CN107988127B - 里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用 - Google Patents

里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用。里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合由具有分泌表达里氏木霉的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β‑葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌构成。分泌的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β‑葡聚糖苷酶能够有效降解羧甲基纤维素钠，可用于食品、能源、医药、饲料、纺织、洗涤等工业。里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合能够有效降解苜蓿中的木质纤维素，提高了苜蓿青贮饲料的发酵和营养品质，具有可观的经济价值。

Description

里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿 青贮饲料中的应用
技术领域
本发明属于应用工业微生物领域，公开了里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用。里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合由能够分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌、能够分泌表达里氏木霉外切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌和能够分泌表达里氏木霉β-葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌组成。分泌的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶能够有效降解羧甲基纤维素钠，可用于食品、能源、医药、饲料、纺织、洗涤等工业。里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合能够有效降解苜蓿中的木质纤维素，提高了苜蓿青贮饲料的发酵和营养品质，具有可观的经济价值。
背景技术
木质纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物干重的30％～50％，是地球上分布最广、再生性最佳的结构性碳水化合物，占地球总生物量的40％。对人类而言，木质纤维素即是自然界中数量最大的可再生性能源，也是自然界碳素循环的中心环节。木质纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、环境污染、粮食和饲料短缺等问题具有十分重要的意义。
纤维素酶是分解木质纤维素的一类酶。里氏木霉(Trichoderma reesei)是高效产纤维素酶的真菌，其产生的纤维素酶具有酶系完全，安全，活性高，能分泌到细胞外，便于分离提纯等优点，被广泛应用于能源、食品、医药、饲料和化工等工业领域。根据催化反应功能的不同，纤维素酶由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶构成，只有三者同时存在时才能彻底有效地降解木质纤维素。内切葡聚糖酶可随机水解木质纤维素非结晶区的β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端，外切葡聚糖酶可从纤维素线状分子的非还原性末端水解切下纤维二糖单位，β-葡聚糖苷酶则将纤维二糖水解成葡萄糖。三个成分相互协同，完成对木氏纤维素的降解，缺乏任意一种酶都无法彻底地将纤维素进行良好地降解。里氏木霉表达内切葡聚糖酶基因有egl1、egl2、egl3、egl4和egl5,其中对egl1、egl2和egl3基因的研究较多，egl3基因编码的内切葡聚糖酶，具有特异性强和活性高的特点。目前，我国构建出的egl1和egl2基因工程大肠杆菌分泌表达内切葡聚糖酶的效果差。里氏木霉表达外切葡聚糖酶的基因分别为cbh1和cbh2。目前，我国对cbh1和cbh2基因工程大肠杆菌和乳酸菌进行了研究，但尚未将构建的cbh2基因工程乳酸菌应用于降解含有木质纤维素的材料。里氏木霉表达β-葡聚糖苷酶的基因分别是bgl1和bgl2，bgl1比bgl2长且含有的内含子较多和较长的信号肽序列。目前，我国仅成功克隆和表达bgl2基因的大肠杆菌，未构建出分泌表达bgl1基因的大肠杆菌和乳酸菌。在纤维素降解过程中，所生成的纤维二糖或寡糖的积累会抑制内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性，而β-葡萄糖苷酶能够从非还原端将上述二者作用形成的纤维二糖或纤维寡糖水解，最终形成葡萄糖，是纤维素降解过程中关键的限速酶，这也是高效利用纤维物质的关键。构建出分泌表达里氏木霉bgl1基因的乳酸菌是成功应用里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌的关键。
青贮饲料是奶牛的当家饲料，约占日粮的50-70％。随着生物技术的飞速发展，人们发现添加纤维素酶或乳酸菌提高青贮饲料的发酵品质更经济、方便、安全，其主要原因是纤维素酶降解纤维素产生水溶性糖为乳酸菌发酵提供充足底物，接种的乳酸菌迅速成为优势菌群，促进乳酸发酵，但是添加纤维素酶或乳酸菌对青贮饲料发酵品质的改善效果常常不稳定。因此，混合添加纤维素酶和乳酸菌提高了苜蓿、全株水稻、小麦秸秆、大黍、玉米秸秆等青贮饲料的发酵品质，但生产成本提高，导致纤维素酶和乳酸菌混合应用于生产实践的比例较低。
乳酸菌是青贮的主导菌，也是人和动物肠道内的常见细菌，被公认为安全级微生物，但大部分不具有降解纤维素的能力。目前，国内外通过转基因技术构建了具有纤维素酶基因的乳酸菌。但是，这些具有纤维素酶基因的乳酸菌降解木质纤维素的效果不佳，其主要原因是构建的纤维素酶转基因乳酸菌不具分泌功能或者分泌的酶不能完整构成纤维素酶(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶未同时存在)。迄今为止，尚无该类纤维素酶基因工程乳酸菌应用于青贮饲料研究和生产的报道。
在本发明中，里氏木霉的内切葡聚糖酶egl3基因、外切葡聚糖酶cbh2基因和β-葡聚糖苷酶bgl1基因在乳酸乳球菌中成功分泌表达。里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合提高了苜蓿青贮饲料发酵和营养品质，为纤维素酶基因工程乳酸菌的青贮应用提供了技术支撑，为苜蓿青贮饲料的生产扩大了优质乳酸菌资源，具有重要的应用前景和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种提高青贮饲料发酵和营养品质的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制青贮饲料中的应用,所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合由能够分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌、能够分泌表达里氏木霉外切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌和能够分泌表达里氏木霉β-葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌组成；
所述的能够分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌是将融合基因usp45-egl3亚克隆至pMG36e原核表达载体中构建出重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化乳酸乳球菌构建得到的；
所述的能够分泌表达里氏木霉外切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌是将融合基因usp45-cbh2亚克隆至pMG36e原核表达载体中构建出重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化乳酸乳球菌构建得到的；
所述的能够分泌表达里氏木霉β-葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌是将融合基因usp45-bgl1亚克隆至pMG36e原核表达载体中构建出重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化乳酸乳球菌构建得到的；
所述的融合基因usp45-egl3具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的融合基因usp45-cbh2具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述的融合基因usp45-bgl1具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合中三种转基因重组乳酸乳球菌的用量比为1:1:1。
将所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合按照每千克≥1×109CFU的添加量添加到鲜原料草中，无氧青贮50～70天。
所述的鲜原料草为苜蓿、全株水稻、小麦秸秆、大黍和玉米秸秆中的任意一种。
一种提高青贮饲料发酵和营养品质的方法，将里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合添加到鲜原料草中进行无氧青贮；所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合如上所述。
上述的方法中，优选为，所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合中三种转基因重组乳酸乳球菌的用量比为1:1:1。进一步优选为，所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在鲜原料草中的添加量为每千克≥1×109CFU。更进一步优选为，所述无氧青贮的时间为50～70天。更进一步优选为，所述的鲜原料草为苜蓿、全株水稻、小麦秸秆、大黍和玉米秸秆中的任意一种。
现有技术中构建出的里氏木霉egl3基因工程大肠杆菌和乳酸菌能分泌活性内切葡聚糖酶，但在没有外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶的情况下，其降解木质纤维素的效果不佳，未能应用于青贮。里氏木霉表达外切葡聚糖酶的基因分别为cbh1和cbh2。目前，我国对cbh1和cbh2基因工程大肠杆菌和乳酸菌进行了研究，但尚未将构建的cbh2基因工程乳酸菌应用于降解含有木质纤维素的材料，其原因是仅用外切葡聚糖酶不能将木质纤维素降解，未能应用于青贮。要在青贮领域彻底良好地降解木质纤维素，就要获得具有分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶基因的乳酸菌，缺一不可。上述方法中采用能够分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌、能够分泌表达里氏木霉外切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌和能够分泌表达里氏木霉β-葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌组合，实现了苜蓿木质纤维素在青贮过程中的良好降解，提高了苜蓿青贮饲料的发酵和营养品质。
上述的融合基因为以下(a)～(d)中的任意一种：
(a)融合基因usp45-egl3：包含乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45的81bp基因片段和里氏木霉内切葡聚糖酶基因egl3中编码成熟蛋白的核苷酸序列(657bp)，其具有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，全长为738bp；
(b)融合基因usp45-cbh2：包含乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45的81bp基因片段和里氏木霉外切葡聚糖酶基因cbh2中编码成熟蛋白的核苷酸序列(1344bp)，其具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，全长为1425bp；
(c)融合基因usp45-bgl1：包含乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45的81bp基因片段和里氏木霉β-葡聚糖苷酶基因bgl1中编码成熟蛋白的核苷酸序列(2142bp)，其具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，全长为2223bp；
(d)同(a)～(c)中任一所述融合基因的核苷酸序列同源性大于50％的核苷酸序列或(a)～(c)中任一所述核苷酸序列的互补序列。
上述的融合基因编码的融合蛋白为(e)～(h)中的任意一种：
(e)融合基因usp45-egl3编码的融合蛋白具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，全长为245个氨基酸；
(f)融合基因usp45-cbh2编码的融合蛋白具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列，全长为474个氨基酸；
(g)融合基因usp45-bgl1编码的融合蛋白具有如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列，全长为740个氨基酸；
(h)同(e)～(g)中任一所述融合蛋白的氨基酸序列同源性大于40％的氨基酸序列。优选为同源性大于98％的氨基酸序列。
含有上述融合基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
上述的重组表达载体，将上述的融合基因亚克隆至pMG36e原核表达载体中，构建出的重组表达载体。
其中，将所述的融合基因usp45-egl3亚克隆至pMG36e原核表达载体中，构建出的重组表达载体pMG36e-usp45-egl3。
将所述的融合基因usp45-cbh2亚克隆至pMG36e原核表达载体中，构建出的重组表达载体pMG36e-usp45-cbh2。
将所述的融合基因usp45-bgl1亚克隆至pMG36e原核表达载体中，构建出的重组表达载体pMG36e-usp45-bgl1。
上述的转基因重组菌，该转基因重组菌为将上述的重组表达载体转化乳酸菌构建的转基因重组乳酸菌。
其中，将重组表达载体pMG36e-usp45-egl3转化乳酸菌构建转基因重组乳酸菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3。
将重组表达载体pMG36e-usp45-cbh2转化乳酸菌构建转基因重组乳酸菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2。
将重组表达载体pMG36e-usp45-bgl1转化乳酸菌构建转基因重组乳酸菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1。
上述的融合基因或上述的融合蛋白在表达内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或β-葡聚糖苷酶中的应用或在水解木质纤维素中的应用。
上述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在制备内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或β-葡聚糖苷酶蛋白质中的应用或在水解木质纤维素中的应用。
本发明所涉及的试验材料除特别说明外均可以通过市场购买获得，本发明所述的室温为25±5℃。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
开创了egl3，cbh2和bgl1基因的原核表达，获得了基因重组乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1。
基因重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1依次能够高效分泌表达内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶，产酶活性依次为1.12 U/ml，0.22U/ml和0.13U/ml，生产的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶可以在食品、能源、医药、饲料、纺织、洗涤等工业中应用。
基因重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1按1：1：1混合后接种于苜蓿青贮饲料。青贮60天后，苜蓿的木质纤维素被降解为可被乳酸菌利用的水溶性碳水化合物，促进了乳酸发酵，降低了pH、丁酸和氨态氮含量，提高了苜蓿青贮饲料的发酵品质，其效果与混合添加普通乳酸菌和纤维素酶的效果相同。因此，可减少纤维素酶的添加，降低了优质青贮饲料的生产成本。
附图说明
图1为pMG36e-usp45-egl3的酶切鉴定
注：M，Maker；1，Xba I酶切；2，Sma I和Xba I酶切
图2为pMG36e-usp45-cbh2的酶切图
注：1和2，Sal I和Sph I的酶切；3，Sal I酶切。
图3pMG36e-usp45-bgl1的酶切图
注：1，Sma I酶切；2，Sma I和Sph I的酶切
图4为L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3降解纤维素的效果
注：MZ：L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3；MK：L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e；MC：L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-egl3。
图5为L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2降解纤维素的效果
注：Wild：未转化的乳酸乳球菌；R1：L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2图6为L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1降解纤维素的效果
注：Wild：未转化的乳酸乳球菌；R2：L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1图7为L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3表达内切葡聚糖酶的SDS-PAGE电泳图
注：M，蛋白Maker；a，L.lactissubsp.lactis MG1363的胞内蛋白；b，L.lactissubsp.lactis MG1363/pMG36e-egl3的胞内蛋白；c，L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3的胞内蛋白；d，L.lactissubsp.lactisMG1363的胞内蛋白；e,L.lactissubsp.lactis MG1363/pMG36e-egl3的胞外蛋白；f和g，L.lactissubsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3的胞外蛋白。
图8为L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1分别表达外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶的SDS-PAGE电泳图
注：cbh2外，L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2的胞外蛋白；cbh2内，L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2的胞内蛋白；1363外，L.lactissubsp.lactis MG1363的胞外蛋白；1363内，L.lactissubsp.lactis MG1363的胞内蛋白；bgl1外，L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1的胞外蛋白；bgl1内，L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1的胞内蛋白；M，蛋白Marker；CBH2,外切葡聚糖酶；BGL1，β-葡聚糖苷酶。
具体实施方式
实施实例一：里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌的构建
1、usp45-egl3，usp45-cbh2和usp45-bgl1融合基因的合成
根据GenBank乳酸乳球菌usp45基因编码(基因收录号：M60178)部分序列和里氏木霉的egl3基因(基因收录号：AB003694)、cbh2基因(基因收录号：M55080.1)、bgl1基因(基因收录号：AB003694)中编码成熟蛋白的序列，采用重叠延伸PCR合成技术合成上下游带有酶切位点的usp45-egl3，usp45-cbh2和usp45-bgl1融合基因。该带有酶切位点的融合基因交由上海捷瑞生物工程有限公司采用重叠延伸PCR技术合成。重叠延伸PCR合成usp45-egl3，usp45-cbh2和usp45-bgl1的步骤是：根据usp45-egl3，usp45-cbh2和usp45-bgl1的序列设计20-30bp的寡核苷酸引物并合成，溶解于PCR Assembly体系(PCR Buffer5x 10μl,10mMdNTPs 1μ1,Primer Mix 2μ1,2U/μ1Polymerase 0.5μ1，补助超纯水至50μ1)，并进行连接(98℃30s；16～25个循环98℃10s，55～65℃20～30s,72℃15～30s/kb；72℃ 5min延伸)。采用PCR扩增体系(PCR Buffer5x10μl,10mM dNTPs 1μ1,Primer F(首引物)和Primer R(尾引物)各1μ1,2U/μ1Polymerase 0.5μ1，模板为PCR Assembly产物2μ1，补助超纯水至50μ1)和扩增程序进行扩增(98℃30s；25个循环98℃10s，55～65℃20～30 s,72℃15～30s/kb；72℃5min延伸)，最终获得usp45-egl3，usp45-cbh2和usp45-bgl1融合基因。整个合成过程以及合成过程中所涉及的引物均由该公司设计完成。
融合基因usp45-egl3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；融合基因usp45-cbh2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；融合基因usp45-bgl1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2、分泌型表达质粒的构建
采用试剂盒Takara Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将测序正确的usp45-egl3，usp45-cbh2和usp45-bgl1片段与pMG36e质粒双酶切后过夜连接制备重组表达载体；其中，将融合基因usp45-egl3与Sma I和Xba I双酶切后的pMG36e质粒采用T4DNA连接酶过夜连接，得到重组表达载体pMG36e-usp45-egl3，酶切鉴定结果如图1所示；将融合基因usp45-cbh2与Sal I和Sph I双酶切后的p MG36e质粒采用T4DNA连接酶过夜连接，得到重组表达载体pMG36e-usp45-cbh2，酶切鉴定结果如图2所示；将融合基因usp45-bgl1与Sma I和Sph I双酶切后的p MG36e质粒采用T4DNA连接酶过夜连接，得到重组表达载体pMG36e-usp45-bgl1，酶切鉴定结果如图3所示。
将得到的重组表达载体pMG36e-usp45-egl3、pMG36e-usp45-cbh2、pMG36e-usp45-bgl1电转化到感受态乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363中并涂于含有5μg/mL红霉素的GM17固体培养基进行筛选。将阳性转化子菌体PCR扩增、提取质粒进行双酶切鉴定，得阳性菌株L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1。
3、重组乳酸乳球菌表达内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶的效果
内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶活性检测采用刚果红染色法，具体步骤如下：将L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，L.lactis subsp.
lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1、L.
lactis subsp.lactis MG1363菌液接种到转接到含有质量体积比5(g/L)羧甲基木质纤维素钠、5μg/mL红霉素的GM17平板，30℃培养48h后经1(g/L)刚果红溶液染色20min和1M NaCl溶液脱色20min，挑取能产生水解圈的阳性转化子，经测序验证基因序列无误后，用40％(V/V)甘油水溶液保存。
DNS法分析L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3表达内切葡聚糖酶的活性：以羧甲基纤维素钠为底物，在pH 6.0的醋酸缓冲液中50℃反应15min，在520nm下测定其吸光值，分析所产生的葡萄糖含量。
DNS法分析L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2表达外切葡聚糖酶的活性：以羧甲基纤维素钠为底物，pH5.0的柠檬酸缓冲液中50℃水浴反应15min，在520nm下测定其吸光值，分析所产生的葡萄糖含量。
DNS法分析L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1表达出的β-葡聚糖苷酶的活性：以水杨苷为底物，在pH 6.0的醋酸缓冲液中50℃反应30min，在520nm下测定其吸光值，分析所产生的葡萄糖含量。
重组乳酸乳球菌产纤维素酶的活性：产生的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶分别每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位。
从图4，图5和图6可见，重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1菌株在0.5％羧甲基木质纤维素钠培养基上呈现清晰的水解圈，而L.lactis subsp.lactisMG1363周围均未见水解圈，说明重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1分别分泌了活性的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶，分泌到细胞外的酶活性分别为1.12U/ml，0.22U/ml和0.13U/ml。
5、β-葡聚糖苷酶表达分析
乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，L.lactissubsp.
lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1在GM17液体培养基中培养24小时后，取5mL,10000rpm，4℃，离心10min，收集上清液。三氯乙酸法在滤液中加入1/4体积的10％(W/V，g/mL)的三氯乙酸，充分混匀，冰上沉淀蛋白1h后，12000rpm，离心15min，弃上清，收集沉淀。用预冷的丙酮将沉淀洗涤3次，12000rpm离心15min，倒掉丙酮，在通风厨中挥发残余的丙酮。取适量的去离子水将沉淀或菌体重悬，加等体积的2×上样缓冲液，混匀，于沸水中沸煮10min，离心。各取10μl上清液和菌体样品液，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。如图7和8，结果表明，重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1各自产生的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶的分子量分别约为25kDa，50kDa和78kDa。
实施实例二：里氏木霉纤维素酶基因工程乳酸菌组合提高苜蓿发酵和营养品质的应用
1、试验材料
2015年10月将吉利品种苜蓿(Medicago sativa Linn)—种植于南京农业大学试验地，于2016年5月11日收割株高为0.8～1.2m的第一茬苜蓿为试验材料。乳酸菌是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.Lactis MG1363)，简称WL；里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合由内切葡聚糖酶转基因工程乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3，外切葡聚糖酶转基因工程乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和β-葡聚糖苷酶转基因工程乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-bgl1按1：1：1构成，简称TL。纤维素酶产至里氏木霉，购自江苏锐阳生物科技有限公司，简称为EN。
1.2试验设计
试验采用单因素——添加剂处理试验设计。添加剂处理：无添加(CK)、添加1×106cfu/g FW乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363(WL)，添加2g/L FW纤维素酶(EN)，添加1×106cfu/g FW里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合(TL)，混合添加1×106cfu/g FW乳酸乳球菌和2g/kg FW纤维素酶(WL+EN)。每个处理4个重复，青贮60d。
1.3试验方法
1.3.1青贮饲料的调制
将新鲜苜蓿切短至1～2cm，混匀，按试验设计进行添加剂处理，再次混匀，装入1L实验室青贮罐中，每个青贮罐装820g，压实后盖上内外盖，并用胶带密封，置于室温下贮藏60d后开窖，评价青贮发酵和营养品质。
1.3.2青贮原料化学成分及微生物组成分析
青贮原料切短后，四分法取300g烘干后测定干物质(dry matter,DM)，烘干样品粉碎后过1mm筛用于测定粗蛋白(crude protein,CP)、水溶性碳水化合物(water-solublecarbohydrate,WSC)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗涤纤维(aciddetergent fiber,ADF)和酸性洗涤木质素(acid detergentlignin，ADL)。DM含量采用65℃干燥法烘60h以上至恒重测定，CP含量采用凯氏定氮法测定，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维采用尼龙袋法测定，中性洗涤纤维减去酸性洗涤纤维得半纤维素含量，酸性洗涤纤维减去酸性洗涤木质素得纤维素含量，WSC含量采用蒽酮-硫酸法测定。采用四分法另取20g青贮原料，于250mL锥形瓶中加蒸馏水180mL稀释10倍，并在4℃浸提18h后过滤得到浸提液，用于分析缓冲能。缓冲能采用盐酸、氢氧化钠滴定法测定。乳酸菌、好气性细菌、酵母菌和霉菌数量分别采用MRS(deMan-Rogosa-Sharpe)琼脂培养基、营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基计数。乳酸菌厌氧37℃培养2d；好气性细菌、酵母菌和霉菌在有氧条件下30℃培养2～3d。1.3.3发酵品质和微生物组成分析
青贮罐开封后，采用四分法取100g混匀的青贮饲料放入聚乙烯塑料封口袋中，加入400mL蒸馏水，冰箱里4℃下浸泡18h后过滤，用pH计(HANNA,pH 211型)测定浸提液pH值。有机酸含量采用高效液相色谱仪测定。色谱条件：Agilent HPLC 1260高效液相色谱仪；色谱柱
Figure BDA0001454849700000101
H-NP5,赛分科技有限公司；流动相为2.5mmol/L的H2SO4溶液；流速0.5mL/min；柱温55℃；检测器，示差检测器。NH3-N含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定。除丁酸梭菌外，乳酸菌、好气性细菌、酵母菌和霉菌的计数方法与原料相同。丁酸梭菌孢子采用梭菌属测定用培养基(海博生物技术有限公司，青岛)厌氧30℃培养2 d后计数。
1.4数据统计
采用SPSS 20软件的一般线性模型(GLM)对苜蓿青贮饲料的发酵品质参数进行单因素方差分析(One way-ANOVA)，并用Tukey法对各处理的平均值进行多重比较，检验水平为P<0.05。
2结果
2.2青贮原料的化学成分
新鲜苜蓿的DM、缓冲能和WSC含量较低，分别为221g/kg FW，61.1g/kg DM和52.8g/kg DM；发酵系数为29.0，粗蛋白为185g/kg DM，NDF，ADF和ADL含量分别为441g/kg DM，326g/kg DM和84.3g/kg DM；附着乳酸菌较少，数量为3.93lgcfu/g FW；好氧性微生物较多，数量超过5.0lgcfu/g FW(见附表的表1)。
2.2里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合TL提高苜蓿青贮饲料发酵品质的效果
由附表的表2可知，WL与对照组在所有发酵品质参数方面都无显著差异(P>0.05)，说明WL未提高苜蓿青贮饲料的发酵品质。与对照组相比，添加EN降低了pH、丁酸和氨态氮含量(P<0.05)，增加了乙酸含量(P<0.05)；添加WL+EN降低了pH、丁酸和氨态氮含量(P<0.05)，增加了乳酸含量(P<0.05)；添加TL降低了pH、丁酸和氨态氮含量(P<0.05)，增加了乳酸含量(P<0.05)，因此添加EN、WL+EN和TL提高了苜蓿青贮饲料的发酵品质。
与WL相比，添加TL降低了pH、丁酸和氨态氮含量(P<0.05)，增加了乳酸含量(P<0.05)；与EN相比，添加TL增加了乳酸含量(P<0.05)，降低了乙酸含量(P<0.05)。因此，添加TL提高苜蓿青贮饲料发酵品质的效果优于单独添加乳酸菌WL或纤维素酶EN。
TL与WL+EN在所有发酵品质参数方面都无显著差异(P>0.05)，说明TL提高苜蓿青贮饲料发酵品质的效果与混合添加乳酸菌WL和纤维素酶EN的效果一致，TL完全可以替代混合添加乳酸菌WL和纤维素酶EN。
2.3添加剂对苜蓿青贮饲料微生物组成的影响
由附表的表3可知，与对照相比，添加EN，WL+EN和TL降低了梭菌数量(P<0.05)，WL没有降低梭菌数量(P>0.05)。与WL相比，添加TL降低了梭菌数量(P<0.05)。TL在降低梭菌数量方面的效果优于EN和WL+EN(P>0.05)。
2.4里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合T L提高苜蓿青贮饲料营养品质的效果
由附表的表4可知，与对照相比，WL未显著改变苜蓿青贮饲料的营养参数(P>0.05)，而且其粗蛋白含量低于原料草，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量高于原料草，说明未提高苜蓿青贮饲料的营养品质。
与对照相比，EN和WL+EN增加了粗蛋白含量(P<0.05)，但是其粗蛋白含量低于原料草，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量高于原料草，说明未提高苜蓿青贮饲料的营养品质。
与对照相比，TL增加了粗蛋白和WSC含量(P<0.05)，降低了中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和纤维素的含量(P<0.05)，而且其粗蛋白含量与原料草无差异，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和纤维素含量低于原料草，说明提高了苜蓿青贮饲料的营养品质。
综上所述，内切葡聚糖酶基因工程乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3在细胞外分泌酶的活性为1.12U/mL，外切葡聚糖酶基因工程乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2在细胞外分泌酶的活性为0.22U/mL，β-葡聚糖苷酶基因工程乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1在细胞外分泌酶的活性为0.13U/mL。在苜蓿青贮饲料中接种里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合(由内切葡聚糖酶转基因工程乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-egl3，外切葡聚糖酶转基因工程乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-cbh2和β-葡聚糖苷酶转基因工程乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1，按1：1：1构成)后，苜蓿的木质纤维素被降解为可被乳酸菌利用的水溶性碳水化合物，促进了乳酸发酵，降低了pH、丁酸和氨态氮含量，提高了苜蓿青贮饲料的发酵品质，其效果与混合添加乳酸菌和纤维素酶的效果相同。因此，可减少纤维素酶的添加，降低了优质青贮饲料的生产成本，为提高纤维素含量高、碳水化合物缺乏的牧草青贮饲料的发酵品质奠定基础。
Figure BDA0001454849700000121
Figure BDA0001454849700000131
Figure BDA0001454849700000141
Figure BDA0001454849700000151
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc tcaaaccagc tgtgaccagt gggcaacctt cactggcaac 120
ggctacacag tcagcaacaa cctttgggga gcatcagccg gctctggatt tggctgcgtg 180
acggcggtat cgctcagcgg cggggcctcc tggcacgcag actggcagtg gtccggcggc 240
cagaacaacg tcaagtcgta ccagaactct cagattgcca ttccccagaa gaggaccgtc 300
aacagcatca gcagcatgcc caccactgcc agctggagct acagcgggag caacatccgc 360
gctaatgttg cgtatgactt gttcaccgca gccaacccga atcatgtcac gtactcggga 420
gactacgaac tcatgatctg gcttggcaaa tacggcgata ttgggccgat tgggtcctca 480
cagggaacag tcaacgtcgg tggccagagc tggacgctct actatggcta caacggagcc 540
atgcaagtct attcctttgt ggcccagacc aacactacca actacagcgg agatgtcaag 600
aacttcttca attatctccg agacaataaa ggatacaacg ctgcaggcca atatgttctt 660
agctaccaat ttggtaccga gcccttcacg ggcagtggaa ctctgaacgt cgcatcctgg 720
accgcatcta tcaactaa 738
<210> 2
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc tcaagcttgc tcaagcgtct ggggccaatg tggtggccag 120
aattggtcgg gtccgacttg ctgtgcttcc ggaagcacat gcgtctactc caacgactat 180
tactcccagt gtcttcccgg cgctgcaagc tcaagctcgt ccacgcgcgc cgcgtcgacg 240
acttctcgag tatcccccac aacatcccgg tcgagctccg cgacgcctcc acctggttct 300
actactacca gagtacctcc agtcggatcg ggaaccgcta cgtattcagg caaccctttt 360
gttggggtca ctccttgggc caatgcatat tacgcctctg aagttagcag cctcgctatt 420
cctagcttga ctggagccat ggccactgct gcagcagctg tcgcaaaggt tccctctttt 480
atgtggctag atactcttga caagacccct ctcatggagc aaaccttggc cgacatccgc 540
accgccaaca agaatggcgg taactatgcg ggacagtttg tggtgtatga cttgccggat 600
cgcgattgcg ctgcccttgc ctcgaatggc gaatactcta ttgccgatgg tggcgtcgcc 660
aaatataaga actatatcga caccattcgt caaattgtcg tggaatattc cgatatccgg 720
accctcctgg ttattgagcc tgactctctt gccaacctgg tgaccaacct cggtactcca 780
aagtgtgcca atgctcagtc agcctacctt gagtgcatca actacgccgt cacacagctg 840
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gcaaaccaag acccggccgc tcagctattt gcaaatgttt acaagaatgc atcgtctccg 960
agagctcttc gcggattggc aaccaatgtc gccaactaca acgggtggaa cattaccagc 1020
cccccatcgt acacgcaagg caacgctgtc tacaacgaga agctgtacat ccacgctatt 1080
ggacgtcttc ttgccaatca cggctggtcc aacgccttct tcatcactga tcaaggtcga 1140
tcgggaaagc agcctaccgg acagcaacag tggggagact ggtgcaatgt gatcggcacc 1200
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tactttgtgc agcttctcac aaacgcaaac ccatcgttcc tgtaa 1425
<210> 3
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc tgttgtacct cctgcaggga ctccatgggg aaccgcgtac 120
gacaaggcga aggccgcatt ggcaaagctc aatctccaag ataaggtcgg catcgtgagc 180
ggtgtcggct ggaacggcgg tccttgcgtt ggaaacacat ctccggcctc caagatcagc 240
tatccatcgc tatgccttca agacggaccc ctcggtgttc gatactcgac aggcagcaca 300
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gcggtaaata gcaatcaggt ccccacgagc agagtcgacg atatggtgac tcgtatcctc 960
gccgcatggt acttgacagg ccaggaccag gcaggctatc cgtcgttcaa catcagcaga 1020
aatgttcaag gaaaccacaa gaccaatgtc agggcaattg ccagggacgg catcgttctg 1080
ctcaagaatg acgccaacat cctgccgctc aagaagcccg ctagcattgc cgtcgttgga 1140
tctgccgcaa tcattggtaa ccacgccaga aactcgccct cgtgcaacga caaaggctgc 1200
gacgacgggg ccttgggcat gggttggggt tccggcgccg tcaactatcc gtacttcgtc 1260
gcgccctacg atgccatcaa taccagagcg tcttcgcagg gcacccaggt taccttgagc 1320
aacaccgaca acacgtcctc aggcgcatct gcagcaagag gaaaggacgt cgccatcgtc 1380
ttcatcaccg ccgactcggg tgaaggctac atcaccgtgg agggcaacgc gggcgatcgc 1440
aacaacctgg atccgtggca caacggcaat gccctggtcc aggcggtggc cggtgccaac 1500
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cgagatctca gctactggga cacggcttcg cagaaatggg tggtgccgtc ggggtcgttt 2160
ggcatcagcg tgggagcgag cagccgggat atcaggctga cgagcactct gtcggtagcg 2220
tag 2223
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Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
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Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Gln Thr Ser Cys Asp
20 25 30
Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Val Ser Asn Asn Leu
35 40 45
Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys Val Thr Ala Val Ser
50 55 60
Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His Ala Asp Trp Gln Trp Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln Ile Ala Ile Pro Gln
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Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro Thr Thr Ala Ser Trp
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Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val Ala Tyr Asp Leu Phe
115 120 125
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130 135 140
Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly Pro Ile Gly Ser Ser
145 150 155 160
Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp Thr Leu Tyr Tyr Gly
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Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe Asn Tyr Leu Arg Asp
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Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Gln Ala Cys Ser Ser
20 25 30
Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Asn Trp Ser Gly Pro Thr Cys Cys
35 40 45
Ala Ser Gly Ser Thr Cys Val Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys
50 55 60
Leu Pro Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr
65 70 75 80
Thr Ser Arg Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ala Thr Pro
85 90 95
Pro Pro Gly Ser Thr Thr Thr Arg Val Pro Pro Val Gly Ser Gly Thr
100 105 110
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Gly Ala Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Val Pro Ser Phe
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Ser Ser Ala Pro Arg Phe Asp Ser His Cys Ala Leu Pro Asp Ala Leu
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Glu Asp Gln Tyr Thr Leu Gln Thr Val Leu Lys Asp Gln Leu Gly Phe
245 250 255
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260 265 270
Ser Ala Asn Ser Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Thr Asp Phe Asn
275 280 285
Gly Asn Asn Arg Leu Trp Gly Pro Ala Leu Thr Asn Ala Val Asn Ser
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Asn Gln Val Pro Thr Ser Arg Val Asp Asp Met Val Thr Arg Ile Leu
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Ala Ala Trp Tyr Leu Thr Gly Gln Asp Gln Ala Gly Tyr Pro Ser Phe
325 330 335
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Ile Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp Ala Asn Ile Leu
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Ile Gly Asn His Ala Arg Asn Ser Pro Ser Cys Asn Asp Lys Gly Cys
385 390 395 400
Asp Asp Gly Ala Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser Gly Ala Val Asn Tyr
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Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp Asn Thr Ser Ser Gly
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Ala Ser Ala Ala Arg Gly Lys Asp Val Ala Ile Val Phe Ile Thr Ala
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Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly Asn Ala Gly Asp Arg
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Asn Asn Leu Asp Pro Trp His Asn Gly Asn Ala Leu Val Gln Ala Val
485 490 495
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Val Ala Thr Val Thr Val Asp Ile Ala Asn Ser Gly Gln Val Thr Gly
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Thr Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ala Lys Leu Asn Leu Thr Pro
675 680 685
Gly Gln Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn Ile Arg Arg Arg Asp Leu Ser
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Tyr Trp Asp Thr Ala Ser Gln Lys Trp Val Val Pro Ser Gly Ser Phe
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Gly Ile Ser Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg Leu Thr Ser Thr
725 730 735
Leu Ser Val Ala
740

Claims (2)

1.里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制青贮饲料中的应用,其特征在于：所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合由能够分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌、能够分泌表达里氏木霉外切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌和能够分泌表达里氏木霉β-葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌组成；
所述的能够分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌是将融合基因usp45-egl3亚克隆至pMG36e原核表达载体中构建出重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化乳酸乳球菌构建得到的；
所述的能够分泌表达里氏木霉外切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌是将融合基因usp45-cbh2亚克隆至pMG36e原核表达载体中构建出重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化乳酸乳球菌构建得到的；
所述的能够分泌表达里氏木霉β-葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌是将融合基因usp45-bgl1亚克隆至pMG36e原核表达载体中构建出重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化乳酸乳球菌构建得到的；
所述融合基因usp45-egl3的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述的融合基因usp45-cbh2的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述融合基因usp45-bgl1的核苷酸序列如SEQ IDNo. 3所示；
所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合中三种转基因重组乳酸乳球菌的用量比为1:1:1；将所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合按照每千克≥1×109CFU的添加量添加到鲜原料草中，无氧青贮50~70天；所述的鲜原料草为苜蓿、全株水稻、小麦秸秆、大黍和玉米秸秆中的任意一种。
2.一种提高青贮饲料发酵和营养品质的方法，其特征在于：将里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合添加到鲜原料草中进行无氧青贮；
所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合由能够分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌、能够分泌表达里氏木霉外切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌和能够分泌表达里氏木霉β-葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌组成；
所述的能够分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌是将融合基因usp45-egl3亚克隆至pMG36e原核表达载体中构建出重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化乳酸乳球菌构建得到的；
所述的能够分泌表达里氏木霉外切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌是将融合基因usp45-cbh2亚克隆至pMG36e原核表达载体中构建出重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化乳酸乳球菌构建得到的；
所述的能够分泌表达里氏木霉β-葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌是将融合基因usp45-bgl1亚克隆至pMG36e原核表达载体中构建出重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化乳酸乳球菌构建得到的；
所述融合基因usp45-egl3的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述融合基因usp45-cbh2的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述融合基因usp45-bgl1的核苷酸序列如SEQ IDNo. 3所示；
所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合中三种转基因重组乳酸乳球菌的用量比为1:1:1；所述的里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在鲜原料草中的添加量为每千克≥1×109CFU；所述无氧青贮的时间为50~70天；所述的鲜原料草为苜蓿、全株水稻、小麦秸秆、大黍和玉米秸秆中的任意一种。
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