CN107488650A

CN107488650A - 一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107488650A
Application number: CN201710749572.3A
Authority: CN
Inventors: 杜昱光; 程功; 任立世; 焦思明; 冯翠
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Jining Zhongke Enjike Innovation Industrial Park Management Co ltd
Priority date: 2017-08-28
Filing date: 2017-08-28
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2037-08-28
Also published as: CN107488650B

Abstract

本发明公开了一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用。本发明根据毕赤酵母密码子偏爱性，利用全基因合成方法获得了番木瓜(Carica Papaya)中的几丁质酶编码基因序列，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步利用毕赤酵母表达系统对该所述优化的几丁质酶编码基因进行高效分泌表达，获得番木瓜几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得的番木瓜几丁质酶对低脱乙酰度的壳聚糖底物有较高的水解活性，摇瓶发酵产生的粗酶液即具有1mL(蛋白质含量约0.18mg)降解0.5g壳聚糖的水解能力，而降解相同量的壳聚糖约需要木瓜蛋白酶20mg，理论上效率提高100倍以上；具有良好的工业应用前景。

Description

一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于几丁质酶技术领域，具体涉及一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用。

背景技术

几丁质酶(Chitinase，EC.3.2.1.14)广泛存在于古菌、细菌及真核生物中，主要分布在糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)家族18及19中。在工业上，由于缺乏经济高效的特异性壳聚糖水解酶类(包括几丁质酶及壳聚糖酶)，往往使用蛋白酶及纤维素酶等非特异性商品酶类水解壳聚糖以制备壳寡糖。由于具有壳聚糖水解活性的酶类在这些商品酶中所占比例极低，用酶量较大，壳寡糖的生产成本也相应增加。因此，迫切需要研发出一系列经济高效的壳聚糖水解酶类以满足工业壳寡糖生产的需求。

发明内容

本发明的目的是，提供一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用；旨在提供一种经济高效的特异性几丁质酶。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明通过对番木瓜几丁质酶(GH19家族)编码基因的密码子进行优化，以利于其在毕赤酵母中实现分泌表达，从而高效快速的获得水解活性高的番木瓜几丁质酶。

本发明提供的一种番木瓜几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明还提供了一种番木瓜几丁质酶基因，编码上述的番木瓜几丁质酶。优选地，所述番木瓜几丁质酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本发明还提供了包含上述番木瓜几丁质酶基因的重组表达载体。优选地，所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：

通过对表达载体pPIC9中的信号肽序列(详见SEQ ID NO.4所示)进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的新的信号肽序列(详见SEQ ID NO.5所示)，并利用Nsi I/XhoI双酶切将SEQ ID NO.5所示的信号肽序列替代原先的SEQ ID NO.4所示信号肽，得到表达载体pGBG1。该表达载体pGBG1能够使目的蛋白在毕赤酵母中更高效的分泌表达。

其中，表达载体pPIC9和毕赤酵母细胞GS115均为商业化产品。

本发明所述的番木瓜几丁质酶的制备方法为：将上述的重组表达载体(例如，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的几丁质酶基因构建至表达载体中)导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的几丁质酶。优选地，所述毕赤酵母为GS115。

进一步地，本发明所述番木瓜几丁质酶的具体制备步骤包括：(1)根据毕赤酵母密码子使用的偏好性，对来源于番木瓜的几丁质酶基因原始序列进行密码子优化；(2)将优化后的基因进行全合成并构建至表达载体pGBG1中；(3)对构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有几丁质酶基因的片段并导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导并获得分泌表达的几丁质酶。

利用诱导表达的几丁质粗酶上清对壳聚糖底物进行水解并使用MALDI-TOF质谱方法对产物的聚合度及组成进行分析。结果表明，本发明所述的番木瓜几丁质酶可单独用于壳聚糖的降解制备壳寡糖；或者所述番木瓜几丁质酶与其他几丁质酶或壳聚糖酶混合使用，协同降解壳聚糖或几丁质。

本发明还提供了上述番木瓜几丁质酶在壳聚糖降解中的应用。优选地，番木瓜几丁质酶单独用于壳聚糖降解制备获得壳寡糖；或者所述番木瓜几丁质酶与其他几丁质酶或壳聚糖酶混合使用，协同降解壳聚糖或几丁质。

本申请的发明人前期在多种食品级商品酶中筛选具有壳聚糖水解酶活性的酶制剂时发现，番木瓜来源的木瓜蛋白酶具有较好的壳聚糖水解活性(1g粗酶干粉约可彻底水解25g壳聚糖)。我们进一步使用MALDI-TOF质谱方法对产物壳寡糖的组分进行鉴定，发现所有壳寡糖产物单糖组成中均带有N-乙酰氨基葡萄糖，说明该单糖可能是水解酶识别的必要组分，我们因此推测木瓜蛋白酶中水解壳聚糖的主要为几丁质酶。因此，为获得更安全高效的几丁质酶用于降解壳聚糖或几丁质，我们选取其中一个已鉴定的属于糖苷水解酶19家族的几丁质酶，根据毕赤酵母密码子的偏好性，通过全基因合成方法获得其编码基因并在毕赤酵母中进行分泌表达(Cell Mol Life Sci.2006,63(24):3042-3054)。表达的几丁质酶能够替代现有的商品木瓜蛋白酶用于壳寡糖或几丁寡糖等的规模生产。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明的几丁质酶基因来源于番木瓜，使用巴斯德毕赤酵母表达系统分泌表达。番木瓜本身为食品，已被用于食品用酶制剂木瓜蛋白酶的提取制备，其来源的酶类安全性有保障，而巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统也已被用于乳糖酶及磷脂酶C等食品级酶制剂的表达，其自身也被用于木聚糖酶的生产(GB2760-2014)。因此，使用番木瓜来源的几丁质酶基因在毕赤酵母中分泌表达，其产物几丁质酶可成为食品级壳寡糖或几丁寡糖的生产用酶制剂。

2.本发明中的几丁质酶基因由于根据毕赤酵母的密码子偏爱性进行了优化，可实现在毕赤酵母中高效分泌表达。经活性测定及换算，1mL粗酶液(含有0.18mg酶蛋白)可完全水解0.5g壳聚糖，而商品木瓜蛋白酶的对应用量则为20mg。因此，与商品木瓜蛋白酶相比，本发明分泌表达的几丁质酶效率提高超过100倍，具有替代现有商品酶用于规模制备壳寡糖的巨大应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例中的重组表达载体cpchi19-pGBG1及其酶切产物凝胶电泳图谱。

图2为本发明实施例中含番木瓜几丁质酶基因的毕赤酵母工程菌发酵液上清的SDS-PAGE图谱，其中，箭头所指为目标产物。

图3为本发明实施例中壳寡糖COS-62-CPCHI19的MALDI-TOF质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1几丁质酶基因的密码子优化及全基因合成

在不改变氨基酸序列的前提下，使用毕赤酵母的偏爱密码子，人工设计了番木瓜的几丁质酶(GH19家族)(如序列SEQ ID NO.1所示，GenBank accession number:3CQL_A)的编码基因，具体核苷酸序列见SEQ ID NO.2。优化后的核苷酸序列与来源于萝卜(Raphanussativus)的潜在几丁质酶编码基因序列(如序列SEQ ID NO.3所示，GenBank accessionnumber:XM_018582027.1)同源性最高，为72％。优化后的基因序列委托生工进行全合成，合成获得的基因序列命名为几丁质酶基因cpchi19。

实施例2几丁质酶基因cpchi19的表达载体构建

首先使用限制性内切酶Xho I及Not I对含有几丁质酶基因cpchi19的克隆载体进行双酶切，获得目的基因片段，同时使用相同的内切酶对表达载体pGBG1进行双酶切，回收大片段。两个回收产物进行连接，获得重组载体，命名为cpchi19-pGBG1。为确定目标几丁质酶基因已经构建至载体中，我们分别使用Xho I/Not I及Bgl II对该重组载体进行双酶切及单酶切，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示：经双酶切后，在750bp和1000bp之间出现了目的基因片段，与cpchi19的片段765bp相符；经Bgl II酶切后，出现了预期的两个片段，依次为含有目的基因的大片段和含有抗性基因的小片段。

实施例3几丁质酶毕赤酵母工程菌的筛选及几丁质酶制备

将获得的重组质粒cpchi19-pGBG1经限制性内切酶BglII线性化后，凝胶电泳分离并切取含有目的基因的核苷酸片段(如图2所示的较大的片段)，电击导入毕赤酵母GS115中，将通过组氨酸营养缺陷MD平板上筛选得到的重组子平铺在含有胶体壳聚糖(0.5％)的BMMY琼脂平板上进行培养，从中筛选出水解圈最大的单克隆菌株。将筛选的单克隆菌株的单菌落接种于200mL BMGY培养基中，30℃及250rpm下培养48小时，离心弃上清，加入等量的BMMY进行诱导表达。24h后补加甲醇至其终浓度为1％，以后每隔24h补加一次，共计诱导120h后离心，上清液即为含有几丁质酶(记为几丁质酶CPCHI19)的粗酶液。使用SDS-PAGE检测蛋白表达情况，其结果如图2所示。Bradford法测定粗酶液中的蛋白质浓度为0.18mg/mL；DNS法测定其比酶活为0.32U/mL。上述的MD琼脂平板、BMMY琼脂平板、BMGY培养基、BMMY培养基为酵母表达系统常用的培养基，可直接购买或者按照现有文献技术配制均可。

实施例4几丁质酶CPCHI19水解低脱乙酰度壳聚糖制备壳寡糖

称取50g壳聚糖(脱乙酰度：62％)，加至1000mL 1.5％乙酸水溶液中(pH 5-6)。充分溶解后，加入100mL发酵的几丁质酶CPCHI19粗酶液，40℃下搅拌反应48小时。反应结束后，离心去除不容物，上清经旋转蒸发仪在40℃下浓缩至约300mL，后经冷冻干燥得成品壳寡糖命名为COS-62-CPCHI19。由于该产物组分较为复杂，难以通过液相对组分进行有效分离，因此采用MALDI-TOF质谱方法对其组分进行分析。具体方法为：称取一定量制备的壳寡糖，配制成浓度为2mg/mL的水溶液，过滤后吸取1μL点样至样品板上，待其自然干燥后，加入1μL基质2,5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液，待其干燥后使用autoflex Ⅲ smartbeam型MALDI-TOF质谱仪(Bruker公司)进行检测(正离子反射模式)。质谱检测结果如图3所示：为便于区分，以A代表N-乙酰氨基葡萄糖，D代表氨基葡萄糖，随后的数字代表含有该单糖的个数，二者加和为寡糖的聚合度。从结果来看，低脱乙酰度壳寡糖COS-62-CPCHI19在使用MALDI-TOF质谱可检测到的聚合度范围为2-12，同一个聚合度下存在不同乙酰度的壳寡糖，所有寡糖组分中均含有N-乙酰氨基葡萄糖。

当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院过程工程研究所

<120> 一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gly Ile Glu Lys Ile Ile Ser Arg

1 5 10 15

Ser Met Phe Asp Gln Met Leu Lys His Arg Asn Asn Pro Ala Cys Pro

20 25 30

Ala Lys Gly Phe Tyr Thr Tyr Asp Ala Phe Ile Ala Ala Ala Lys Ser

35 40 45

Phe Pro Ser Phe Gly Thr Thr Gly Ser Thr Asp Val Arg Lys Arg Glu

50 55 60

Ile Ala Ala Phe Leu Gly Gln Thr Ser His Glu Thr Thr Gly Gly Trp

65 70 75 80

Pro Ser Ala Pro Asp Gly Pro Tyr Ala Trp Gly Tyr Cys Phe Leu Lys

85 90 95

Glu Arg Asn Pro Ser Ser Asn Tyr Cys Ala Pro Ser Pro Arg Tyr Pro

100 105 110

Cys Ala Pro Gly Lys Ser Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Ile Gln Leu Ser

115 120 125

Trp Asn Tyr Asn Tyr Gly Pro Cys Gly Glu Ala Leu Arg Val Asn Leu

130 135 140

Leu Gly Asn Pro Asp Leu Val Ala Thr Asp Arg Val Ile Ser Phe Lys

145 150 155 160

Thr Ala Leu Trp Phe Trp Met Thr Pro Gln Ala Pro Lys Pro Ser Cys

165 170 175

His Asp Val Ile Thr Gly Arg Trp Gln Pro Ser Ala Ala Asp Thr Ala

180 185 190

Ala Gly Arg Leu Pro Gly Tyr Gly Val Ile Thr Asn Ile Ile Asn Gly

195 200 205

Gly Leu Glu Cys Gly Lys Gly Pro Asn Pro Gln Val Ala Asp Arg Ile

210 215 220

Gly Phe Phe Arg Arg Tyr Cys Gly Ile Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn

225 230 235 240

Asn Leu Asp Cys Tyr Asn Gln Arg Pro Phe Gly

245 250

<210> 2

<211> 765

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

ctcgagaaga gagaggctga ggctggtatc gagaagatca tctccagatc catgttcgac 60

caaatgttga agcacagaaa caacccagct tgtccagcta agggtttcta cacttacgac 120

gctttcatcg ctgctgctaa gtccttccca tccttcggta ctactggttc cactgacgtt 180

agaaagagag agatcgctgc tttcttgggt caaacttccc acgagactac tggtggttgg 240

ccatccgctc cagacggtcc atacgcttgg ggttactgtt tcttgaagga gagaaaccca 300

tcctccaact actgtgctcc atccccaaga tacccatgtg ctccaggtaa gtcctactac 360

ggtagaggtc caatccaatt gtcctggaac tacaactacg gtccatgtgg tgaggctttg 420

agagttaact tgttgggtaa cccagacttg gttgctactg acagagttat ctccttcaag 480

actgctttgt ggttctggat gactccacaa gctccaaagc catcctgtca cgacgttatc 540

actggtagat ggcaaccatc cgctgctgac actgctgctg gtagattgcc aggttacggt 600

gttatcacta acatcatcaa cggtggtttg gagtgtggta agggtccaaa cccacaagtt 660

gctgacagaa tcggtttctt cagaagatac tgtggtatct tgggtgttgg tactggtaac 720

aacttggact gttacaacca aagaccattc ggttaagcgg ccgcg 765

<210> 3

<211> 1008

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

atgaagagtt ctctagttct cttacttaac ctcttgttcc ttttatcatt ttcctcagcc 60

gagcaatgtg ggcgacaagc aggaggtgct ctctgcccca atggtctatg ctgcagcgag 120

tacggatggt gcggttccac cgaagcttac tgtaagctgc ctggctgcca aagccagtgc 180

actcccactg gtcctcctcc tccccctcct cctcctcctg gtcctcctcc tcctgatccc 240

actggcggtc ttactgatat cattacaaaa tctcagttcg atgaaatgct taaacatagg 300

aacgatgccg cttgtcccgc tagaggtttc tacacttacg atgcttttat cgccgccgct 360

aaatatttcc ccagcttctg caacaatgga gacactgccg caaggaagaa agagctcgcc 420

gccttctttg gtcagacttc ccacgaaacc accggtgggt ggccagcagc accagacgga 480

ccatatgcat ggggatactg tttcaaggaa gaggtgaatc cttcttcaga ctactgttca 540

ccgagtggaa cgtggccatg cgcacctggc aaacgttact acggaagagg accgatgcag 600

ctgtcgtgga actacaacta cggacagtgt ggagcagccc ttagagagga cttactcaac 660

aaccctgacc ttgtctccaa ccaggcagtg atggctttca aagccgcgat ttggttctgg 720

atgactcctc agtcccctaa gccgtcgtgc cacgccgtta tcaacggtga atggcagcct 780

tcagacgccg acattgctgc cgggagatta cctggttacg gtgtgactac gaatatcatt 840

aacggtgggt tggaatgtgg acatggccca gactcgagag ttctcgatag gattgggttt 900

tatgagaggt actgtggtat ctttggagtg gatcctggaa gtaaccttga ttgttacaac 960

caaaggtcct ttgcttctgt taactccttc ctcgacgctg ctatgtaa 1008

<210> 4

<211> 525

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

atgcattgtc tccacattgt atgcttccaa gattctggtg ggaatactgc tgatagccta 60

acgttcatga tcaaaattta actgttctaa cccctacttg acagcaatat ataaacagaa 120

ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt attagcttac tttcataatt 180

gcgactggtt ccaattgaca agcttttgat tttaacgact tttaacgaca acttgagaag 240

atcaaaaaac aactaattat tcgaaggatc caaacgatga gatttccttc aatttttact 300

gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta gctgctccag tcaacactac aacagaagat 360

gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc atcggttact cagatttaga aggggatttc 420

gatgttgctg ttttgccatt ttccaacagc acaaataacg ggttattgtt tataaatact 480

actattgcca gcattgctgc taaagaagaa ggggtatctc tcgag 525

<210> 5

<211> 526

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

atgcattgtc tccacattgt atgcttccaa gattctggtg ggaatactgc tgatagccta 60

acgttcatga tcaaaattta actgttctaa cccctacttg acagcaatat ataaacagaa 120

ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt attagcttac tttcataatt 180

gcgactggtt ccaattgaca agcttttgat tttaacgact tttaacgaca acttgagaag 240

atcaaaaaac aactaattat tcgaaacgat ggctatccca agattcccat ccatcttcac 300

tgctgttttg ttcgctgctt cctccgcttt ggctgctcca gttaacacta ctactgagga 360

cgagactgct caaatcccag ctgaggctgt tatcggttac tccgacttgg agggtgactt 420

cgacgttgct gttttgccat tctccaactc cactaacaac ggtttgttgt tcatcaacac 480

tactatcgct tccatcgctg ctaaggagga gggtgtttcc ctcgag 526

Claims

1.一种番木瓜几丁质酶，其特征在于：所述番木瓜几丁质酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种番木瓜几丁质酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的番木瓜几丁质酶。

3.根据权利要求2所述的番木瓜几丁质酶基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述番木瓜几丁质酶基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：

将表达载体pPIC9中的信号肽序列如SEQ ID NO.4所示进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的信号肽序列如SEQ ID NO.5所示；

利用Nsi I/Xho I双酶切，将表达载体pPIC9中如SEQ ID NO.4所示的序列替换为如SEQID NO.5所示的信号肽序列，得到表达载体pGBG1。

6.一种权利要求1所述的番木瓜几丁质酶的制备方法，该方法为：将权利要求4或5所述的重组表达载体导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的番木瓜几丁质酶。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述毕赤酵母为GS115。

8.权利要求1所述的番木瓜几丁质酶在壳聚糖降解中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述番木瓜几丁质酶单独用于壳聚糖降解制备获得壳寡糖；或者所述番木瓜几丁质酶与其他几丁质酶或壳聚糖酶混合使用，协同降解壳聚糖或几丁质。