CN105018446B

CN105018446B - 纤维素外切葡聚糖酶cbh i的突变体及玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆的降粘剂

Info

Publication number: CN105018446B
Application number: CN201510475849.9A
Authority: CN
Inventors: 黄和; 俞亚东; 李秀娟; 李干禄
Original assignee: NANJING TIANKAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING TIANKAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2015-08-06
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2035-08-06
Also published as: CN105018446A

Abstract

本发明提供纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体及玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆的降粘剂，涉及生物技术领域。所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体，是将纤维素外切葡聚糖酶CBH I氨基酸序列第68位的酪氨酸用甘氨酸或丙氨酸取代后所得。本发明降粘剂，是所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体与选自果胶酶、木聚糖酶、β‑葡聚糖酶、甘露聚糖酶、谷氨酰胺转氨酶和脂肪酶中的一种或两种以上的混合物。本发明纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体，具有优异的酶稳定性和催化活性，制备方法简单，高效。采用本发明降粘剂，可以在低能耗的条件下对玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆进行快速、高效降粘。

Description

纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体及玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆的降粘剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体及其在降低淀粉发酵乙醇中清液浓缩物粘度方面的应用。

背景技术

长期以来，化石能源一直是人类依赖的主要能源之一。然而，化石能源为不可再生的资源，经长期大量开采使用后，目前正走向枯竭；此外化石资源的长期使用还带来日益严峻的环境污染问题。鉴于以上原因，世界各国一直在积极寻找各种可替代化石资源的可再生清洁能源，其中燃料乙醇正是备受青睐的可再生清洁能源之一。

然而，自2014年以来，受国际原油价格下跌60％的影响，燃料乙醇价格已经下跌了1800元/吨。2015年起，国家取消了燃料乙醇的补贴政策，占燃料乙醇主要成本85％的谷物原料(如玉米)价格受托市政策影响而价格坚挺。在此背景下，燃料乙醇生产企业面临极大的生存压力，同时由于原料本身的问题，在管道输送、蒸馏酒精、酒糟干燥等处理工程中，产生较高的蒸汽消耗成本，主要副产品DDGS受进口产品冲击而持续降价，使得国内主要玉米燃料乙醇生产企业经济效益出现较大亏损。

在国际油价持续收低和国家补贴政策退出的情况下，玉米燃料乙醇生产企业必须通过创新性技术研发提升产品力，提高生产效率，降低生产成本和副产品增值，是一条摆脱困境的最有效途径。目前，燃料乙醇生产企业以淀粉质原料(如玉米、大米、小麦、高粱、山芋干、木薯等)发酵生产燃料乙醇，原料需要经过粉碎、液糖化、发酵、蒸馏、饲料加工等工序。玉米酒精发酵后的蒸馏废醪经离心或板框过滤，得到湿酒糟(WDG)和清液(DGS)，受粘度和悬浮物的限制，清液只能浓缩为29％的糖浆，再加入湿酒糟(WDG)一起烘干，制备出干酒糟及其可溶物产品(DDGS)。由于糖浆浓度不高，带入的大量水分，将极大增加饲料烘干蒸汽能耗，提高烘干的温度，延长高温停留时间，营养物质得到大量破坏，产生大量美拉德反应，使得DDGS颜色较深，极易有焦糊味，影响饲养动物的适口性，影响了DDGS饲料的等级和价格，从而影响到玉米燃料乙醇企业的利润。

现有技术中，没有方法能够对玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆进行低能耗、快速、高效降粘。

发明内容

本发明的目的是提供纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体，具有优异的酶稳定性和催化活性。

本发明的另一目的是提供所述突变体的制备方法，该方法简单，高效。

本发明的再一目的是提供玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆的降粘剂，可以在低能耗的条件下对玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆进行快速、高效降粘。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体，是将纤维素外切葡聚糖酶CBH I氨基酸序列第68位的酪氨酸用甘氨酸或丙氨酸取代后所得。

本发明还提供所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体的编码基因及含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或细胞系。

本发明还提供所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体的制备方法，包括下述步骤：通过发酵携带权利要求1所述突变体编码基因的大肠杆菌得到所述突变体。

本发明还提供玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆的降粘剂，该降粘剂是权利要求1所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体与选自果胶酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、谷氨酰胺转氨酶和脂肪酶中的一种或两种以上的混合物。

优选的技术方案中，所述降粘剂按照质量份含有下述成分：权利要求1所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体40-50份，

果胶酶10-15份，

木聚糖酶8-15份，

β-葡聚糖酶10-12份，

甘露聚糖酶7-10份，

谷氨酰胺转氨酶0.6-2份，

脂肪酶0.2-2份。

在本发明中，所述降粘剂还含有稳定剂，所述稳定剂选自甘油、乙醇、氯化钠中的一种或两种以上。

在本发明中，所述降粘剂还含有防腐剂，所述防腐剂选自山梨醇、松油、麝香草酚、苯甲酸钠中的一种或两种以上。

本发明还提供所述降粘剂在降低玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆粘度方面的应用。

本发明纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体，具有优异的酶稳定性和催化活性。本发明所述突变体的制备方法，简单、高效。采用本发明降粘剂，可以在低能耗的条件下对玉米燃料乙醇发酵生产中的糖浆进行快速、高效降粘。本发明降粘剂，对糖浆的降粘可实现将清液浓缩到70％浓度以上，减少了燃料酒精发酵过程中蒸汽的消耗，提高副产品DDGS的一级品率。本发明为玉米燃料乙醇的节能减排生产、副产品DDGS的提升，提供了一条有效方法。

附图说明

图1降粘剂1及对照降粘剂1添加量对浓度为29％糖浆粘度的影响。

图2降粘剂4及对照降粘剂2添加量对浓度为29％糖浆粘度的影响。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1纤维素外切葡聚糖酶CBH I突变体的制备及性质

1.突变体的序列

瑞氏木霉纤维素外切葡聚糖酶CBH I的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因cDNA序列如SEQ ID NO:2所示。

经过分子模拟软件PROPKA software分析，将瑞氏木霉纤维素外切葡聚糖酶CBH I氨基酸序列第68位的酪氨酸(Y)用甘氨酸(G)取代，得到突变体Y68G，相应的替换密码子(将SEQ ID NO:2中第202-204位的TAC替换为GGT)。针对大肠杆菌，利用http://www.jcat.de网站进行密码子优化，最终得到突变体Y68G的编码基因(SEQ ID NO:3)。另外，将瑞氏木霉纤维素外切葡聚糖酶CBH I氨基酸序列第68位的酪氨酸(Y)用丙氨酸(A)取代，得到突变体Y68A，通过上述相同方法，得到突变体Y68A的编码基因(SEQ ID NO:4)。

2.纤维素外切葡聚糖酶CBH I突变体的制备

委托南京金斯瑞生物科技有限公司(http://www.genscript.com.cn/)合成突变体Y68G的基因片段。通过酶切位点Nde I和Xho I，将突变体Y68G的基因片段插入pET-22b表达载体质粒，然后导入大肠杆菌，得到重组菌1。采用IPTG诱导重组菌1表达突变体Y68G。将诱导培养后的重组菌1发酵液离心，分离上清液和沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳，发现仅沉淀泳道出现大小约为65kDa的条带。将沉淀采用PBS缓冲液洗涤后，采用上清液相同体积的PBS缓冲液悬浮后超声破碎，离心取上清液作为突变体Y68G粗酶液。

参照上述相同方法，构建携带突变体Y68A基因片段的重组菌2。采用IPTG诱导重组菌2表达突变体Y68A。将诱导培养后的重组菌2发酵液离心分离上清液和沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳，发现仅沉淀泳道出现大小约为65kDa的条带。将沉淀采用PBS缓冲液洗涤后，采用上清液相同体积的PBS缓冲液悬浮后超声破碎，离心取上清液作为突变体Y68A粗酶液。

采用上述方法，构建携带纤维素外切葡聚糖酶CBH I基因片段的重组菌3。采用IPTG诱导后，超声裂解破碎，取上清液作为纤维素外切葡聚糖酶CBH I粗酶液。

3.两种突变体及原始酶在稳定性及催化活性方面的比较

(1)按照前述方法，诱导表达纤维素外切葡聚糖酶CBH I、突变体Y68G和突变体Y68A，分别定义为CBH I组、Y68G组和Y68A组；

(2)上述三个实验组中，分别取5mL同样密度(OD₆₀₀相同)的菌液，超声破碎制得粗酶液，待用；

(3)测试各组粗酶液初始酶活力，以及反复冻融1次、3次和5次后酶活力。参考文献(姚博，纤维素外切葡聚糖酶CBH I在Pichia pastoris中的表达研究，2004年山东大学硕士论文)中的方法，酶活力测试方法如下：以pH5.0、50mmol/L的醋酸钠缓冲液配制2.5mmol/L的pNPC(对硝基苯纤维二糖苷)溶液作为底物溶液。取0.8ml的底物溶液加入0.2ml酶液，50℃保温30min，加入1％的碳酸钠溶液1ml终止反应，410nm比色读取OD值。以不同浓度的对硝基酚溶液在410nm下的OD值作标准曲线。以每毫升粗酶液每分钟催化产生1微摩尔对硝基酚为1个活力单位(U)。通过标准曲线，计算酶活(U/ml)。

从表1可以看出，两种突变体Y68G和Y68A，在初始酶活力和抗冻融性能上，均显著优于原始的纤维素外切葡聚糖酶CBH I。

表1酶活力及稳定性测试(单位：U/ml)

实施例2降粘剂的制备

分别制备如下组成的降粘剂。本实施例中的份数为质量份。本实例中原始的纤维素外切葡聚糖酶CBH I、两种突变体Y68G和Y68A，分别按照实施例1中的方法获得粗酶液，随后按照文献1(潘锋等，宇佐美曲霉Y-26纤维素酶的纯化及酶学性质，南京理工大学学报，2001)中方法纯化各纤维素外切葡聚糖酶并冷冻干燥，纤维素外切葡聚糖酶CBH I的比活力为21500U/g，突变体Y68G的比活力为39600U/g，Y68A的比活力为38400U/g。其余所用酶的信息如表2所示。

表2复合降粘剂中所用酶信息

酶名称	厂家	产品编号	比活力
				果胶酶	苏柯汉(潍坊)生物工程有限公司	SUKAPec	50000U/g
木聚糖酶	上海源叶生物科技有限公司	MFCD00132594	60000U/mg
				β-葡聚糖酶	上海源叶生物科技有限公司	MFCD00130940	50U/mg
甘露聚糖酶	湖北远成赛创科技有限公司	37288-54-3	10000U/g
				谷氨酰胺转氨酶	郑州裕和食品添加剂有限公司	TG-K	10000U/g
脂肪酶	Sigma公司	MFCD02685893	10000U/g

降粘剂1：纤维素酶突变体Y68G 45份、果胶酶15份、木聚糖酶13份、β-葡聚糖酶12份、甘露聚糖酶8份、谷氨酰胺转氨酶1份和脂肪酶0.5份。

降粘剂2：纤维素酶突变体Y68G 50份、果胶酶13份、木聚糖酶8份、β-葡聚糖酶10份、甘露聚糖酶7份、谷氨酰胺转氨酶0.6份和脂肪酶0.2份。

对照降粘剂1：纤维素外切葡聚糖酶CBH I 45份、果胶酶15份、木聚糖酶13份、β-葡聚糖酶12份、甘露聚糖酶8份、谷氨酰胺转氨酶1份和脂肪酶0.5份。

降粘剂3：纤维素酶突变体Y68A 48份、果胶酶10份、木聚糖酶14份、β-葡聚糖酶10份、甘露聚糖酶9份、谷氨酰胺转氨酶1.5份和脂肪酶0.6份。

降粘剂4：纤维素酶突变体Y68A50份、果胶酶13份、木聚糖酶15份、β-葡聚糖酶11份、甘露聚糖酶9份、谷氨酰胺转氨酶1.5份和脂肪酶0.2份。

对照降粘剂2：纤维素外切葡聚糖酶CBH I 50份、果胶酶13份、木聚糖酶15份、β-葡聚糖酶11份、甘露聚糖酶9份、谷氨酰胺转氨酶1.5份和脂肪酶0.2份。

实施例3降粘剂的应用

玉米燃料乙醇发酵的工艺流程为：玉米粉—调浆—加入酶制剂及酵母—生料发酵—蒸馏—脱水—燃料乙醇。发酵中各物质的添加量为玉米粉2kg、酵母0.1-0.5％、α-淀粉酶20-80U/g玉米粉、糖化酶100-200U/g玉米粉。发酵条件：料水比1:2-1:5,28-35℃恒温，搅拌速度100-200r/min，无蒸煮发酵3-6天。发酵结束后，蒸馏出燃料乙醇，将蒸馏废醪板框过滤，得到清液。将清液浓缩至浓度(干物质质量百分浓度，下同)为29％的糖浆。分别采用实施例2中降粘剂1与对照降粘剂1，降粘剂4与对照降粘剂2对糖浆进行降粘。

实验方法：取pH2.5、浓度29％的糖浆500ml，置在40℃水浴锅中100rpm条件下振荡加热到40℃，用4℃、5％NaOH溶液(5gNaOH溶于水、定容到100ml)调pH至5.0。在糖浆中加入降粘剂并搅拌均匀，保温40℃维持3h。测定溶液粘度。Cx表示添加的降粘剂与糖浆的质量比，Cp表示粘度(单位mPa·S)。

实验结果：由图1可以看出，在添加量相同的条件下，与对照降粘剂1相比，降粘剂1使得糖浆粘度下降更多。使糖浆粘度降低4.8mPa·S(由18.8mPa·S降低到14mPa·S)，需要添加对照降粘剂1的量为1.25‰，而使糖浆粘度降低5.3mPa·S(由19mPa·S降低到13.7mPa·S)，需添加降粘剂1的量仅为0.25‰，是对照降粘剂1添加量的1/5。由图2可以看出，在添加量相同的条件下，与对照降粘剂2相比，降粘剂4使得糖浆粘度下降更多。使糖浆粘度降低4.3mPa·S(由18mPa·S降低到13.7mPa·S)，需要添加对照降粘剂1的量为0.75‰，而使糖浆粘度降低4.5mPa·S(由18.2mPa·S降低到13.7mPa·S)，需添加降粘剂4的量仅为0.25‰，是对照降粘剂1添加量的1/3。

降粘剂1和4可将浓度为29％的糖浆粘度降至9.5％和7.5％，再次浓缩，可将糖浆浓缩至浓度达到70％，这样将减少了燃料酒精发酵过程中蒸汽的消耗，提高副产品DDGS的一级品率。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京天凯生物技术股份有限公司

<120> 纤维素外切葡聚糖酶CBH

I的突变体及玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆的降粘剂

<130> 20150805

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 514

<212> PRT

<213> 瑞氏木霉

<400> 1

Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg

1 5 10 15

Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr

20 25 30

Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser

35 40 45

Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser

50 55 60

Thr Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp

65 70 75 80

Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala

85 90 95

Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe

100 105 110

Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met

115 120 125

Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe

130 135 140

Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala

145 150 155 160

Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro

165 170 175

Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln

180 185 190

Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly

195 200 205

Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly

210 215 220

Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu

225 230 235 240

Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu

245 250 255

Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr

260 265 270

Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr

275 280 285

Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys

290 295 300

Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr

305 310 315 320

Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly

325 330 335

Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu

340 345 350

Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln

355 360 365

Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp

370 375 380

Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr

385 390 395 400

Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr

405 410 415

Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys

420 425 430

Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn

435 440 445

Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr

450 455 460

Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln

465 470 475 480

Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val

485 490 495

Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln

500 505 510

Cys Leu

<210> 2

<211> 1545

<212> DNA

<213> 瑞氏木霉

<400> 2

atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60

tgcactctcc aatcggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc 120

acgtgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gactcacgct 180

acgaacagca gcacgaactg ctacgatggc aacacttgga gctcgaccct atgtcctgac 240

aacgagacct gcgcgaagaa ctgctgtctg gacggtgccg cctacgcgtc cacgtacgga 300

gttaccacga gcggtaacag cctctccatt ggctttgtca cccagtctgc gcagaagaac 360

gttggcgctc gcctttacct tatggcgagc gacacgacct accaggaatt caccctgctt 420

ggcaacgagt tctctttcga tgttgatgtt tcgcagctgc cgtgcggctt gaacggagct 480

ctctacttcg tgtccatgga cgcggatggt ggcgtgagca agtatcccac caacaccgct 540

ggcgccaagt acggcacggg gtactgtgac agccagtgtc cccgcgatct gaagttcatc 600

aatggccagg ccaacgttga gggctgggag ccgtcatcca acaacgcgaa cacgggcatt 660

ggaggacacg gaagctgctg ctctgagatg gatatctggg aggccaactc catctccgag 720

gctcttaccc cccacccttg cacgactgtc ggccaggaga tctgcgaggg tgatgggtgc 780

ggcggaactt actccgataa cagatatggc ggcacttgcg atcccgatgg ctgcgactgg 840

aacccatacc gcctgggcaa caccagcttc tacggccctg gctcaagctt taccctcgat 900

accaccaaga aattgaccgt tgtcacccag ttcgagacgt cgggtgccat caaccgatac 960

tatgtccaga atggcgtcac tttccagcag cccaacgccg agcttggtag ttactctggc 1020

aacgagctca acgatgatta ctgcacagct gaggaggcag aattcggcgg atcctctttc 1080

tcagacaagg gcggcctgac tcagttcaag aaggctacct ctggcggcat ggttctggtc 1140

atgagtctgt gggatgatta ctacgccaac atgctgtggc tggactccac ctacccgaca 1200

aacgagacct cctccacacc cggtgccgtg cgcggaagct gctccaccag ctccggtgtc 1260

cctgctcagg tcgaatctca gtctcccaac gccaaggtca ccttctccaa catcaagttc 1320

ggacccattg gcagcaccgg caaccctagc ggcggcaacc ctcccggcgg aaacccgcct 1380

ggcaccacca ccacccgccg cccagccact accactggaa gctctcccgg acctacccag 1440

tctcactacg gccagtgcgg cggtattggc tacagcggcc ccacggtctg cgccagcggc 1500

acaacttgcc aggtcctgaa cccttactac tctcagtgcc tgtaa 1545

<210> 3

<211> 1542

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 突变体Y68G的编码基因

<400> 3

atgtaccgta aactggctgt tatctctgct ttcctggcta ccgctcgtgc tcagtctgct 60

tgcaccctgc agtctgaaac ccacccgccg ctgacctggc agaaatgctc ttctggtggt 120

acctgcaccc agcagaccgg ttctgttgtt atcgacgcta actggcgttg gacccacgct 180

accaactctt ctaccaactg cggtgacggt aacacctggt cttctaccct gtgcccggac 240

aacgaaacct gcgctaaaaa ctgctgcctg gacggtgctg cttacgcttc tacctacggt 300

gttaccacct ctggtaactc tctgtctatc ggtttcgtta cccagtctgc tcagaaaaac 360

gttggtgctc gtctgtacct gatggcttct gacaccacct accaggaatt caccctgctg 420

ggtaacgaat tctctttcga cgttgacgtt tctcagctgc cgtgcggtct gaacggtgct 480

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ggtgctaaat acggtaccgg ttactgcgac tctcagtgcc cgcgtgacct gaaattcatc 600

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ggtggtacct actctgacaa ccgttacggt ggtacctgcg acccggacgg ttgcgactgg 840

aacccgtacc gtctgggtaa cacctctttc tacggtccgg gttcttcttt caccctggac 900

accaccaaaa aactgaccgt tgttacccag ttcgaaacct ctggtgctat caaccgttac 960

tacgttcaga acggtgttac cttccagcag ccgaacgctg aactgggttc ttactctggt 1020

aacgaactga acgacgacta ctgcaccgct gaagaagctg aattcggtgg ttcttctttc 1080

tctgacaaag gtggtctgac ccagttcaaa aaagctacct ctggtggtat ggttctggtt 1140

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<210> 4

<211> 1542

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 突变体Y68A的编码基因

<400> 4

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gttggtgctc gtctgtacct gatggcttct gacaccacct accaggaatt caccctgctg 420

ggtaacgaat tctctttcga cgttgacgtt tctcagctgc cgtgcggtct gaacggtgct 480

ctgtacttcg tttctatgga cgctgacggt ggtgtttcta aatacccgac caacaccgct 540

ggtgctaaat acggtaccgg ttactgcgac tctcagtgcc cgcgtgacct gaaattcatc 600

aacggtcagg ctaacgttga aggttgggaa ccgtcttcta acaacgctaa caccggtatc 660

ggtggtcacg gttcttgctg ctctgaaatg gacatctggg aagctaactc tatctctgaa 720

gctctgaccc cgcacccgtg caccaccgtt ggtcaggaaa tctgcgaagg tgacggttgc 780

ggtggtacct actctgacaa ccgttacggt ggtacctgcg acccggacgg ttgcgactgg 840

aacccgtacc gtctgggtaa cacctctttc tacggtccgg gttcttcttt caccctggac 900

accaccaaaa aactgaccgt tgttacccag ttcgaaacct ctggtgctat caaccgttac 960

tacgttcaga acggtgttac cttccagcag ccgaacgctg aactgggttc ttactctggt 1020

aacgaactga acgacgacta ctgcaccgct gaagaagctg aattcggtgg ttcttctttc 1080

tctgacaaag gtggtctgac ccagttcaaa aaagctacct ctggtggtat ggttctggtt 1140

atgtctctgt gggacgacta ctacgctaac atgctgtggc tggactctac ctacccgacc 1200

aacgaaacct cttctacccc gggtgctgtt cgtggttctt gctctacctc ttctggtgtt 1260

ccggctcagg ttgaatctca gtctccgaac gctaaagtta ccttctctaa catcaaattc 1320

ggtccgatcg gttctaccgg taacccgtct ggtggtaacc cgccgggtgg taacccgccg 1380

ggtaccacca ccacccgtcg tccggctacc accaccggtt cttctccggg tccgacccag 1440

tctcactacg gtcagtgcgg tggtatcggt tactctggtc cgaccgtttg cgcttctggt 1500

accacctgcc aggttctgaa cccgtactac tctcagtgcc tg 1542

Claims

1.纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体，是将纤维素外切葡聚糖酶CBH I氨基酸序列第68位的酪氨酸用甘氨酸或丙氨酸取代后所得，所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体的编码基因。

3.含有权利要求2所述编码基因的表达盒。

4.含有权利要求2所述编码基因的重组载体。

5.含有权利要求2所述编码基因的重组菌。

6.含有权利要求2所述编码基因的细胞系。

7.权利要求1所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体的制备方法，包括下述步骤：通过发酵携带权利要求1所述突变体编码基因的大肠杆菌得到所述突变体。

8.玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆的降粘剂，其特征在于该降粘剂是权利要求1所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体与选自果胶酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、谷氨酰胺转氨酶和脂肪酶中的一种或两种以上的混合物。

9.根据权利要求8所述降粘剂，其特征在于所述降粘剂按照质量份含有下述成分：权利要求1所述纤维素外切葡聚糖酶CBH I的突变体40-50份，

果胶酶10-15份，

木聚糖酶8-15份，

β-葡聚糖酶10-12份，

甘露聚糖酶7-10份，

谷氨酰胺转氨酶0.6-2份，

脂肪酶0.2-2份。

10.根据权利要求8或9所述降粘剂，其特征在于所述降粘剂还含有稳定剂，所述稳定剂选自甘油、乙醇、氯化钠中的一种或两种以上。

11.根据权利要求10所述降粘剂，其特征在于所述降粘剂还含有防腐剂，所述防腐剂选自山梨醇、松油、麝香草酚、苯甲酸钠中的一种或两种以上。

12.权利要求8所述降粘剂在降低玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆粘度方面的应用。