CN109321551A

CN109321551A - 一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因及其蛋白表达、载体和应用

Info

Publication number: CN109321551A
Application number: CN201811237700.7A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 米丹; 张赛名; 胡兴
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: HUNAN BUSKY PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109321551B

Abstract

本发明涉及一种新Trx‑β‑葡萄糖苷酶的基因，所述基因为序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列所示；或者是与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同生物学功能蛋白质的序列；或者是能与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的序列。本发明如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列可以利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx的融合，得到大量可溶形式的Trx‑β‑Glucosidase融合蛋白，并通过简单的亲和层析的纯化方法得到高纯度高活性的重组Trx‑β‑葡萄糖苷酶，为大量产业化生产β‑葡萄糖苷酶提供基础。

Description

一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因及其蛋白表达、载体和应用

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，涉及一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因及其蛋白表达、载体和应用。

背景技术

纤维素是一种由D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键结合而成的葡聚糖大分子链，作为植物细胞壁的重要成分，是世界上最丰富、最廉价且未得到充分利用的可再生性资源。纤维素生物质如农林业废弃物和部分城市工业废物经酶解糖化生产乙醇等生物能和其他生物基制产品，对于解决粮食短缺、能源危机和环境污染等问题意义重大。纤维素资源的生物炼制需经过3个基本步骤：粉碎、预处理、酶水解，提高纤维素酶对纤维素原料的水解效率是降低成本提高经济效益的关键技术之一。纤维素酶是多组分的复合酶，包含3类主要成分：内切-β-葡聚糖酶(CMC酶)、外切-β-葡聚糖酶(C1酶、纤维二糖水解酶)、β-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶、CB)。纤维素酶在将纤维素水解成葡萄糖的过程中，依靠不同组分之间的协同作用才能完成。结晶底物首先在C1组分作用下，成为对水解敏感区，然后被多组分酶Cx水解，最后由β-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖。因此，β-葡萄糖苷酶在纤维素的分解过程中起着重要作用。其次，β-葡萄糖苷酶有转糖苷活力，目的即通过具有转苷活力的葡萄糖苷酶合成功能性低聚葡聚糖、低聚麦芽寡糖、低聚纤维寡糖等可以作为益生元的功能性糖类。此外，β-葡萄糖苷酶在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和印染行业等方面都具有重要应用价值。但是目前纤维素酶的生产成本高使得纤维素酶的应用受到限制。

因此采用基因工程技术，深入研究纤维素酶的作用机制，加强对纤维素酶的分子生物学研究，特别是要注意利用DNA基因重组技术的应用，利用外源基因表达系统生产β-葡萄糖苷酶将为该酶的生产应用奠定坚实基础；选育出活性高、产酶量大的菌种，获得产量高，纯度好，有蛋白活性的单种类纤维素酶，进一步提高纤维素酶系组成中β-葡萄糖苷酶比例，成为研发热点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因，目的之二在于提供这种基因所编码的新Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白，以及含有这种基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等表达载体，目的之四在于提供一种所述基因编码的新Trx-β-葡萄糖苷酶的制备方法及其纯化方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有96％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有97％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交条件为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

其中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列由1617个脱氧核苷酸组成，编码序列表中SEQID NO.2所示的氨基酸残基序列的蛋白。

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

以上三种任一种基因编码得到的Trx-β-葡萄糖苷酶属于本发明的保护范围。

进一步，所述Trx-β-葡萄糖苷酶为如下(1)或(2)的蛋白：

(1)蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

(2)序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.2由539个氨基酸残基组成，其编码基因的读码框包含1617个核苷酸。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

3.含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

进一步，所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。

所述目的基因选自以下三种核苷酸序列中的一种：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

进一步，所述空载体为pET32载体。

进一步，所述重组载体为将上述基因插入表达载体pET32的BamH I和Hind III酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

4.一种Trx-β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：

a.将上述的基因重组到构建到pET32载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

b.将步骤a表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的Trx-β-葡萄糖苷酶。

进一步，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含50～100mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含150mM～400mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。

进一步，还包括在pH值为6.0～6.5的条件下透析，将透析后的物质超滤浓缩。

根据上述的制备蛋白的方法制备得到的纯化后的蛋白也属于本发明的保护范围。

5.上述技术方案1所述基因、技术方案2或4所述蛋白、技术方案3所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和/或印染领域中的应用。

进一步，所述蛋白在乳制品中的乳糖水解中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明通过改造和测试大量的核苷酸序列发明出如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列可以利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx的融合，并得到实现了一种新的Trx-β-葡萄糖苷酶的可溶性表达，得到大量可溶形式的Trx-β-Glucosidase融合蛋白；进一步简单的通过亲和纯化，即可得到纯度高于95％且浓度较高的活性蛋白，因在本发明的所提供的表达系统内，重组Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白可按适当的方式折叠，并保持天然构象；三是摸索出一条有效能得到高纯度高活性的重组Trx-β-葡萄糖苷酶的纯化方法；通过本发明所提供的蛋白制备方法得到的Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白具有很强的生物活性。

旨在获得高活力β-葡萄糖苷酶以及高协同降解性能的纤维素酶生产菌株，对可再生纤维素资源的生物转化与利用具有重要的作用。

该β-葡萄糖苷酶基因是新发现的基因,目前还没有对其进行研究开发的报道。因此，利用有通过改造该β-葡萄糖苷酶的DNA序列且优化其表达纯化方法来高效生产该β-葡萄糖苷酶的方法，得到一种可以降低成本、实现大量生产且具有生物活性的β-葡萄糖苷酶，为该酶在工业生产中的应用奠定基础。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明实施例中的pET32/β-Glucosidase载体构建示意图。

图2为本发明实施例中的含有优化后β-Glucosidase的pET32重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中的纯化前Trx-β-Glucosidase融合蛋白和用包括不同浓度的咪唑的缓冲液纯化得到的Trx-β-Glucosidase融合蛋白的SDS－PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中的浓缩的Trx-β-Glucosidase重组蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图5为本发明实施例中含有优化前从茯苓菌丝体中经RT-PCR克隆的天然β-Glucosidase的pET32重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图6为本发明实施例中pH对酶活的影响。

图7为本发明实施例中温度对酶活的影响。

图8为本发明实施例重组酶对乳糖的水解效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET32均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方和试剂配方如下：

1)LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；

2)LB/Amp平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的氨苄青霉素(Ampicillin)，充分混均后倒板，4℃避光保存；

3)LB/Amp培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL Ampicillin(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。

4)50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)50mL，加蒸馏水定容至500mL，室温保存；

5)50mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；

6)5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB 25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500μL每份)后于室温保存，使用每份加入25μLβ-巯基乙醇混匀；

7)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；

8)考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-2500.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9)考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的新β-葡萄糖苷酶基因β-Glucosidase，具体序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的SEQ IDNO.2所示。本发明提供的序列在NCBI数据库中无相似度达60％的序列，它是根据大肠杆菌表达的特点如密码子的偏好性、防止出现复杂的DNA结构以免影响转录效率、保证合理的GC含量、选择合适的酶切位点、理想的表达标签及终止信号等特点人工优化并合成的众多序列中的一种DNA序列。本发明所述的序列及与本序列高度同源的DNA序列在大肠杆菌中均有较其它序列更高的可溶性目标蛋白的表达。

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核。木材的主要成分是纤维素，含量达40％～50％。因此，茯苓菌丝中极可能存在高活性的分泌型纤维素酶。利用转录组技术对茯苓的纤维素酶分解酶的表达谱进行分析发现了数十个与纤维素分解的酶基因，其中本专利申请保护的酶基因在转录水平具有最高丰度且远高于其它β-葡萄糖苷酶基因。

将上述优化后的如序列SEQ ID NO.1所示的基因构建到大肠杆菌表达载体pET32中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中重组表达载体pET32/β-Glucosidase载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET32/β-Glucosidase载体构建示意图。

利用经优化的Trx-β-葡萄糖苷酶基因序列的pET32重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.1-0.5mM的IPTG在18℃下诱导均检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图2所示，β-葡萄糖苷酶的蛋白分子量为55kDa左右，pET32载体在目标蛋白的N-端融合了一个大小为20kDa左右的Trx片段，该片段可以增强外源蛋白表达的可溶性，Trx-β-葡萄糖苷酶大小为75kDa左右，表达的目标蛋白如箭头所示。

将人工化学合成经优化的成熟β-Glucosidase基因连接至pUC通用载体得到pUC/β-Glucosidase，利用BamHI和HindIII双酶切pUC/β-Glucosidase，将得到的β-Glucosidase片段再亚克隆至表达载体pET32中，得到重组表达载体pET32/β-Glucosidase，载体构建如图1所示。pET32/β-Glucosidase载体构建的主要步骤如下：

(1)用BamH I和Hind III双酶切重组载体pUC/β-Glucosidase，获得目的片断β-Glucosidase，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用BamH I和Hind III双酶切pET32，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：

将重组载体pET32/β-Glucosidase转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/β-Glucosidase；用热激法将重组载体pET32/β-Glucosidase转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Amp抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET32/β-Glucosidase的大肠杆菌表达菌株转化子。

实施例2

本实施例提供一种制备Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：可溶性Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白的表达与提取：将包含序列SEQ ID NO.1基因的pET32/β-Glucosidase载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.6，然后分别加入浓度为0、0.1、0.5mM的IPTG，在18℃诱导10小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次后，离心取上清液，得到重组的可溶性融合蛋白Trx-β-葡萄糖苷酶，SDS-PAGE结果如图2所示。

S2：Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白的纯化：经扩大培养和在18℃下用0.1mM IPTG诱导10小时，收集经IPTG诱导表达后的表达菌的菌体，将菌体重悬于50ml的缓冲液A(含20mMNa₂HPO₄，200mM NaCl，10mM咪唑和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8.0)中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000g离心15min；将离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；用100ml缓冲液B(含20mM Na₂HPO₄，200mMNaCl，10mM咪唑pH 8.0)漂洗蛋白纯化柱子后，再依次用分别加入包括浓度为50、100、200和400mM咪唑的缓冲液C(含20mMNa₂HPO₄，200mM NaCl，pH 8.0)，将蛋白洗脱下来，收集每个浓度咪唑的洗脱液，400mM咪唑洗脱的蛋白是纯度在95％以上的Trx-β-葡萄糖苷酶融合蛋白，各浓度咪唑的缓冲液C洗脱的电泳具体结果如图3所示。

S3：Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白的浓缩：将蛋白质样品在pH6.0的20mM NaH₂PO₄下透析，透析结束后，利用截留分子是来15kDa的超滤管进行超滤浓缩即可得到纯度在95％以上的高浓度重组Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白，结果如图4所示。利用胶扫描并结合Bradford法对目标蛋白的浓度进行了检测，表1是100ml经IPTG诱导的菌体中可溶性Trx-β-葡萄糖苷酶重组蛋白经各纯化步骤的得率与纯度结果。

表1蛋白纯化结果

需要说明的是，在步骤S2得到的上清液中加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在18℃温度下IPTG的浓度为0.1、0.5和1mM时，都可以得到可溶性Trx-β-葡萄糖苷酶融合蛋白。为节约成本，缩短生产周期，我们优选采用诱导温度18℃，0.1mM的IPTG进行诱导表达。

对比例

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。木材的主要成分是纤维素、半纤维素和木素，其中，木材纤维素含量为50％左右。因此，茯苓菌丝中极可能存在高活性的分泌型纤维素酶。利用转录组技术对茯苓的纤维素酶分解酶的表达谱进行分析发现了几个高丰度的纤维素分解的酶基因，其中本专利中需要保护的Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白在所有茯苓的β-葡萄糖苷酶基因中具有最高的丰度。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，将该天然的茯苓β-葡萄糖苷酶基因用BamHI和HindIII双酶切，并连接到同样经BamHI和HindIII双酶切的pET32表达载体。重组载体经热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子。将包含优化前基因的pET32/β-Glucosidase载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6，然后分别加入浓度为0、0.1、0.5、1mM的IPTG，在18℃诱导10小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次后，离心取上清液，未得到重组可溶性Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白，SDS-PAGE结果如图5所示。该对比例结果说明，只有人工优化后的β-葡萄糖苷酶基因才能在大肠杆菌中实现可溶性的表达。

实施例3

本实施例对纯化的Trx-β-葡萄糖苷酶酶活进行检测，具体步骤和结果如下：

以对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷为底物物，对硝基苯酚为标准品，对纯化的Trx-β-葡萄糖苷酶进行酶活检测。

(1)标准曲线的绘制：取5μmol/L的对硝基苯，将其用pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液分别稀释至400、200、100、50、25、12.5和0nmol/L。取上述稀释液各100μl，分别加入到96孔酶标板中，每浓度各3个重复，于室温下置于全波长酶标仪中，选择吸光值为400nm，测定各稀释浓度的对硝基苯的吸光值，并绘制标准曲线，所得的标准曲线方程为：Y＝0.0011X+0.0021，相关系统r＝0.9995，标准品的检测结果表如表2示。

表2标准品的检测结果

标准品浓度(nmol/L)	0	12.5	25	50	100	200	400
								OD<sub>400</sub>	0	0.019	0.036	0.069	0.117	0.233	0.470

(2)样品酶活的测定：取1μl浓度为1mg/mL的纯化的Trx-β-葡萄糖苷酶、10μlpH6.0的200mM的磷酸二氢钠溶液，10μl的浓度为5mmol/L硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷，补加水至总体积为100μl,40℃下反应15min后，加入100μl浓度为2mol/L的碳酸钠，终止反应。取10μl上述反应终止液，加入到含有90μl pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液的96孔酶标板中，于400nm测定吸光值。根据标准曲线，计算出经反应后产生的对硝基苯的浓度再乘以20，得到最终生成的对硝基苯的量。同时，定义一分钟得到1nmol的对硝基苯的Trx-β-葡萄糖苷酶为1国际单位(IU)。根据计算，该Trx-β-葡萄糖苷酶的比活为1.25×10⁵IU/mg酶蛋白，是一种酶活力极强的β-葡萄糖苷酶。

(3)根据(2)的方法，分别利用pH4-8的磷酸盐缓冲液，对酶活进行了检测。在不同pH值下，相对活力如图6所示，从图中可以看出，该酶的最适pH为6左右。表3为不同pH值下相对酶活的检测结果。

表3不同pH值下相对酶活

pH	4	4.5	5	5.5	6	6.5	7	7.5	8
										相对酶活(％)	8	12	18	41	100	86	65	22	9

同样，温度对酶活的影响也根据(2)的方法进行了测定，结果如图7所示，从图可知，该酶在40℃左右具有最高的酶活。表4为不同温度下相对酶活的检测结果。

表4不同温度下相对酶活

温度	30	35	40	45	50	55
							相对酶活(％)	69	92	100	48	31	17

实施例4

本实施例对纯化的可溶性β-葡萄糖苷酶的乳糖水解活力进行薄层层析检测，具体步骤和结果如下：

将终浓度为2mg/L的β-葡萄糖苷酶加入到10mg/ml的乳糖溶液中，4℃下反应2小时。取硅胶G板于100℃烘箱活化后冷却至室温，用毛细管点样1μL，点样位置为从硅胶板下端1.5cm，两侧2～3cm，每个样品点相距1～1.5cm。将展层剂(乙酸乙酯∶乙酸∶水＝2∶1∶1)于层析缸中平衡，数分钟后，将硅胶板放入。当展层剂移至距上端2～3cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂(25％硫酸)，于100℃显色5～30min后从烘箱取出。显色结果如图8所示，从图中可以看出，该酶在加入β-葡萄糖苷酶(+)与不加酶(-)的情况下，显色斑点的位置出现明显差异，说明加入β-葡萄糖苷酶使乳糖出现了水解，迁移位置发生改变。

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的Trx-β-葡萄糖苷酶是一种酶活力极强的，最适pH为6左右、最适温度为40℃左右为β-葡萄糖苷酶；另外，该酶在低温下对乳糖有很强的水解活性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因及其蛋白表达、载体和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtccgcta ccactaccac cgccaaatta cctaaggact tcatctgggg tttcgccact 60

gcttcctttc agattgaggg ttctaccgac gttgacggta gaggtaagtc cttttgggac 120

gacttctcca gaactccagg aaagaccttg gacggtagaa acggagacgt cgctactgac 180

tcttacaaca gatggcgtga ggaccttgac ttgttgtccg agtacggtgt caagtcttac 240

cgtttctcca tcgcctggtc ccgtatcatt cctcttggtg gtcgtaacga cccagtcaac 300

gaggccggta ttaagtttta ctctgacttg atcgacggtt tgttggagag aggtattact 360

ccatttgtta ctttgtatca ctgggatctt cctcaggctt tacatgaccg ttacttggga 420

tggttgaaca aggaggaaat tgttcaggac tatgtccgtt acgcccgtgt ttgcttcgaa 480

agattcggtg acagagtcaa gcactggttg accatgaacg agccttggtg catttccatc 540

ttgggttacg gaagaggagt tttcgcccca ggtagatctt ctgacagatt gcgttcctct 600

gagggagatt cctccagaga accttggatc gctggtcact ctgtcatttt ggcccatgcc 660

aacgctgtta aggcttaccg tgaggagttc aaggccaagc agggtggaca gatcggaatt 720

actttgaacg gagactgggc catgccatat gatgattccc ctgctaacat cgaagctgct 780

cagcacgctt tggatgttgc cattggttgg ttcgccgacc ctatctactt gggatcttac 840

cctgccttca tgaaggagat gttgggagac cgtttgccag agttcaccca ggaggagttg 900

gctgttgtta agggttcctc tgatttttat ggtatgaata cttataccac taacttgtgt 960

aaggccggtg gagatgacga gtttcaggga catgtcgaat acaccttcac cagaccagac 1020

ggtacccaat tgggacctca agctcattgt gcctggttgc aggattacgc tccaggtttc 1080

agagacttgt tgaattactt gtacaagaga tacagaaagc ctatctacgt cactgagaac 1140

ggtttcgccg tcaaggacga gaactctatg accattgaac aggctttgaa ggacgatgcc 1200

agagtccatt attacgccgg tgtcaccgat gccttgttga acgccgttaa cgaagacggt 1260

gtcgacgttc gtgcttactt cggttggtcc cttttggaca acttcgaatg ggccgacggt 1320

tatgtcactc gtttcggtgt cacctacgtc gattacgaga ctcaaaaaag ataccctaag 1380

gattctggaa agtttttggc caagtggttc aaggaacatg ttcctgccgc tgaggctgaa 1440

gctccaaagc ctgttgttgt cgttgaggcc gctaagccta aacctatctc caacggtaag 1500

gctccagtcg tcgagcaatt ccacattgag caggcccaaa agggagccgc tccacttaag 1560

aagagaaagg ccccattcgc ccgttttact gcctacgtct ccgctttctt gggtttg 1617

<210> 2

<211> 539

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ala Thr Thr Thr Thr Ala Lys Leu Pro Lys Asp Phe Ile Trp

1 5 10 15

Gly Phe Ala Thr Ala Ser Phe Gln Ile Glu Gly Ser Thr Asp Val Asp

20 25 30

Gly Arg Gly Lys Ser Phe Trp Asp Asp Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

35 40 45

Thr Leu Asp Gly Arg Asn Gly Asp Val Ala Thr Asp Ser Tyr Asn Arg

50 55 60

Trp Arg Glu Asp Leu Asp Leu Leu Ser Glu Tyr Gly Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

Arg Phe Ser Ile Ala Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Asn

85 90 95

Asp Pro Val Asn Glu Ala Gly Ile Lys Phe Tyr Ser Asp Leu Ile Asp

100 105 110

Gly Leu Leu Glu Arg Gly Ile Thr Pro Phe Val Thr Leu Tyr His Trp

115 120 125

Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Leu Gly Trp Leu Asn Lys

130 135 140

Glu Glu Ile Val Gln Asp Tyr Val Arg Tyr Ala Arg Val Cys Phe Glu

145 150 155 160

Arg Phe Gly Asp Arg Val Lys His Trp Leu Thr Met Asn Glu Pro Trp

165 170 175

Cys Ile Ser Ile Leu Gly Tyr Gly Arg Gly Val Phe Ala Pro Gly Arg

180 185 190

Ser Ser Asp Arg Leu Arg Ser Ser Glu Gly Asp Ser Ser Arg Glu Pro

195 200 205

Trp Ile Ala Gly His Ser Val Ile Leu Ala His Ala Asn Ala Val Lys

210 215 220

Ala Tyr Arg Glu Glu Phe Lys Ala Lys Gln Gly Gly Gln Ile Gly Ile

225 230 235 240

Thr Leu Asn Gly Asp Trp Ala Met Pro Tyr Asp Asp Ser Pro Ala Asn

245 250 255

Ile Glu Ala Ala Gln His Ala Leu Asp Val Ala Ile Gly Trp Phe Ala

260 265 270

Asp Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Pro Ala Phe Met Lys Glu Met Leu

275 280 285

Gly Asp Arg Leu Pro Glu Phe Thr Gln Glu Glu Leu Ala Val Val Lys

290 295 300

Gly Ser Ser Asp Phe Tyr Gly Met Asn Thr Tyr Thr Thr Asn Leu Cys

305 310 315 320

Lys Ala Gly Gly Asp Asp Glu Phe Gln Gly His Val Glu Tyr Thr Phe

325 330 335

Thr Arg Pro Asp Gly Thr Gln Leu Gly Pro Gln Ala His Cys Ala Trp

340 345 350

Leu Gln Asp Tyr Ala Pro Gly Phe Arg Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Tyr

355 360 365

Lys Arg Tyr Arg Lys Pro Ile Tyr Val Thr Glu Asn Gly Phe Ala Val

370 375 380

Lys Asp Glu Asn Ser Met Thr Ile Glu Gln Ala Leu Lys Asp Asp Ala

385 390 395 400

Arg Val His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Asp Ala Leu Leu Asn Ala Val

405 410 415

Asn Glu Asp Gly Val Asp Val Arg Ala Tyr Phe Gly Trp Ser Leu Leu

420 425 430

Asp Asn Phe Glu Trp Ala Asp Gly Tyr Val Thr Arg Phe Gly Val Thr

435 440 445

Tyr Val Asp Tyr Glu Thr Gln Lys Arg Tyr Pro Lys Asp Ser Gly Lys

450 455 460

Phe Leu Ala Lys Trp Phe Lys Glu His Val Pro Ala Ala Glu Ala Glu

465 470 475 480

Ala Pro Lys Pro Val Val Val Val Glu Ala Ala Lys Pro Lys Pro Ile

485 490 495

Ser Asn Gly Lys Ala Pro Val Val Glu Gln Phe His Ile Glu Gln Ala

500 505 510

Gln Lys Gly Ala Ala Pro Leu Lys Lys Arg Lys Ala Pro Phe Ala Arg

515 520 525

Phe Thr Ala Tyr Val Ser Ala Phe Leu Gly Leu

530 535

<210> 3

<211> 1617

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtccgcta ccactaccac cgccaaatta cctaaggact tcatctgggg tttcgccact 60

gcttcctttc agattgaggg ttctaccgac gttgacggta gaggtaagtc cttttgggac 120

gacttctcca gaactccagg aaagaccttg gacggtagaa acggagacgt cgctactgac 180

tcttacaaca gatggcgtga ggaccttgac ttgttgtccg agtacggtgt caagtcttac 240

cgtttctcca tcgcctggtc ccgtatcatt cctcttggtg gtcgtaacga cccagtcaac 300

gaggccggta ttaagtttta ctctgacttg atcgacggtt tgttggagag aggtattact 360

ccatttgtta ctttgtatca ctgggatctt cctcaggctt tacatgaccg ttacttggga 420

tggttgaaca aggaggaaat tgttcaggac tatgtccgtt acgcccgtgt ttgcttcgaa 480

agattcggtg acagagtcaa gcactggttg accatgaacg agccttggtg catttccatc 540

ttgggttacg gaagaggagt tttcgcccca ggtagatctt ctgacagatt gcgttcctct 600

gagggagatt cctccagaga accttggatc gctggtcact ctgtcatttt ggcccatgcc 660

aacgctgtta aggcttaccg tgaggagttc aaggccaagc agggtggaca gatcggaatt 720

actttgaacg gagactgggc catgccatat gatgattccc ctgctaacat cgaagctgct 780

cagcacgctt tggatgttgc cattggttgg ttcgccgacc ctatctactt gggatcttac 840

cctgccttca tgaaggagat gttgggagac cgtttgccag agttcaccca ggaggagttg 900

gctgttgtta agggttcctc tgatttttat ggtatgaata cttataccac taacttgtgt 960

aaggccggtg gagatgacga gtttcaggga catgtcgaat acaccttcac cagaccagac 1020

ggtacccaat tgggacctca agctcattgt gcctggttgc aggattacgc tccaggtttc 1080

agagacttgt tgaattactt gtacaagaga tacagaaagc ctatctacgt cactgagaac 1140

ggtttcgccg tcaaggacga gaactctatg accattgaac aggctttgaa ggacgatgcc 1200

agagtccatt attacgccgg tgtcaccgat gccttgttga acgccgttaa cgaagacggt 1260

gtcgacgttc gtgcttactt cggttggtcc cttttggaca acttcgaatg ggccgacggt 1320

tatgtcactc gtttcggtgt cacctacgtc gattacgaga ctcaaaaaag ataccctaag 1380

gattctggaa agtttttggc caagtggttc aaggaacatg ttcctgccgc tgaggctgaa 1440

gctccaaagc ctgttgttgt cgttgaggcc gctaagccta aacctatctc caacggtaag 1500

gctccagtcg tcgagcaatt ccacattgag caggcccaaa agggagccgc tccacttaag 1560

aagagaaagg ccccattcgc ccgttttact gcctacgtct ccgctttctt gggtttg 1617

Claims

1.一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

2.根据权利要求1所述的基因编码得到的Trx-β-葡萄糖苷酶。

3.根据权利要求2所述的Trx-β-葡萄糖苷酶，其特征在于：所述Trx-β-葡萄糖苷酶为如下(1)或(2)的蛋白：

(1)蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

4.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pET32载体。

7.一种权利要求2或3所述的Trx-β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将权利要求1所述的基因重组到构建到pET32载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

b.将步骤a表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～1mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的Trx-β-葡萄糖苷酶。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含50～100mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含150mM～400mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。

9.根据权利要求7或8所述制备方法得到的蛋白。

10.权利要求1所述基因、权利要求2、3或9所述蛋白、权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和/或印染领域中的应用。