CN109666663B

CN109666663B - 一种利用n-乙酰氨基葡萄糖合成氨基寡糖的方法及其专用酶

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Publication number: CN109666663B
Application number: CN201910059390.2A
Authority: CN
Inventors: 赵黎明; 陈宝莉; 秦臻; 邱勇隽
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2039-01-22
Also published as: CN109666663A

Abstract

本发明涉及一种利用N‑乙酰氨基葡萄糖合成氨基寡糖的方法及其专用酶。具体涉及基于多酶协同利用N‑乙酰氨基葡萄糖合成氨基寡糖的方法、具有逆水解活性/转糖苷活性的β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶、几丁质酶，编码这些酶的核酸，以及包含这些核酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生产这些酶的方法。本发明所公开的方法可通过酶法制备不同连接方式、聚合度(DP)2‑10的氨基寡糖；反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生，具有重要应用价值。

Description

一种利用N-乙酰氨基葡萄糖合成氨基寡糖的方法及其专用酶

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及基于多酶协同利用N-乙酰氨基葡萄糖合成氨基寡糖的方法、具有逆水解活性/转糖苷活性的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、几丁质酶，编码这些酶的核酸，以及包含这些核酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生产这些酶的方法。

背景技术

以几丁寡糖(Chitin oligosaccharides,CHOS)为代表的氨基寡糖是由海洋虾蟹壳来源的甲壳素降解生成的小分子寡糖。几丁寡糖分子内的N-乙酰-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接，聚合度(DP)通常介于2-10之间，分子量一般不超过3kDa。几丁寡糖具有良好水溶性和丰富的生理活性，已被广泛应用于保健食品、药品及农业制剂的开发及应用领域。

目前，几丁寡糖常用的制备方法是降解几丁质来制备得到，降解几丁质常用方法包括：化学降解法、物理降解法和酶水解法。化学降解可分为酸水解和氧化降解等，酸水解常用的是浓盐酸、亚硝酸、磷酸、草酸和柠檬酸等。氧化降解法用于几丁质降解的研究较多，主要利用的是过氧化氢、过硼酸钠和次氯酸钠等。化学降解所用的试剂价廉易得，易于实现工业化，但是产物相对分子质量分布较宽，需引入强酸，后处理会比较困难，而且会给环境造成污染。物理降解几丁质主要有微波、辐射、超声及光降解法等。物理法需要的设备单一，不会引入杂质，且污染较少，但是大多数物理法能耗高、操作复杂，多是与其它方法复合应用。酶水解法降解几丁质具有反应条件温和、不添加其他化学试剂、无副产物、低环境污染、产物分子量易于控制、产品的食用安全性高等优点，是目前应用前景最广、最为理想的几丁质降解方法，近年来已经逐渐得到应用。

尽管酶水解法降解几丁质制备几丁寡糖已发展多年，但现有的降解法仍以虾蟹壳为初始原料，对海洋甲壳质资源的依赖较大，且几丁质原料的制备过程能耗高、操作繁琐、污染严重，产业发展受到限制。因此，合成法制备氨基寡糖具有十分重要的研究意义。

目前公开号为CN201510114679.1、专利名称为：一种氨基葡萄糖合成甲壳素及其衍生物的方法的中国发明专利公开了一种以氨基葡萄糖为底物，利用糖端基离去基团，在Lewis酸催化下合成脱氧葡萄糖的壳寡糖及其衍生物的办法。公开号为CN200610134023.7、专利名称为：一种氨基葡萄糖四糖的合成方法的中国发明专利公开了以辛基-β-(1→4)连接的氨基葡萄糖二糖糖苷为受体，以1→4连接的氨基葡萄糖二糖硫苷为供体，以路易斯酸和碘代琥珀酰亚胺作为催化，于有机溶剂中合成氨基葡萄糖四糖的方法。以上两种化学合成法在制备氨基寡糖的过程中需要使用二氯甲烷、路易斯酸等有毒、腐蚀性试剂，且反应条件严苛，需要低温且严格的避光条件。直接以氨基葡萄糖为单体合成三糖以上的寡糖具有难度，大多需要对反应底物烷基化或卤代修饰后才能进一步合成高聚合度的寡糖。因此，利用化学合成法面临着有毒试剂的使用、底物修饰和后处理步骤较为复杂及反应条件严苛等缺点。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种利用N-乙酰氨基葡萄糖合成氨基寡糖的方法及其专用酶。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供一种酶。

所述酶，可以作为具有逆水解活性的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，或具有转糖苷活性的几丁质酶。所述酶是如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)如SEQ ID NO.2第1-616位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQ ID NO.4第1-434位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQ ID NO.6第1-344位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQ ID NO.8第1-490位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQ ID NO.10第1-426位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQID NO.12第1-423位氨基酸残基编码的蛋白质，将其分别命名为BaNagase、LcNagase、EfNagase、EfChi、SfChi或BnChi，其中，BaNagase、LcNagase、EfNagase指的是β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，具有逆水解活性，EfChi、SfChi、BnChi指的是几丁质酶，具有转糖苷活性；

b)如SEQ ID NO.2第1-616位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、SEQ ID NO.4第1-434位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、SEQ ID NO.6第1-344位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、SEQ ID NO.8第1-490位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、SEQ IDNO.10第1-426位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、SEQ ID NO.12第1-423位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质；

c)在如SEQ ID NO.2第1-616位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质、在如SEQ ID NO.4第1-434位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质、在如SEQ ID NO.6第1-344位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质、在如SEQ ID NO.8第1-490位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质、在如SEQ ID NO.10第1-426位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质、在如SEQ ID NO.12第1-423位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

进一步地，为了使a)中的蛋白质便于纯化，在a)所述蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质，即得到b)所述的融合蛋白。

所述标签如表1所示。

表1蛋白质氨基末端和/或羧基末端标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

进一步地，上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明第二方面，提供一种核酸。

所述的核酸用于编码本发明第一方面所涉及的蛋白质，其是如下1)或2)或3)或4)的核酸分子：

1)核苷酸序列是SEQ ID NO.1第1-1851位所示的DNA分子、SEQ ID NO.3第1-1305位所示的DNA分子、SEQ ID NO.5第1-1035位所示的DNA分子、SEQ ID NO.7第1-1473位所示的DNA分子、SEQ ID NO.9第1-1281位所示的DNA分子或SEQ ID NO.11第1-1212位所示的DNA分子；

2)与1)限定的DNA序列至少具有92％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码本发明第一方面所涉及的蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码本发明第一方面所涉及的蛋白质的DNA分子；

4)利用密码子优化后获得的编码SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示相同氨基酸序列的蛋白质，或b)所述蛋白质或c)所述蛋白质的DNA分子。

其中，上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.1第1-1851位或SEQ IDNO.3第1-1305位或SEQ ID NO.5第1-1035位或SEQ ID NO.7第1-1473位或SEQ ID NO.9第1-1281位或SEQ ID NO.11第1-1212位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码BaNagase、LcNagase、EfNagase、EfChi、SfChi或BnChi的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码BaNagase、LcNagase、EfNagase、EfChi、SfChi或BnChi的核苷酸序列92％或者更高同一性的核苷酸，只要编码BaNagase、LcNagase、EfNagase、EfChi、SfChi或BnChi且具有相同功能，均是衍生于本发明的核酸，属于本发明核酸的保护范围。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO.2第1-616位或SEQ ID NO.4第1-434位或SEQ ID NO.6第1-344位或SEQID NO.8第1-490位或SEQ ID NO.10第1-426位或SEQ ID NO.12第1-423位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有92％或更高，或95％或，或97％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述92％或92％以上同一性，可为93％、95％、97％或99％以上的同一性。

本发明的第三方面，提供一种生物材料。

所示生物材料，是与上述蛋白质相关的生物材料。

所述的生物材料为下述B1)-B4)中的任一种：

B1)含有上述核酸分子的表达盒；

B2)含有上述核酸分子的重组载体或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有上述核酸分子的重组菌或含有B1)所述表达盒的重组菌或含有B2)所述重组载体的重组菌；

B4)含有上述核酸分子的细胞系或含有B1)所述表达盒的细胞系或含有B2)所述重组载体的细胞系。

上述生物材料中，B2)所述含有上述核酸分子的重组载体，是指能够在宿主细胞中表达所述本发明第一方面所涉及蛋白质的核酸，该核酸不但可包括启动本发明第一方面所涉及蛋白质转录的启动子，还可包括终止本发明第一方面所涉及蛋白质转录的终止子。

具体而言，针对蛋白质BaNagase、LcNagase、EfNagase、EfChi、SfChi或BnChi，含有编码BaNagase、LcNagase、EfNagase、EfChi、SfChi或BnChi的核酸分子的表达盒分别是BaNagase基因表达盒、LcNagase基因表达盒、EfNagase基因表达盒、EfChi基因表达盒、SfChi基因表达盒或BnChi基因表达盒。

进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

进一步，可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。

进一步，上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

进一步，B3)所述重组菌的宿主菌包括大肠杆菌、毕赤酵母、丝状真菌、芽孢杆菌或其他用于表达重组蛋白的宿主细胞，优选为大肠杆菌。

本发明实施例中以大肠杆菌为宿主菌，通过基因工程的方式获得BaNagase。其他蛋白质均通过相同的常规方法获得。

本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述酶的制备方法。

所述酶通过诱导培养上述重组菌得到。

本发明的第五方面，提供一种组合物。

所述组合物，包含一种或多种本发明第一方面所述酶。

进一步的，所述组合物中，至少含有一种β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，

优选地，所述组合物中，至少含有一种β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶与一种几丁质酶；

所述β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶选自以下物质中的一种或几种：如SEQ ID NO.2第1-616位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQ ID NO.4第1-434位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQID NO.6第1-344位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQ ID NO.2第1-616位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、SEQ ID NO.4第1-434位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、SEQ ID NO.6第1-344位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、在如SEQ ID NO.2第1-616位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质、在如SEQ ID NO.4第1-434位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质、在如SEQ ID NO.6第1-344位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质；

所述几丁质酶选自以下物质中的一种或几种：SEQ ID NO.8第1-490位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQ ID NO.10第1-426位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQ ID NO.12第1-423位氨基酸残基编码的蛋白质、SEQ ID NO.8第1-490位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、SEQ ID NO.10第1-426位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、SEQ ID NO.12第1-423位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端和/或羧基末端连接标签得到的融合蛋白质、在如SEQ IDNO.8第1-490位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质、在如SEQ ID NO.10第1-426位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质、在如SEQ IDNO.12第1-423位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

多种酶的组合可以起到协同作用。

进一步，所述组合物还包含以下中的一种或多种另外的酶：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、壳聚糖酶、唾液酸酶、β-半乳糖苷酶。

本发明的第六方面，提供所述组合物的应用。

所述组合物可用于合成氨基寡糖。

进一步，所述氨基寡糖包括聚合度2-10的氨基寡糖，连接键可能的方式为β-1,3糖苷键、β-1,4糖苷键或β-1,6糖苷键及其混合连接。

本发明第七方面，提供一种生产聚合度2-10的氨基寡糖的方法。

一种生产聚合度2-10的氨基寡糖的方法，包括如下步骤：以N-乙酰氨基葡萄糖为底物，用本发明第五方面涉及的组合物催化N-乙酰氨基葡萄糖逆向合成氨基寡糖。

酶法催化N-乙酰氨基葡萄糖逆向合成氨基寡糖的反应机理如图1所示。

进一步，上述方法中，所述N-乙酰氨基葡萄糖的质量分数为5-40％。

进一步，上述方法中，所述反应条件为：反应pH 5.0-6.5，反应30-50℃，反应时间1-6天。

本发明利用酶法以N-乙酰氨基葡萄糖为单体合成高聚合度的氨基寡糖的新的合成途径具有十分重要的工业应用价值和意义。

与现有的制备氨基寡糖的技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明利用的原料N-乙酰氨基葡萄糖通过发酵法制备的工艺已非常成熟，可从源头上摆脱降解法对海洋甲壳质资源的依赖；

(2)本发明利用酶法合成的反应过程条件温和，无需消耗酸碱、有毒和强腐蚀性的试剂，环境友好、绿色安全。

(3)本发明采用多酶协同的方法，以N-乙酰氨基葡萄糖为底物，通过逆水解和转糖苷反应可合成聚合度2-10的氨基寡糖。而现有技术以N-乙酰氨基葡萄糖为底物无法直接合成三糖以上的氨基寡糖。

附图说明

图1为酶法催化N-乙酰氨基葡萄糖逆向合成氨基寡糖的反应机理图。

具体实施方式

下面具体实施例对本发明进行详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶基因的发掘及相应重组蛋白的获得

一、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶基因的获得

依据Genbank数据库中已提交的基因序列，经生物信息学比对筛选及功能验证，选取以下基因人工合成：Bacillus amyloliquefaciens Glycoside Hydrolase(GH)3家族蛋白(Genbank ID:CBI41296.1)、Lactobacillus casei GH20家族蛋白(Genbank ID:BAA76352.1)、Enterococcus faecalis GH20家族蛋白(Genbank ID:AAO79989.1)、Enterococcus faecalis GH18家族蛋白(Genbank ID:AAO79989.1)、Serratia fonticolaGH18家族蛋白(Genbank ID:ALX95363.1)、Buttiauxella noackiae GH18家族蛋白(Genbank ID:OAT20368.1)。

二、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶重组蛋白的获得

以基因BaNagase为例，设计上游引物BaNagase-up(5’-ATTCTAGCTAGCTCGACAAAACCGGACATTCC-3’，下划线示NheⅠ酶切位点)和下游引物BaNagase-down(5’-ATTCCGCTCGAGTTAAAGCGGTTTTCCGTTTTTTAGAT-3’，下划线示XhoⅠ酶切位点)，以Bacillusamyloliquefaciens内的目的基因为模板，PCR扩增得到目的DNA片段。

PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃后延伸10min。

PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以NheⅠ和XhoⅠ双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的原核表达载体pET-28a(+)(美国Novagen公司，产品编号：69864-3)片段以T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒，并将其转化至宿主大肠杆菌DH5α。挑选菌落PCR(PCR所用的引物和扩增条件与本段前述PCR的相同)验证为阳性的转化子测序。

测序结果表明：重组质粒为在载体pET-28a(+)的NheⅠ和XhoⅠ位点间插入了SEQ IDNO.1第1-1851位所示的DNA片段，阳性转化子即为含有上述重组质粒的大肠杆菌DH5α。

将SEQ ID NO.1第1-1851位所示的基因命名为基因BaNagase，将该基因所编码的蛋白命名为蛋白BaNagase，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2中第1-617位所示。

以重组蛋白BaNagase为例，将成功构建的重组质粒分别转化表达至宿主大肠杆菌BL21(DE3)(北京博迈德基因技术有限公司，产品编号：BC201-01)，得到重组菌，并将其接种至1L LB液体培养基(含50μg mL^-1卡那霉素)，在37℃，200rpm条件下培养至OD₆₀₀在0.6-0.8之间，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃诱导过夜。离心收集菌体后，将菌体按照1:10(v/v)的比例，用缓冲液A(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑,pH 8.0)重悬浮，然后于冰水浴中超声破碎(200W，超声2s，间歇3s，120次)，再离心收集上清液即为粗酶液，粗酶液中含有重组蛋白，即重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。

基于pET-28a(+)质粒中有编码His-Tag标签蛋白的序列，使用Ni-IDA亲和柱纯化重组蛋白(即在序列表序列2所示氨基酸序列的C端连接了His-Tag标签序列(HHHHHH)的重组蛋白)。具体纯化步骤如下：

将粗酶液上样于Ni-IDA柱进行纯化。纯化的具体步骤为(流速为1mL min^-1)：先用缓冲液A(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)洗脱至OD₂₈₀小于0.05，然后用缓冲液B(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，40mM咪唑，pH 8.0)洗脱至OD₂₈₀小于0.05，最后用缓冲液C(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH 8.0)洗脱。收集缓冲液C洗脱部分，得到纯化的重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的溶液。

经SDS-PAGE(Laemmli，U.K.Nature，1970，227(5259):680-685)检测蛋白纯度。结果显示重组蛋白BaNagase经Ni-IDA亲和柱一步纯化可得电泳纯蛋白，分子量大小约为67kDa。

同理，制备得到LcNagase、EfNagase、EfChi、SfChi、BnChi。

实施例2

重组酶的酶学性质检测

一、重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶学性质检测

1、重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活力测定

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶活力的测定方法具体如下：1.5mL离心管中加入200μL用蒸馏水配制的2mM pNP-GlcNAG底物，然后加入100μL 200mM相应的最适缓冲液，混匀，50℃预热1min，然后加入100μL适当稀释的酶液，反应10min后，加入400μL 0.5M NaOH溶液终止反应，冷却后测定A410值。

实施例1中制备得到的重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(BaNagase)的比酶活为16.42U mg^-1；LcNagase的比酶活力为95.50U mg^-1；EfNagase的比酶活力为3659.97U mg^-1。

2、重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的最适反应温度测定

将实施例1中制备得到的纯化的重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶溶液在200mM最适缓冲液中适当稀释，然后分别在不同温度下：30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃按照步骤1中的方法测定β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶活力，以酶活力的最高值作为100％。

结果显示重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(BaNagase)的最适温度为65℃，在55-75℃均具有较高活性；重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(LcNagase)的最适温度为50℃，在45-55℃均具有较高活性；重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EfNagase)的最适温度为50℃，在40-55℃均具有较高活性。

3、重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的温度稳定性测定

将实施例1制备得到的纯化的重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶溶液在200mM的最适缓冲液中适当稀释，然后分别在不同温度下：30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，保温30min，随后在冰水浴中冷却30min，最后在最适温度和pH 5.0条件下按照步骤1中的方法测定β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶活力，以未经热处理的酶液作为对照，分别计算不同热处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。结果显示重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(BaNagase)在55℃以下较为稳定，酶活力能保持80％以上；重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(LcNagase)在50℃以下较为稳定，酶活力能保持80％以上；重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EfNagase)在50℃以下较为稳定，酶活力能保持90％以上。

二、重组几丁质酶的酶学性质检测

1、重组几丁质酶的酶活力

几丁质酶的酶活力的测定方法具体如下：1.5mL离心管中加入350μL质量分数为1％的胶体几丁质，再加入50μL适当稀释的酶液，最适反应温度下孵育30min，加入600μLDNS液，沸水浴10min终止反应。12000rpm离心5min，于540nm下测定吸光值。

实施例1中制备得到的重组几丁质酶EfChi的比酶活为0.42U mg^-1；SfChi的比酶活力为0.84U mg^-1；BnChi的比酶活力为0.29U mg^-1。

2、重组几丁质酶的最适反应温度测定

将实施例1中制备得到的纯化的重组几丁质酶溶液在200mM最适缓冲液中适当稀释，然后分别在不同温度下：30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃按照步骤1中的方法测定几丁质酶的酶活力，以酶活力的最高值作为100％。

结果显示重组几丁质酶(EfChi)的最适温度为65℃，在55-70℃均具有较高活性；重组几丁质酶(SfChi)的最适温度为55℃，在40-55℃均具有较高活性；重组几丁质酶(BnChi)的最适温度为45℃，在40-50℃均具有较高活性。

3、重组几丁质酶的温度稳定性测定

将实施例1制备得到的纯化的重组几丁质酶溶液在200mM的最适缓冲液中适当稀释，然后分别在不同温度下：30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，保温30min，随后在冰水浴中冷却30min，最后在最适温度和pH 5.0条件下按照步骤1中的方法测定几丁质酶的酶活力，以未经热处理的酶液作为对照，分别计算不同热处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。结果显示重组几丁质酶(EfChi)在50℃以下较为稳定，酶活力能保持70％以上；重组几丁质酶(SfChi)在40℃以下较为稳定，酶活力能保持50％以上；重组几丁质酶(BnChi)在45℃以下较为稳定，酶活力能保持50％以上。

实施例3

组合酶在酶法合成氨基寡糖中的应用(1)

重组蛋白LcNagase和纤维素酶组合物(酶活(U)比例为5:1)催化N-乙酰氨基葡萄糖逆向合成氨基寡糖的反应条件：反应pH 5.5，反应温度40℃，N-乙酰氨基葡萄糖质量分数25％，加酶量180U/mL，反应时间1d。反应体系体积10mL。沸水浴煮沸10min灭酶终止反应。将上述制备的氨基寡糖反应液泵入活性炭柱，用浓度梯度5-30％的乙醇水溶液分离N-乙酰氨基葡萄糖和几丁寡糖。将分离后的几丁寡糖料液旋转蒸发(50-60℃)浓缩至糖液固形物含量30-60％，冷冻干燥得到几丁寡糖粉末。反应产物分布用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法进行检测分析，产物纯度用高效液相色谱进行定量检测分析。实验结果显示，LcNagase和纤维素酶组合物能够逆向生成DP2-3的几丁寡糖(135±4mg，得率为5.4％，纯度为96.2％)。

实施例4

组合酶在酶法合成氨基寡糖中的应用(2)

重组蛋白BaNagase、SfChi组合物(酶活(U)比例为10:3)催化N-乙酰氨基葡萄糖逆向合成氨基寡糖的反应条件：反应pH 6.0，反应温度45℃，N-乙酰氨基葡萄糖质量分数15％，加酶量260U/mL，反应时间2d。反应体系体积10mL。沸水浴煮沸10min灭酶终止反应。将上述制备的氨基寡糖反应液泵入活性炭柱，用浓度梯度5-40％的乙醇水溶液分离N-乙酰氨基葡萄糖和几丁寡糖。将分离后的几丁寡糖料液旋转蒸发(50-60℃)浓缩至糖液固形物含量30-60％，冷冻干燥得到几丁寡糖粉末。反应产物分布用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法进行检测分析，产物纯度用高效液相色谱进行定量检测分析。实验结果显示，BaNagase、SfChi组合酶能够逆向生成DP2-5的几丁寡糖(168±3mg，得率为11.2％，纯度为94.7％)。

实施例5

组合酶在酶法合成氨基寡糖中的应用(3)

重组蛋白LcNagase、BnChi和纤维素酶的组合物(酶活(U)比例为5:1:1)催化N-乙酰氨基葡萄糖逆向合成氨基寡糖反应条件：反应pH 5.0，反应温度37℃，N-乙酰氨基葡萄糖质量分数20％，加酶量140U/mL，反应时间3d。反应体系体积10mL。100℃保温10min灭酶终止反应。将上述制备的氨基寡糖反应液泵入活性炭柱，用浓度梯度5-60％的乙醇水溶液分离N-乙酰氨基葡萄糖和几丁寡糖。将分离后的几丁寡糖料液旋转蒸发(50-60℃)浓缩至糖液固形物含量30-60％，冷冻干燥得到几丁寡糖粉末。反应产物分布用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法进行检测分析，产物纯度用高效液相色谱进行定量检测分析。实验结果显示，LcNagase、BnChi和纤维素酶的组合酶能够逆向生成DP2-8的几丁寡糖(372±5mg，得率为18.6％，纯度为87.4％)。

实施例6

组合酶在酶法合成氨基寡糖中的应用(4)

重组蛋白EfNagase、EfChi和淀粉酶的组合物(酶活(U)比例为1:1:1)催化N-乙酰氨基葡萄糖苷酶逆向合成氨基寡糖的反应条件：反应pH 5.0，反应温度30℃，N-乙酰氨基葡萄糖质量分数30％，加酶量200U/mL，逆水解时间1d。反应体系体积10mL。100℃保温10min灭酶终止反应。将上述制备的氨基寡糖反应液泵入活性炭柱，用浓度梯度5-70％的乙醇水溶液分离N-乙酰氨基葡萄糖和几丁寡糖。将分离后的几丁寡糖料液旋转蒸发(50-60℃)浓缩至糖液固形物含量30-60％，冷冻干燥得到几丁寡糖粉末。反应产物分布用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法进行检测分析，产物纯度用高效液相色谱进行定量检测分析。实验结果显示，EfNagase、EfChi和淀粉酶的组合酶能够逆向生成DP2-10的几丁寡糖(435±9mg，得率为14.5％，纯度为91.4％)。

氨基寡糖的检测方法

具体检测方法如下：

(1)基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，Maldi-tof-MS)分析逆向合成产物

为了鉴定β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶/几丁质酶逆向合成寡糖的组成，采用MALDI-TOFMS法分析β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶/几丁质酶逆向合成的几丁寡糖产物。取反应液稀释40倍，与等体积10mg/mL 2,5-羟基苯甲酸水溶液混合均匀。样品(1μL)上样于Maldi载片使用AB SCIEX TOF/TOF^TM 4800系统采用阳离子模式分析样品。

(2)高效液相色谱法(High erformance liquid chromatography，HPLC)分析逆向合成产物

为了鉴定β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶/几丁质酶逆向合成寡糖的组成，采用HPLC法分析β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶/几丁质酶逆向合成的几丁寡糖产物。取反应液稀释3倍，样品(10μL)，使用Agilent 1260系统，分析色谱柱为Shodex Asahipak NH2P-50 4E column，流动相乙腈：水＝75:25的条件分析样品。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种利用N-乙酰氨基葡萄糖合成氨基寡糖的方法及其专用酶

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1851

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 1

tcgacaaaac cggacattcc gtcacaggcg gaacaagcgg tatcccgcat gacattagat 60

gaaaaactgg ggcagatgct catgcctgat tttcgaaatt ggcaaaagaa ggggcagtca 120

tcccctcagg ctcttaccca aatgaatgac gaagtcgcag ggcttattca aaagtaccgg 180

ttcggcggcg ttatcttatt tgaagaaaat gtaaaaagca ctgagcaaac ggtccgcctg 240

acagatgcct ttcaaaaggc gagccctgat attccacttt tattaagcat tgatcaagaa 300

ggcggcatcg taacaagact tggtgaaggc actcatttcc caggcaatat ggcactcgga 360

gccgcgagaa aaacagctta cgcgtcccag accggcgcca taatcgggaa agaactgaag 420

gcacttggca ttaatacgaa tttcgctccc gttctcgata tcaataataa tcccggaaat 480

ccggtcatcg gcgtcaggtc attcagttca gaccgtgatc tgacagcatc actcggcctt 540

gcctcaatga aggctcagca aaaacaggat gtcgctgccg ccgtcaaaca tttcccggga 600

cacggcgata cggatgtcga cagccactac ggcctcccgc ttgtcaccca cagtcaagaa 660

aggctgcgtc agattgaact ttatccgttc cggaaagcca ttcaggccgg ggccgatatg 720

atcatgacag cccatgtgca atttcccgct tttgacgata caacttataa aagcaaactg 780

gacggttcag acatcctcgt acccgccaca ctctcgaaaa aagtgatgac tcatcttctc 840

cgtgaggaaa tgggatttaa cggcgtcatt gtcacggatg cattaaatat gaaagccatt 900

gccgatcatt tcggccagga agaggcggtc gtcatggccg taaaagcagg agtggatatc 960

gctctgatgc cggcccaagt gacatcgctg caaacggaaa accgctttgc ccaagttctt 1020

gccgctttaa aaaaggcggt tcagaaaggg gaaataccgg ttcagcaaat taacaaatcg 1080

gcggaacgca tcatttccct gaaaataaaa agaggtatat atcccgcgaa agaaacaagt 1140

ctgaataaga aggtcgcaaa agcaaagcaa accgtcggaa gcaaaaacca tctgaaagct 1200

gaaaaacaaa tcgcggaaag atccgtcacc gtcttacaaa acaaaaaccg tacccttcca 1260

ttcaaaccga aaaagaacag ccgcgttctc attgccgctc cttatgaaga tcaaacagca 1320

tccatggaac aaaccatccg gcagctcatc aagaagaaag agatccggcc ggtaaccatc 1380

agtaaaatga acttcgccga gcgcacattt aatgatgagt ataaaaagct cgtatccgac 1440

gccgattacg tcattacagg ctcatatgtc gtgaaaaatg accctgtcgt aaatgacggc 1500

accattgacg attctgtcac agatcccggc aagtggacga ccgcatttcc gcgggccgtc 1560

atgaaatccg cacaatcgaa ccataaaccc tttgtgctga tgagccttcg taatccttac 1620

gacgccgcta attttgaaga agctgaagcc cttattgcag tctacggctt taaaggatat 1680

gcagacggac aatttcttca gccaaacatt ccggcaggca ttgaagcgat attcggacag 1740

acaaaaccga aaggcaggct gcccgttgac attccttccg tcactcaccc gggaacgacg 1800

ctgtaccctt atggcttcgg aattaatcta aaaaacggaa aaccgcttta a 1851

<210> 2

<211> 616

<212> PRT

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 2

Ser Thr Lys Pro Asp Ile Pro Ser Gln Ala Glu Gln Ala Val Ser Arg

1 5 10 15

Met Thr Leu Asp Glu Lys Leu Gly Gln Met Leu Met Pro Asp Phe Arg

20 25 30

Asn Trp Gln Lys Lys Gly Gln Ser Ser Pro Gln Ala Leu Thr Gln Met

35 40 45

Asn Asp Glu Val Ala Gly Leu Ile Gln Lys Tyr Arg Phe Gly Gly Val

50 55 60

Ile Leu Phe Glu Glu Asn Val Lys Ser Thr Glu Gln Thr Val Arg Leu

65 70 75 80

Thr Asp Ala Phe Gln Lys Ala Ser Pro Asp Ile Pro Leu Leu Leu Ser

85 90 95

Ile Asp Gln Glu Gly Gly Ile Val Thr Arg Leu Gly Glu Gly Thr His

100 105 110

Phe Pro Gly Asn Met Ala Leu Gly Ala Ala Arg Lys Thr Ala Tyr Ala

115 120 125

Ser Gln Thr Gly Ala Ile Ile Gly Lys Glu Leu Lys Ala Leu Gly Ile

130 135 140

Asn Thr Asn Phe Ala Pro Val Leu Asp Ile Asn Asn Asn Pro Gly Asn

145 150 155 160

Pro Val Ile Gly Val Arg Ser Phe Ser Ser Asp Arg Asp Leu Thr Ala

165 170 175

Ser Leu Gly Leu Ala Ser Met Lys Ala Gln Gln Lys Gln Asp Val Ala

180 185 190

Ala Ala Val Lys His Phe Pro Gly His Gly Asp Thr Asp Val Asp Ser

195 200 205

His Tyr Gly Leu Pro Leu Val Thr His Ser Gln Glu Arg Leu Arg Gln

210 215 220

Ile Glu Leu Tyr Pro Phe Arg Lys Ala Ile Gln Ala Gly Ala Asp Met

225 230 235 240

Ile Met Thr Ala His Val Gln Phe Pro Ala Phe Asp Asp Thr Thr Tyr

245 250 255

Lys Ser Lys Leu Asp Gly Ser Asp Ile Leu Val Pro Ala Thr Leu Ser

260 265 270

Lys Lys Val Met Thr His Leu Leu Arg Glu Glu Met Gly Phe Asn Gly

275 280 285

Val Ile Val Thr Asp Ala Leu Asn Met Lys Ala Ile Ala Asp His Phe

290 295 300

Gly Gln Glu Glu Ala Val Val Met Ala Val Lys Ala Gly Val Asp Ile

305 310 315 320

Ala Leu Met Pro Ala Gln Val Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asn Arg Phe

325 330 335

Ala Gln Val Leu Ala Ala Leu Lys Lys Ala Val Gln Lys Gly Glu Ile

340 345 350

Pro Val Gln Gln Ile Asn Lys Ser Ala Glu Arg Ile Ile Ser Leu Lys

355 360 365

Ile Lys Arg Gly Ile Tyr Pro Ala Lys Glu Thr Ser Leu Asn Lys Lys

370 375 380

Val Ala Lys Ala Lys Gln Thr Val Gly Ser Lys Asn His Leu Lys Ala

385 390 395 400

Glu Lys Gln Ile Ala Glu Arg Ser Val Thr Val Leu Gln Asn Lys Asn

405 410 415

Arg Thr Leu Pro Phe Lys Pro Lys Lys Asn Ser Arg Val Leu Ile Ala

420 425 430

Ala Pro Tyr Glu Asp Gln Thr Ala Ser Met Glu Gln Thr Ile Arg Gln

435 440 445

Leu Ile Lys Lys Lys Glu Ile Arg Pro Val Thr Ile Ser Lys Met Asn

450 455 460

Phe Ala Glu Arg Thr Phe Asn Asp Glu Tyr Lys Lys Leu Val Ser Asp

465 470 475 480

Ala Asp Tyr Val Ile Thr Gly Ser Tyr Val Val Lys Asn Asp Pro Val

485 490 495

Val Asn Asp Gly Thr Ile Asp Asp Ser Val Thr Asp Pro Gly Lys Trp

500 505 510

Thr Thr Ala Phe Pro Arg Ala Val Met Lys Ser Ala Gln Ser Asn His

515 520 525

Lys Pro Phe Val Leu Met Ser Leu Arg Asn Pro Tyr Asp Ala Ala Asn

530 535 540

Phe Glu Glu Ala Glu Ala Leu Ile Ala Val Tyr Gly Phe Lys Gly Tyr

545 550 555 560

Ala Asp Gly Gln Phe Leu Gln Pro Asn Ile Pro Ala Gly Ile Glu Ala

565 570 575

Ile Phe Gly Gln Thr Lys Pro Lys Gly Arg Leu Pro Val Asp Ile Pro

580 585 590

Ser Val Thr His Pro Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Tyr Gly Phe Gly Ile

595 600 605

Asn Leu Lys Asn Gly Lys Pro Leu

610 615

<210> 3

<211> 1305

<212> DNA

<213> Lactobacillus casei

<400> 3

atggtgttga gtctgagtca gccgcccaag caggtagctg ctgctgataa caccttgaaa 60

agcgtttttt cgattgatgc gggacgaaag tttttttccg cggatcagtt gaaaatgatc 120

attgatcggg cacatacaga cggttacacc gatgtgcagg ttttattggg caacgatgca 180

ttgcgattgc tacttgatga catgagcgtg acgatcaatg gcaaaacata tggcagtgat 240

gtcgtgaaac aggccataca ggctggtaac aaagcgtact acgatgatcc aaacgggaat 300

gcgttgacgc aaaccgacat ggatgcggtc ttgaaatatg cagcggcacg ggatatcaat 360

atcattccgg ttatcaatag tcccggccat atggatgcca ttttgacggc gatggcgcaa 420

ctaggcatta agaatcctgc ctttaatggg tctaaacgga ctgtcgatct taacaatgac 480

actgctattg cctttacaaa agcgctattg cagaagtatg tgatgtattt caaggggcat 540

gctacgatct tcaactttgg cagtgacgag tatgcaaatg atgtcgatac tggcggctgg 600

gccaagttgc aacaaagtgg cacctacaaa aagtttgtgg catacgtcaa cgacttagcg 660

gcgatggcca aaaatgccag cctgaagccg atggttttca atgacgggat ttattatgac 720

aataacacca gtttcgggac ttttgacaag gatttgatcg tctcttattg gaccgctggc 780

tggggcgggt atgatgtcgc aaagccagaa tttttgaccg ataagggttt gaaaatcatg 840

aataccaatg acggttggta ttgggtttta ggtcgcgtgg acggcgatct ctatagttac 900

aaaacggcgc tagctagttt agcaagtaaa aaatttactg atgtacccgg cgcttcgagt 960

gccgtgccga ttattggcag tgtgcaggcg gtttgggcgg atgatccgag tgcacagtta 1020

gacatgccgg cgctgttgaa gttgatggat caattttcga cagcctatgc accttactta 1080

gttcgcccag ccgattacag taaagttgat gccgccatcg ctgccgtgcc gcggcaactt 1140

aatcagtaca ccgaagcatc agttgctaaa cttgatgcag cgttaaatgc tgttgtccgc 1200

ggtaaaaagg caaccgatca ggcattggtt gacggctatg cccagaccat tactgtcgcc 1260

atcaaggcac tgcaactgcg gccggccgat tacacaaagg tttga 1305

<210> 4

<211> 434

<212> PRT

<213> Lactobacillus casei

<400> 4

Met Val Leu Ser Leu Ser Gln Pro Pro Lys Gln Val Ala Ala Ala Asp

1 5 10 15

Asn Thr Leu Lys Ser Val Phe Ser Ile Asp Ala Gly Arg Lys Phe Phe

20 25 30

Ser Ala Asp Gln Leu Lys Met Ile Ile Asp Arg Ala His Thr Asp Gly

35 40 45

Tyr Thr Asp Val Gln Val Leu Leu Gly Asn Asp Ala Leu Arg Leu Leu

50 55 60

Leu Asp Asp Met Ser Val Thr Ile Asn Gly Lys Thr Tyr Gly Ser Asp

65 70 75 80

Val Val Lys Gln Ala Ile Gln Ala Gly Asn Lys Ala Tyr Tyr Asp Asp

85 90 95

Pro Asn Gly Asn Ala Leu Thr Gln Thr Asp Met Asp Ala Val Leu Lys

100 105 110

Tyr Ala Ala Ala Arg Asp Ile Asn Ile Ile Pro Val Ile Asn Ser Pro

115 120 125

Gly His Met Asp Ala Ile Leu Thr Ala Met Ala Gln Leu Gly Ile Lys

130 135 140

Asn Pro Ala Phe Asn Gly Ser Lys Arg Thr Val Asp Leu Asn Asn Asp

145 150 155 160

Thr Ala Ile Ala Phe Thr Lys Ala Leu Leu Gln Lys Tyr Val Met Tyr

165 170 175

Phe Lys Gly His Ala Thr Ile Phe Asn Phe Gly Ser Asp Glu Tyr Ala

180 185 190

Asn Asp Val Asp Thr Gly Gly Trp Ala Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr

195 200 205

Tyr Lys Lys Phe Val Ala Tyr Val Asn Asp Leu Ala Ala Met Ala Lys

210 215 220

Asn Ala Ser Leu Lys Pro Met Val Phe Asn Asp Gly Ile Tyr Tyr Asp

225 230 235 240

Asn Asn Thr Ser Phe Gly Thr Phe Asp Lys Asp Leu Ile Val Ser Tyr

245 250 255

Trp Thr Ala Gly Trp Gly Gly Tyr Asp Val Ala Lys Pro Glu Phe Leu

260 265 270

Thr Asp Lys Gly Leu Lys Ile Met Asn Thr Asn Asp Gly Trp Tyr Trp

275 280 285

Val Leu Gly Arg Val Asp Gly Asp Leu Tyr Ser Tyr Lys Thr Ala Leu

290 295 300

Ala Ser Leu Ala Ser Lys Lys Phe Thr Asp Val Pro Gly Ala Ser Ser

305 310 315 320

Ala Val Pro Ile Ile Gly Ser Val Gln Ala Val Trp Ala Asp Asp Pro

325 330 335

Ser Ala Gln Leu Asp Met Pro Ala Leu Leu Lys Leu Met Asp Gln Phe

340 345 350

Ser Thr Ala Tyr Ala Pro Tyr Leu Val Arg Pro Ala Asp Tyr Ser Lys

355 360 365

Val Asp Ala Ala Ile Ala Ala Val Pro Arg Gln Leu Asn Gln Tyr Thr

370 375 380

Glu Ala Ser Val Ala Lys Leu Asp Ala Ala Leu Asn Ala Val Val Arg

385 390 395 400

Gly Lys Lys Ala Thr Asp Gln Ala Leu Val Asp Gly Tyr Ala Gln Thr

405 410 415

Ile Thr Val Ala Ile Lys Ala Leu Gln Leu Arg Pro Ala Asp Tyr Thr

420 425 430

Lys Val

<210> 5

<211> 1035

<212> DNA

<213> Enterococcus faecalis

<400> 5

aaaagtgtct tttccattga tgcgggaaga aaatattttt ccgtggagca actggaagaa 60

ttagtggcca aagctagtca aaatgggtac acagatgtcc aattaatttt aggaaatgat 120

ggcttacggt ttatcttgga tgatatgtcg gtcaatgtga atggtaaaaa atacaaccac 180

aaccgggttt caaaagcaat ccaacgaggc aacaacgcat attacaatga tcctaatggc 240

aacgcgttaa cacaaaaaga aatggatcgg ttgttggctt ttgcgaaagc gcgcaacatc 300

aacatcattc ccgtgattaa cagtccagga catatggatg ccttgttagt ggccatggaa 360

aaactagcga ttaaaaatcc cgcttttgat ggctcaaaac gaacagtaga tttagggaac 420

caaaaggcag tgaatttcac aaaggcgatt atcagtaagt acgtggctta tttttccgcg 480

catagtgaaa ttttcaattt tggcggcgat gagtatgcaa atgatgtcga tacaggcggt 540

tgggcgaaac tgcaatcttc tgggcgctac aaagattttg tcgcttatgc gaatgattta 600

gctaaaataa ttaaagatgc gggcatgcag ccaatgagct tcaatgatgg catttattac 660

aacagcgacg attctttcgg tacatttgac ccagagatta ttatttctta ttggacagcc 720

ggttggagcg gatatgacgt agccaaacct gagtactttg ttcaaaaagg acacaaaatt 780

tttaatacca atgatgcgtg gtattgggtc gctggcaatg ttgattctgg catttatcaa 840

tatgatgatg ctttagcaaa tatgtcgaaa aaagcattta cagatgtgcc agcaggtagc 900

ccgaatcttc caattattgg aagtattcaa tgtgtttggt atgatgaccc tcgtcgtgac 960

tatgattttg aacgaattta tacgctaatg gatacgttct cggaaaatta tcgtgagtat 1020

atggtggtta aataa 1035

<210> 6

<211> 344

<212> PRT

<213> Enterococcus faecalis

<400> 6

Lys Ser Val Phe Ser Ile Asp Ala Gly Arg Lys Tyr Phe Ser Val Glu

1 5 10 15

Gln Leu Glu Glu Leu Val Ala Lys Ala Ser Gln Asn Gly Tyr Thr Asp

20 25 30

Val Gln Leu Ile Leu Gly Asn Asp Gly Leu Arg Phe Ile Leu Asp Asp

35 40 45

Met Ser Val Asn Val Asn Gly Lys Lys Tyr Asn His Asn Arg Val Ser

50 55 60

Lys Ala Ile Gln Arg Gly Asn Asn Ala Tyr Tyr Asn Asp Pro Asn Gly

65 70 75 80

Asn Ala Leu Thr Gln Lys Glu Met Asp Arg Leu Leu Ala Phe Ala Lys

85 90 95

Ala Arg Asn Ile Asn Ile Ile Pro Val Ile Asn Ser Pro Gly His Met

100 105 110

Asp Ala Leu Leu Val Ala Met Glu Lys Leu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Ser Lys Arg Thr Val Asp Leu Gly Asn Gln Lys Ala Val

130 135 140

Asn Phe Thr Lys Ala Ile Ile Ser Lys Tyr Val Ala Tyr Phe Ser Ala

145 150 155 160

His Ser Glu Ile Phe Asn Phe Gly Gly Asp Glu Tyr Ala Asn Asp Val

165 170 175

Asp Thr Gly Gly Trp Ala Lys Leu Gln Ser Ser Gly Arg Tyr Lys Asp

180 185 190

Phe Val Ala Tyr Ala Asn Asp Leu Ala Lys Ile Ile Lys Asp Ala Gly

195 200 205

Met Gln Pro Met Ser Phe Asn Asp Gly Ile Tyr Tyr Asn Ser Asp Asp

210 215 220

Ser Phe Gly Thr Phe Asp Pro Glu Ile Ile Ile Ser Tyr Trp Thr Ala

225 230 235 240

Gly Trp Ser Gly Tyr Asp Val Ala Lys Pro Glu Tyr Phe Val Gln Lys

245 250 255

Gly His Lys Ile Phe Asn Thr Asn Asp Ala Trp Tyr Trp Val Ala Gly

260 265 270

Asn Val Asp Ser Gly Ile Tyr Gln Tyr Asp Asp Ala Leu Ala Asn Met

275 280 285

Ser Lys Lys Ala Phe Thr Asp Val Pro Ala Gly Ser Pro Asn Leu Pro

290 295 300

Ile Ile Gly Ser Ile Gln Cys Val Trp Tyr Asp Asp Pro Arg Arg Asp

305 310 315 320

Tyr Asp Phe Glu Arg Ile Tyr Thr Leu Met Asp Thr Phe Ser Glu Asn

325 330 335

Tyr Arg Glu Tyr Met Val Val Lys

340

<210> 7

<211> 1473

<212> DNA

<213> Enterococcus faecalis

<400> 7

atgaacggag tgcagaaagg aatggtgttc aaagtgggga acaatttatc gacaagaaaa 60

ggagaaaaca gagaaacaat tgtcagttgg ctgggtcttt cgttattggt tggcttggcg 120

tttatcttat ttagtctgtt tcatcaacca atgatcagcc aagccaatga gccgacccaa 180

gagaaacatt ttatggttta ttatcgggct tggcgtgaca aaacgatgca aggagttaat 240

acaacattgc cagatgaaaa ttggctaacg atgcacgata ttccttatgg tattgacatt 300

gtgaatgtct ttagttatgt gccaaaagga caagaagcac ttgcacagcc attttatgat 360

acgttaaaaa atgagtatgc gccagcactg catgcacgag gtgttcgttt agttcgtggg 420

attgattaca gcgagctatt aaaagttcct tatgcaggaa caacgcctac agaagcagaa 480

tttgatgctt atgcgaaaga gttgttaacc aaatttgtcg atgatttagg aattgatggg 540

ttagatattg acatggaaac tcgtccaagt gaaaaagata ttgttctatc taatggtgtc 600

attcgtgcat tatcaaaata cattggaccg aagtcgggaa cggatcgtcc atttttgtat 660

gataccaatg cagaatattt accaccttta caagatgtca gtgactgttt cgattttctc 720

gcgtatcaac agtatggcag cgatgaccaa cgcacgcaac gagcattaaa taatttaagt 780

ccggttctca atggggaacg atttgttcca ggattaactt tcccagaaga gcaagatcgc 840

aaccgctggt atgacacaaa agagccgtat atggaaagta acatgtataa agtagctcgt 900

tattcttatg aaaataattt agggggcatg ttcctctatg ccttagatcg cgatggtcgc 960

acctataatg aagacgattt aaatcagata aaaccttcta atttactttg gacaaaaacg 1020

gccattgcag agagtaaagg cgtttctctt gcagagatga aagcggctgc gcaacactat 1080

ttaaaacgaa ttagctacgc caacacagac cttgaagcac aaaataaagc cgcagaagca 1140

gtgacacaag caacaacgct ttatgatgtg aataaagcta ttttaggtgg cgattatggc 1200

caagggattt caaacaccta tgatgctgaa ttagaaaaag gcctgttagc cattgactta 1260

accactttat atcgtgcgtt ggatcaagca gttacagcca ttgaaaaggc agaaagctat 1320

acaccagaaa cgattcaagc actacaaaca acaaaagaga cagtcgccac agaacttgcg 1380

ggaaaaacgt atacagccgc acaagtgact acttggcaaa cggaggtcca aacagctttg 1440

gataatttaa aagagaaaca aacacaacct tta 1473

<210> 8

<211> 491

<212> PRT

<213> Enterococcus faecalis

<400> 8

Met Asn Gly Val Gln Lys Gly Met Val Phe Lys Val Gly Asn Asn Leu

1 5 10 15

Ser Thr Arg Lys Gly Glu Asn Arg Glu Thr Ile Val Ser Trp Leu Gly

20 25 30

Leu Ser Leu Leu Val Gly Leu Ala Phe Ile Leu Phe Ser Leu Phe His

35 40 45

Gln Pro Met Ile Ser Gln Ala Asn Glu Pro Thr Gln Glu Lys His Phe

50 55 60

Met Val Tyr Tyr Arg Ala Trp Arg Asp Lys Thr Met Gln Gly Val Asn

65 70 75 80

Thr Thr Leu Pro Asp Glu Asn Trp Leu Thr Met His Asp Ile Pro Tyr

85 90 95

Gly Ile Asp Ile Val Asn Val Phe Ser Tyr Val Pro Lys Gly Gln Glu

100 105 110

Ala Leu Ala Gln Pro Phe Tyr Asp Thr Leu Lys Asn Glu Tyr Ala Pro

115 120 125

Ala Leu His Ala Arg Gly Val Arg Leu Val Arg Gly Ile Asp Tyr Ser

130 135 140

Glu Leu Leu Lys Val Pro Tyr Ala Gly Thr Thr Pro Thr Glu Ala Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ala Tyr Ala Lys Glu Leu Leu Thr Lys Phe Val Asp Asp Leu

165 170 175

Gly Ile Asp Gly Leu Asp Ile Asp Met Glu Thr Arg Pro Ser Glu Lys

180 185 190

Asp Ile Val Leu Ser Asn Gly Val Ile Arg Ala Leu Ser Lys Tyr Ile

195 200 205

Gly Pro Lys Ser Gly Thr Asp Arg Pro Phe Leu Tyr Asp Thr Asn Ala

210 215 220

Glu Tyr Leu Pro Pro Leu Gln Asp Val Ser Asp Cys Phe Asp Phe Leu

225 230 235 240

Ala Tyr Gln Gln Tyr Gly Ser Asp Asp Gln Arg Thr Gln Arg Ala Leu

245 250 255

Asn Asn Leu Ser Pro Val Leu Asn Gly Glu Arg Phe Val Pro Gly Leu

260 265 270

Thr Phe Pro Glu Glu Gln Asp Arg Asn Arg Trp Tyr Asp Thr Lys Glu

275 280 285

Pro Tyr Met Glu Ser Asn Met Tyr Lys Val Ala Arg Tyr Ser Tyr Glu

290 295 300

Asn Asn Leu Gly Gly Met Phe Leu Tyr Ala Leu Asp Arg Asp Gly Arg

305 310 315 320

Thr Tyr Asn Glu Asp Asp Leu Asn Gln Ile Lys Pro Ser Asn Leu Leu

325 330 335

Trp Thr Lys Thr Ala Ile Ala Glu Ser Lys Gly Val Ser Leu Ala Glu

340 345 350

Met Lys Ala Ala Ala Gln His Tyr Leu Lys Arg Ile Ser Tyr Ala Asn

355 360 365

Thr Asp Leu Glu Ala Gln Asn Lys Ala Ala Glu Ala Val Thr Gln Ala

370 375 380

Thr Thr Leu Tyr Asp Val Asn Lys Ala Ile Leu Gly Gly Asp Tyr Gly

385 390 395 400

Gln Gly Ile Ser Asn Thr Tyr Asp Ala Glu Leu Glu Lys Gly Leu Leu

405 410 415

Ala Ile Asp Leu Thr Thr Leu Tyr Arg Ala Leu Asp Gln Ala Val Thr

420 425 430

Ala Ile Glu Lys Ala Glu Ser Tyr Thr Pro Glu Thr Ile Gln Ala Leu

435 440 445

Gln Thr Thr Lys Glu Thr Val Ala Thr Glu Leu Ala Gly Lys Thr Tyr

450 455 460

Thr Ala Ala Gln Val Thr Thr Trp Gln Thr Glu Val Gln Thr Ala Leu

465 470 475 480

Asp Asn Leu Lys Glu Lys Gln Thr Gln Pro Leu

485 490

<210> 9

<211> 1281

<212> DNA

<213> Serratia fonticola

<400> 9

atggctttaa cccgtaaact gctacccttg ctggtagcgg tgcaactcgg tgtggctggc 60

gtgggcatgg ctcacgcggc accttatctc tctgtcggct acttcaacgg cggtggcgac 120

gtaaccgccg ggccgggcgg tgatatcaac cagcttgacg tcagccagat cacccacctc 180

aactactctt ttggcctgat ttataacgct gaaaaagagg aaaccaaccc ggcactgaaa 240

gatccctccc gcctacacca aatctatctc tcccctaaag tcgaagcaga cttaaagcta 300

ttacccgtat tgcgccagca aaatccggcg ctgaaggttt tgctgtccgt tggcggatgg 360

ggagctcgtg ggttctccgg cgcggcagcc acaccggaaa gccgggcggt gtttattcgt 420

tcggtgcagg aggtgattgc caagtatcag ctagatggta tcgatctgga ttgggaatac 480

ccggttaacg gtgcctgggg attggtggaa agccagccca ctgacagagc caatttcacc 540

gccctactga gcgaactgca tcaggcgttg ggtaaagaaa aactgctgac catcgccgtc 600

ggggctaacg tcaaaagtcc gcaggaatgg gtagacgtta aggctatcgc gccctatctg 660

aactacatca atctgatgac ctacgacatg gcgtacggta cccagtattt caattccaat 720

ctctatgact ccaaacaatg gccaaccgtg gccgccgccg acaagtacag cgccgacttt 780

gtggtcaaca actatttggc cgccgggctg aagccagctc agctcaatct ggggatcggt 840

ttctatggcc gggtacctaa acgcgccacc gagccgggta ttgattggga tgtggcagat 900

gcggccaagc atcccgtcac ccagccctat ttcaccacac gtgaaaaaga cgtcttcaag 960

tcactgggcg tggatttgga taaagacagt tacatcaagt acaacgatat tgtgaacaag 1020

atgctgaaag acccacaacg gcgcttcacc gcgcattggg atagcgaggc caaggtgccc 1080

tatctgatga tgaagtcatc cgcaggcaaa ccactgttcg cgataagcta tgaaaacccg 1140

cgctcggtag ccatcaaggc cgagtacatc aagagcaaag gattgggagg ggcgatgttc 1200

tgggagtatg gcgcggacga taacaaccgc ctggcccacc agttagccga aagcttaggc 1260

ttgagcccgc agaagcagta a 1281

<210> 10

<211> 426

<212> PRT

<213> Serratia fonticola

<400> 10

Met Ala Leu Thr Arg Lys Leu Leu Pro Leu Leu Val Ala Val Gln Leu

1 5 10 15

Gly Val Ala Gly Val Gly Met Ala His Ala Ala Pro Tyr Leu Ser Val

20 25 30

Gly Tyr Phe Asn Gly Gly Gly Asp Val Thr Ala Gly Pro Gly Gly Asp

35 40 45

Ile Asn Gln Leu Asp Val Ser Gln Ile Thr His Leu Asn Tyr Ser Phe

50 55 60

Gly Leu Ile Tyr Asn Ala Glu Lys Glu Glu Thr Asn Pro Ala Leu Lys

65 70 75 80

Asp Pro Ser Arg Leu His Gln Ile Tyr Leu Ser Pro Lys Val Glu Ala

85 90 95

Asp Leu Lys Leu Leu Pro Val Leu Arg Gln Gln Asn Pro Ala Leu Lys

100 105 110

Val Leu Leu Ser Val Gly Gly Trp Gly Ala Arg Gly Phe Ser Gly Ala

115 120 125

Ala Ala Thr Pro Glu Ser Arg Ala Val Phe Ile Arg Ser Val Gln Glu

130 135 140

Val Ile Ala Lys Tyr Gln Leu Asp Gly Ile Asp Leu Asp Trp Glu Tyr

145 150 155 160

Pro Val Asn Gly Ala Trp Gly Leu Val Glu Ser Gln Pro Thr Asp Arg

165 170 175

Ala Asn Phe Thr Ala Leu Leu Ser Glu Leu His Gln Ala Leu Gly Lys

180 185 190

Glu Lys Leu Leu Thr Ile Ala Val Gly Ala Asn Val Lys Ser Pro Gln

195 200 205

Glu Trp Val Asp Val Lys Ala Ile Ala Pro Tyr Leu Asn Tyr Ile Asn

210 215 220

Leu Met Thr Tyr Asp Met Ala Tyr Gly Thr Gln Tyr Phe Asn Ser Asn

225 230 235 240

Leu Tyr Asp Ser Lys Gln Trp Pro Thr Val Ala Ala Ala Asp Lys Tyr

245 250 255

Ser Ala Asp Phe Val Val Asn Asn Tyr Leu Ala Ala Gly Leu Lys Pro

260 265 270

Ala Gln Leu Asn Leu Gly Ile Gly Phe Tyr Gly Arg Val Pro Lys Arg

275 280 285

Ala Thr Glu Pro Gly Ile Asp Trp Asp Val Ala Asp Ala Ala Lys His

290 295 300

Pro Val Thr Gln Pro Tyr Phe Thr Thr Arg Glu Lys Asp Val Phe Lys

305 310 315 320

Ser Leu Gly Val Asp Leu Asp Lys Asp Ser Tyr Ile Lys Tyr Asn Asp

325 330 335

Ile Val Asn Lys Met Leu Lys Asp Pro Gln Arg Arg Phe Thr Ala His

340 345 350

Trp Asp Ser Glu Ala Lys Val Pro Tyr Leu Met Met Lys Ser Ser Ala

355 360 365

Gly Lys Pro Leu Phe Ala Ile Ser Tyr Glu Asn Pro Arg Ser Val Ala

370 375 380

Ile Lys Ala Glu Tyr Ile Lys Ser Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Phe

385 390 395 400

Trp Glu Tyr Gly Ala Asp Asp Asn Asn Arg Leu Ala His Gln Leu Ala

405 410 415

Glu Ser Leu Gly Leu Ser Pro Gln Lys Gln

420 425

<210> 11

<211> 1272

<212> DNA

<213> Buttiauxella noackiae

<400> 11

atggtcttca cgcgtaaact gctgccgttg ctcgcagtaa tacaaatcgc ctgtgccggt 60

gtggctcagg caagctctta tctctccgtc ggttacttta atggaggcgg tgatgttacc 120

gccgggcctg gtggcgatat caacaaactc gatgtgcgcc agataaccca cctcaattac 180

tcatttggtc tgatttacaa cgacgagaaa gacgaaacca atccggcgct gaaagatgcc 240

tcaaaattgc accagatttg gttatcacca aaagtgatgt ccgaccttga gaagatcccg 300

gagttgcgta aacagaatcc ctcactgaaa gttttgctgt ctgtaggtgg ttggggtgct 360

cgtggctttt caggagctgc ggcaacacct gaaaaccgcg ctgtgtttat ccgctcagta 420

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aatggcgcat gggggttagt ggcaagtctt cctgaagacc gcgctaattt cactgccttg 540

ctaaacgaac tgcgcaccgc tttgggtaaa gaaaaattac tgaccatcgc tgtgggcgct 600

aacgtgaaaa gcccaacgga atgggtcgat gtgaaggcca ttgcaccagc gctggattac 660

atcaacctga tgacctacga catggcgtat ggcactcagt actttaacgc taatctgtat 720

gattcgaaga cctggccaac cgtggctgcg gctgataact acaacgttaa tttcgtggtc 780

gataattata tcaaagcggg gcttaagccg gcacagatga acctcggtat cggcttctac 840

ggccgtatcc ctaaacgcgc aaccgaaccg ggtattgact gggataaacc agacgctgct 900

aaaaatccgg tcacacaacc gtactttggt gatacagaaa aagcgttgtt tatgtcttta 960

ggtgttgatc taaccaaaga cagttatatg aaatacaacg atattgtcag caagatgctt 1020

aacgatccgc agaaacgctt taccgaaaac tgggatgatg acgcgcatgt gccttatctg 1080

accatcaagt cagccgaagg taagccgctg ttcgctattt cttatgagaa cccgcgttct 1140

gtagcaatta aagcggagta catcaaagcg aaaggcctgg gtggcgcaat gttctgggag 1200

tatggcgcgg atgataataa ccaactggcg aaagagctag ccaaagattt gggcattaaa 1260

acggagcatt aa 1272

<210> 12

<211> 423

<212> PRT

<213> Buttiauxella noackiae

<400> 12

Met Val Phe Thr Arg Lys Leu Leu Pro Leu Leu Ala Val Ile Gln Ile

1 5 10 15

Ala Cys Ala Gly Val Ala Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Val Gly Tyr

20 25 30

Phe Asn Gly Gly Gly Asp Val Thr Ala Gly Pro Gly Gly Asp Ile Asn

35 40 45

Lys Leu Asp Val Arg Gln Ile Thr His Leu Asn Tyr Ser Phe Gly Leu

50 55 60

Ile Tyr Asn Asp Glu Lys Asp Glu Thr Asn Pro Ala Leu Lys Asp Ala

65 70 75 80

Ser Lys Leu His Gln Ile Trp Leu Ser Pro Lys Val Met Ser Asp Leu

85 90 95

Glu Lys Ile Pro Glu Leu Arg Lys Gln Asn Pro Ser Leu Lys Val Leu

100 105 110

Leu Ser Val Gly Gly Trp Gly Ala Arg Gly Phe Ser Gly Ala Ala Ala

115 120 125

Thr Pro Glu Asn Arg Ala Val Phe Ile Arg Ser Val Gln Asp Val Ile

130 135 140

Gln Arg Tyr Gly Leu Asp Gly Ile Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Val

145 150 155 160

Asn Gly Ala Trp Gly Leu Val Ala Ser Leu Pro Glu Asp Arg Ala Asn

165 170 175

Phe Thr Ala Leu Leu Asn Glu Leu Arg Thr Ala Leu Gly Lys Glu Lys

180 185 190

Leu Leu Thr Ile Ala Val Gly Ala Asn Val Lys Ser Pro Thr Glu Trp

195 200 205

Val Asp Val Lys Ala Ile Ala Pro Ala Leu Asp Tyr Ile Asn Leu Met

210 215 220

Thr Tyr Asp Met Ala Tyr Gly Thr Gln Tyr Phe Asn Ala Asn Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ser Lys Thr Trp Pro Thr Val Ala Ala Ala Asp Asn Tyr Asn Val

245 250 255

Asn Phe Val Val Asp Asn Tyr Ile Lys Ala Gly Leu Lys Pro Ala Gln

260 265 270

Met Asn Leu Gly Ile Gly Phe Tyr Gly Arg Ile Pro Lys Arg Ala Thr

275 280 285

Glu Pro Gly Ile Asp Trp Asp Lys Pro Asp Ala Ala Lys Asn Pro Val

290 295 300

Thr Gln Pro Tyr Phe Gly Asp Thr Glu Lys Ala Leu Phe Met Ser Leu

305 310 315 320

Gly Val Asp Leu Thr Lys Asp Ser Tyr Met Lys Tyr Asn Asp Ile Val

325 330 335

Ser Lys Met Leu Asn Asp Pro Gln Lys Arg Phe Thr Glu Asn Trp Asp

340 345 350

Asp Asp Ala His Val Pro Tyr Leu Thr Ile Lys Ser Ala Glu Gly Lys

355 360 365

Pro Leu Phe Ala Ile Ser Tyr Glu Asn Pro Arg Ser Val Ala Ile Lys

370 375 380

Ala Glu Tyr Ile Lys Ala Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Phe Trp Glu

385 390 395 400

Tyr Gly Ala Asp Asp Asn Asn Gln Leu Ala Lys Glu Leu Ala Lys Asp

405 410 415

Leu Gly Ile Lys Thr Glu His

420

Claims

1.一种以N-乙酰氨基葡萄糖为底物合成聚合度为2-10的氨基寡糖的组合物，其特征在于，所述组合物选自以下组合中的一种：

（1）重组蛋白LcNagase和纤维素酶组合物，且酶活比例为5:1；

（2）重组蛋白BaNagase、SfChi组合物，且酶活比例为10:3；

（3）重组蛋白LcNagase、BnChi和纤维素酶的组合物，且酶活比例为5:1:1；

（4）重组蛋白EfNagase、EfChi和淀粉酶的组合物，且酶活比例为1:1:1；

所述重组蛋白LcNagase是指SEQ ID NO.4第1-434位氨基酸残基编码的蛋白质，

所述重组蛋白BaNagase是指SEQ ID NO.2第1-616位氨基酸残基编码的蛋白质，

所述重组蛋白EfNagase是指SEQ ID NO.6第1-344位氨基酸残基编码的蛋白质，

所述SfChi是指SEQ ID NO.10第1-426位氨基酸残基编码的蛋白质，

所述BnChi是指SEQ ID NO.12第1-423位氨基酸残基编码的蛋白质，

所述EfChi是指SEQ ID NO.8第1-490位氨基酸残基编码的蛋白质。

2.如权利要求1所述组合物的应用，其特征在于，以N-乙酰氨基葡萄糖为底物，用如权利要求1所述组合物催化N-乙酰氨基葡萄糖逆向合成氨基寡糖。

3.以N-乙酰氨基葡萄糖为底物合成聚合度为2-10的氨基寡糖的方法，其特征在于，以N-乙酰氨基葡萄糖为底物，用如权利要求1所述组合物催化N-乙酰氨基葡萄糖逆向合成氨基寡糖，所述N-乙酰氨基葡萄糖的质量分数为5-40%；所述反应条件为：反应pH 5.0-6.5，反应30-50°C，反应时间1-6天。