CN112430614A - 一种昆布多糖酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种昆布多糖酶及其应用。本发明提供了一种编码昆布多糖酶的基因，编码昆布多糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的昆布多糖酶在广泛的pH条件下具有极强的耐受性，用该酶水解昆布多糖获得的水解物具有更强的抗氧化能力，使其成为适合昆布多糖工业化开发的选择。

Description

一种昆布多糖酶及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种昆布多糖酶及其应用。

背景技术

外切和内切β-1,3-葡聚糖酶可以水解昆布多糖中的β-1,3-葡萄糖苷键，释放葡萄糖或低聚糖。到目前为止，细菌中还没有专门记录的外切β-1,3-葡聚糖酶，而内切β-1,3-葡聚糖酶被称为昆布多糖酶。根据水解位置，外切β-1,3-葡聚糖酶被归类为EC 3.2.1.58，内切β-1,3-葡聚糖酶被归类为EC 3.2.1.6和EC 3.2.1.39。

根据碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中的信息，GH16家族的内切β-1,3-葡聚糖酶(Laminarinase；EC3.2.1.39)来源于芽孢杆菌(Bacillus)、热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor)、纤维菌(Cellulosimicrobium)、黄杆菌(Laceyella)、溶杆菌(Lysobacter)、诺卡氏菌(Nocardiopsis)、拟芽孢杆菌(Paenibacillus)、土地杆菌(Pedobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomyces)、栖热孢菌(Thermotoga)、卓贝尔氏黄杆菌(Zobellia)等。在GH55、GH64、GH81、GH128、GH157和GH158中还发现了其他细菌内切-β-1,3-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)，其中包括节杆菌(Arthrobacter)、拟杆菌(Bacteroides)、克氏杆菌(Kribbella)、热双歧杆菌(Thermobifida)和维氏杆菌(Victivallis)等。

然而，现有的昆布多糖酶的适应pH值在偏酸和中性范围内，这使得昆布多糖酶在昆布多糖生物资源开发的过程中受限制。因此发现新型的耐极端酸性和碱性的昆布多糖对工业生产具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出一种编码昆布多糖酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明基于PCR的方法克隆了昆布多糖酶MaLamNA的核酸序列，序列分析结果表明，MaLamNA基因全长1545bp，编码514个氨基酸残基，预测分子量57.3kda，pI值5.83。预测含有一个信号肽，由位于N-末端的前18个氨基酸组成。蛋白质结构域分析表明，MaLamNA含有一个C端层粘连蛋白-G3结构域，专用于伴刀豆球蛋白A类凝集素/葡聚糖酶家族，表明MaLamNA在通过水解降解生物质方面具有潜在的作用。

根据本发明的实施例，该昆布多糖酶MaLamNA对昆布多糖具有特异性的水解活性，在45℃和pH 4.5-5.5条件下活性最高，对极端酸性和碱性pH具有很高的稳定性。MaLamNA水解昆布多糖的产物比未水解的昆布多糖具有更强的抗氧化活性。MaLamNA的这些特性为其在昆布多糖生物资源开发的工业应用中提供了新的选择。

在本发明的第二方面中，根据本发明实施例，提供了一种表达载体，其包含上述编码昆布多糖酶的多核苷酸。其中，多核苷酸为DNA序列。

在本发明的第三方面中，根据本发明实施例，提供了一种重组菌株，由前述表达载体转化宿主细胞获得。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备昆布多糖酶的方法，其包括下列步骤：

1)以海洋细菌Microbulbifer sp.ALW1基因组DNA为模板，通过设计特异性引物，利用PCR的方法扩增昆布多糖酶基因序列；

2)将所述昆布多糖酶基因克隆到质粒中，得到如权利要求2所述的表达载体；

3)将所述表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

4)将所述重组菌株发酵诱导表达，获得昆布多糖酶。

根据本发明实施例，本发明从海洋细菌Microbulbifer sp.ALW1中鉴定出一种新的β-1,3-葡聚糖酶MaLamNA，这是据报道属于微泡藻属的第一种β-1,3-葡聚糖酶。它作为一种昆布多糖酶专一地作用于底物昆布多糖。

在本发明的第五方面中，本发明提出了前述方法制得的昆布多糖酶。如前所述，根据本发明的实施例，可制备出对强酸和强碱条件具有很高的，且对于其他影响因子例如金属离子都具有良好的耐受能力的昆布多糖酶，这使得其在工业化生产中应用较为广泛。

在本发明的第六方面中，根据本发明实施例，本发明还提出了上述昆布多糖酶在水解昆布多糖中的应用。

具体而言，将所述昆布多糖酶加入含昆布多糖的醋酸盐缓冲液中，在40℃下酶解12h，获得昆布多糖水解物。其中，所述昆布多糖水解物用于制备抗氧化剂。

经上述昆布多糖酶水解后的昆布多糖具有更强的抗自由基和抗氧化能力，使其成为适合昆布多糖工业化开发的选择。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为表达产物SDS-PAGE电泳结果；

图2为MaLamNA的底物特异性测定；

图3为MaLamNA的系统发育树；

图4为MaLamNA的最适反应温度；

图5为MaLamNA的最适反应pH；

图6为MaLamNA的热稳定性测定曲线；

图7为MaLamNA的pH稳定性测定；

图8为金属离子对MaLamNA的影响；

图9为MaLamNA的酶解产物对DPPH自由基清除活性；

图10为MaLamNA的酶解产物对ABTS自由基清除活性；

图11为MaLamNA的酶解产物的还原力。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实验材料和试剂

1.菌株及载体：本发明所用海洋细菌Microbulbifer sp.ALW1，保藏单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，编号：CICC23821，保藏时间：2014-12-16。毕赤酵母表达载体pPIC9k及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2.酶类及其他生化试剂：内切酶及连接酶购自TaKaRa公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3.溶液及培养基：

(1)BMGY培养基：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，100mmol/L磷酸钾，1.34g/L YNB，4×10^-5％生物素，10％甘油，pH 6.0，用于毕赤酵母的培养。

(2)BMMY培养基：将上述BMGY培养基中的碳源替换成为终浓度为0.5％的甲醇溶液100mL，用于毕赤酵母的诱导培养。

需要说明的是：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1

1、菌株ALW1基因组提取

采用PureLink^TM基因组DNA小量提取试剂盒(Thermo Fisher Science，USA)按照说明书提取菌株ALW1的基因组DNA。

2、昆布多糖酶MalamNA基因的PCR扩增

以菌株ALW1的基因组DNA为模板，用利用引物MaLamNA-F(5′-CCGGAATTCGATTTTTGGTGTCTGGAAGCA-3′)和MaLamNA-R(5′-ATTTGCGGCCGCGTGATGCCCAACGCTGA-3′)进行PCR扩增，扩增条件为94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，30次循环；72℃ 10min；4℃保温。利用凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，获得昆布多糖酶MalamNA基因。

3、重组表达载体pPIC9K-MaLamNA的构建

将扩增的昆布多糖酶MaLamNA基因利用EcoR I和Not I酶切后，插入载体pPIC-9K。

4、表达载体pPIC9K-MaLamNA转化毕赤酵母GS115

重组质粒pPIC-9K-MaLamNA经SalI线性化后，电穿孔转化毕赤酵母GS115细胞。转化子在MD培养平板(13.4g/L YNB(北京索莱宝科技有限公司)，4×10^-5％生物素，10g/L葡萄糖，15g/L琼脂)上培养3天后，在含2.5mg/mL G418抗生素的YPD平板(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂)上进行筛选。阳性转化子进行PCR和DNA测序验证。

实施例2昆布多糖酶MaLamNA的表达及底物特异性

含有pPIC-9K-MaLamNA重组质粒的毕赤酵母GS115菌株以2％的接种量接种至300mL BMGY培养基中，30℃ 220rpm振荡培养约18h直至OD₆₀₀达到3.0～6.0，5000rpm离心5min，收集沉淀，沉淀重新悬浮于300mL BMMY培养基中，30℃ 220rpm振荡培养7d，每24h补充500μL 0.5％甲醇诱导蛋白表达。发酵液在4℃下7500rpm离心15min，上清液用微孔超滤膜浓缩。用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0)透析48h，共3次，缓冲液总用量为上清液体积的100倍。以牛血清白蛋白为标准，用BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度。浓缩样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电(SDS-PAGE)。考马斯亮蓝染色可见蛋白条带，如图1。从凝胶中回收目的条带，通过质谱分析(Nano-ESI-MS/MS)鉴定该蛋白。

通过使用3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法测量昆布多糖释放的还原糖量来测定昆布多糖酶活性。在450μL含5.0mg/mL昆布多糖的50mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)中加入50μLMaLamNA酶液(0.5mg/mL)，在45℃孵育30min后，加入500μL DNS试剂，沸水浴10min，冷却至室温后，记录540nm处的吸光度，并换算为酶活力单位。1个酶活力单位(U)定义为在该反应条件下每分钟释放1μmoL还原糖所需的酶量。

分别在450μL含5.0mg/ml的昆布多糖、普鲁兰多糖、淀粉、木聚糖和石耳素为底物的50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)中加入50μL酶液(0.5mg/ml)，在45℃孵育30min后，加入500μL DNS试剂，沸水浴10min，冷却至室温后，记录540nm处的吸光度，测定MaLamNA的底物特异性。

结果如图2所示，Laminarin(昆布多糖)是一种水溶性多糖，是自然界常见的β-1,3-葡聚糖之一，主要含有β-1,3和部分β-1,6-糖苷键。Pullulan(普鲁兰多糖)是一种由麦芽三糖单元组成的多糖，其中三个葡萄糖单元通过α-1,4糖苷键连接，麦芽三糖单元通过α-1,6-糖苷键连接。Starch(淀粉)由葡萄糖单体的链组成，葡萄糖单体通过α-1,4-糖苷键连接，分支通过α-1,6-糖苷键连接。Xylan(木聚糖)是一种主要的半纤维素，主链由β-1,4-连接的木糖残基组成。Pustulan(石耳素)由β-1,6-葡聚糖组成。结果显示，MaLamNA主要作用于主要含有β-1,3-糖苷键的昆布多糖，表明MaLamNA是一种β-1,3-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)。

实施例3昆布多糖酶MaLamNA序列分析

生物信息学分析使用NCBI保守域程序执行保守域搜索。信号肽的预测是在SignalP5.0在线平台上进行的。通过在线计算等电点(PI/Mw)工具预测蛋白质的分子量和等电点(PI)。用ClustalW程序生成蛋白质序列的对齐，用MEGA(v10.1)程序建立系统发育树。

结果表明，MaLamNA基因全长1545bp，编码514个氨基酸残基，预测分子量57.3kDa，pI值5.83。预测含有一个信号肽，由位于N-末端的前18个氨基酸组成。蛋白质结构域分析表明，MaLamNA含有一个C端层粘连蛋白-G3结构域，专用于伴刀豆球蛋白A类凝集素/葡聚糖酶家族，表明MaLamNA在通过水解降解生物质方面具有潜在的作用。

参照图3，MaLamNA的系统发育分析与EC 3.2.1.39中不同糖苷水解酶家族的昆布多糖酶特征相比较，表明MaLamNA与其他家族成员在同一家族分支中关系不紧密，这意味着MaLamNA可以暂时归入非分类的家族。

实施例4昆布多糖酶MaLamNA的温度和pH稳定性

在450μL含5.0mg/ml昆布多糖的50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)中加入50μLMaLamNA酶液(0.5mg/mL)。分别在25、30、35、40、45、50、55、60℃孵育30min后，加入500μL的DNS试剂，沸水浴10min，冷却至室温后，记录540nm处的吸光度，确定MaLamNA的最适温度。在25～60℃温度下放置1h后，通过对残留酶活力进行测定来考察其热稳定性。

分别在450μL含5.0mg/mL昆布多糖的50mmol/L醋酸盐缓冲液(pH3.0～6.0)、磷酸钠缓冲液(pH6.0～7.0)、Tris-HCl缓冲液(pH7.0～9.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0～11.0)加入50μL MaLamNA酶液(0.5mg/mL)。在45℃孵育30min后，加入500μL的DNS试剂，沸水浴10min，冷却至室温后，记录540nm处的吸光度，确定MaLamNA的最适pH。分别在醋酸盐缓冲液(pH3.0和pH5.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH11.0)中，在25℃孵育120h，每24h测定残余酶活力，考察其pH稳定性。

结果如图4-图7所示，活性曲线表明，MaLamNA在45℃和pH 4.5-5.5下的活性最高(图4和图5)。MaLamNA在25至45℃的温度范围内表现出热稳定性，而当温度达到50℃及以上时，稳定性急剧下降(图6)。MaLamNA对强酸和强碱条件具有很强的耐受性，即使在pH值为3.0、5.0和11.0的环境中孵育120小时，其初始活性仍保持在55％以上(图7)。由此可见，MaLamNA的高pH耐受性和稳定性为其潜在的工业应用提供了理想的特性。

实施例5昆布多糖酶MaLamNA其他酶学性质

将25μL MaLamNA酶液(0.5mg/ml)分别置于终浓度为1mmol/L或10mmol/L的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺的溶液中，按1:1体积混合，在25℃孵育1h后，加入450μL含5.0mg/ml昆布多糖的50mmol/L醋酸盐缓冲液(PH5.0)，测定MaLamNA对金属离子的稳定性，以不加金属离子的酶活力为100％，研究金属离子对昆布多糖酶活性的影响。

结果如图8所示，K⁺和Mg²⁺对酶活性无显著影响。Na⁺和Ca²⁺在两种浓度下对酶活性都有轻微的促进作用，而Cu²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺则降低了MaLamNA的活性。Ba²⁺浓度为1mmol/L时对酶活性几乎没有影响，为10mmol/L处表现出正作用。Mn²⁺浓度为1mmol/L时提高了酶活性，而较高浓度时降低了MaLamNA的活性。

实施例6昆布多糖水解物的制备

将纯化的昆布多糖酶MaLamNA(2.3U)加入100mL含1％(w/v)昆布多糖的50mmol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中，在40℃下酶解12h。沸水浴10min，冰浴5min，终止反应。在4℃下6250rpm离心20min后，应用微孔过滤离心机将上清液进行微孔过滤。滤液被收集起来，进一步冷冻干燥成粉末，备用。

实施例7昆布多糖水解物的抗氧化活性

为了评价上述昆布多糖酶MaLamNA的实际应用价值，以MaLamNA的酶解产物(实施例6获得的昆布多糖水解物)对DPPH、ABTS自由基清除活性和还原能力进行了测定。

DPPH自由基清除试验：在1mL DPPH甲醇溶液(2mg/mL)中加入不同浓度(1mL)的MaLamNA的酶解产物，反应30min后，在517nm处测定吸光度。以昆布多糖作对照。

ABTS自由基清除试验：原液包括7mmol/L ABTS溶液和2.4mmol/L过硫酸钾溶液。通过将两种原液等量混合，并允许它们在室温下在黑暗中反应14小时来制备工作溶液。然后用2mL ABTS溶液与50mL甲醇混合稀释，用分光光度计在734nm处获得0.305±0.01unit的吸光度。每次测定均配制新鲜的ABTS溶液。不同浓度(1mL)的MaLamNA的酶解产物与2mL的ABTS溶液反应，5min后在734nm处测定吸光度。以昆布多糖作为对照组。

酶解产物还原力测定试验，通过测量700nm处普鲁士蓝的形成来监测Fe²⁺。将1mL组分(50-800μg/mL)，2.5mL磷酸盐缓冲液(pH6.6)和2.5mL 1％铁氰化钾在50℃孵育30min，加入2.5mL 10％三氯乙酸，4420rpm离心10min，约2.5mL上清液用2.5mL蒸馏水稀释，加入0.5mL新鲜制备的0.1％三氯化铁摇匀。在700nm处测定吸光度。

517nm和734nm处吸光度的增加分别反映了对DPPH和ABTS自由基清除能力的增强。增量按公式(1-A₁/A₀)×100计算，其中A₀是阴性对照的吸光度，A₁是在处理样品存在时的吸光度。700nm处吸光度的增加反映了还原力的增加。

结果如图9-图11所示，MaLamNA的酶解产物对自由基的清除能力和还原力呈浓度依赖性增加，酶解产物对DPPH和ABTS的抗氧化活性显著提高(图9-图11)。当浓度为12.5mg/mL时，酶解液对DPPH的去除率为62％，而昆布多糖对自由基清除率仅为14％，酶解物的IC₅₀值为6.8mg/mL(图9)。酶解物对ABTS的清除能力比昆布多糖显著。当浓度为2.4mg/mL时，ABTS清除活性从昆布多糖的3％提高到水解物的82％，IC₅₀值为1.5mg/mL(图10)。此外，昆布多糖酶解后还原力明显增强，且昆布多糖及其酶解产物浓度越高，还原力增加越明显(图11)。

综上，根据本发明的实施例，从海洋细菌Microbulbifer sp.ALW1中鉴定出一种新的β-1,3-葡聚糖酶MaLamNA，这是据报道属于微泡藻属的第一种β-1,3-葡聚糖酶。它作为一种昆布多糖酶专一地作用于底物昆布多糖。

MaLamNA对强酸和强碱条件具有很高的耐受性，在pH3.0、5.0、10.0的环境中孵育120h，活性仍在55％以上；水解产物的自由基清除能力和还原能力与其浓度具有相关性，水解产物的浓度越高，抗氧化能力越强；相对于酸水解、碱水解多糖等方法，采用酶解法具有特异性强，无副产物生成的优点，是有效、安全的生产方法；水解体系中酶用量少，水解过程简便易行，且主要作用于具有β-1,3-糖苷键的昆布多糖，具有底物特异性。

因此，MaLamNA在广泛的pH条件下具有极强的耐受性，水解后的昆布多糖具有更强的抗自由基和抗氧化能力，使其成为适合昆布多糖工业化开发的选择，并提供了一种酶作为制备工具。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 集美大学

<120> 一种昆布多糖酶及其应用

<130> 无

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgagatttc ttttattttt tatcttgttg gtgtcttttc aggtatcgca tgctgatttt 60

tggtctggaa gcagtcgtaa ttttctccgg acacaattgg ggaataaagt ggcgatttcc 120

tgccataact gttacgccat agataataaa gttttaagtt tagaggaaac gctttcatat 180

attcatagtg gtcaggctgc aggtgccgat ctaatagaaa tagatatggt ggcgcataat 240

aacagctggg tagtaaggca tgatggtatc cctaagggtt cctctgaaac tgaggaccct 300

gagtacctag gcccggattt tgaactggtg tttcaggatt ctgctttcag aaatggttcc 360

caagtaccgt ttatagagtt gaagtcgaaa cttggaccaa acgtaggtga tcactatgcc 420

aaccttctga tcggcacact aaacgatctt ggctatctgg agtcagggaa aatagtggtt 480

attcgatctt ttcatttaga tactttgaaa gaaattaaaa ctgccttgtc cggattgact 540

gctcaaaagc aatcgcgagt caagttaagt cgagcttacc gtactaattt tgagccagat 600

gttgagcttt gtgaaaattc tgaggcttgc ggaaaacttg aagcttggca gaaagatatc 660

gccagggtta agtcgaatgg atatgaaatg gtggagctca attttcaaac caaaaatatt 720

gcgagtctta ttgagtacgc taagtcgtta ggtttggcgg taaacctgtg gacaataaga 780

gattactcgg aagtttttgc ggcaatcttt cgggagagtg tagatgcctt gaccatagac 840

caaaataaag ggcaatggga gagaagtcgg gaaacgaata tccgaattgc caggtcggtg 900

atatccgatc caaccaatat tctacatctg aatatggcag gtcaaaatta tactaatagc 960

aactatctga attatgtgga tcagactgcg agccggcaga tttaccgctt tagcaacggg 1020

catcccagtt gggagtggct tggggccatt ggtgaagatc ggtttggcgg ttcattaatt 1080

tttgataaga ataatgctca ctttgtgcga ctgcacgatg gagacaataa ttcaggtgag 1140

ggttttttag tgcatgctgt agttaacttt gattcgtttt cgggaagtcc cacacaggcg 1200

atcgtcagca aagccgatac tggaggcttt gcgcttgaat taagtggcgg ctatttacga 1260

tttggtgtgc acgttaatgg tgcgtatcat tacgttaaat atccacagca aaattttaat 1320

gggacagata cctatcaaat agttggcgtc tacgatggca gtggtggcgt tagaatgtgg 1380

gtggacggaa aagaggtagg tacgcccccc gttgtagatg gagaggttac gaaaaataat 1440

tcgcctatcg ttataggtgc tgatccacag ggttggtcaa atcaacgatt tttcttttcc 1500

gggaaaatac agcaggtaaa tgttcagcgt tgggggcatc actga 1545

Claims (8)

1.一种编码昆布多糖酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的编码昆布多糖酶的基因。

3.一种重组菌株，其特征在于，通过如权利要求2所述的表达载体转化宿主细胞获得。

4.一种制备昆布多糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以海洋细菌Microbulbifer sp.ALW1基因组DNA为模板，通过设计特异性引物，利用PCR的方法扩增昆布多糖酶基因序列；

2)将所述昆布多糖酶基因克隆到质粒中，得到如权利要求2所述的表达载体；

3)将所述表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

4)将所述重组菌株发酵诱导表达，获得昆布多糖酶。

5.权利要求4所述的方法制得的昆布多糖酶。

6.权利要求5所述的昆布多糖酶在水解昆布多糖中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述昆布多糖酶加入含昆布多糖的醋酸盐缓冲液中，在40℃下酶解12h，获得昆布多糖水解物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述昆布多糖水解物用于制备抗氧化剂。

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