctg gggcgatgta 780

ttcatattgc cgatccgata g 801

<210> 2

<211> 266

<212> PRT

<213> Gynuella sunshinyii

<400> 2

Met Asn Pro Phe Trp His Leu Ala Ile Thr Leu Thr Cys Leu Ser

5 10 15

Phe Leu Val Met Pro Val Gln Ala Ala Gln Leu Thr Ala Gln Gln

20 25 30

Arg Leu Leu Ala Asp Gln Ile Ile Ser Ile Phe Glu Asn Asn Thr

35 40 45

Pro Glu Leu Gln Tyr Gly Tyr Ala Glu Val Leu Asp Asp Gly Arg

50 55 60

Gly Ile Thr Ala Gly Arg Ala Gly Phe Thr Ser Ala Thr Gly Asp

65 70 75

Met Leu Glu Val Ile Gln Arg Tyr Ser Arg Leu Arg Pro Asp Asn

80 85 90

Ile Leu Val Pro Phe Leu Pro Arg Leu Gln Gln Leu Ala Ala Ser

95 100 105

Glu Asp Gly Ser Ile Glu Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gln Arg Trp

110 115 120

Ala Asp Ala Ser Gln Asn Pro Val Phe Arg Gln Val Gln Asp Asp

125 130 135

Val Val Asp Glu Leu Tyr Phe Gln Pro Ala Met Glu Arg Ala Ala

140 145 150

Glu Leu Gly Ala Gln Met Pro Leu Thr Leu Leu Ala Leu Tyr Asp

155 160 165

Ala Ile Ile Gln His Gly Glu Gly Asp Asp Gly Asp Gly Leu Pro

170 175 180

Ala Met Ile Ala Arg Thr Thr Ala Lys Val Asn Gly Ile Pro Ala

185 190 195

Glu Gly Val Asp Glu Arg Arg Trp Leu Lys Thr Phe Leu Lys Ile

200 205 210

Arg Lys Gln Val Leu Arg His Pro Ala Asn Leu Glu Thr Glu Asp

215 220 225

Glu Trp Ser Glu Ser Thr Gly Arg Val Asp Ser Leu Met Lys Leu

230 235 240

Leu Lys Gln Gly Asn Thr Asp Leu His Pro Pro Ile Arg Ile Ser

245 250 255

Thr Trp Gly Asp Val Phe Ile Leu Pro Ile Arg

260 265

Claims

1.一种低温水解壳聚糖生产壳寡糖的方法，其特征在于，利用壳聚糖酶在pH5.5，20-30℃对壳聚糖水解20-50min，所述壳聚糖质量分数为0.1-4％，所述壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。