CN111334488A

CN111334488A - 昆布多糖酶ouc-l1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111334488A
Application number: CN202010257314.5A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 姜宏; 黄倚; 孙建安; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111334488B

Abstract

本发明公开了昆布多糖酶OUC‑L1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码该昆布多糖酶OUC‑L1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的昆布多糖酶OUC‑L1，是从人体肠道细菌A.muciniphila基因组中发掘到，属于糖苷水解酶GH16家族，能够有效水解昆布多糖，其主要产物为三部分寡糖，具有较高的比酶活，具有良好的生物催化效率。在35℃有着最高反应活力。此外该酶也具有很好的适冷性。本发明还公开了一种含有昆布多糖酶的酶制剂，在低温下依旧具有可观得催化活力，具有良好的工业化应用潜质。

Description

昆布多糖酶OUC-L1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及昆布多糖酶OUC-L1及其编码基因与应用，属于功能基因克隆表达技术领域。

背景技术

昆布寡糖是昆布多糖降解后的产物，聚合度(DP)一般在2～10之间。研究证实昆布寡糖不仅具有提高机体的免疫能力、调节肠道菌群、改善糖尿病症状等一系列重要生理活性，且相较于昆布多糖在抗肿瘤、抗氧化性方面呈现更优的活性。目前的研究中，使用酶法、物理法、化学法均可降解昆布多糖，得到一系列的寡糖产物。化学法可采用酸碱溶液对昆布多糖进行降解，而物理法可采用γ射线来降解昆布多糖。由于化学法、物理法都是在剧烈的条件下随机破坏昆布多糖内的糖苷键，降解程度难以控制，会形成一系类聚合度分散的寡糖产物，难以分离纯化；而且，采用化学法与物理法制备寡糖时剧烈的反应条件不仅会对昆布多糖原有的生物活性造成破坏，往往也伴随着高能耗及对环境造成污染的潜在风险。酶法指利用昆布多糖酶，在温和可控的条件下对昆布多糖进行特异性水解，水解产物为聚合度较为均一的寡糖。随着绿色、环保、节能的理念流行，使用酶法制备昆布寡糖产品便成了一种极具潜力的产业趋势。

人体肠道微生物中蕴藏着丰富的多糖降解酶资源。Akkermansia muciniphila是疣微菌门的一种肠道微生物，由于其与人类多种代谢紊乱和疾病成显著的负相关而备受关注，CN110693917A涉及Akkermansia muciniphila菌在制备预防和治疗抑郁症的药物或保健品中的应用。该微生物在肠道中能够高效水解碳水化合物和肠粘膜蛋白，是一种理想的糖苷水解酶挖掘宿主。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种比酶活高的昆布多糖酶——OUC-L1，及其编码基因，以及应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

昆布多糖酶OUC-L1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1：

MKSLFAVLLTACLCMSVKGEDSKPPRTLPGGWVYVWGDEFNGSRIDAKKWKPELGVIRNQGSQQTYTGRPKNMRLEDGCLVLETHFEKFANVNYKKSSADWIKNTKFMPYTSGSVTTIKTKNFMFGRLEVRAKVPKTKGIWPAIWLLGKNKWGWPVNGEIDMLENISQQPDVVYSTFHLSPDGVSTRDASRGGTVKIENLSDDFHTYVMEWDKDSIKLMVDDKLVKSIDLNTTNYANGAGNPFRTPFYLILNSAVGGTWCEKAPKDGQGYPVKFLIDYVRFYQTKEHAQQAKQFDPETGLPKKK。

一种编码上述昆布多糖酶OUC-L1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

5’-ATGAAGAGCCTATTTGCCGTGTTGTTGACTGCATGCCTTTGCATGTCTGTAAAGGGAGAAGATTCCAAACCTCCGAGGACCCTCCCCGGCGGGTGGGTTTATGTCTGGGGTGACGAGTTCAACGGTTCCAGGATAGACGCCAAAAAGTGGAAACCGGAGTTGGGAGTAATCCGTAACCAGGGCTCCCAGCAGACTTATACAGGCCGACCCAAGAATATGAGATTGGAGGATGGCTGCCTGGTTTTGGAAACCCATTTTGAAAAGTTCGCCAATGTCAATTATAAGAAAAGTTCCGCGGATTGGATCAAGAATACCAAGTTCATGCCCTATACCTCCGGTTCCGTTACGACGATCAAAACAAAAAATTTCATGTTCGGCAGACTGGAAGTGCGTGCCAAGGTTCCCAAAACCAAGGGCATCTGGCCTGCCATCTGGTTGCTTGGCAAGAATAAATGGGGCTGGCCCGTCAACGGGGAGATTGATATGCTGGAGAATATTTCCCAACAGCCGGATGTGGTTTATTCCACTTTCCACTTGAGTCCGGACGGCGTGTCCACAAGGGACGCTTCCCGCGGAGGGACTGTGAAGATAGAGAATCTTTCCGATGATTTTCATACCTATGTCATGGAATGGGACAAGGATTCCATCAAGTTGATGGTGGATGACAAGCTGGTGAAGTCCATTGACCTTAATACCACTAATTATGCCAATGGGGCGGGGAATCCGTTCCGTACGCCGTTCTATCTCATTCTCAATTCCGCCGTGGGCGGCACCTGGTGCGAGAAAGCTCCTAAAGACGGGCAAGGGTATCCTGTAAAATTCCTGATTGATTACGTTCGGTTCTATCAGACGAAAGAACATGCCCAGCAGGCTAAGCAGTTTGACCCGGAAACCGGCCTGCCCAAGAAGAAATAG-3’。

所述昆布多糖酶OUC-L1在降解昆布多糖中的应用，在制备昆布寡糖中的应用。

一种降解昆布多糖的方法，采用上述昆布多糖酶OUC-L1降解昆布多糖，优选的，降解条件为：温度35℃，pH6.0。

一种酶制剂，包含上述昆布多糖酶OUC-L1，该酶制剂在降解昆布多糖中的应用。

本发明的昆布多糖酶OUC-L1，是从人体肠道细菌A.muciniphila基因组中发掘到，经鉴定属于糖苷水解酶GH16家族。该酶能够有效水解昆布多糖，其主要产物为三部分寡糖，具有较高的比酶活，具有良好的生物催化效率。在35℃有着最高反应活力。此外该酶也具有很好的适冷性，其被证实在20-50℃均有不错的催化活性，尤其是在20℃时依旧能达到最高酶活35％以上的降解活力，即在平常室温下也能有效水解昆布多糖。本发明的昆布多糖酶制剂，具有活性好、效率高、纯度高、产量高、稳定性好等优点，且在低温下依旧具有可观得催化活力，具有良好的工业化应用潜质。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：本发明的昆布多糖酶纯化后的纯酶SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker；1为粗酶蛋白；2为纯化后的昆布多糖酶蛋白。

图2：温度变化对相对酶活的影响。

图3：pH变化对相对酶活的影响。

图4：酶解产物的TLC图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本发明所涉及的人体肠道微生物Akkermansia muciniphila，为常见菌，诸多保藏机构都有保藏，比如保藏于美国模式培养物集存库(American type culture collection，简称ATCC)的Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835，也可通过多种渠道购买获得(比如可购自德国微生物菌种保藏库)。

实施例1 昆布多糖酶OUC-L1的克隆

本发明的昆布多糖酶OUC-L1的产酶基因，是以人体肠道细菌A.muciniphila(由中国农业科学院农产品加工研究所逄晓阳老师馈赠)基因组(虽然该菌的基因组序列已经公开，但关于本发明中所涉及的昆布多糖酶OUC-L1基因，并未有人将其单独分离或扩增出来并对其生物活性进行表征；本发明是首次从人体肠道微生物Akkermansia muciniphila基因组中分离得到OUC-L1基因)为模板，经PCR特异性扩增获得的：

在NCBI上下载人体肠道细菌A.muciniphila基因组序列(Accession number：GCA_000020225.1)，通过采用BioEdit软件将已表征的昆布多糖酶基因序列如LamC(Accessionnumber：CAZ95067.1)、LamR(Accession number：AAC69707.1)、Lam16(Accession number：AAD35118.1)等，与该基因组进行本地Blast比对，最终在A.muciniphila基因组中成功找到一个相似度较高的序列，命名为OUC-L1。SignalP预测结果显示该序列编码蛋白携带有信号肽，信号肽为前19个氨基酸序列。编码蛋白预测分子量为34.4kDa，等电点为9.25。通过PCR扩增，扩增基因序列中去掉了原有的信号肽。去掉信号肽后将该基因克隆至pET28a(+)载体中并在大肠杆菌中进行高效表达。根据进化树比对，发现该昆布多糖酶属于糖苷水解酶第16家族(GH16)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(本领域技术人员知晓该序列后，可以人工合成，为常规技术手段)。

以A.muciniphila(来自中国农业科学院农产品加工研究所)的基因组为模板，在昆布多糖酶基因的上、下游设计用于无缝克隆的引物，进行PCR扩增，得OUC-L1基因片段，该片段中已经去掉了原有信号肽。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-GATCCGAATTCGAGCTCCGTGAAGATTCCAAACCTCCGAGGA-3’，如SEQ IDNO.3所示；

下游引物：5’-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTCTTCTTGGGCAGGCCGG-3’，如SEQ ID NO.4所示。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μL，dNTP 10μL，引物各1.5μL，模板1μL，KOD Fx酶1μL，无菌水10μL，总体系50μL。

PCR的反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸60s，反应30个循环，72℃后延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳后回收其中大小在915kb的PCR产物片段。

实施例2 含昆布多糖酶基因的表达载体构建

基因片段与pET28a(+)克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基固体平板上。37℃培养箱中培养12-16h后，挑取单克隆至含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基，于转速220rpm的37℃摇床培养过夜，PCR阳性验证后测序。将测序验证无误的菌液放置于甘油管内-20℃保藏，表达载体命名为pET28a-OUC-L1。

实施例3 含昆布多糖酶基因的重组质粒及工程菌的构建

提取测序正确的菌液得到重组pET28a-OUC-L1质粒，转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在含50μg/mL卡那霉素抗性平板上长出。

实施例4 利用大肠杆菌工程菌制备重组昆布多糖酶

吸取100μL大肠杆菌重组菌株接种在5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h后按1％的接种量接入含有50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052培养基，20℃，200rpm培养48h，自诱导表达昆布多糖酶。

诱导结束后，菌液于4℃，8000g离心10min后收集菌体。细胞重悬于50mM pH 8.0的Tirs-HCl缓冲液中，超声破碎30min后12000g离心15min，上清液即为粗酶液。

粗酶液使用Ni^-NTA柱进行亲和层析纯化，使用10mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mMTris-HCl)平衡柱子，然后用30mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱结合力弱的杂蛋白，100mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，将得到的溶液进行SDS-PAGE检测(如图1所示)，使用Bradford法测定蛋白浓度。

实施例5 重组昆布多糖酶比酶活测定

昆布多糖酶OUC-L1活性的标准测定方法为：使用pH 6.0的柠檬酸缓冲液配置0.2％(m/v)昆布多糖底物。50μL酶液加入200μL的昆布多糖底物中，在35℃下反应30min，沸水浴5min对酶灭活后在小型离心机10000rpm中离心1min。之后取180μL溶液与270μL的DNS溶液混合，沸水浴5min后取出，使用酶标仪在540nm波长处测定吸光值。酶活力定义为在标准条件下每分钟产生1μM还原糖所需要的酶量。

实施例6 测定重组昆布多糖酶的最适反应条件

反应条件为：将重组昆布多糖酶与底物在20、30、35、40、45、50℃反应30min测定最适温度；在35℃下，选用pH为3.0-10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，根据昆布多糖酶的酶活力表现，确定昆布多糖酶的最适pH。结果如图2、图3所示，重组昆布多糖酶的最适反应温度为35℃，最适pH为6.0。目前大部分昆布多糖酶需要在较高温度下才能达到最高的催化活力，如来自细小裸藻Euglena gracilis中的昆布多糖酶需要在50℃才能达到最佳的催化条件。而来源罗尔夫青霉Penicillium rolfsii中的昆布多糖酶则需要在80℃的高温下才能达到最佳的催化条件。2018年有学者首次报道了来自于假交替单胞菌属Pseudoalteromonas具有适冷性的昆布多糖酶LA,此酶在20℃下只能达到19％的酶活力。由图2可知，昆布多糖酶OUC-L1具有很好的适冷性，在20-50℃均显示出不错的催化活性，尤其是在20℃时依旧能达到最高酶活35％以上的降解活力，即在平常室温下也能有效水解昆布多糖。

目前有关人体肠道内微生物来源的多糖降解酶报道较少，本发明首次从人体肠道微生物A.muciniphila中发掘到高活力昆布多糖酶，首次从肠道微生物中分离得到能够降解昆布多糖的水解酶并测定了其生物活性，该酶可应用于昆布寡糖的制备。经过亲和层析(镍柱)纯化后测定酶活为1.44U/mg，相比来自于产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes中的昆布多糖酶GluB酶活(0.7U/mg)显示出了较好的催化活力。该酶也表现出了一定的适冷性(在20-50℃显示出不错的活力，尤其是在20℃时依旧能达到最高酶活35％以上的催化活力，而昆布多糖酶LA在20℃下只能达到19％的酶活力)。与已报道的来自于假交替单胞菌属Pseudoalteromonas且具有适冷性的昆布多糖酶LA相比，该酶在更广阔的pH环境(pH3.0-8.0)下依旧表现出良好的水解活力。

实施例7 测定重组昆布多糖酶的降解产物

将实施例4中纯化所得昆布多糖酶OUC-L1与0.2％的昆布多糖在35℃下分别孵育不同时间，然后用TLC板检测产物。具体为：展开剂(正丁醇：乙酸：水＝3:2:2)，显色剂(显色剂：0.2％(w/v)地衣酚溶于10％(v/v)H₂SO₄溶液中)80℃显色。我们以葡萄糖及蔗糖为参照物，对降解产物进行TLC分析(以葡萄糖及蔗糖为参照物)，如图4所示，昆布多糖酶OUC-L1主要酶解产物由三部分寡糖组成。

实施例8 利用重组昆布多糖酶制备酶制剂

利用实施例4制备的重组昆布多糖酶制备酶制剂：发酵破碎后的溶液纯化后，用缓冲液置换咪唑，冻干后保存酶粉。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 昆布多糖酶OUC-L1及其编码基因与应用

<141> 2020-04-02

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> Akkermansia muciniphila

<400> 1

Met Lys Ser Leu Phe Ala Val Leu Leu Thr Ala Cys Leu Cys Met Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly Glu Asp Ser Lys Pro Pro Arg Thr Leu Pro Gly Gly Trp

20 25 30

Val Tyr Val Trp Gly Asp Glu Phe Asn Gly Ser Arg Ile Asp Ala Lys

35 40 45

Lys Trp Lys Pro Glu Leu Gly Val Ile Arg Asn Gln Gly Ser Gln Gln

50 55 60

Thr Tyr Thr Gly Arg Pro Lys Asn Met Arg Leu Glu Asp Gly Cys Leu

65 70 75 80

Val Leu Glu Thr His Phe Glu Lys Phe Ala Asn Val Asn Tyr Lys Lys

85 90 95

Ser Ser Ala Asp Trp Ile Lys Asn Thr Lys Phe Met Pro Tyr Thr Ser

100 105 110

Gly Ser Val Thr Thr Ile Lys Thr Lys Asn Phe Met Phe Gly Arg Leu

115 120 125

Glu Val Arg Ala Lys Val Pro Lys Thr Lys Gly Ile Trp Pro Ala Ile

130 135 140

Trp Leu Leu Gly Lys Asn Lys Trp Gly Trp Pro Val Asn Gly Glu Ile

145 150 155 160

Asp Met Leu Glu Asn Ile Ser Gln Gln Pro Asp Val Val Tyr Ser Thr

165 170 175

Phe His Leu Ser Pro Asp Gly Val Ser Thr Arg Asp Ala Ser Arg Gly

180 185 190

Gly Thr Val Lys Ile Glu Asn Leu Ser Asp Asp Phe His Thr Tyr Val

195 200 205

Met Glu Trp Asp Lys Asp Ser Ile Lys Leu Met Val Asp Asp Lys Leu

210 215 220

Val Lys Ser Ile Asp Leu Asn Thr Thr Asn Tyr Ala Asn Gly Ala Gly

225 230 235 240

Asn Pro Phe Arg Thr Pro Phe Tyr Leu Ile Leu Asn Ser Ala Val Gly

245 250 255

Gly Thr Trp Cys Glu Lys Ala Pro Lys Asp Gly Gln Gly Tyr Pro Val

260 265 270

Lys Phe Leu Ile Asp Tyr Val Arg Phe Tyr Gln Thr Lys Glu His Ala

275 280 285

Gln Gln Ala Lys Gln Phe Asp Pro Glu Thr Gly Leu Pro Lys Lys Lys

290 295 300

<210> 2

<211> 915

<212> DNA

<213> Akkermansia muciniphila

<400> 2

atgaagagcc tatttgccgt gttgttgact gcatgccttt gcatgtctgt aaagggagaa 60

gattccaaac ctccgaggac cctccccggc gggtgggttt atgtctgggg tgacgagttc 120

aacggttcca ggatagacgc caaaaagtgg aaaccggagt tgggagtaat ccgtaaccag 180

ggctcccagc agacttatac aggccgaccc aagaatatga gattggagga tggctgcctg 240

gttttggaaa cccattttga aaagttcgcc aatgtcaatt ataagaaaag ttccgcggat 300

tggatcaaga ataccaagtt catgccctat acctccggtt ccgttacgac gatcaaaaca 360

aaaaatttca tgttcggcag actggaagtg cgtgccaagg ttcccaaaac caagggcatc 420

tggcctgcca tctggttgct tggcaagaat aaatggggct ggcccgtcaa cggggagatt 480

gatatgctgg agaatatttc ccaacagccg gatgtggttt attccacttt ccacttgagt 540

ccggacggcg tgtccacaag ggacgcttcc cgcggaggga ctgtgaagat agagaatctt 600

tccgatgatt ttcataccta tgtcatggaa tgggacaagg attccatcaa gttgatggtg 660

gatgacaagc tggtgaagtc cattgacctt aataccacta attatgccaa tggggcgggg 720

aatccgttcc gtacgccgtt ctatctcatt ctcaattccg ccgtgggcgg cacctggtgc 780

gagaaagctc ctaaagacgg gcaagggtat cctgtaaaat tcctgattga ttacgttcgg 840

ttctatcaga cgaaagaaca tgcccagcag gctaagcagt ttgacccgga aaccggcctg 900

cccaagaaga aatag 915

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gatccgaatt cgagctccgt gaagattcca aacctccgag ga 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cagtggtggt ggtggtggtg tttcttcttg ggcaggccgg 40

Claims

1.昆布多糖酶OUC-L1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码权利要求1所述的昆布多糖酶OUC-L1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的昆布多糖酶OUC-L1的基因在降解昆布多糖中的应用。

4.权利要求1所述的昆布多糖酶OUC-L1的基因在制备昆布寡糖中的应用。

5.一种降解昆布多糖的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的昆布多糖酶OUC-L1降解昆布多糖。

6.根据权利要求5所述的降解昆布多糖的方法，其特征在于：降解条件为：温度35℃，pH6.0。

7.一种酶制剂，其特征在于：包含权利要求1所述的昆布多糖酶OUC-L1。

8.权利要求7所述的酶制剂在降解昆布多糖中的应用。