CN106497948B

CN106497948B - 一种来源于食木天牛的功能基因及其表达产物和应用

Info

Publication number: CN106497948B
Application number: CN201610998231.5A
Authority: CN
Inventors: 夏定国; 梅慧珍; 赵巧玲
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2016-11-14
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2036-11-14
Also published as: CN106497948A

Abstract

本发明公开了一种来源于食木天牛的功能基因及其表达产物和应用，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，及由该基因编码的多功能纤维素酶，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明利用RACE方法从云斑天牛中克隆出编码多功能纤维素酶的基因，经系统发育分析表明，由昆虫内源性的GHF5纤维素酶组成的真核生物组区别于原核的GHF5纤维素酶组或线虫GH5纤维素酶组，且相对于其他家族，该酶能够消化坚韧的新鲜的木质纤维素；且其同时具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β‑葡聚糖苷酶的活性，单位酶活力为816U/mg；本发明所述多功能纤维素酶能够利用新鲜的植物或秸秆为原料合成生物能源，即能够高效分解木质生物质生产葡萄糖，进而为生物乙醇的合成提供原料。

Description

一种来源于食木天牛的功能基因及其表达产物和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种新的功能基因，尤其涉及一种来源于食木天牛的功能基因及其表达产物和应用。

背景技术

木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素组成的聚合物。木材及大量的农业废弃物，如小麦和水稻秸秆，其主要成分是木质纤维素，他们是地球上最丰富的可生产乙醇的可再生资源。除了生产生物燃料和生物乙醇外，来源于木质纤维素的半纤维素、低聚糖是生产化学胶片、保护胶体和动物饲料的主要原料；木糖可转化为木糖醇、有机酸；木质素衍生品可以转化为塑料、呋喃、尼龙等。其他可再生能源在未来可能面临衰竭，因此，木质纤维素是宝贵的可再生资源。

尽管自然界存在着大量的天然植物纤维素，但目前人类所利用的能量中，只有2％是从纤维素转换而来。提高纤维素的生物能源利用效率的瓶颈是纤维素的降解和糖基化。虽然可以用物理或化学的方法分解纤维素，但是存在着能量消耗和环境污染两大问题。因此，人类必须找到一个既可提高生物质转化效率又可减少污染和能源需求的新方案。

在自然界中，可协同降解纤维素(聚合物β-1,4-glucan)的水解酶是糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase families，GHFs)。昆虫源纤维素酶基因属于三个不同的蛋白质家族：内切葡聚糖酶[(endo-β-1,4-D-glucanase)，EC 3.2.1.4]、外切葡聚糖酶[(exo-1,4-β-D-glucanase)，EC 3.2.1.91]、β-葡聚糖苷酶[(β-1,4-glucosidase)，EC 3.2.1.21,BG]，这三种酶协同作用可以将纤维素降解成寡糖或单糖。

到目前为止，虽然从真菌、细菌和原生动物中克隆和鉴定出大量的纤维素酶基因，但是从动物体内克隆出的内源性纤维素酶极少。1998年，首次报道在无共生菌的动物分泌腺体中存在纤维素酶，Watanabe等从白蚁唾液腺中克隆到纤维素酶，Smant等在植物寄生孢囊线虫中发现内源性纤维素酶。在无脊椎动物中，一些能消化纤维素的内源性纤维素酶(endo-b-1,4-glucanase)基因已被分离和鉴定，如节肢动物(昆虫、小龙虾)和线虫。

植食性昆虫的内源性纤维素酶基因也被克隆与分析，例如：辣根猿叶虫(Phaedoncochleariae)、白蚁、三化螟甲虫(Oncideres albomarginata chamela)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、山杨叶甲(Chrysomela tremμLa)、米象(Sitophilusoryzae)、松大小蠹(Dendroctonus ponderosae)的内切β-1,4-葡聚糖酶等。

天牛科内源性纤维素酶的研究是新的热点。天牛是木材的主要害虫，其克隆的纤维素酶家族成员与白蚁的纤维素水解酶不同。天牛幼虫的消化道的结构不同于白蚁，其相对较小的后肠表明这类昆虫在降解纤维素时，可能是自主的或不依赖共生。大多数的微生物、白蚁消化死亡或腐烂的植物组织。然而，天牛幼虫钻入坚硬的活树木质部，降解尚未分解的纤维素。人类利用新鲜的植物或秸秆合成生物能源，因此对天牛可分解坚硬新鲜组织的独特的纤维素酶的未来应用特别感兴趣。

目前，已报道了多个天牛源内源性纤维素酶基因，例如：云斑天牛；桑天牛；黄星天牛(Psacothea hilaris beetle)；星天牛等等。

已知昆虫纤维素酶分为3个糖基水解酶家族(Glycosyl hydrolase families，GHFs)。分别为GHF 9、GHF 5、GHF 45。已报道的来源于GHF 9的endo-1,4-β-glucanases有白蚁，吃木材的蟑螂和蟋蟀；属于GHF 45有Phaedon cochleariae、Apriona germari.；属于GHF 5有Psacothea hilaris。GHF 45有1个非常保守的催化结构域；而GHF 5有2个非常保守的催化结构域，1个是质子供体区域，1个是亲核区域；GHF 9与GHF 5相似，也有2个非常保守的催化结构域。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种新的功能基因及其表达产物，且该表达产物能够利用新鲜的植物或秸秆最终合成生物能源，本发明提供了一种来源于食木天牛的功能基因及其表达产物和应用。

技术方案：一种来源于食木天牛的功能基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。

优选的，所述基因包括3'UTR和一个978bp编码325个氨基酸残基的完整的开放阅读框。

一种多功能纤维素酶，是由上述功能基因编码的蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

优选的，所述氨基酸序列中含有1个假定的N-糖基化位点300-302；其蛋白质分子量为37.1kDa，等电点为4.28。

优选的，所述多功能纤维素酶含有1个GHF 5非常保守的潜在质子供体156-165和1个亲核试剂246-254。

优选的，所述多功能纤维素酶的最适pH为5.0，在pH4.0-8.0的范围内，酶的活性为60％以上；最适pH条件下，其最适反应温度为40℃，在30℃-80℃的范围内，其酶活力为60％以上。

优选的，所述多功能纤维素酶具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶的活性。

所述的多功能纤维素酶的制备方法，包含以下步骤：

本发明采用的材料为：云斑天牛(鞘翅目：天牛科)在桑园中收集，采用人工饲料饲养；家蚕(商业名称：54A)是中国农业科学院蚕业研究所培育、保存；蚕幼虫在25℃，相对湿度65％±5％和光周期12光亮:12黑暗的条件下，用鲜桑叶饲养，当幼虫生长到第五龄起蚕时，分成几组注入重组病毒DNA。家蚕BmN细胞及野生型家蚕核型多角体病毒(BmNPV)为江苏大学生命科学院保存。

(1)获取目的基因

将云斑天牛中肠经冰上解剖后-80℃冻存，采用RNeasy试剂盒(Qiagen公司)提取中肠组织的总RNA，用分光光度计检测总RNA的浓度与纯度，并将总RNA浓度稀释到1μg/μL，-80℃保存备用。以RNA为模板用反转录酶M-MLV、oligo-dT(TaKaRa公司)反转录合成相应的cDNA。

该基因是来源于云斑天牛(Batocera horsfieldi)中肠中的属于糖苷水解酶家族5(glycoside hydrolase families 5，GHF5)的纤维素酶(cellulase)，故命名为Bh-CGHF5。

与已知昆虫源纤维素酶基因(GenBank登录号：AY771358、AB080266、KJ186853)进行比对，根据保守核苷酸序列设计合成目的基因引物，SEQ ID NO:3～5，如表1所示。采用Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit进行Bh-CGHF5基因5’、3’-RACE。

根据5'-RACE、3'-RACE的测序结果，对Bh-CGHF5的全长核苷酸序列进行电子拼接。根据拼接结果设计合成引物对，SEQ ID NO:6～7，如表1所示，以云斑天牛Genomic DNA为模板，进行目的片段PCR扩增，产物经回收、酶切、连接、转化、重组质粒的快速抽提鉴定按Sambrook方法进行。阳性克隆菌液送到上海生物工程公司测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示。

表1克隆目的基因的引物

(2)构建重组质粒及重组BmNPV病毒

以云斑天牛中肠cDNA为模板，进行PCR扩增，回收目的基因，双酶切目的片段及pFastBac^TM1质粒，回收酶切产物，经连接、转化、重组质粒筛选、鉴定后，获得重组质粒pFast-BhCGHF5；利用BmNPV/Bac-to-Bac表达系统构建重组Bacmid，阳性重组质粒转化感受态细胞BmDH10Bac，获得重组Bacmid DNA；用M13通用引物及特异性引物进行PCR鉴定，确定重组Bacmid构建结果。

(3)重组Bacmid转染BmN细胞

家蚕卵巢细胞培养BmN，在含12％胎牛血清(FBS、Gibco，Invitrogen公司)的昆虫TC-100(Gibco，Invitrogen公司)培养基中培养。转染方法参考Invitrogen Cellfectin使用说明，在离心管中准备两种溶液，A：将Bacmid DNA(1ug)加入100μL无胎牛血清的TC 100培养基中，B：8μL cellfection试剂溶于100μL无胎牛血清的TC-100培养基中，混匀后将A、B溶液混合均匀，室温放置45-60min。加入800μL无胎牛血清的TC-100培养基，使终体积为1mL。缓慢加入到BmN细胞(1.0-1.5×10⁶细胞/35毫米细胞培养皿)中，27℃培养5h后弃混合液，加入含12％FBS的TC-100培养基中继续培养。4-5天左右后，观察细胞形态，当细胞涨大变圆、有成串融合的趋势时收获细胞，离心取上清进行次代感染培养，次代(P2)上清液用于注射。

(4)重组杆状病毒感染家蚕

重组杆状病毒感染家蚕54A五龄期起蚕，将蚕搁置冰上10min进行麻醉，直至其静止不动，将10⁷的重组病毒注入到蚕幼虫皮下组织，注入30分钟后用桑叶喂食，在温度25℃、湿度70％的环境中饲养，在感染后5-6天内收集家蚕血淋巴并存储在-80℃。

(5)Western blot分析

将在蚕血中表达产物经SDS-PAGE电泳后，采用湿法转膜(100V，60min)将蛋白条带转移到PVDF膜上，TTBS洗涤1次，然后用5％的脱脂奶粉室温下封闭3h，TTBS洗涤三次，加入带有His标签的羊抗鼠多克隆抗体[1:10000(v/v)；GenScript,USA]，4℃过夜，TTBS洗涤3次。再用HRP标记的羊抗鼠二抗[1:20000(v/v)；GenScript，USA]室温孵育1h，TTBS洗三次，TBS洗涤一次，用HRP-DAB显色试剂盒(Qiagen公司)进行显色。

(6)重组纤维素酶的纯化

将His Trap^TM HP亲和层析柱接到AKTApurifier 10蛋白层析仪上。首先用10倍柱床体积的EqμLibrium buffer(10mMTris buffer,pH 7.5,250mMNaCl,10％Glycerol)平衡柱子。从-80℃超低温冰箱中取出蚕血样品，放室温融化后超速离心(30×1000g,1h,4℃)取上清加入4倍体积的binding buffer(50mM NaH₂PO₄,300mMNaCl,pH7.5)稀释后上样；收集流出液，继续用平衡缓冲液洗柱以彻底去除杂蛋白，直至洗涤到基线。使用洗脱缓冲液(终浓度1M咪唑)进行线性洗脱(V＝1mL/min，T＝60min，Target＝100％)，2mL一管收集洗脱峰，将仅有一条蛋白条带的收集管，分装冻存于-80℃备用。并通过SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白纯度。纯化后的蛋白质浓度测定按Bradford方法进行，以牛血清白蛋白制作标准曲线。

所述的多功能纤维素酶在降解CMC-Na、纤维二糖或纤维三糖中的应用。

所述的多功能纤维素酶在利用新鲜植物或秸秆为原料合成生物能源中的应用。

所述的多功能纤维素酶在合成生物乙醇中的应用；其中多功能纤维素酶首先分解木质生物质生产葡萄糖，进而为生物乙醇的合成提供原料。

有益效果：(1)本发明利用RACE放方法从云斑天牛中克隆出编码多功能纤维素酶的基因，经系统发育分析表明，由昆虫内源性的GHF5纤维素酶组成的真核生物组区别于原核的GHF5纤维素酶组或线虫GH5纤维素酶组，且相对于其他家族，该酶能够消化坚韧的新鲜的木质纤维素；(2)本发明所述多功能纤维素酶同时具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶的活性；(3)本发明所述多功能纤维素酶的单位酶活力为816U/mg；(4)本发明所述多功能纤维素酶能够利用新鲜的植物或秸秆为原料合成生物能源，即能够高效分解木质生物质生产葡萄糖，进而为生物乙醇的合成提供原料。

附图说明

图1为重组纤维素酶的表达与纯化结果图；

其中，A为重组纤维素酶的Western blot结果图；B为重组纤维素酶纯化后的SDS-PAGE电泳图；

图2为Bh-CGHF5在最适温度条件下，酶活性随pH值变化图；

图3为Bh-CGHF5在最适pH值条件下，酶活性随温度变化图；

图4为阴阳离子对Bh-CGHF5的影响结果图；

图5为多功能纤维素酶降解糖原的薄层色谱分析检测结果图；

图6为纤维素酶三维结构图；

其中A为Bh-CGHF5酶三维结构图；B为Ag-EGaseⅢ酶三维结构图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1克隆、测序、基因结构及系统发育分析

本实施例采用的材料为：云斑天牛(鞘翅目：天牛科)在桑园中收集，采用人工饲料饲养；家蚕(商业名称：54A)是中国农业科学院蚕业研究所培育、保存；蚕幼虫在25℃，相对湿度65％±5％和光周期12光亮:12黑暗的条件下，用鲜桑叶饲养，当幼虫生长到第五龄起蚕时，分成几组注入重组病毒DNA。家蚕BmN细胞及野生型家蚕核型多角体病毒(BmNPV)为江苏大学生命科学院保存。

表1克隆目的基因的引物

将克隆的Bh-CGHF5基因测序后，用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)数据库进行相似基因或蛋白搜寻。

采用软件MEGA 4内置的Clustal W程序对Bh-CGHF5的氨基酸序列进行比对。经比对的序列采用Gene-Doc显示序列中的保守位点。

采用MEGA 4程序，用最小进化(minimum evolution,ME)算法对Bh-CGHF5氨基酸序列构建进化树，1000个复制完成自举检验，其它参数均取默认值。

结果显示：完整Bh-CGHF5基因是由1015bp组成，包括3'UTR和一个978bp编码325个氨基酸残基的完整的开放阅读框；Bh-CGHF5的cDNA推导的氨基酸序列中含有1个假定的N-糖基化位点300-302(N-T-T)，如图1所示；预测其蛋白质分子量为37.1kDa(包含6×His的分子量0.84kDa)，等电点为4.28；具有1个GHF 5非常保守的潜在质子供体156-165(IIYETFNEPT)和1个亲核试剂246-254(PIFVTEYGT)。该基因是来源于云斑天牛(Batocerahorsfieldi)中肠中的属于糖苷水解酶家族5(glycoside hydrolase families 5，GHF5)的纤维素酶(cellulase)，故命名为Bh-CGHF5。

实施例2多功能纤维素酶的制备

(1)获取实施例1中的Bh-CGHF5基因

(2)构建重组质粒及重组BmNPV病毒

(3)重组Bacmid转染BmN细胞

(4)重组杆状病毒感染家蚕

(5)Western blot分析

(6)重组纤维素酶的纯化

如图2中A所示，家蚕血淋巴中表达的重组Bh-CGHF5蛋白大小为40.0kDa，大于预测的分子量。这是因为重组蛋白都带有信号肽，分泌到细胞外的蛋白经翻译后折叠、糖基化修饰后蛋白质分子量增大。如图2中B所示，采用亲和层析方法特异性分离重组蛋白，特异性分离的蛋白质分子量大小与纯化前的Western blot的结果相符，表明目标蛋白得到纯化。用Bradford方法测定纯化后的蛋白质浓度，Bh-CGHF5的浓度为0.22mg/mL。

对制备获得的多功能纤维素酶的生化特性进行检测：

(1)最佳pH和最佳温度

将重组酶加入到2％(W/V)用0.1M乙酸钠(pH 6.0)溶解的羧甲基纤维素钠(CMC-Na，Sigma)溶液中，分别在pH2.0-pH12.0的反应条件下50℃温育1h，加入DNS溶液，用分光光度计检测OD540nm，测得酶活力。

在最适pH条件下，分别在30℃-80℃温度条件下测定重组Bh-EGaseⅡ酶的活力。一个单位酶活性被定义为活动产生的每分钟1还原糖μmol以葡萄糖当量。

如图2和3所示，结果表明：酶的活性普遍受到pH值、温度和化学物质的影响，重组Bh-CGHF5酶的最适pH为5.0，在pH4.0-8.0的范围内，酶的活性都在60％以上；在最适pH条件下，该酶最适反应温度为40℃，在30℃-80℃的范围内，其酶活力能维持在60％以上。测定的重组酶Bh-CGHF5的单位酶活力为816U/mg。

(2)阴阳离子对重组酶的影响

将100μL粗酶稀释液(1μL蚕血+99μL ddH₂O)加入到200μL溶解了2％CMC的最适pH值缓冲液中，然后，分别加入质量浓度为0、3、6、9、12、15、18mg/mL的各种离子缓冲液(Na⁺，K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Cl^-，SO₄ ^2-，PO₄ ^3-)，50℃预热5min，反应60min，540nm测吸光值。

如图4所示：结果表明：Na⁺对Bh-CGHF5的酶活性几乎没有影响，而3mg/mL的K⁺是Bh-CGHF5的一个抑制点，相对酶活仅为84.4％。

二价金属阳离子(Co²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺)对酶的活性影响呈现钟罩型，低浓度促进酶活性，高浓度抑制酶活性，其中高浓度的Cu²⁺的抑制作用最强。

为了避开阳离子的影响，选用对酶活性影响最小的Na⁺与Cl-、SO₄ ^2-、PO₄ ^3-组成的盐进行测试，从图中可知SO₄ ^2-对纤维素酶活性的影响程度大于PO₄ ^3-，对Bh-EGase III均有抑制作用。Cl^-对其基本没有影响。

实施例3多功能纤维素酶降解糖原

采用实施例2制备获得的多功能纤维素酶降解纤维二糖、纤维三糖、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。水解溶液和标准品(葡萄糖G1、纤维二糖G2、纤维三糖G3)经展开剂展开后，用5％硫酸乙醇显色，结果如图5所示，Bh-EGase III可以降解CMC-Na、纤维二糖、纤维三糖生成相应的低聚糖及葡萄糖，说明Bh-EGase III具有内切、外切葡聚糖酶以及β-葡聚糖苷酶活性。

实施例4多功能纤维素酶的三级结构

将Bh-CGHF5和Ag-EGaseⅢ进行蛋白质同源比对及三维结构建模参照纤维弧菌属的甘露糖苷酶。从图6中可知：在上述两个蛋白质三维结构图中，无论是α螺旋还是β折叠，其形状、位置都非常相近。酶的潜在的质子供体和亲核试剂组成催化核心区，3个核心区口径大小不同，其中，Ag-EGaseⅢ口径大，而Bh-CGHF5口径小，这可能是影响酶活性的主要因素，也与测定的各个酶的单位酶活力大小相一致，Ag-EGaseⅢ的单位酶活力为1037U/mg。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏科技大学

<120> 一种来源于食木天牛的功能基因及其表达产物和应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1040

<212> DNA

<213> 云斑天牛

<400> 1

atgaagttcg tacttgctct tatcggtctg gtgctagcct gctcagtcga cgtttctgta 60

tccaaagatg cggctcttga gaccgtcagt aaacacggtc aattgtctct gcaaggtgtc 120

gacctcgtcg atgaaaacgg agagaggatt caattgaaag gtatgtccct gttctgggat 180

gtttggatgc ctcagtacta caacaaggag tctgtcgatg gaatccacaa attgtgccac 240

tccaacgtcg tccgagcagc tatatctgtg gaaaccgaat acgacggagg atacattgaa 300

acccctgagg atagcttgga aagactgtac gctgttgtcg atgccgcaat tgaagacgat 360

atctacgtaa tcattgactg gcacgatcat gaagccgaca agcatctcaa ttactctctt 420

gaattctttg acattgtgtc taagaagtac agtggtgtac caaacatcat ctacgaaacc 480

tttaacgaac ccacttcaca atcatggaat gatgttctta aaccctacca cgaagctgtg 540

atcgacgcca tccgcgccaa cgatcctgac aacatcatcg tcgtaggtac accaacctgg 600

tctcaatccg tcgaccaagc tgcttccaac cccatcaccg gccagaagaa cattatgtac 660

accctccact tctacgctgg tacccacaaa caatggctca gagacaccgc caccaacgcc 720

ttgaacaacg gaattcccat cttcgtaact gaatatggta ctgtgaacgc tgacgctacc 780

gatcccatcg acgaagacga atctcgcttg tggtgggcct ggttagatga acactatatc 840

tcttatgcca actgggccat ttccgacaaa ctggaaggcg cttctgtgtt ggtagctaac 900

actaccgctg ctgaggtatg ccaagaagaa ttccttactg attctggaaa actcgtagtt 960

gctcagaaca aagcttaaat ttctgtatat cctaaataaa gtttgttaag atttaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1040

<210> 2

<211> 325

<212> PRT

<213> 云斑天牛

<400> 2

Met Lys Phe Val Leu Ala Leu Ile Gly Leu Val Leu Ala Cys Ser Val

1 5 10 15

Asp Val Ser Val Ser Lys Asp Ala Ala Leu Glu Thr Val Ser Lys His

20 25 30

Gly Gln Leu Ser Leu Gln Gly Val Asp Leu Val Asp Glu Asn Gly Glu

35 40 45

Arg Ile Gln Leu Lys Gly Met Ser Leu Phe Trp Asp Val Trp Met Pro

50 55 60

Gln Tyr Tyr Asn Lys Glu Ser Val Asp Gly Ile His Lys Leu Cys His

65 70 75 80

Ser Asn Val Val Arg Ala Ala Ile Ser Val Glu Thr Glu Tyr Asp Gly

85 90 95

Gly Tyr Ile Glu Thr Pro Glu Asp Ser Leu Glu Arg Leu Tyr Ala Val

100 105 110

Val Asp Ala Ala Ile Glu Asp Asp Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His

115 120 125

Asp His Glu Ala Asp Lys His Leu Asn Tyr Ser Leu Glu Phe Phe Asp

130 135 140

Ile Val Ser Lys Lys Tyr Ser Gly Val Pro Asn Ile Ile Tyr Glu Thr

145 150 155 160

Phe Asn Glu Pro Thr Ser Gln Ser Trp Asn Asp Val Leu Lys Pro Tyr

165 170 175

His Glu Ala Val Ile Asp Ala Ile Arg Ala Asn Asp Pro Asp Asn Ile

180 185 190

Ile Val Val Gly Thr Pro Thr Trp Ser Gln Ser Val Asp Gln Ala Ala

195 200 205

Ser Asn Pro Ile Thr Gly Gln Lys Asn Ile Met Tyr Thr Leu His Phe

210 215 220

Tyr Ala Gly Thr His Lys Gln Trp Leu Arg Asp Thr Ala Thr Asn Ala

225 230 235 240

Leu Asn Asn Gly Ile Pro Ile Phe Val Thr Glu Tyr Gly Thr Val Asn

245 250 255

Ala Asp Ala Thr Asp Pro Ile Asp Glu Asp Glu Ser Arg Leu Trp Trp

260 265 270

Ala Trp Leu Asp Glu His Tyr Ile Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Ile Ser

275 280 285

Asp Lys Leu Glu Gly Ala Ser Val Leu Val Ala Asn Thr Thr Ala Ala

290 295 300

Glu Val Cys Gln Glu Glu Phe Leu Thr Asp Ser Gly Lys Leu Val Val

305 310 315 320

Ala Gln Asn Lys Ala

325

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgaaacctt taacgaaccc act 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcaggatcg ttggcgcgga t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcacagctt cgtggtaggg tt 22

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgggatcca tgaagttcgt acttgctctt at 32

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtctctagat tagtgatggt gatggtgatg agctttgttc tgagcaacta c 51

Claims

1.一种来源于食木天牛的功能基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。

2.根据权利要求1所述的一种来源于食木天牛的功能基因，其特征在于，所述基因包括3'UTR和一个978bp编码325个氨基酸残基的完整的开放阅读框。

3.一种多功能纤维素酶，其特征在于，由权利要求1所述的功能基因编码的蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

4.根据权利要求3所述的一种多功能纤维素酶，其特征在于，所述氨基酸序列中含有1个假定的N-糖基化位点300-302；其蛋白质分子量为37.1kDa，等电点为4.28。

5.根据权利要求3所述的一种多功能纤维素酶，其特征在于，所述多功能纤维素酶含有1个糖苷水解酶家族5非常保守的潜在质子供体和1个亲核试剂，所述质子供体位于SEQ IDNO:2第156-165aa，所述亲核试剂位于SEQ ID NO:2第246-254aa。

6.根据权利要求3所述的一种多功能纤维素酶，其特征在于，所述多功能纤维素酶的最适pH为5.0，在pH4.0-8.0的范围内，酶的活性为60％以上；最适pH条件下，其最适反应温度为40℃，在30℃-80℃的范围内，其酶活力为60％以上。

7.权利要求3～6任一所述的多功能纤维素酶的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)获取目的基因

将云斑天牛中肠经冰上解剖后-80℃冻存，采用RNeasy试剂盒提取中肠组织的总RNA，以RNA为模板用反转录酶M-MLV、oligo-dT反转录合成相应的cDNA；设计目的基因引物SEQID NO:3～7，以云斑天牛Genomic DNA为模板，扩增出目的基因；

(2)构建重组质粒及重组BmNPV病毒

以云斑天牛中肠cDNA为模板，进行PCR扩增，回收目的基因，双酶切目的片段及pFastBac^TM1质粒，回收酶切产物，经连接、转化、重组质粒筛选、鉴定后，获得重组质粒pFast-BhCGHF5；利用BmNPV/Bac-to-Bac表达系统构建重组Bacmid，阳性重组质粒转化感受态细胞BmDH10Bac，获得重组Bacmid DNA；

(3)重组Bacmid转染BmN细胞

家蚕卵巢细胞培养BmN，在含12％胎牛血清的昆虫TC-100培养基中培养，在离心管中准备两种溶液，A：将Bacmid DNA 1ug加入100μL无胎牛血清的TC-100培养基中，B：8μLcellfection试剂溶于100μL无胎牛血清的TC-100培养基中，将A、B溶液混合均匀，室温放置45-60min，加入800μL无胎牛血清的TC-100培养基，使终体积为1mL，缓慢加至BmN细胞中，27℃培养5h后弃混合液，加入含12％FBS的TC-100培养基中继续培养，4-5天后，观察细胞形态，当细胞涨大变圆、有成串融合的趋势时收获细胞，离心取上清进行次代感染培养，次代上清液用于注射；

(4)重组杆状病毒感染家蚕

重组杆状病毒感染家蚕54A五龄期起蚕，将蚕搁置冰上10min进行麻醉，直至其静止不动，将10⁷的重组病毒注入到蚕幼虫皮下组织，注入30分钟后用桑叶喂食，在温度25℃、湿度70％的环境中饲养，在感染后5-6天内收集家蚕血淋巴并存储在-80℃；

(5)Western blot分析

将在蚕血中表达产物经SDS-PAGE电泳后，采用湿法转膜将蛋白条带转移到PVDF膜上，TTBS洗涤1次，然后用5％的脱脂奶粉室温下封闭3h，TTBS洗涤三次，加入带有His标签的羊抗鼠多克隆抗体，4℃过夜，TTBS洗涤3次，再用HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育1h，TTBS洗三次，TBS洗涤一次，用HRP-DAB显色试剂盒进行显色；

(6)重组纤维素酶的纯化

将His Trap^TM HP亲和层析柱接到AKTApurifier 10蛋白层析仪上，用10倍柱床体积的EqμLibrium buffer平衡柱子，从-80℃超低温冰箱中取出蚕血样品，放室温融化后超速离心、取上清加入4倍体积的binding buffer稀释后上样；收集流出液，继续用平衡缓冲液洗柱以彻底去除杂蛋白，直至洗涤到基线；使用洗脱缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱峰，将仅有一条蛋白条带的收集管，分装冻存于-80℃备用；并通过SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白纯度，纯化后的蛋白质浓度测定按Bradford方法进行，以牛血清白蛋白制作标准曲线。

8.权利要求3～6任一所述的多功能纤维素酶在降解CMC-Na、纤维二糖或纤维三糖中的应用。

9.权利要求3～6任一所述的多功能纤维素酶在利用新鲜植物或秸秆为原料合成生物能源中的应用。

10.权利要求3～6任一所述的多功能纤维素酶在合成生物乙醇中的应用。