CN113416721B - 一组gh16家族葡聚糖酶的n-糖基化突变体及其应用 - Google Patents

一组gh16家族葡聚糖酶的n-糖基化突变体及其应用 Download PDF

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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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Abstract

一组GH16家族葡聚糖酶的N‑糖基化突变体及其应用，包括TlGlu16A_A62T和RhGlu16B_N57A，所述TlGlu16A_A62T的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；RhGlu16B_N57A的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。最终验证表明此N‑糖基化位点对GH16家族葡聚糖酶的热稳定性和催化活力具有重要影响。在此改造条件下，发生N‑糖基化突变体的热稳定性和催化效率有显著增强。本发明通过Ala62位点的改造可以大大提高葡聚糖酶的热稳定性和催化效率，并对GH16家族葡聚糖酶及其它糖苷水解酶的热稳定性和催化效率改良具有重要的指导意义，还为其在工业生产的应用提供了基础。

Description

一组GH16家族葡聚糖酶的N-糖基化突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程、蛋白质工程领域，具体涉及一组GH16家族葡聚糖酶的N-糖基化突变体及其应用。
背景技术
纤维素类物质包括纤维素、半纤维素和木质素，是自然界中常见的、最丰富的可再生资源。半纤维素一般指自然界植物细胞壁中除果胶和纤维素类成分之外的其他聚糖类物质，主要包括葡聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。其中，β-葡聚糖是一类非淀粉葡萄糖聚合物，其包含通过β-糖苷键连接的β-葡萄糖残基。
β-葡聚糖酶是内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶和外切β-1,3-1,4-葡聚糖酶的总称。他作用域葡聚糖的β-1,3和β-1,4糖苷键，使β-葡聚糖分解成寡糖。它是我们日常生活中重要的膳食纤维，它可以通过降低胆固醇和血糖来影响我们的代谢活动。饲料工业中β-葡聚糖酶通过降解β-葡聚糖，降低食糜粘度，促进营养物质的消化与吸收来提高饲料利用率。β-葡聚糖酶也可用于食品酿造行业，可溶性β-1,3-葡聚糖可用作免疫激活剂，它还可以参与细胞分化和防御真菌病原体。
糖基化是真核细胞中最常见的翻译后修饰方法之一。N-糖基化是新生肽链的共翻译或翻译后修饰方法。它在蛋白质生物学功能的发展中起着至关重要的作用，如蛋白质折叠、细胞识别等。许多研究表明，N-糖基化对表达的重组酶的活性、热稳定性和分泌效率有重要影响。N-糖基化对酵母中表达的重组酶有重要影响。可以使用各种方法对这些影响进行理性或半理性的分析。以往的研究提供了许多可行的策略。基于这些理论和方法，在重组酶的特定位点添加或去除N-糖基化可以改善重组酶的特性。
针对饲料业、食品制造业等工业需求，获得具有优良特性的β-葡聚糖酶仍具有重大意义。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种GH16家族葡聚糖酶的N-糖基化突变体及其应用，该突变体为定点突变后筛选得到。
技术方案：一组GH16家族葡聚糖酶的N-糖基化突变体，包括TlGlu16A_A62T和RhGlu16B_N57A，所述TlGlu16A_A62T的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；RhGlu16B_N57A的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一组GH16家族葡聚糖酶的N-糖基化突变体，所述TlGlu16A_A62T的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；该位点反向验证葡聚糖酶突变体RhGlu16B_N57A的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
一种重组载体，含有上述核苷酸序列。
一种重组菌株，含有上述重组载体。
所述重组菌株在制备饲料添加剂中的应用。
有益效果：本发明提供一种热稳定性和催化效率增强的催化半纤维素降解的葡聚糖酶突变体。在热稳定性方面，突变体TlGlu16A_A62T在65℃下的半衰期(t1/2)为54min，是野生酶TlGlu16A(32min)的1.69倍；突变体TlGlu16A_A62T的T50值为68℃(图3)，相较野生酶TlGlu16A(65℃)提高3℃；在催化活力方面，以燕麦葡聚糖为底物时，突变体TlGlu16A_A62T的比活为13100U/mg，是野生型TlGlu16A(10800U/mg)的1.21倍；最适pH和最适温度和野生型基本保持一致，完全符合饲料的要求。验证实验中使用葡聚糖酶野生型RhGlu16B和突变体RhGlu16B_N57A。在热稳定性方面，突变体RhGlu16B_N57A在65℃下的半衰期(t1/2)为14min，相较野生酶RhGlu16B(140min)降低的90％；突变体RhGlu16B_N57A的T50值为68.6℃(图6)，相较野生酶RhGlu16B(63℃)降低5.6℃；在催化活力方面，以燕麦葡聚糖为底物时，突变体RhGlu16B_N57A的比活为5340U/mg，相较野生型RhGlu16B(9673U/mg)降低45％；最适pH和最适温度也和野生型基本保持一致，完全符合饲料的要求。这样一种在催化活力高、热稳定性优良的酸性葡聚糖酶在饲料加工、啤酒酿造及寡糖生产等领域中具有极大的应用潜力。
附图说明
图1为葡聚糖酶突变体TlGlu16A_A62T与野生型TlGlu16A的最适温度；
图2为65℃下葡聚糖酶突变体TlGlu16A_A62T与野生型TlGlu16A的半衰期t1/2；
图3为葡聚糖酶突变体TlGlu16A_A62T与野生型TlGlu16A的T50值。
图4为葡聚糖酶突变体RhGlu16B_N57A与野生型RhGlu16B的最适温度；
图5为65℃下葡聚糖酶突变体RhGlu16B_N57A与野生型RhGlu16B的半衰期t1/2；
图6为葡聚糖酶突变体RhGlu16B_N57A与野生型RhGlu16B的T50值。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9γ为实验室保存；2、酶类及其它生化试剂：Taq酶购自全式金公司，内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，燕麦葡聚糖购自Sigma公司；其它都为国产分析纯试剂(均从国药集团购买)；
3、培养基：
(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0；
(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
(3)MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin；
(4)MM固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇；
(5)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1.34％YNB，0.00004％Biotin；
(6)BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)。
实施例1高催化活力葡聚糖酶突变体的构建
分别以Talaromyces leycettanus JCM12802和Rhizopus homothallicus来源的葡聚糖酶基因TlGlu16A和RhGlu16B为出发材料，采用定点突变的方法分别对Ala62和Asn57位点进行突变，引物设计分别如表1和表2所示，突变方法和克隆方法参考文献(Improvement in catalytic activity and thermostability of a GH10 xylanase andits synergistic degradation of biomass with cellulase；You,et al.,2019)。Rhizopus homothallicus；以葡聚糖酶野生型TlGlu16A的核苷酸序列SEQ ID NO.5为基础对Ala62位点定点突变后得到的突变体TlGlu16A_A62T，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。以葡聚糖酶野生型RhGlu16B的核苷酸序列SEQ ID NO.6为基础对Asn57位点定点突变得到突变体RhGlu16B_N57A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
表1葡聚糖酶TlGlu16A中Ala62位点突变引物
Figure BDA0003100848480000041
表2葡聚糖酶RhGlu16B中Asn57位点突变引物
Figure BDA0003100848480000042
实施例2高催化活力葡聚糖酶突变体的制备
将经实施例1PCR获得的线性重组表达载体直接转化DMT感受态，菌落PCR验证，获得突变体TlGlu16A_A62T和RhGlu16B_N57A的核酸序列，将重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/TlGlu16A_A62T和GS115/RhGlu16B_N57A。
将含有重组质粒的GS115菌株，接种于2mL BMGY培养基的10mL试管中，置于30℃,220rpm摇床培养48h后将培养液3000g离心5min,弃上清，沉淀用2mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养48h。取上清用于酶活性检测，筛选到具有催化活性的突变体TlGlu16A_A62T和RhGlu16B_N57A。
将GS115/TlGlu16A_A62T、GS115/TlGlu16A、GS115/RhGlu16B_N57A和GS115/RhGlu16B放大发酵体系，首先接种于YPD培养基中获得种子培养液，按1％接种量接种于300mL BMGY培养基的l L三角瓶中，置于30℃,220r pm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5mi n,弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃,220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持0.5％,同时取上清用于酶活性检测。最后将上清液浓缩至20mL,采用阴离子交换法纯化蛋白用于酶学性质测定和比较。所表达的葡聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上。
实施例3重组高催化活力葡聚糖酶突变体和野生型的酶学性质分析
一、葡聚糖酶的酶活力测定
根据Yang等人先前所报道的方法(Yang 10.1021/jf800303b)，以1％(w/v，g/mL)的燕麦β-葡聚糖作为底物，测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活力。具体方法如下：在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系包括100μL酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力单位(U)定义为在上述条件下，每分钟生成1μmol葡萄糖当量还原糖所需的酶量。
二、重组葡聚糖酶突变体和野生型的性质测定
1、重组葡聚糖酶突变体和野生型的最适温度测定如下:
将实施例2纯化的重组葡聚糖酶突变体和野生型在不同的温度下进行酶促反应以测定其最适温度。突变体TlGlu16A_A62T酶促反应最适温度测定结果(图1)表明,突变体RhGlu16B_N57A酶促反应最适温度测定结果(图4)表明，两种重组葡聚糖酶突变体与野生型的最适温度都在55℃-65℃之间，彼此相差不明显。
2、重组葡聚糖酶突变体和野生型的热稳定性测定如下:
将葡聚糖酶突变体TlGlu16A_A62T和野生型TlGlu16A在65℃处理一定时间后热稳定性逐渐降低，但所有突变体的热稳定性均优于野生型。通过拟合曲线(图2)可以发现，突变体TlGlu16A_A62T较野生型酶半衰期增加22min。突变体TlGlu16A_A62T的T50值为68℃(图3)，相较野生酶TlGlu16A(65℃)提高3℃。
将葡聚糖酶突变体RhGlu16B_N57A和野生型RhGlu16B在65℃处理一定时间后热稳定性逐渐降低，但所有突变体的热稳定性均劣于野生型。通过拟合曲线(图5)可以发现，突变体TlGlu16A_A62T较野生型酶半衰期减少126min。突变体RhGlu16B_N57A的T50值为68.6℃(图6)，相较野生酶RhGlu16B(63℃)降低5.6℃。
4、重组葡聚糖酶突变体和野生型的动力学测定如下：
在最适条件下，用燕麦葡聚糖底物测定重组葡聚糖酶TlGlu16A_A62T和野生型TlGlu16A的动力学参数和比活力，结果如表3所示。TlGlu16A_A62T的Km和Vm为1.97mg/mL和14900μmol/min·mg。野生型的Km和Vm分别为3.08mg/mL和14400μmol/min·mg。突变体较野生型的催化效率和比活均有很大程度上的提高。以燕麦葡聚糖为底物，突变体的kcat/Km为野生型的1.61倍，比活则为1.21倍。
在最适条件下，用燕麦葡聚糖底物测定重组葡聚糖酶RhGlu16B_N57A和野生型RhGlu16B的动力学参数和比活力，结果如表4所示。RhGlu16B_N57A的Km和Vm为3.97mg/mL和7280μmol/min·mg。野生型的Km和Vm分别为3.31mg/mL和10820μmol/min·mg。突变体较野生型的催化效率和比活均有很大程度上的降低。以燕麦葡聚糖为底物，突变体的kcat/Km为野生型的0.56倍，比活则为0.55倍。
综合来看，发生N-糖基化后的突变体不仅酶活力有了大幅提高，在热稳定性方面也要优于野生型葡聚糖酶。
表3 TlGlu16A及其突变体在最适条件下的动力学和比活
Figure BDA0003100848480000061
表4 RhGlu16B及其突变体在最适条件下的动力学和比活
Figure BDA0003100848480000062
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 一组GH16家族葡聚糖酶的N-糖基化突变体及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 995
<212> DNA
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130 135 140
Thr Pro Thr Gly His Gln Asp Cys Asp Val Thr Asn Asp Pro Ser Asn
145 150 155 160
Leu Gly Cys Gly Val Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Gly
165 170 175
Phe Asn Asn Glu Asn Gly Gly Val Tyr Ala Thr Arg Trp Thr Ala Ser
180 185 190
Thr Gly Ile Gln Ile Trp Phe Phe Asp Arg Ser Ser Ile Pro Ser Asp
195 200 205
Ile Gln Ser Gly Ser Pro Asn Pro Asp Ser Trp Pro Thr Pro Ala Ala
210 215 220
Asp Phe Pro Phe Thr Ser Cys Asn Pro Ser Leu Phe Ser Asn Met Lys
225 230 235 240
Ile Val Leu Asp Leu Thr Phe Cys Gly Asp Trp Ala Gly Ser Val Tyr
245 250 255
Ser Ser Ser Gly Cys Pro Ser Asp Cys Thr Thr Tyr Val Ser Asn Thr
260 265 270
Pro Ser Gly Phe Asp Glu Ala Tyr Trp Arg Ile Asn Ser Phe Lys Val
275 280 285
Tyr Gln Ser Ser
290
<210> 5
<211> 995
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttatgtgc tgcaggatga ttatggaaac tcggattcct tctttgacaa gttcactttc 60
ttcacgggct ctgacccaac ccacggcttt gtccagtatg tcgaccaggc cacagcagag 120
aatgcaggtc tgattcacgc gtcgaacggc gaggtctata ttggcgtcga tcataccaat 180
gtcgccagtg gtagcggccg tcagagcgtg cgcatcacca gcaccaacag ctatactcat 240
ggcctgttca ttgtggacct tgcgcatatg cccggtagca tctgcggagc ctggcctgcc 300
ttctggatgg tcggtgccaa ctggccgaac aacggcgaaa tcgatatcat cgaaggagtc 360
aaccaacaga ccaacaacgc catgaccctt cacactaacg aaggatgcac catcgacaac 420
tctggcttca cgggcactct cgtcaccagc aactgctgga taaacgcccc cggccaatcc 480
accaacgcag gatgcagcat cgactcgacc tcctcacagt cctacggcac gggcttcaac 540
aacgccggcg gcggcgtcta cgccaccgaa tggaccagca acggcatcag catctggttc 600
ttcccccgcg gaagcatccc cgcggacatc tcatccggca gccccgaccc atcgacctgg 660
ggtactcccg cggcgagctt cggaggctca ggctgcgaca tagactcgca ctttggcgcg 720
cagcagatcg tcttcgacac gaccttctgc ggcgactggg ccggcaacgt ctggagctcc 780
ggcagctgtg cctccctcgc gggcacatgc caggattacg tcgccaacaa cccttccgcg 840
ttcgccgagg cgtactggta cgtcaactcg ttgaaggtct accaggacac cgcggaaagt 900
actataatag ctcatggccc cggtaatgtg acttcgacac attcgacgac cgctccggtt 960
cccttcgcgc gtacacaccg tatccgcaga catgg 995
<210> 6
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcctggacct tgcaggacac ctacgagggc tccaccttct tcaacggctt cgacttcttt 60
acatccgctg atcctacgca cggatttgtc caatacgtcg accaggccac ggcccagtca 120
agcggcttga tttataacca aggcagccaa gtcatcatca aggcagacgc cacctccacc 180
accccaaacg gccgtccatc ggtccgtatc tcatcccaag cgacctacaa ttccggcctc 240
ttcatctttg atctggagca catgccgttt ggatgcgcta cctggcctgc catctggctt 300
gtcggtccca actggcccaa cggtggtgag attgatatca ttgaaggcgt gaacctgcag 360
accacggact ccatgacgct ccacacggcg agcggatgca cgatggaaaa cgtggctcgc 420
acggagaccg gcacgcccac gggccatcag gactgcgacg tgaccaacga tccttccaac 480
ctggggtgcg gcgtcacgtc gacctcgacc acgagctacg gccagggctt caacaacgag 540
aacggcggcg tgtacgcaac ccgctggact gcctcgaccg gcatccagat ttggttcttc 600
gaccggtcca gtattccatc tgatatccag tctggctcgc ccaacccgga cagctggccc 660
acgcccgcgg ccgatttccc gttcacgagc tgcaacccgt ccctgttctc caacatgaag 720
atcgtgctcg acttgacctt ctgcggcgac tgggctggca gcgtctacag ctccagtgga 780
tgcccctcgg actgcacgac ttacgtaagc aacacccctt cgggattcga tgaagcttac 840
tggcgcatca actccttcaa agtgtaccaa agctcttag 879
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtgacattg gtatgatcga cgccaatata gacctcg 37
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatcatacca atgtcaccag tggtagcggc c 31
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcgtctgcc ttgatgatga cttggctgcc ttg 33
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcatcaagg cagacgccac ctccaccacc c 31

Claims (5)

1.一种GH16家族葡聚糖酶的N-糖基化突变体TlGlu16A_A62T，其特征在于，突变体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种GH16家族葡聚糖酶的N-糖基化突变体TlGlu16A_A62T，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所示核苷酸序列。
4.一种重组菌株，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求4所述的重组菌株在制备饲料添加剂中的应用。
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