CN107254458B

CN107254458B - 一种里氏木霉几丁质酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107254458B
Application number: CN201710630518.7A
Authority: CN
Inventors: 杜昱光; 程功; 任立世; 焦思明; 孙明; 冯翠
Original assignee: Zhongke Rongxin (suzhou) Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Zhongke Rongxin (suzhou) Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2037-07-28
Also published as: CN107254458A

Abstract

本发明公开了一种里氏木霉几丁质酶及其制备方法和应用。本发明根据毕赤酵母密码子的偏好性，对里氏木霉(Trichoderma reesei)中的几丁质酶编码基因进行了优化，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步利用毕赤酵母表达系统对该所述优化的几丁质酶编码基因进行高效分泌表达，获得里氏木霉几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得的里氏木霉几丁质酶对低脱乙酰度的壳聚糖底物有较高的水解活性，摇瓶发酵产生的粗酶液即具有1mL(蛋白质含量约0.17mg)降解0.5g壳聚糖的水解能力，而降解相同量的壳聚糖约需要非特异性商品酶50mg，理论上效率提高300倍；具有良好的工业应用前景。

Description

一种里氏木霉几丁质酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于几丁质酶技术领域，具体涉及一种里氏木霉几丁质酶及其制备方法和应用。

背景技术

几丁质酶(Chitinase，EC.3.2.1.14)广泛存在于古菌、细菌及真核生物中，主要分布在糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)家族18及19中。在工业上，由于缺乏经济高效的特异性壳聚糖糖水解酶类(包括几丁质酶及壳聚糖酶)，往往使用蛋白酶及纤维素酶等非特异性商品酶类水解壳聚糖以制备壳寡糖。由于具有壳聚糖水解活性的酶类在这些商品酶中所占比例极低，用酶量较大，壳寡糖的生产成本也相应增加。因此，迫切需要研发出一系列经济高效的壳聚糖水解酶类以满足工业壳寡糖生产的需求。

本发明研发人员前期在多种食品级商品酶中筛选具有壳聚糖水解酶活性的酶制剂时发现，里氏木霉发酵生产的纤维素酶及β-葡聚糖酶均具有较好的壳聚糖水解活性(1g粗酶干粉约可彻底水解10g壳聚糖)。我们进一步使用¹H NMR方法对产物壳寡糖的末端进行鉴定，发现其还原端均为乙酰化单糖(N-乙酰氨基葡萄糖)，而非还原端同时包含N-乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖。我们据此推测这些商品酶中水解壳聚糖的主要为几丁质酶。我们通过基因组检索发现，里氏木霉中存在多种几丁质酶编码基因。因此，为获得更安全高效的几丁质酶用于降解壳聚糖或几丁质，我们选取其中的特定几丁质酶基因进行了密码子优化并在毕赤酵母中进行分泌表达。表达的几丁质酶能够替代现有的商品酶用于壳寡糖或几丁寡糖等的规模生产。

发明内容

本发明的目的是，提供一种里氏木霉几丁质酶及其制备方法和应用；旨在提供一种经济高效的特异性几丁质酶。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明通过对里氏木霉几丁质酶(GH18家族)编码基因的密码子进行优化，以利于其在毕赤酵母中实现分泌表达，从而高效快速的获得水解活性高的里氏木霉几丁质酶。

本发明提供的一种里氏木霉几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述里氏木霉几丁质酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的里氏木霉几丁质酶的制备方法为：将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的几丁质酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的几丁质酶。

所述里氏木霉几丁质酶的具体制备步骤包括：(1)根据毕赤酵母密码子使用的偏好性，对来源于里氏木霉的几丁质酶基因原始序列进行密码子优化；(2)将优化后的基因进行全合成并构建至表达载体pGBG1中；(3)对构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有几丁质酶基因的片段并导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导并获得分泌表达的几丁质酶；(4)利用诱导表达的几丁质粗酶上清对壳聚糖底物进行水解并使用MALDI-TOF质谱方法对产物的聚合度及组成进行分析。本发明所述的里氏木霉几丁质酶可单独用于壳聚糖的降解制备壳寡糖；或者所述里氏木霉几丁质酶与其他几丁质酶或壳聚糖酶混合使用，协同降解壳聚糖或几丁质。

所述表达载体pGBG1的获得方式是：通过对表达载体pPIC9中的信号肽序列(详见SEQ ID NO.4所示)进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的新的信号肽序列(详见SEQ ID NO.5所示)，并利用Nsi I/Xho I双酶切将SEQ ID NO.5所示的信号肽序列替代原先的SEQ ID NO.4所示信号肽，得到表达载体pGBG1。该表达载体pGBG1能够使目的蛋白在毕赤酵母中更高效的分泌表达。

其中，表达载体pPIC9和毕赤酵母细胞GS115均为商业化产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明的几丁质酶基因来源于里氏木霉，使用巴斯德毕赤酵母表达系统分泌表达。里氏木霉已被用于包括β-葡聚糖、木聚糖酶及纤维素酶等多种食品用酶制剂的发酵制备，菌株及其来源的酶类安全性有保障，而巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统也已被用于乳糖酶及磷脂酶C等食品级酶制剂的表达，其自身也被用于木聚糖酶的生产(GB2760-2014)。因此，使用里氏木霉来源的几丁质酶基因在毕赤酵母中分泌表达，其产物几丁质酶可成为食品级壳寡糖或几丁寡糖的生产用酶制剂。

2.本发明中的几丁质酶基因由于根据毕赤酵母的密码子偏爱性进行了优化，可实现在毕赤酵母中高效分泌表达。经活性测定及换算，1mL粗酶液(含有0.17mg酶蛋白)可完全水解0.5g壳聚糖，而商品纤维素酶(里氏木霉发酵制备获得的纤维素酶)的对应用量则为50mg。因此，与商品纤维素酶相比，本发明分泌表达的几丁质酶效率提高接近300倍，具有替代现有商品酶用于规模制备壳寡糖的巨大应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例中的重组表达载体trchi18-pGBG1及其酶切产物凝胶电泳图谱。

图2为本发明实施例中含几丁质酶基因的毕赤酵母工程菌的发酵液上清的SDS-PAGE图谱。

图3为本发明实施例中壳寡糖COS-62-TRCHI18的MALDI-TOF质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1几丁质酶基因的密码子优化及全基因合成

在不改变氨基酸序列的前提下，对来源于里氏木霉的几丁质酶(GH18家族)编码基因进行密码子优化，优化后的密码子全部为毕赤酵母偏爱密码子，具体序列见SEQ IDNO.2。优化后的核苷酸序列trchi18与原始序列(如序列SEQ ID NO.3所示，GenBankaccession number:XM_006968075)相比，有246个核苷酸发生了变化，核酸序列同源性为80％。同时，为了使几丁质酶在毕赤酵母中能够高效稳定的分泌表达，优化后的几丁质酶基因少了编码5’端信号肽序列的22个氨基酸。优化后的基因序列委托生工进行全合成，合成获得的基因序列命名为几丁质酶基因trchi18。

实施例2几丁质酶基因trchi18的表达载体构建

首先使用限制性内切酶Xho I及Not I对含有几丁质酶基因trchi18的克隆载体进行双酶切，获得目的基因片段，同时使用相同的内切酶对表达载体pGBG1进行双酶切，回收大片段。两个回收产物进行连接，获得重组载体，命名为trchi18-pGBG1。为确定目标几丁质酶基因已经构建至载体中，我们分别使用Xho I/Not I及Bgl II对该重组载体进行双酶切及单酶切，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示：经双酶切后，在1000bp和1500bp之间出现了目的基因片段，与trchi18的片段1242bp相符；经Bgl II酶切后，出现了预期的两个片段，依次为含有目的基因的大片段和含有抗性基因的小片段。

实施例3几丁质酶毕赤酵母工程菌的筛选及几丁质酶制备

将获得的重组质粒trchi18-pGBG1经限制性内切酶BglII线性化后，凝胶电泳分离并切取含有目的基因的核苷酸片段(如图2所示的较大的片段)，电击导入毕赤酵母GS115中，将通过组氨酸营养缺陷MD平板上筛选得到的重组子平铺在含有胶体壳聚糖(0.5％)的BMMY琼脂平板上进行培养，从中筛选出水解圈最大的单克隆菌株。将筛选的单克隆菌株的单菌落接种于200mL BMGY培养基中，30℃及250rpm下培养48小时，离心弃上清，加入等量的BMMY进行诱导表达。24h后补加甲醇至其终浓度为1％，以后每隔24h补加一次，共计诱导120h后离心，上清液即为含有几丁质酶(记为几丁质酶TRCHI18)的粗酶液。使用SDS-PAGE检测蛋白表达情况，其结果如图2所示。Bradford法测定粗酶液中的蛋白质浓度为0.17mg/mL；DNS法测定其比酶活为0.52U/mL。上述的MD琼脂平板、BMMY琼脂平板、BMGY培养基、BMMY培养基为酵母表达系统常用的培养基，可直接购买或者按照现有文献技术配制均可。

实施例4：几丁质酶TRCHI18水解低脱乙酰度壳聚糖制备壳寡糖

称取50g壳聚糖(脱乙酰度：62％)，加至1000mL 1.5％乙酸水溶液中，(pH 5-6)。充分溶解后，加入100mL发酵的几丁质酶TRCHI18粗酶液，40℃下搅拌反应48小时。反应结束后，离心去除不容物，上清经旋转蒸发仪在40℃下浓缩至约300mL，后经冷冻干燥得成品壳寡糖命名为COS-62-TRCHI18。由于该产物组分较为复杂，难以通过液相对组分进行有效分离，因此采用MALDI-TOF质谱方法对其组分进行分析。具体方法为：称取一定量制备的壳寡糖，配制成浓度为2mg/mL的水溶液，过滤后吸取1μL点样至样品板上，待其自然干燥后，加入1μL基质2,5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液，待其干燥后使用autoflexⅢsmartbeam型MALDI-TOF质谱仪(Bruker公司)进行检测(正离子反射模式)。质谱检测结果如图3所示：为便于区分，以A代表N-乙酰氨基葡萄糖，D代表氨基葡萄糖，随后的数字代表含有该单糖的个数，二者加和为寡糖的聚合度。从结果来看，低脱乙酰度壳寡糖COS-62-TRCHI18在使用MALDI-TOF质谱可检测到的聚合度范围为2-13，同一个聚合度下存在不同乙酰度的壳寡糖，所有寡糖组分均带有乙酰基。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中科荣信（苏州）生物科技有限公司

<120> 一种里氏木霉几丁质酶及其制备方法和应用

<130> 2017

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 406

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<400> 1

Glu Ala Glu Ala Ser Pro Leu Ala Thr Lys Glu His Ser Val Glu Lys

1 5 10 15

Arg Ala Ser Gly Phe Ala Asn Ala Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly Ile

20 25 30

Tyr Gly Arg Asn Phe Gln Pro Ala Asp Leu Val Ala Ser Asp Ile Thr

35 40 45

His Val Ile Tyr Ser Phe Met Asn Leu Gln Ser Asp Gly Thr Val Val

50 55 60

Ala Ser Asp Thr Tyr Ala Asp Val Glu Lys His Tyr Ala Asp Asp Ser

65 70 75 80

Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn Leu Tyr Gly Cys Ala Lys Gln Leu Phe

85 90 95

Lys Leu Lys Lys Ala Asn Arg Asn Leu Lys Val Met Leu Ser Ile Gly

100 105 110

Gly Trp Thr Tyr Ser Thr Asn Phe Ala Ser Ala Ala Ser Thr Asp Ala

115 120 125

Asn Arg Lys Arg Phe Ala Ser Thr Ala Ile Thr Tyr Met Lys Asp Trp

130 135 140

Gly Phe Asp Gly Ile Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Ser Thr

145 150 155 160

Gln Ala Ser Asn Met Ile Leu Leu Leu Lys Glu Val Arg Ser Gln Leu

165 170 175

Asp Ala Tyr Ala Ala Gln His Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu Leu Ser

180 185 190

Ile Ala Ala Pro Ala Gly Glu Val Asn Tyr Ser Leu Leu Arg Met Ala

195 200 205

Asp Leu Gly Gln Val Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr

210 215 220

Ala Gly Ser Trp Ser Asn Ala Ser Gly His Asp Ala Asn Leu Tyr His

225 230 235 240

Asn Pro Gln Asn Pro Asn Ala Thr Pro Phe Asn Thr Asp Asp Ala Val

245 250 255

Lys Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Val Pro Ala Ser Lys Ile Val Leu Gly

260 265 270

Met Pro Ile Tyr Gly Arg Ser Phe Glu Ser Thr Ser Gly Ile Gly Gln

275 280 285

Pro Phe Thr Gly Ile Gly Ser Gly Ser Trp Glu Asn Gly Val Trp Asp

290 295 300

Tyr Lys Ala Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Val Gln Tyr Asp Asp Val

305 310 315 320

Ala Lys Ala Ser Tyr Ser Tyr Asp Pro Ser Thr Lys Glu Leu Ile Ser

325 330 335

Phe Asp Thr Pro Asp Val Val Asn Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Ser

340 345 350

Leu Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp Lys Lys

355 360 365

Gly Ala Asp Ser Leu Ile Gly Thr Ser His Lys Ala Leu Gly Ala Leu

370 375 380

Asp Ser Thr Gln Asn Leu Leu Ser Tyr Pro Asp Ser Lys Tyr Asp Asn

385 390 395 400

Leu Lys Asn Gly Leu Ile

405

<210> 2

<211> 1242

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<400> 2

ctcgagaaga gagaggctga ggcttcccca ttggctacta aggagcactc cgttgagaag 60

agagcttccg gtttcgctaa cgctgtttac ttcactaact ggggtatcta cggtagaaac 120

ttccaaccag ctgacttggt tgcttccgac atcactcacg ttatctactc cttcatgaac 180

ttgcaatccg acggtactgt tgttgcttcc gacacttacg ctgacgttga gaagcactac 240

gctgacgact cctggaacga cgttggtact aacttgtacg gttgtgctaa gcaattgttc 300

aagttgaaga aggctaacag aaacttgaag gttatgttgt ccatcggtgg ttggacttac 360

tccactaact tcgcttccgc tgcttccact gacgctaaca gaaagagatt cgcttccact 420

gctatcactt acatgaagga ctggggtttc gacggtatcg acatcgactg ggagtaccca 480

gctgactcca ctcaagcttc caacatgatc ttgttgttga aggaggttag atcccaattg 540

gacgcttacg ctgctcaaca cgctccaggt taccacttct tgttgtccat cgctgctcca 600

gctggtgagg ttaactactc cttgttgaga atggctgact tgggtcaagt tttggactac 660

gttaacttga tggcttacga ctacgctggt tcctggtcca acgcttccgg tcacgacgct 720

aacttgtacc acaacccaca aaacccaaac gctactccat tcaacactga cgacgctgtt 780

aaggcttaca tcaacggtgg tgttccagct tccaagatcg ttttgggtat gccaatctac 840

ggtagatcct tcgagtccac ttccggtatc ggtcaaccat tcactggtat cggttccggt 900

tcctgggaga acggtgtttg ggactacaag gctttgccaa aggctggtgc tactgttcaa 960

tacgacgacg ttgctaaggc ttcctactcc tacgacccat ccactaagga gttgatctcc 1020

ttcgacactc cagacgttgt taacactaag gtttcctact tgaagtcctt gggtttgggt 1080

ggttccatgt tctgggaggc ttccgctgac aagaagggtg ctgactcctt gatcggtact 1140

tcccacaagg ctttgggtgc tttggactcc actcaaaact tgttgtccta cccagactcc 1200

aagtacgaca acttgaagaa cggtttgatc taagcggccg cg 1242

<210> 3

<211> 1275

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<400> 3

atgttgaact tcttcggcaa gtccgtggcc ctgctggctg cgctgcaggc cacccttacc 60

tctgcgagcc ccctcgccac aaaggaacac tctgttgaga agagagccag tggatttgcg 120

aatgcggtct acttcacaaa ctggggcatc tacggacgca acttccagcc tgcggatctg 180

gtcgcgtcgg acatcactca tgtcatctac tccttcatga acctccaatc agacggcact 240

gttgtcgcca gtgatactta cgctgatgtc gagaagcact atgcggatga ttcctggaac 300

gatgtcggca ccaacttgta cggctgtgcc aagcaactgt tcaagttgaa gaaggccaac 360

cgaaacctga aggttatgct ttccatcggc ggctggacct attctaccaa cttcgcctct 420

gcagcgagca cggatgcgaa ccgaaagaga ttcgcctcaa ctgccattac gtacatgaag 480

gactggggct tcgacggtat cgacatcgac tgggagtacc ctgccgacag cacccaggcc 540

tccaacatga ttcttctgtt gaaggaggtc cgatctcagc ttgacgccta cgccgcacag 600

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gtcaacacca aggtgtctta cctcaagtcc cttggcctgg gcggcagcat gttctgggag 1140

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aacggcctca tctaa 1275

<210> 4

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcattgtc tccacattgt atgcttccaa gattctggtg ggaatactgc tgatagccta 60

acgttcatga tcaaaattta actgttctaa cccctacttg acagcaatat ataaacagaa 120

ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt attagcttac tttcataatt 180

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actattgcca gcattgctgc taaagaagaa ggggtatctc tcgag 525

<210> 5

<211> 526

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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acgttcatga tcaaaattta actgttctaa cccctacttg acagcaatat ataaacagaa 120

ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt attagcttac tttcataatt 180

gcgactggtt ccaattgaca agcttttgat tttaacgact tttaacgaca acttgagaag 240

atcaaaaaac aactaattat tcgaaacgat ggctatccca agattcccat ccatcttcac 300

tgctgttttg ttcgctgctt cctccgcttt ggctgctcca gttaacacta ctactgagga 360

cgagactgct caaatcccag ctgaggctgt tatcggttac tccgacttgg agggtgactt 420

cgacgttgct gttttgccat tctccaactc cactaacaac ggtttgttgt tcatcaacac 480

tactatcgct tccatcgctg ctaaggagga gggtgtttcc ctcgag 526

Claims

1.一种里氏木霉几丁质酶，其特征在于：所述里氏木霉几丁质酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.权利要求1所述的里氏木霉几丁质酶的编码基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的里氏木霉几丁质酶的制备方法，该方法为：将核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的几丁质酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的里氏木霉几丁质酶。

4.如权利要求3所述的里氏木霉几丁质酶的制备方法，其特征在于：所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：

将表达载体pPIC9中的信号肽序列如SEQID NO.4所示进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的信号肽序列如SEQ ID NO.5所示；

利用Nsi I/Xho I双酶切，将表达载体pPIC9中如SEQ ID NO.4所示的序列替换为如SEQID NO.5所示的信号肽序列，得到表达载体pGBG1。

5.如权利要求3所述的里氏木霉几丁质酶的制备方法，其特征在于：所述毕赤酵母为GS115。

6.如权利要求3所述的里氏木霉几丁质酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的几丁质酶编码基因进行全基因合成并构建至表达载体pGBG1中；

(2)对前述构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有几丁质酶基因的片段；

(3)将前述获得的含有几丁质酶基因的表达载体导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导培养，获得分泌表达的几丁质酶。

7.权利要求1所述的里氏木霉几丁质酶在壳聚糖降解中的应用。

8.权利要求7所述的里氏木霉几丁质酶在壳聚糖降解中的应用，其特征在于：所述里氏木霉几丁质酶用于壳聚糖降解制备获得壳寡糖。