CN116179517A - 一种葡聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents

一种葡聚糖酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

一种葡聚糖酶突变体及其应用，以葡聚糖酶PfGlu16C为母本对Asp57和Asn114两个位点分别突变后而得。该葡聚糖酶突变体最适温度较野生型提高5‑10℃，55℃下的半衰期较野生型分别延长77.8%和37.0%，T 50值较野生型分别提高10.7℃和2.2℃；在催化效率方面两个突变体与野生型持平，无明显降低。相对于盲目筛菌或人工自然诱变等手段，酶分子改良缩短了酶学性质改造时间。这样一种在酸性pH环境和中低温范围内保持稳定，并具有高酶活的葡聚糖酶变体经过麸皮降解实验，显示其对麸皮的水解效率效果显著，符合饲料添加需求。

Description

一种葡聚糖酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体的涉及一种第16家族热稳定性提升的葡聚糖酶突变体及其应用。
背景技术
纤维素、半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞干重的40％-45％，是由葡萄糖通过β-1,4和β-1,3糖苷键连接而形成的线形分子。半纤维素(主要包括木聚糖、葡聚糖和甘露聚糖)的素约占细胞干上的30％-35％，是继纤维素之后最丰富的可再生生物质资源，它由杂聚多糖组成，按主链组成类型来命名分为为葡聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖等(Schulze E 1891.Ber Dtsch Chem Ges 24,2277-2287)。其中β-葡聚糖是单子叶禾本科植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，主要存在于糊粉层和胚乳细胞中，如大麦和燕麦胚乳细胞壁约含有约70％-75％的β-葡聚糖酶(Philippe S et al.,2016.Planta 224(2),449-461)。
β-葡聚糖酶是能分解β-葡萄糖苷键链成的葡聚糖聚合物的一类酶的总称。按作用方式不同，可以分为内切型和外切型两类，其中β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)可以专一作用于与β-1,3键相连的β-1,4糖苷键，使其降解为低分子量片段，失去亲水性和粘性，降低单胃动物肠道内容物粘度，提高内源性消化酶活性，改善肠道微生物环境，提高生长性能和饲料转化率(Mathlouthi N et al.2002.Amin Res 51,395-406.)。在食品酿造方面应用广泛，尤其在啤酒酿造过程中，麦芽中的葡聚糖造成啤酒过滤困难、堵塞过滤膜，增加了啤酒的生产成本和品质，采用酸性葡聚糖酶和木聚糖酶协同作用可以解决以上问题。因此，酸性葡聚糖酶的生产、纯化、热稳定性、催化效率以及酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工以及能源等领域的应用研究正在不断深入。由于不同工业对葡聚糖酶性质需求不同，因此改良有应用潜力的葡聚糖酶研究仍有重大意义。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供了一种第16家族耐热葡聚糖酶突变体及其应用。该类突变体是对葡聚糖酶野生型的氨基酸进行定点突变后得到的酸性的葡聚糖酶突变体，该类突变体能够耐受70℃以上的高温处理，在酸性pH条件下均有非常高的半纤维素酶活力，尤其是在饲料、啤酒酿造及食品工业行业中具有很好的应用潜力。
技术方案：一种葡聚糖酶突变体，以葡聚糖酶PfGlu16C为母本对Asp57或Asn114两个位点分别突变后而得。
母本PfGlu16C的基因序列如SEQ ID NO：1所示。氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
上述Asp57位点突变后得突变体D57N，基因序列如SEQ ID NO：2所示。氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
上述Asn114位点突变后得突变体N144L，基因序列如SEQ ID NO：3所示。氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
一种重组载体，含有上述基因序列。
一种重组菌株，含有上述重组载体。
上述重组菌在制备饲料中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供的一种热稳定性优良的适合于在半纤维素降解中应用的葡聚糖酶突变体，该葡聚糖酶突变体最适温度较野生型提高5-10℃，55℃下的半衰期较野生型分别延长77.8％和37.0％，T50值较野生型分别提高10.7℃和2.2℃；在催化效率方面两个突变体与野生型持平，无明显降低。相对于盲目筛菌或人工自然诱变等手段，酶分子改良缩短了酶学性质改造时间。这样一种在酸性pH环境和中低温范围内保持稳定，并具有高酶活的葡聚糖酶变体经过麸皮降解实验，显示其对麸皮的水解效率效果显著，符合饲料添加需求。
附图说明
图1为野生型和两个突变体的最适pH；
图2为野生型和两个突变体的pH稳定性；
图3为野生型和两个突变体的最适温度；
图4为野生型和两个突变体在55℃下的半衰期t1/2；
图5为野生型和两个突变体的T50值。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
1.菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115从Invitrogen公司购买。
2.酶类及其它生化试剂：高保真聚合酶购自Fermentas公司，大麦葡聚糖购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3.培养基：
1)YPD培养基：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物；
2)LB培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1％琼脂粉(固体)；
3)MD培养基：1.5％琼脂糖，2％葡萄糖，0.00004％Biotin，1.34％YNB；
5)BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，1％甘油(V/V)，0.00004％，Biotin1.34％YNB；
6)BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％YNB，0.5％甲醇(V/V)，0.00004％Biotin。
实施例1耐热葡聚糖酶突变体编码基因的获得
以来源于Pseudocercospora fijiensis的葡聚糖酶基因PfGlu16c的重组表达载体pic9r_PfGlu16c为模板，采用定点突变法对D57和N144两个位点分别进行定点突变，引物设计如表1所示，突变方法以及克隆方法参考文献(You，et al.,2016)。
表1木聚糖酶HwXyl10A的定点突变引物
Figure BDA0003748928070000031
实施例2耐热葡聚糖酶突变体的制备
将PCR获得的线性重组表达载体直接转化DMT感受态，菌落PCR验证，获得突变体的核酸序列，将重组质粒线性化后转化毕赤酵母Gs115，获得重组酵母菌株Gs115/D57N和Gs115/N144L。
将含有重组质粒的Gs115菌株，接种于2mL BMGY培养基的10mL试管中，置于30℃，220rpm摇床培养48h后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用2mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养48h。取上清用于酶活性检测，筛选到热稳定性和催化活力较野生酶同时提高的突变体D57N和N144L。
将野生型菌株GS115/PfGlu16C和两个突变菌株Gs115/D57N和Gs115/N144L放大发酵体系，首先接种于YPD培养基中获得种子培养液，按1％接种量接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。最后将上清液浓缩至20mL，采用阴离子交换法纯化蛋白用于酶学性质测定和比较。
实施例3重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的酶学性质比较分析
一、DNS法：具体方法如下：在各自最适pH、最适温度条件下，1mL的反应体系包括100μL稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解葡聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量。
二、重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的性质测定
1、重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的最适pH和pH稳定性测定方法如下:
将纯化的木聚糖酶突变体和野生型在不同的pH(1.0-6.5)下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中45℃下进行木聚糖酶活力测定。结果如图1所示，野生型和突变体的最适反应pH相近在4.0-4.5之间；野生型葡聚糖酶和突变体在pH1.0-12.0的环境中37℃处理1h后测定剩余酶活，结果如图2所示，野生型的pH稳定性与两个突变体并无明显差异，均在pH 3.0-pH 10.0之间稳定。
2、野生型葡聚糖酶和突变体的最适温度测定方法如下：
重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的最适温度的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)缓冲液体系及不同温度(30-70℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果如图3表明,耐热葡聚糖酶突变体D57N和N144L较野生型(45℃)的最适温度分别提高10℃和5℃，且两突变体在高温下的相对酶活较野生酶明显提高。
3、野生型葡聚糖酶和突变体热稳定性测定如下：
55℃条件下半衰期(t1/2)：突变体与野生型在55℃处理不同时间，最多处理120min，检测各自的剩余酶活,55℃的半衰期测定结果如图4表明，突变体D57N和N144L的t1/2分别为96分钟和74分钟，较野生型(54分钟)分别延长77.8％和37.0％，且突变体D57N热稳定性最好。
T50：突变体和野生酶在40-80℃之间处理半小时，当酶活剩余原来的一半时所对应的温度即为该酶的T50值。定结果如图5表明，突变体D57N和N144L的T50值分别为69.5℃和61.0℃，分别较野生型(58.8℃)提高10.7℃和2.2℃，该结果与半衰期测定结果趋势吻合。即热稳定性顺序为：D57N>N144L>PfGlu16C。
4、重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型的动力学参数测定方法如下:
检测方法参照文献(You，et al.,2018)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的木聚糖(1.25，1.0，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1mg/mL)为底物，在最适条件(温度、pH)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraFit7软件计算Km值及Vmax。
在各自最适条件下以大麦葡聚糖为底物时，重组耐热葡聚糖酶突变体D57N和N144L的催化效率(kcat/Km)均分别为600mL/s·mg和380mL/s·mg，与野生型(380mL/s·mg)相比突变体D57N的催化效率提高58％；D57N和N144L的比活分别为2700U/mg和2100U/mg，与野生型比活无明显差距(表2)。
表2木聚糖酶突变体与野生型的比活及动力学参数
Figure BDA0003748928070000051
/>

Claims (8)

1.一种葡聚糖酶突变体，其特征在于，以葡聚糖酶PfGlu16C为母本对Asp57或Asn114两个位点分别突变后而得。
2.根据权利要求1所述的葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述Asp57位点突变后得突变体D57N，基因序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求2所述的葡聚糖酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
4.根据权利要求1所述的葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述Asn114位点突变后得突变体N144L，基因序列如SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求4所述的葡聚糖酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
6.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2或权利要求4所述的基因序列。
7.一种重组菌株，其特征在于，含有权利要求6所述的重组载体。
8.权利要求7所述重组菌在制备饲料中的应用。
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