CN112708608A - 木聚糖酶突变体及其制备方法与应用 - Google Patents

木聚糖酶突变体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种木聚糖酶突变体及其制备方法与应用，涉及基因工程和遗传工程技术领域。该突变体包括以木聚糖酶HwXyl10A为母本对Gly363位点饱和突变后得到的一种或几种突变体。具体通过定点突变得到了19种突变体，对其进行酵母表达，再通过热稳定新和催化活力筛选，获得2个比活力和热稳定性均显著提高的突变体；本发明通过对Gly363位点的改造可以大大提高木聚糖酶的热稳定新和催化效率，并对第10家族木聚糖酶及其它糖苷水解酶的热稳定性和催化效率改良具有重要的指导意义，还为其在工业生产中的应用提供了基础。

Description

木聚糖酶突变体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程和遗传工程技术领域，涉及一种木聚糖酶突变体及其制备方法与应用，特别是涉及一种高比活耐热木聚糖酶突变体及其制备方法与应用。
背景技术
自然界中50％以上的生物量由纤维素、半纤维素、木质素和果胶等成分组成。木聚糖是半纤维素的主要组成成分之一，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源，约占地球可再生有机碳的1/3。木聚糖的结构比较复杂，主链是由吡喃木糖以β-D-1,4-木糖苷键连接而成，侧链成分多样，主要包括阿魏酸、α-L-阿拉伯呋喃糖残基、O–乙酰基、香豆酸和葡萄糖醛酸残基等，因此木聚糖的水解需要多种酶的共同参与。
木聚糖酶是水解木聚糖的关键酶，它可以切割木聚糖主链的β-1，4-糖苷键产生小寡糖或者单糖。木聚糖的应用十分广泛，主要包括动物饲料、食品、造纸、啤酒酿造以及绿色能源等领域。木聚糖酶在5、7、8、10、11、16、26、30、43、52和62等11个糖苷水解酶家族(GH)中都有分布，其中GH10和GH11家族的木聚糖酶研究最多，GH10家族木聚糖酶属于(β/α)8–barrel结构，其分子量较GH11家族木聚糖酶高，稳定性强且底物谱广。大部分微生物来源的GH10家族木聚糖酶都在中温(大约40到60℃)中性或者微酸性环境表现出最大活力。在工业应用中，大多数应用环境都属于高温环境，因此获得热稳定性优良且催化活力高的木聚糖酶对工业生产至关重要，目前已经有53个真菌来源木聚糖酶的晶体结构被解析，这为木聚糖酶的性质改良打下了基础。
目前，蛋白质工程在酶分子改良方面应用广泛，即通过对基因或者蛋白本身进行修改或修饰以改变蛋白分子结构从而实现酶功能的改造。蛋白质工程主要用于酶的热稳定性、催化效率、底物特异性和极端环境耐受性等酶学性质的设计和改造。主要涉及的方法有定向进化、理性设计和半理性设计。其中理性设计是一种快速且有效的改造手段，其对蛋白分子结构准确性要求较高。理性设计中常用的方法主要有模块替换和定点突变。如通过该方法，Thermoascus aurantiacus来源的木聚糖酶XynA的热稳定性和pH稳定性得到显著提升。定点饱和突变是理性设计中行之有效的改造方法，通过计算机模拟计算，筛选到与酶功能密切相关的氨基酸位点，对该位点进行饱和突变充分发挥关键氨基酸位点的作用潜力，获得性质提升的突变体。而如何获取更多种性能优越的木聚糖酶突变体，以丰富糖苷水解酶家族的木聚糖酶种类，满足不同工业领域的需求，是亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种木聚糖酶突变体及其制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过对第10家族木聚糖酶HwXyl10A关键氨基酸位点Gly363饱和突变后筛选得到的突变体，具体得到2种热稳定性和催化效率大幅度提高的木聚糖酶突变体，对于应用到饲料和利用生物质降解木聚糖产糖产业中具有广阔的前景。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种高比活耐热木聚糖酶突变体，包括以木聚糖酶HwXyl10A为母本对Gly363位点饱和突变后得到的一种或几种突变体。
优选的是，以木聚糖酶HwXyl10A为母本对Gly363位点饱和突变后得到2种高比活耐热木聚糖酶突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K。
优选的是，所述HwXyl10A_G363R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述HwXyl10A_G363K的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明还提供编码所述的高比活耐热木聚糖酶突变体的核苷酸序列。
优选的是，具有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包括所述的核苷酸序列。
本发明还提供一种重组菌株，包括所述的重组载体或者在所述重组菌株的基因组中整合有所述的核苷酸序列。
本发明还提供一种所述的高比活耐热木聚糖酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：获取高比活耐热木聚糖酶突变体的核苷酸序列，经扩增后，将所得扩增产物转化DMT感受态细胞中，获取木聚糖突变体重组表达载体；
步骤2：所得木聚糖突变体重组表达载体转化毕赤酵母菌，诱导表达，获得毕赤酵母重组菌株；
步骤3：发酵培养毕赤酵母重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；
步骤4：回收并纯化高比活耐热的木聚糖酶突变体。
优选的是，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
本发明还提供一种所述的高比活耐热木聚糖酶突变体在饲料或利用生物质降解木聚糖产糖中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过以来源于Hortaea werneckii的木聚糖酶基因HwXyl10a为母本对Gly363位点饱和突变后得到的一种或几种突变体，具体通过构建含有该突变体的重组菌株，诱导培养后筛选出在热稳定性和催化效率具有大幅度提高的2种木聚糖酶突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K。在热稳定性方面，突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K在80℃下的半衰期(t1/2)分别为15min和20min，分别是野生酶HwXyl10A(8min)的1.9倍和2.5倍；突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K的T50值分别为78℃和80℃，分别较野生酶HwXyl10A(75℃)提高3℃和5℃；在催化活力方面，突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K的比活分别为4030U/mg和4990U/mg，较野生型HwXyl10A(3260U/mg)分别提高24％和53％；最适pH值和最适温度与野生型基本一致，完全符合饲料生产和生物质降解的要求。相对于盲目筛菌或人工(自然)诱变等手段，酶分子改良缩短了酶学性质改造时间。因此，将本发明的高比活耐热木聚糖酶突变体应用于饲料添加和利用生物质降解木聚糖产糖产业中，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为高比活耐热木聚糖酶突变体的SDS-PAGE分析，其中，M为低分子量蛋白质Marker；A、C和E分别为纯化后的野生酶HwXyl10A、突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K；B、D和F分别为脱N糖基后的HwXyl10A、HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K；
图2为野生型木聚糖酶和两个木聚糖酶突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K的最适pH测定结果；
图3为野生型木聚糖酶和两个突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K的pH稳定性测定结果；
图4为野生型木聚糖酶和两个突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K的最适温度测定结果；
图5为野生型木聚糖酶和两个突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K在80℃下的半衰期t1/2的测定结果；
图6为野生型木聚糖酶和两个突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K的T50值的测定结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所用试剂或材料如无特殊说明，均能通过商业渠道获取。
以下实施例所用的试验材料：
1.菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115从Invitrogen公司购买。
2.酶类及其它生化试剂：高保真聚合酶购自Fermentas公司，榉木木聚糖购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3.培养基：
1)YPD培养基：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物；
2)LB培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1％琼脂粉(固体)；
3)MD培养基：1.5％琼脂糖，2％葡萄糖，0.00004％Biotin，1.34％YNB；
5)BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，1％甘油(V/V)，0.00004％Biotin1.34％YNB；
6)BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％YNB，0.5％甲醇(V/V)，0.00004％Biotin。
实施例1高比活耐热木聚糖酶突变体编码基因的获得
以来源于Hortaea werneckii的木聚糖酶基因HwXyl10a(核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)的重组表达载体pic9r-HwXyl10a为模板，采用定点突变的方法对Gly363位点进行饱和突变，引物设计如表1所示，突变方法以及克隆方法参考文献(Improvement in catalytic activity and thermostability of a GH10xylanase and its synergistic degradation of biomass with cellulase；You，etal.,2019)。
表1木聚糖酶HwXyl10A中Gly363位点饱和突变引物
Figure BDA0002940872000000051
实施例2高比活耐热木聚糖酶突变体的制备
将经实施例1PCR获得的线性重组表达载体直接转化DMT感受态，菌落PCR验证，获得该位点除Gly以外的19个突变体的核酸序列，将重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/HwXyl10A-G363X(X代表除Gly以外的19种氨基酸)。
将含有重组质粒的GS115菌株，接种于2mL BMGY培养基的10mL试管中，置于30℃，220rpm摇床培养48h后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用2mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养48h。取上清用于酶活性检测，筛选到热稳定性和催化活力较野生酶同时提高的突变体HwXyl10A_G363R(氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)和HwXyl10A_G363K(氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)。
将野生型GS115/HwXyl10A和两个突变体GS115/HwXyl10A_G363R和GS115/HwXyl10A_G363K放大发酵体系，首先接种于YPD培养基中获得种子培养液，按1％接种量接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。最后将上清液浓缩至20mL，采用阴离子交换法纯化蛋白用于酶学性质测定和比较。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上(如图1所示)。
实施例3重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型的酶学性质比较分析
一、DNS法测定
具体方法如下：在各自最适pH、最适温度条件下，1mL的反应体系包括100μL稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解木聚糖生成1μmoL还原糖所需的酶量。
二、重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型的性质测定
1、重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型的最适pH和pH稳定性测定方法
将实施例2纯化的木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶在不同的pH(2.0-7.0)下进行酶促反应，以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH(2.0、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0)的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中75℃下进行木聚糖酶活力测定。
结果如图2所示，野生型木聚糖酶和木聚糖酶突变体的最适反应pH相近在4.0-4.5之间；野生型木聚糖酶和木聚糖酶突变体在pH1.0-12.0的环境中，37℃处理1h后，测定剩余酶活，结果如图3所示，野生型木聚糖酶的pH稳定性与两个木聚糖酶突变体并无明显差异，均在pH2.0-pH9.0之间稳定。
2、野生型木聚糖酶和木聚糖酶突变体的最适温度测定方法
重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶的最适温度的测定为：在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)缓冲液体系及不同温度(35-90℃)下进行酶促反应。
结果如图4所示,表明重组高比活耐热木聚糖酶突变体与野生型木聚糖酶(75℃)的最适温度在75-80℃之间，两突变体在高温80-90℃下的相对酶活较野生酶明显提高。
3、野生型木聚糖酶和突变体热稳定性测定方法
80℃条件下半衰期(t1/2)：突变体与野生型在80℃处理不同时间，最多处理30min，检测各自的剩余酶活。
80℃的半衰期测定结果如图5所示，表明木聚糖酶突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K的t1/2分别为15min和20min，分别较野生型木聚糖酶(8min)延长0.88倍和1.5倍，且突变体HwXyl10A_G363K热稳定性最好。
T50：木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶在60-85℃之间分别处理半小时，当酶活剩余原来的一半时所对应的温度即为该酶的T50值。
T50测定结果如图6所示，表明木聚糖酶突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K的T50值分别为78℃和80℃，分别较野生型木聚糖酶HwXyl10A(75℃)提高3℃和5℃，该结果与半衰期测定结果趋势吻合。即热稳定性顺序为：HwXyl10A_G363K>HwXyl10A_G363R>HwXyl10A。
4、重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶的动力学参数测定方法
检测方法参照文献(A thermophilic and acid stable family-10 xylanasefrom the acidophilic fungus Bispora sp MEY-1.Extremophiles.2009；13:849-57.Luo，et al.,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的木聚糖(1.25，1.0，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1mg/mL)为底物，在最适条件(温度、pH)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraFit7软件计算Km值及Vmax。
在各自最适条件下以木聚糖为底物时，重组高比活耐热木聚糖酶突变体的催化效率(kcat/Km)分别为3050mL/s·mg和3180mL/s·mg，较野生型(2970mL/s·mg)提高3％和7％；重组高比活耐热木聚糖酶突变体的比活分别为4030U/mg和4990U/mg，较野生型(U/mg)提高24％和53％(见表2)。
表2高催化效率木聚糖酶突变体与野生型的比活及动力学参数比较表
Figure BDA0002940872000000071
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 木聚糖酶突变体及其制备方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actaagaccg aaacctccgt tcaaatgatg accgaaacct ctaccgttac ccaatctgcc 60
tcttgctctg gattgtctgg atccaccatg acctccggag gaaacggatc taccatgtct 120
accaccatgt cttcttcttc cagaactaga ccatctacta ccttgaccgc cactgctact 180
gctaccggtt ccggtttgaa cgatgccgcc gaagatgctg gaaagcttta ctttggtact 240
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Claims (10)

1.一种高比活耐热木聚糖酶突变体，其特征在于，包括以木聚糖酶HwXyl10A为母本对Gly363位点饱和突变后得到的一种或几种突变体。
2.如权利要求1所述的高比活耐热木聚糖酶突变体，其特征在于，以木聚糖酶HwXyl10A为母本对Gly363位点饱和突变后得到2种高比活耐热木聚糖酶突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K。
3.如权利要求2所述的高比活耐热木聚糖酶突变体，其特征在于，所述HwXyl10A_G363R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述HwXyl10A_G363K的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述的高比活耐热木聚糖酶突变体的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，具有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求4所述的核苷酸序列。
7.一种重组菌株，其特征在于，包括权利要求6所述的重组载体或者在所述重组菌株的基因组中整合有权利要求4或5所述的核苷酸序列。
8.一种如权利要求1-3任一项所述的高比活耐热木聚糖酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获取高比活耐热木聚糖酶突变体的核苷酸序列，经扩增后，将所得扩增产物转化DMT感受态细胞中，获取木聚糖突变体重组表达载体；
步骤2：所得木聚糖突变体重组表达载体转化毕赤酵母菌，诱导表达，获得毕赤酵母重组菌株；
步骤3：发酵培养毕赤酵母重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；
步骤4：回收并纯化高比活耐热的木聚糖酶突变体。
9.如权利要求8所述的高比活耐热木聚糖酶突变体的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的高比活耐热木聚糖酶突变体在饲料或利用生物质降解木聚糖产糖中的应用。
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