CN113862243B - 一种耐热木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents

一种耐热木聚糖酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

一种耐热木聚糖酶突变体及其应用，涉及基因工程和遗传工程技术领域。本发明以来源于真菌Cladophialophora carrionii的第10家族木聚糖酶CcXyl10B为母本，采用理性设计方法，筛选到突变体V126F、S210P和P243L三个突变体的热稳定性明显提升，且催化活力无明显降低。本发明发现了影响第10家族木聚糖酶热稳定性的三个关键氨基酸残基，对第10家族木聚糖酶热稳定性改良具有重要指导意义，同时本发明为木聚糖酶的产业化生产及其在饲料中的应用提供借鉴。

Description

一种耐热木聚糖酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和遗传工程技术领域，涉及一种耐热木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术
纤维素、半纤维素和木质素是植物组织的主要组成成分，其总量占自然界中生物量的50％以上。木聚糖作为半纤维素的主要组成成分，其含量仅次于纤维素，约占地球有机碳的1/3。木聚糖的结构比较复杂，主链是由吡喃木糖以β-1,4-木糖苷键连接而成，侧链主要包括α-L-阿拉伯呋喃糖残基、阿魏酸、香豆酸、O–乙酰基和葡萄糖醛酸残基等，因此木聚糖的水解需要多种酶的共同参与。
木聚糖酶是降解木聚糖大分子的关键酶，其可切割木聚糖主链的β-1，4-糖苷键生成寡糖或单糖。木聚糖酶在5、7、8、10、11、16、26、30、43、52和62等11个糖苷水解酶家族(GH)中都有分布，其中GH10和GH11家族的木聚糖酶研究最多，GH10家族木聚糖酶属于(β/α)8筒状结构，其稳定性强且底物谱广。大部分微生物来源的GH10家族木聚糖酶在中温(40～60℃)及微酸性环境下活力较强。木聚糖的应用十分广泛，主要包括动物造纸、饲料、食品、啤酒酿造以及绿色能源等领域。在工业应用中，大多数应用环境都属于高温环境，因此获得热稳定性优良的木聚糖酶对工业生产至关重要。
目前，蛋白质工程在酶分子改良方面应用广泛，即通过对基因或者蛋白本身进行修改或修饰以改变蛋白结构从而实现酶功能的改造。蛋白质工程主要用于酶的热稳定性、催化效率、底物特异性和极端环境耐受性等酶学性质的设计和改造。主要涉及的方法有定向进化、理性设计和半理性设计。其中理性设计是一种快速且有效的改造手段，其常用的方法主要有模块替换和定点突变。如通过该方法，显著提高了Thermoascus aurantiacus来源的木聚糖酶XynA的热稳定性。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种耐热木聚糖酶突变体及其应用，通过对第10家族木聚糖酶CcXyl10B关键氨基酸位点Val126、S210和P243突变后筛选得到的突变体，具体得到3种热稳定性提高的木聚糖酶突变体，对于应用到饲料和利用生物质降解木聚糖产糖产业中具有广阔的前景。
技术方案：一种耐高温木聚糖酶突变体，包括以木聚糖酶CcXyl10B为母本对Val126、S210和P243三个位点突变后得到的三种突变体，命名为CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L；所述CcXyl10B_Val126F的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CcXyl10B_S210P的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CcXyl10B_P243L的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
翻译上述耐高温木聚糖酶突变体的核苷酸序列。
如上所述的核苷酸序列，具有CcXyl10B_Val126F的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述CcXyl10B_S210P的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述CcXyl10B_P243L的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
一种重组载体，所述重组载体包括如上所述的核苷酸序列。
一种重组菌株，含有如上所述的重组载体。
上述重组菌株在制备饲料添加剂中的应用。
上述重组菌株在利用生物质降解木聚糖产糖中的应用。
有益效果：本发明通过以来源于Cladophialophora carrionii的第10家族木聚糖酶CcXyl10b为母本对Val126、S210和P243位点突变后得到的三种突变体，具体通过构建含有该突变体的重组菌株，诱导培养后筛选出在热稳定性具有大幅度提高的三种木聚糖酶突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L。在热稳定性方面，突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的T50值分别为92℃、85℃和88℃，分别比野生酶CcXyl10B(82℃)提高10℃、3℃和6℃；突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L在90℃下的半衰期(t1/2)分别为27min、15min和13min，分别是野生酶CcXyl10B(8min)的3.4倍、1.9倍和1.6倍；在催化活力方面，突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的比活分别为2150U/mg、2270U/mg和1670U/mg，与野生型CcXyl10B(1860U/mg)相比差距不大；最适pH值和最适温度与野生型基本一致，完全符合饲料生产和生物质降解的要求。相对于盲目筛菌或人工(自然)诱变等手段，理性设计缩短了酶学性质改造时间。因此，将本发明的高比活耐热木聚糖酶突变体应用于饲料添加和利用生物质降解木聚糖产糖产业中，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为高比活耐热木聚糖酶突变体的SDS-PAGE分析，其中，M为低分子量蛋白质Marker；A、B、C和D分别为纯化后的野生酶CcXyl10B以及突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L；
图2为野生型木聚糖酶和三个木聚糖酶突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的最适pH测定结果；
图3为野生型木聚糖酶和三个突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的最适温度测定结果；
图4为野生型木聚糖酶和三个突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的T50值的测定结果；
图5为野生型木聚糖酶和三个突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L在90℃下的半衰期t1/2的测定结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所用试剂或材料如无特殊说明，均能通过商业渠道获取。
以下实施例所用的试验材料：
1.菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115从Invitrogen公司购买。
2.酶类及其它生化试剂：高保真聚合酶购自Fermentas公司，榉木木聚糖购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3.培养基：
1)YPD培养基：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物；
2)LB培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1％琼脂粉(固体)；
3)MD培养基：1.5％琼脂糖，2％葡萄糖，0.00004％Biotin，1.34％YNB；
5)BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，1％甘油(V/V)，0.00004％Biotin1.34％YNB；
6)BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％YNB，0.5％甲醇(V/V)，0.00004％Biotin。
实施例1高比活耐热木聚糖酶突变体编码基因的获得
以来源于Cladophialophora carrionii的木聚糖酶基因CcXyl10b(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的重组表达载体pic9r-CcXyl10b为模板，采用定点突变的方法对Val126、S210和P243位点进行定点突变，引物设计如表1所示，突变方法以及克隆方法参考文献(Improvement in catalytic activity andthermostability of a GH10 xylanase and its synergistic degradation of biomasswith cellulase；You，et al.,2019)。
表1 木聚糖酶CcXyl10B中定点突变引物
Figure BDA0003369538000000041
实施例2高比活耐热木聚糖酶突变体的制备
将经实施例1PCR获得的线性重组表达载体直接转化DMT感受态，菌落PCR验证，获得目标位点突变体的核酸序列，将重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/CcXyl10B_Val126F、GS115/CcXyl10B_S210P和GS115/CcXyl10B_P243L。
将含有重组质粒的GS115菌株，接种于2mL BMGY培养基的10mL试管中，置于30℃，220rpm摇床培养48h后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用2mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养48h。取上清用于酶活性检测，筛选到热稳定性较野生酶提高的突变体CcXyl10B_Val126F(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)、CcXyl10B_S210P(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)和CcXyl10B_P243L(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)。
将野生型GS115/CcXyl10B和三个突变体GS115/CcXyl10B_Val126F、GS115/CcXyl10B_S210P和GS115/CcXyl10B_P243L放大发酵体系，首先接种于YPD培养基中获得种子培养液，按1％接种量接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。最后将上清液浓缩至20mL，采用阴离子交换法纯化蛋白用于酶学性质测定和比较。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上(如图1所示)。
实施例3重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型的酶学性质比较分析
一、DNS法测定
具体方法如下：在各自最适pH、最适温度条件下，1mL的反应体系包括100μL稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解木聚糖生成1μmoL还原糖所需的酶量。
二、重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型的性质测定
1、重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型的最适pH测定方法
将实施例2纯化的木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶在不同的pH(2.0-7.0)下进行酶促反应，以测定其最适pH。底物榉木木聚糖用不同pH(2.0、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0)的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中75℃下进行木聚糖酶活力测定。
结果如图2所示，野生型木聚糖酶和木聚糖酶突变体的最适反应pH相近在4.0-4.5之间。
2、野生型木聚糖酶和木聚糖酶突变体的最适温度测定方法
重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶的最适温度的测定为：在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)缓冲液体系及不同温度(30-95℃)下进行酶促反应。
结果如图3所示,表明重组野生型木聚糖酶的最适温度为80℃，而三个耐热木聚糖酶突变体的最适温度在85-90℃之间，且在高温(90℃)下的相对酶活较野生酶明显提高。
3、野生型木聚糖酶和突变体热稳定性测定方法
T50：木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶在70-95℃之间分别处理30min，当酶活剩余原来的50％时所对应的温度即为该酶的T50值。
T50测定结果如图4所示，表明木聚糖酶突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的T50值分别为92℃、85℃和88℃，分别较野生型木聚糖酶CcXyl10B(82℃)提高10℃、3℃和6℃。
90℃条件下半衰期(t1/2)：突变体与野生型在90℃处理不同时间，最多处理30min，检测各自的剩余酶活。
90℃的半衰期测定结果如图5所示，表明木聚糖酶突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的t1/2分别为27min、15min和13min，分别较野生型木聚糖酶(8min)延长2.4倍、0.9倍和0.6倍，该结果与T50值测定结果趋势吻合。即突变体CcXyl10B_Val126F热稳定性最好。
4、重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶的动力学参数测定方法
检测方法参照文献(A thermophilic and acid stable family-10 xylanasefrom the acidophilic fungus Bispora sp MEY-1.Extremophiles.2009；13:849-57.Luo，et al.,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的榉木木聚糖(1.25，1.0，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1mg/mL)为底物，在最适条件(温度、pH)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraFit7软件计算Km值及Vmax。
在各自最适条件下以榉木木聚糖为底物时，重组耐热木聚糖酶突变体CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L的催化效率(kcat/Km)分别为2040mL/s·mg和2210mL/s·mg和1160mL/s·mg，较野生型(2030mL/s·mg)变化不大；重组耐热木聚糖酶突变体的比活分别为2150U/mg、2270U/mg和1670U/mg，较野生型(1860U/mg)无明显变化(见表2)。
表2 高催化效率木聚糖酶突变体与野生型的比活及动力学参数比较表
Figure BDA0003369538000000061
Figure BDA0003369538000000071
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 一种耐热木聚糖酶突变体及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 411
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Pro Val Ala Trp Gly Pro Pro Gln Gly Pro Pro Gln Gly Pro Pro
1               5                   10                  15
Gly Trp Asn Pro Pro Ser Pro Pro Trp Gly Gln Pro Gly Pro Ala Ser
            20                  25                  30
Ser Ala Ser Ser Gly Pro Thr Lys Pro Val Thr Ser Ser Ser Ala Pro
        35                  40                  45
Ser Thr Thr Ser Ser Gly Pro Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Cys Gln
    50                  55                  60
Gly Tyr Phe Glu Pro Leu Ala Pro Pro Tyr Leu Asn Asp Leu Ala Gln
65                  70                  75                  80
Ala Ala Gly Lys Leu Trp Phe Gly Thr Ala Thr Asp Gln Pro Gly Thr
                85                  90                  95
Gly Glu Asp Thr Asn Ile Leu Tyr Gln Thr Ile Leu Asn Asn Thr His
            100                 105                 110
Ile Phe Gly Gln Val Thr Pro Ala Asn Ala Met Lys Phe Val Ser Thr
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Glu Pro Glu Gln Asn Val Phe Asn Tyr Thr Gly Gly Asp Ile Val Val
    130                 135                 140
Ala Ile Ala Gln Asp His Gly Lys Tyr Leu Arg Cys His Asn Leu Val
145                 150                 155                 160
Trp Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Val Leu Asn Gly Asn Trp Ser Ala
                165                 170                 175
Asp Glu Leu Thr Ala Ile Met Gln Asn His Ile Tyr Asn Val Val Ala
            180                 185                 190
His Phe Gly Gly Ala Cys Tyr Ser Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu
        195                 200                 205
Asn Ser Asn Gly Thr Phe Ser Ala Ser Val Trp Tyr Asp Thr Ile Gly
    210                 215                 220
Pro Glu Tyr Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Phe Ala Gln Glu Ala Val Asp
225                 230                 235                 240
Ala Leu Pro Ala Gly Thr Pro Lys Pro Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr
                245                 250                 255
Gly Ile Glu Ala Pro Gly Asn Lys Ser Thr Ala Thr Glu Asn Leu Val
            260                 265                 270
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        275                 280                 285
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Leu Asp Ile Arg Phe Val Gln Ala Asn Ala Thr Asn Ser Thr Gly Phe
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Ala Glu Gln Ala Gln Asn Tyr Tyr Asp Ser Val Ala Ser Cys Val Glu
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Val Asp Gly Cys Val Gly Ile Thr Val Trp Asp Phe Asp Asp Gln Tyr
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Ser Trp Ile Pro Gln Thr Phe Pro Gly Gln Gly Ala Ala Thr Leu Tyr
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Asn Ala Asp Phe Thr Arg Lys Pro Ala Tyr Tyr Ala Val Gly Asp Ala
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Leu Gln Gly Val Pro Cys Ser Val Cys Ser Ala
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<210> 2
<211> 411
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1               5                   10                  15
Gly Trp Asn Pro Pro Ser Pro Pro Trp Gly Gln Pro Gly Pro Ala Ser
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Ser Ala Ser Ser Gly Pro Thr Lys Pro Val Thr Ser Ser Ser Ala Pro
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Ser Thr Thr Ser Ser Gly Pro Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Cys Gln
    50                  55                  60
Gly Tyr Phe Glu Pro Leu Ala Pro Pro Tyr Leu Asn Asp Leu Ala Gln
65                  70                  75                  80
Ala Ala Gly Lys Leu Trp Phe Gly Thr Ala Thr Asp Gln Pro Gly Thr
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Gly Glu Asp Thr Asn Ile Leu Tyr Gln Thr Ile Leu Asn Asn Thr His
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Gly Ile Glu Ala Pro Gly Asn Lys Ser Thr Ala Thr Glu Asn Leu Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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tgggacgttg tcaacgaagc tttgaaccca aacggtactt tttctgcttc tgtttggtac 660
gataccattg gacctgagta cttttatttg gcttttcagt ttgctcaaga agccgttgat 720
gctttgccag ctggaactcc taagcctaag ttgtactaca acgattacgg tattgaagct 780
ccaggtaata agtcaactgc tactgaaaat ttggttaagg aattgcaagc tagaaacatt 840
agaatcgatg gagttggttt ggaatcacat tttgaagtcg gtggtacacc atctttggaa 900
gatcaaattg cccaaaaaga agcatacgtt gctttgggag tcgaagttgc tatgaccgag 960
ttggatatta gatttgttca agccaacgct actaactcta ctggattcgc tgagcaagct 1020
caaaactatt acgattctgt tgcttcttgt gttgaagttg atggttgtgt tggaattact 1080
gtttgggatt ttgatgatca atactcttgg attcctcaga cttttcctgg tcaaggtgct 1140
gctactttgt acaatgctga ttttactaga aagccagctt attatgctgt tggtgatgct 1200
ttgcagggtg ttccatgttc tgtttgttct gcttaa 1236
<210> 8
<211> 1236
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actccagttg cttggggacc accacaaggt cctcctcaag gtcctccagg ttggaaccct 60
ccttctccac cttggggtca acctggtcca gcctcttctg cttcctctgg tccaactaaa 120
ccagttactt cttcttccgc tccatctact acttcttctg gtccatctgc tccaacttct 180
tcttcttgtc aaggttactt tgaaccattg gcccctcctt accttaacga tttggctcaa 240
gctgccggta agctttggtt tggtactgct actgatcaac caggtactgg tgaagatact 300
aacattttgt atcaaactat cttgaacaac acccatattt ttggacaggt tactccagct 360
aacgctatga agtttgtttc tactgaacca gaacaaaacg tttttaatta cactggagga 420
gacattgttg tcgccattgc tcaagatcac ggtaagtact tgagatgtca caacttggtc 480
tgggcaaccc aaatttctga ctttgttttg aacggaaatt ggtccgctga cgaattgact 540
gctattatgc aaaaccatat ttacaacgtt gtcgctcatt ttggtggtgc ttgttattct 600
tgggacgttg tcaacgaagc tttgaactct aacggtactt tttctgcttc tgtttggtac 660
gataccattg gacctgagta cttttatttg gcttttcagt ttgctcaaga agccgttgat 720
gctttgttgg ctggaactcc taagcctaag ttgtactaca acgattacgg tattgaagct 780
ccaggtaata agtcaactgc tactgaaaat ttggttaagg aattgcaagc tagaaacatt 840
agaatcgatg gagttggttt ggaatcacat tttgaagtcg gtggtacacc atctttggaa 900
gatcaaattg cccaaaaaga agcatacgtt gctttgggag tcgaagttgc tatgaccgag 960
ttggatatta gatttgttca agccaacgct actaactcta ctggattcgc tgagcaagct 1020
caaaactatt acgattctgt tgcttcttgt gttgaagttg atggttgtgt tggaattact 1080
gtttgggatt ttgatgatca atactcttgg attcctcaga cttttcctgg tcaaggtgct 1140
gctactttgt acaatgctga ttttactaga aagccagctt attatgctgt tggtgatgct 1200
ttgcagggtg ttccatgttc tgtttgttct gcttaa 1236
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctatgaagt ttttttctac tgaaccagaa c 31
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaaaaacttc atagcgttag ctggagtaac c 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaagctttga accctaacgg tactttttct g 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agggttcaaa gcttcgttga caacgtccca a 31
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gttgatgctt tgttggctgg aactcctaag c 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caacaaagca tcaacggctt cttgagcaaa c 31

Claims (7)

1.一种耐高温木聚糖酶突变体，其特征在于，包括以木聚糖酶CcXyl10B为母本对Val126、S210和P243三个位点突变后得到的三种突变体，命名为CcXyl10B_Val126F、CcXyl10B_S210P和CcXyl10B_P243L；所述CcXyl10B_Val126F的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CcXyl10B_S210P的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CcXyl10B_P243L的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.权利要求1所述耐高温木聚糖酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，具有CcXyl10B_Val126F的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述CcXyl10B_S210P的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述CcXyl10B_P243L的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求3所述的编码基因。
5.一种重组菌株，其特征在于，含有权利要求4所述的重组载体。
6.权利要求5所述重组菌株在制备饲料添加剂中的应用。
7.权利要求5所述重组菌株在利用生物质降解木聚糖产糖中的应用。
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