CN110616228B

CN110616228B - 一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用

Info

Publication number: CN110616228B
Application number: CN201911006023.2A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 董海丽; 胡兴
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: Huaihua University
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2039-10-22
Also published as: CN110616228A

Abstract

本发明涉及一种编码乳糖酶的人工合成基因，该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建重组载体并转化酵母，可实现该重组乳糖酶在甲醇诱导下的分泌表达，通过镍亲和纯化，可得到纯度高于95％活性重组乳糖蛋白，该活性蛋白具有很强的水解乳糖活性，将为分解乳制品中的乳糖提供高活力的酶产品。

Description

一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，涉及一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用。

背景技术

乳糖不耐受是由于乳糖酶分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻，又称乳糖酶缺乏症。母乳和牛乳中的糖类主要是乳糖，小肠尤其是空肠黏膜表面绒毛的顶端乳糖酶的分泌量减少或活性不高就不能完全消化和分解乳汁中乳糖，部分乳糖被结肠菌群酵解成乳酸、氢气、甲烷和二氧化碳。乳酸刺激肠壁，增加肠蠕动而出现腹泻，偶尔还可能诱发肠痉挛出现肠绞痛。乳糖酶缺乏是广泛存在的世界性问题，不同国家乳糖不耐受发生的高峰年龄段不同，我国87％的儿童乳糖不耐受发生在7～8岁。

利用外源基因表达系统来生产重组乳糖酶是大量获得乳糖酶的主要技术手段之一。大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。不少研究者将外源基因构建大肠杆菌表达载体，经转化E.coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒副作用，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活，因此该表达系统并不适合于大量生产重组乳糖酶。昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等外源基因表达系统对技术、设备和技术水平的要求太高，因此生产的产品往往价格都很高，同样不适合乳糖酶的大量且低成本地生产。甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具最显著的优点：通过筛选高水平分泌表达的转化子和优化表达条件，可以廉价且大规模地生产和制备重组蛋白。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.本发明提供基因，为编码乳糖酶蛋白的基因，为如下(1)-(2)中任意一种的DNA分子：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或至少具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

其中，序列表中的SEQ ID No.1由1638个脱氧核苷酸组成，本序列包括乳糖酶基因的成熟蛋白全长读码框和6个组氨组成的表达标签和终止密码子，编码具有序列表中SEQID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。

2.本发明提供蛋白，是如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由序列2衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由546个氨基酸残基组成，其中前540个氨基酸残基为成熟乳糖酶蛋白氨基酸序列，后6个氨基酸残基为组氨酸组成的表达标签，其编码基因的读码框包含1638个核苷酸(包含一个终止密码子)。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

3.含有上述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的Xho I和Xba I酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No.3(GCCTCGAGAAAAGAAAA AAGCAATCCGCTACTACAAC)，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No.4(GCTCTAGATCAGTTGATGATAGTAGTGTCAC)，利用SEQ ID No.3和SEQID No.4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

4.本发明的第四个目的是提供一种制备乳糖酶蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZαA分别用Xho I和Xba I双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pPICZαA-乳糖酶；

S2：将所述重组载体pPICZαA-乳糖酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：将所述阳性克隆转接至含有1000μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管培养高抗性的转化子，28℃、250rpm培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，将上清液10μl加入到100μl浓度为5mmol/L硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷溶液中，4℃下反应30min后，加入100μl浓度为2mol/L的碳酸钠，终止反应。取30μl上述反应终止液，加入到含有70μl pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液的96孔酶标板中，于400nm测定吸光值。吸光值较大的转化子即为高水平表达乳糖酶的转化子，吸光值最大的转化子即为最高水平表达乳糖酶的转化子。

S4：将高水平分泌表达乳糖酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，用于大量分泌乳糖酶重组蛋白，并补加甲醇使其质量分数保持在1～2％。

进一步，将所述高表达乳糖酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD600为10～15，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌乳糖酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导3-4天。

BMGY扩大生长培养后，一般以生长培养基1/10-1/5体积的诱导培养基BMMY来诱导培养。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至8，以大于或等于15000g的转速离心30分钟，将获得的上清液加入到经pH 8Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH 8的含10mM Tris-HCl和30mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含10mM Tris-HCl和200mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于10mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

优选地，在步骤S5之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥。

根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。

通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达乳糖酶的酵母转化子也属于本发明保护的范围。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系也是本发明保护的范围。

3.上述制备方法得到的蛋白在食品、保健领域中的应用。

优选的，所述蛋白用于乳制品中乳糖的转化。

本发明提供的技术方案具有以下优点：一是提供一种能高效表达高活力的乳糖酶的人工基因序列，；二是利用酵母载体pPICZαA-乳糖酶上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持乳糖酶的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得乳糖酶的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达乳糖酶的方法和快速高效纯化乳糖酶的方法，可以降低成本且实现大量生产；根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组乳糖酶能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；六是表达的重组蛋白可以利用镍亲合层析快速纯化，纯化的蛋白具有很强的水解乳糖的生物活性。

本发明通过优化基因首次利用毕赤外源基因表达系统制备了一种来源于茯苓的新颖具有高活力的重组乳糖酶。该重组酶的最适pH值与天然牛乳的pH十分接近且高浓度的钙镁离子对酶活力无明显抑制作用。该重组乳糖酶的成功制备为下一步的产业化开和用于乳糖不耐受症的防治奠定了前期基础，在食品、保健品和药品领域具有重要的应用开发前景。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的表达载体pPICZαA-乳糖酶构建示意图。

图2为本发明实施例中高Zeocin抗性乳糖酶的酵母转化子培养液上清的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中在扩大培养条件下，不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中200mM咪唑洗脱纯化得到的乳糖酶蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图5为本发明实施例中纯化得到的乳糖酶蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图6为对比例酵母转化子上清液中的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图7为本发明实施例中优化后的重组乳糖酶蛋白的生物学活性结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZαA均购自美国Invritrogen公司。

本发明中的引物具体序列如序列表中的SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

所用培养基配方如下：

1)酵母生长培养基(BMGY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mI YNB，2mL 500×生物素，20mL 50％灭菌甘油；

2)酵母诱导培养基(BMMY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mL YNB，2mL500×生物素，10mL甲醇；

3)YPD培养基

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到900mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100mL 20％灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.6-1.8％的琼脂可制得YPD固体培养基。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的C-端带有6×His标签的乳糖酶基因，具体序列如序列表中的SEQ ID No.1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的SEQ IDNo.2所示。优化后的DNA序列经NCBI比对，没有明显相似性。

将本发明根据乳糖酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列、优化前的乳糖酶的天然DNA和另几种仅仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，得到重组载体，然后利用Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌X-33中，转化后分别用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证，将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线分别接种至终浓度为1000μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板，分别筛选得高抗性的毕赤酵母转化子。将筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，离心取上清，将上清液10μl加入到100μl浓度为5mmol/L硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷溶液中，4℃下反应30min后，加入100μl浓度为2mol/L的碳酸钠，终止反应。取10μl上述反应终止液，加入到含有90μl pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液的96孔酶标板中，于400nm测定吸光值。吸光值最大的转化子即为最高水平表达乳糖酶的转化子。分析结果显示用优化前的乳糖酶天然DNA和另几种仅仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列构建得到的毕赤酵母转化子几乎不能检测到酶活而以基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列即SEQ ID No.1构建载体所筛选的转化子都具有很高的酶活。

实施例2

本实施例提供一种制备高活力乳糖酶蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：构建表达载体及转化：将实施例1的根据基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列即SEQ ID No.1中的DNA连接至毕赤酵母组成型分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-乳糖酶，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA-乳糖酶构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：

(1)用Xho I和Xba I双酶切含合成的乳糖酶基因的质粒，获得目的片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用Xho I和Xba I双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

S2：重组质粒的转化：将所述重组载体pPICZαA-乳糖酶用Sac I单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选得到阳性克隆，并利用PCR对转化子进行验证。

S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1000μg/mL Zeocin的YPD平板，将筛选得到高Zeocin抗性的转化子，再用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，将上清液10μl加入到100μl浓度为5mmol/L硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷溶液中，4℃下反应30min后，加入100μl浓度为2mol/L的碳酸钠，终止反应。取10μl上述反应终止液，加入到含有90μl pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液的96孔酶标板中，于400nm测定吸光值；吸光值最大的转化子即为最高水平表达乳糖酶的转化子。

S4：将所述高表达乳糖酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD₆₀₀为10～15，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌乳糖酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导4天。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至8，以大于或等于15000g的转速离心30分钟，将获得的上清液加入到经pH 8Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH 8的含10mM Tris-HCl和30mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱。

需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用BMMY培养基小量表达，经SDS-PAGE分析，从高抗性(抗性水平为1000μg/mL Zeocin)转化子中筛选得到了3株稳定且高水平分泌表达乳糖酶的酵母转化子，而从抗性水平低于300μg/mL Zeocin YPD平板的转化子分泌表达目标蛋白的能力明显低于高抗性的转化子且酶活检测具有同样的结果，部分高Zeocin抗性转化子分泌目标蛋白的SDS-PAGE结果如图2所示。

同样需要说明的是，用SDS-PAGE检测不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。经培养1～4天，通过继续补加甲醇，培养得到的目的蛋白总量更高，具体上清液蛋白的总量结果如下表1所示。

表1总蛋白含量

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					总蛋白浓度(mg/L)	150	240	310	520

取培养1～4天的发酵液上清，经SDS-PAGE，在55kDa左右有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甘油，培养得到的目的蛋白总量更高，使用Bio-rad凝胶成像系统对SDS-PAG胶的灰度扫描结果显示，目标蛋白的比例与培养时间成反比，目的蛋白占上清液总蛋白的比例结果如下表2所示。

表2不同诱导时间得到的目的蛋白占上清液蛋白的百分比含量结果

经计算，虽然目标蛋白比例在下降，但由于总蛋白增加得更快，因此目标蛋白总量仍在明显增加，目的蛋白含量结果如下表3所示。

表3目标蛋白总量

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					乳糖酶(mg/L)	60	100	135	202

取培养1～4天的发酵液上清，将上清液10μl加入到100μl浓度为5mmol/L硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷溶液中，4℃下反应30min后，加入100μl浓度为2mol/L的碳酸钠，终止反应。取30μl上述反应终止液，加入到含有70μl pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液的96孔酶标板中，于400nm测定吸光值。所得的吸光值变化如表4所示。从结果可以看出，在培养到第3天之后，酶活力已接近最大值。

表4吸光值变化结果

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					400nm测定吸光值	0.52	0.98	1.46	1.54

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至8，以大于或等于15000g的转速离心10～20分钟，将获得的上清液加入到经pH 8Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH 8的含10mM Tris-HCl和30mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含10mM Tris-HCl和200mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，洗脱蛋白的SDS-PAGE结果如图4所示，从图中可以看出目标蛋白具有很高的纯度，说明该方法能有效纯化目标。将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于10mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

优选地，在步骤S5之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥，即得到冻干粉蛋白。冻干粉溶解于生理盐水中，4℃、15000g的转速离心20分钟，取上清液进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，检测到了目标蛋白且目标蛋白具有很高纯度，说明该蛋白处理的方法不会使蛋白大量变性蛋白仍呈可溶解状态。表5为发酵上清液及各纯化阶段蛋白纯化比较，其中总体积为100ml发酵上清液经过每一个步骤处理后的大致体积。

表5发酵上清液蛋白纯化比较

发明人在申请号为CN201811239932.6和CN201811237700.7两个专利分别利用了pET28和pET32为载体，先对茯苓的乳糖酶基因人工优化后进行了原核表达，但是利用上述两种载体表达的蛋白都是胞内蛋白，纯化时需要先破碎菌体。利用pET28为表达载体每100mL发酵液可得化到2.2mg纯化的蛋白；利用pET32为表达载体每100mL发酵液可得到约10mg纯化的蛋白，而以本发明提供SEQ ID NO.1所示序列以pPICZαA为表达载体，X33为表达菌株，经发酵每100mL发本酵液可以纯化到的目标蛋白为18毫克，最终目标蛋白的回收率可达近90％且纯度都在95％以上，其回收率和纯度均高于大肠杆菌表达系统。可见毕赤酵母为表达系统pPICZαA为表达载体，X33为表达菌株，目标蛋白的表达水平较原核系统更为高效且目标蛋白更易于纯化。

对比例

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。发明人利用转录组技术对茯苓的乳糖酶基因的表达谱进行分析发现了几个高丰度的纤维素分解的酶基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因天然序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；同样，也合成了另几种仅仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，其中的一种仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工序列如序列表中SEQ ID NO.6所示(以该序列为代表)。将上述乳糖酶基因序列用Xho I和Xba I双酶切，并连接到同样经Xho I和Xba I双酶切的pPICZαA表达载体。重组载体pPICZαA-乳糖酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆。将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1000μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，将上清液10μl加入到100μl浓度为5mmol/L硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷溶液中，4℃下反应30min后，加入100μl浓度为2mol/L的碳酸钠，终止反应。取30μl上述反应终止液，加入到含有70μl pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液的96孔酶标板中，于400nm测定吸光值，结果表明，几乎检测不到上述转化子的吸光值差异且几乎全部为0。同时，以SDS-PAGE检测上清蛋白中目标蛋白的表达情况，SDS-PAGE的检测结果如图6所示，未在目标位置检测到目标蛋白条带。结果说明，只有本发明提供的根据乳糖酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列表SEQ ID NO.1所示的序列转化到毕赤酵母中才能实现目标蛋白的高水平分泌表达。

实施例3

本实施例对纯化的可溶性乳糖酶的酶活力进行检测，具体步骤和结果如下：

以对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷为底物，对硝基苯酚为标准品，对实施例2经S7步骤纯化、浓缩后并冷冻干燥的重组乳糖酶冻干粉重新溶于生理盐水，调节蛋白浓度至1mg/ml后再进行酶活检测。

(1)标准曲线的绘制：取5μmol/L的对硝基苯，将其用pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液分别稀释至800、400、200、100、50、25和0nmol/L。取上述稀释液各100μl，分别加入到96孔酶标板中，每浓度各3个重复，于室温下置于全波长酶标仪中，选择吸光值为400nm，测定各稀释浓度的对硝基苯的吸光值，并绘制标准曲线，所得的标准曲线方程为：Y＝0.0011X+0.0066，相关线性系数R²＝0.9996，标准品的检测结果表如表6所示。

表6标准品的检测结果

标准品浓度(nmol/L)	0	25	50	100	200	400	800
								OD₄₀₀	0	0.032	0.060	0.118	0.223	0.450	0.865

(2)样品酶活的测定：取1μl浓度为1mg/mL的纯化的乳糖酶、pH6.0的200mM的磷酸二氢钠溶液10μl、10μl的浓度为5mmol/L硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷，补加水至总体积为100μl,40℃下反应15min后，加入100μl浓度为2mol/L的碳酸钠，终止反应。取10μl上述反应终止液，加入到含有90μl pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液的96孔酶标板中，于400nm测定吸光值。根据标准曲线，计算出经反应后产生的对硝基苯的浓度再乘以20，得到最终生成的对硝基苯的量。同时，定义一分钟得到1mmol的对硝基苯的乳糖酶为1国际单位(IU)。根据计算，该乳糖酶的比活为4.2×10⁵IU/mg酶蛋白，是一种酶活力极强的乳糖酶。

同样测定CN201811239932.6和CN201811237700.7中表达的乳糖酶(以下分别用pET28和pET32表示)的比活力，目标蛋白的比活分别是1.58×10⁵IU/mg和1.25×10⁵IU/mg。所以本发明表达的重组冷耐受乳糖酶具有更强的生物活性。

(3)根据(2)的方法，分别利用pH4-8的磷酸盐缓冲液，对酶活性进行了检测。在不同pH值下，相对活力如表6所示，该酶的最适pH为6左右。表7为不同pH值下相对酶活性的检测结果。

表7不同pH值相对酶活

pH	4	5	6	7	8
						相对酶活性(％)	72	86	100	80	48

同样，对金属Mg²⁺和Cal²⁺等离子(终浓度为5mmol/l)对该酶的活力影响进行了检测，金属离子对酶活性的影响如表8所示，从结果可以看出，Mg²⁺和Ca²⁺等离子对酶活性几乎没有影响(无离子情况下的酶活性设定为100％)。

表8不同离子值相对酶活

离子各类	Mg²⁺	Ca²⁺	Cu²⁺	Zn²⁺	无离子
						相对酶活性(％)	96	98	22	94	100

实施例4

本实施例对纯化的可溶性乳糖酶的乳糖水解活力进行薄层层析检测，具体步骤和结果如下：

将50μg的乳糖酶(终浓度为1mg/mL)加入到50μl 10mg/ml的乳糖溶液中，40℃下分别反应0、1、2和4小时。取硅胶G板于100℃烘箱活化后冷却至室温，用毛细管点样1μL，点样位置为从硅胶板下端1.5cm，两侧2～3cm，每个样品点相距1～1.5cm。将展层剂(乙酸乙酯∶乙酸∶水＝2∶1∶1)于层析缸中平衡，数分钟后，将硅胶板放入。当展层剂移至距上端2～3cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂(25％硫酸)，于100℃显色5～30min后从烘箱取出。显色结果如图7所示，从图中可以看出，该酶在加入乳糖酶与不加(0小时)酶的情况下，显色斑点的位置出现明显差异，说明加入乳糖酶使乳糖出现了水解从来迁移位置发生改变。

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的乳糖酶是一种酶活力极强的，最适pH为6左右，Mg²⁺和Ca²⁺等离子对酶活性几乎没有影响的高活力乳糖酶。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caatccgcta ctacaaccac tgccaagttg ccaaaggact tcatttgggg tttcgctact 60

gcctccttcc agattgaagg ttccaccgac gttgacggta gaggtaagtc tttctgggat 120

gacttctcca gaactcctgg taagaccctg gatggtagaa acggtgacgt tgctaccgac 180

tcttacaaca gatggcgtga ggatttggac ttgttgtccg agtacggtgt caagtcctac 240

agattctcta tcgcctggtc cagaatcatc ccactgggtg gtagaaatga cccagttaac 300

gaggccggta tcaagttcta ctccgacttg attgatggtc tgttggagag aggtatcacc 360

ccatttgtta ccctgtacca ctgggatttg ccacaagcct tgcacgatag ataccttggt 420

tggctgaaca aagaagagat cgtccaggac tacgtcagat acgccagagt gtgtttcgag 480

agattcggtg acagagtcaa gcactggttg actatgaacg agccttggtg catttccatc 540

cttggttacg gaagaggtgt tttcgcacca ggtagatctt ccgacagatt gagatcttct 600

gaaggtgact cttccagaga gccatggatt gctggtcact ccgtgattct ggctcacgcc 660

aacgctgtta aggcctacag agaagagttc aaggctaagc aaggtggtca gatcggtatc 720

actttgaacg gtgattgggc tatgccttac gacgattccc cagctaacat tgaagctgcc 780

caacacgctt tggacgttgc tattggttgg ttcgctgacc ctatctactt gggttcttac 840

ccagccttca tgaaggaaat gttgggagac agattgcccg agttcaccca agaagaattg 900

gccgttgtta agggttcctc cgacttctac ggtatgaaca cttacaccac aaacttgtgt 960

aaagctggtg gtgacgatga attccaaggt cacgttgagt acaccttcac tagaccagac 1020

ggtactcaat tgggtcctca ggctcattgt gcttggttgc aagattacgc ccctggtttc 1080

agagacttgc tgaactacct gtacaagaga tacagaaaac ccatctacgt caccgagaac 1140

ggttttgccg ttaaggacga aaactccatg actatcgagc aggctttgaa ggacgatgcc 1200

agagttcatt actacgctgg tgttactgac gccttgctga acgccgttaa cgaagatggt 1260

gttgacgtca gagcttactt cggttggtct ttgttggaca acttcgaatg ggctgacggt 1320

tacgttacca gattcggagt tacttacgtc gactacgaga ctcagaagag atacccaaag 1380

gattccggta agttcctggc caagtggttc aaagaacacg ttcctgctgc tgaagccgaa 1440

gctccaaagc cagtcgtggt tgtcgaagct gctaagccta agccaatctc taacggtaaa 1500

gctccagttg tcgagcagtt ccacattgag caagctcaga agggtgctgc cccactgaag 1560

aagagaaaag ctccatttgc tagattcacc gcttacgttt ccgccttctt gggattgcat 1620

catcaccatc accactaa 1638

<210> 2

<211> 545

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Ser Ala Thr Thr Thr Thr Ala Lys Leu Pro Lys Asp Phe Ile Trp

1 5 10 15

Gly Phe Ala Thr Ala Ser Phe Gln Ile Glu Gly Ser Thr Asp Val Asp

20 25 30

Gly Arg Gly Lys Ser Phe Trp Asp Asp Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

35 40 45

Thr Leu Asp Gly Arg Asn Gly Asp Val Ala Thr Asp Ser Tyr Asn Arg

50 55 60

Trp Arg Glu Asp Leu Asp Leu Leu Ser Glu Tyr Gly Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

Arg Phe Ser Ile Ala Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Asn

85 90 95

Asp Pro Val Asn Glu Ala Gly Ile Lys Phe Tyr Ser Asp Leu Ile Asp

100 105 110

Gly Leu Leu Glu Arg Gly Ile Thr Pro Phe Val Thr Leu Tyr His Trp

115 120 125

Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Leu Gly Trp Leu Asn Lys

130 135 140

Glu Glu Ile Val Gln Asp Tyr Val Arg Tyr Ala Arg Val Cys Phe Glu

145 150 155 160

Arg Phe Gly Asp Arg Val Lys His Trp Leu Thr Met Asn Glu Pro Trp

165 170 175

Cys Ile Ser Ile Leu Gly Tyr Gly Arg Gly Val Phe Ala Pro Gly Arg

180 185 190

Ser Ser Asp Arg Leu Arg Ser Ser Glu Gly Asp Ser Ser Arg Glu Pro

195 200 205

Trp Ile Ala Gly His Ser Val Ile Leu Ala His Ala Asn Ala Val Lys

210 215 220

Ala Tyr Arg Glu Glu Phe Lys Ala Lys Gln Gly Gly Gln Ile Gly Ile

225 230 235 240

Thr Leu Asn Gly Asp Trp Ala Met Pro Tyr Asp Asp Ser Pro Ala Asn

245 250 255

Ile Glu Ala Ala Gln His Ala Leu Asp Val Ala Ile Gly Trp Phe Ala

260 265 270

Asp Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Pro Ala Phe Met Lys Glu Met Leu

275 280 285

Gly Asp Arg Leu Pro Glu Phe Thr Gln Glu Glu Leu Ala Val Val Lys

290 295 300

Gly Ser Ser Asp Phe Tyr Gly Met Asn Thr Tyr Thr Thr Asn Leu Cys

305 310 315 320

Lys Ala Gly Gly Asp Asp Glu Phe Gln Gly His Val Glu Tyr Thr Phe

325 330 335

Thr Arg Pro Asp Gly Thr Gln Leu Gly Pro Gln Ala His Cys Ala Trp

340 345 350

Leu Gln Asp Tyr Ala Pro Gly Phe Arg Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Tyr

355 360 365

Lys Arg Tyr Arg Lys Pro Ile Tyr Val Thr Glu Asn Gly Phe Ala Val

370 375 380

Lys Asp Glu Asn Ser Met Thr Ile Glu Gln Ala Leu Lys Asp Asp Ala

385 390 395 400

Arg Val His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Asp Ala Leu Leu Asn Ala Val

405 410 415

Asn Glu Asp Gly Val Asp Val Arg Ala Tyr Phe Gly Trp Ser Leu Leu

420 425 430

Asp Asn Phe Glu Trp Ala Asp Gly Tyr Val Thr Arg Phe Gly Val Thr

435 440 445

Tyr Val Asp Tyr Glu Thr Gln Lys Arg Tyr Pro Lys Asp Ser Gly Lys

450 455 460

Phe Leu Ala Lys Trp Phe Lys Glu His Val Pro Ala Ala Glu Ala Glu

465 470 475 480

Ala Pro Lys Pro Val Val Val Val Glu Ala Ala Lys Pro Lys Pro Ile

485 490 495

Ser Asn Gly Lys Ala Pro Val Val Glu Gln Phe His Ile Glu Gln Ala

500 505 510

Gln Lys Gly Ala Ala Pro Leu Lys Lys Arg Lys Ala Pro Phe Ala Arg

515 520 525

Phe Thr Ala Tyr Val Ser Ala Phe Leu Gly Leu His His His His His

530 535 540

His

545

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctcgagaa aagaaaaaag caatccgcta ctacaac 37

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctctagatc agttgatgat agtagtgtca c 31

<210> 5

<211> 1581

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caatccgcta ctacaaccac tgcccctaag gacttcatct ggggtttcgc cactgcttcc 60

tttcagattg agggttctac cgacgttgac ggtagaggta agtccttttg ggacgacttc 120

tccagaactc caggaaagac cttggacggt agaaacggag acgtcgctac tgactcttac 180

aacagatggc gtgaggacct tgacttgttg tccgagtacg gtgtcaagtc ttaccgtttc 240

tccatcgcct ggtcccgtat cattcctctt ggtggtcgta acgacccagt caacgaggcc 300

ggtattaagt tttactctga cttgatcgac ggtttgttgg agagaggtat tactccattt 360

gttactttgt atcactggga tcttcctcag gctttacatg accgttactt gggatggttg 420

aacaaggagg aaattgttca ggactatgtc cgttacgccc gtgtttgctt cgaaagattc 480

ggtgacagag tcaagcactg gttgaccatg aacgagcctt ggtgcatttc catcttgggt 540

tacggaagag gagttttcgc cccaggtaga tcttctgaca gattgcgttc ctctgaggga 600

gattcctcca gagaaccttg gatcgctggt cactctgtca ttttggccca tgccaacgct 660

gttaaggctt accgtgagga gttcaaggcc aagcagggtg gacagatcgg aattactttg 720

aacggagact gggccatgcc atatgatgat tcccctgcta acatcgaagc tgctcagcac 780

gctttggatg ttgccattgg ttggttcgcc gaccctatct acttgggatc ttaccctgcc 840

ttcatgaagg agatgttggg agaccgtttg ccagagttca cccaggagga gttggctgtt 900

gttaagggtt cctctgattt ttatggtatg aatacttata ccactaactt gtgtaaggcc 960

ggtggagatg acgagtttca gggacatgtc gaatacacct tcaccagacc agacggtacc 1020

caattgggac ctcaagctca ttgtgcctgg ttgcaggatt acgctccagg tttcagagac 1080

ttgttgaatt acttgtacaa gagatacaga aagcctatct acgtcactga gaacggtttc 1140

gccgtcaagg acgagaactc tatgaccatt gaacaggctt tgaaggacga tgccagagtc 1200

cattattacg ccggtgtcac cgatgccttg ttgaacgccg ttaacgaaga cggtgtcgac 1260

gttcgtgctt acttcggttg gtcccttttg gacaacttcg aatgggccga cggttatgtc 1320

actcgtttcg gtgtcaccta cgtcgattac gagactcaaa aaagataccc taaggattct 1380

ggaaagtttt tggccaagtg gttcaaggaa catgttcctg ccgctgaggc tgaagctcca 1440

aagcctgttg ttgtcgttga ggccgctaag cctaaaccta tctccaacgg taaggctcca 1500

gtcgtcgagc aattccacat tgagcaggcc caaaagggag ccgctccact taagaagaga 1560

aaggccccat tcgcccgttt t 1581

<210> 6

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caatccgcta caactacaac caccgctcca aaggatttca tctggggctt cgccactgcg 60

agcttccaga ttgaaggttc aaccgacgtt gacggccgcg gaaagtcttt ctgggacgat 120

ttctcaagaa caccgggcaa gaccctcgat ggacgcaatg gcgacgtcgc cactgattcg 180

tataaccgct ggagggagga cctcgatctt ttgagcgaat acggtgtgaa gagctaccgt 240

ttctccatcg cctggtcaag aatcattccg ctcggtggtc gcaacgaccc cgtgaatgag 300

gctggaatca agttttactc agacctcatt gacggcttgc tcgagcgagg tattacccct 360

tttgtgactt tgtatcactg ggatcttcct caggcactcc acgaccgata cctcggctgg 420

ttgaataagg aagagatcgt acaggactac gttcgctatg cacgagtttg cttcgagcgt 480

ttcggtgacc gagtgaagca ctggcttact atgaacgagc cctggtgcat ttccatcttg 540

ggctacggcc gcggcgtctt cgctcccgga aggtccagtg accgtttgcg ctcgtccgaa 600

ggggattcct cgagagaacc ttggattgct ggacacagcg tcattctggc tcacgcaaac 660

gccgtcaagg cttatcgtga agaattcaag gcgaagcagg gtggtcaaat aggtatcacc 720

ctcaacggtg actgggcaat gccatatgac gacagtcccg caaatatcga agccgctcaa 780

catgcgctgg acgtcgctat cggttggttt gctgacccca tttatctcgg ctcgtacccg 840

gccttcatga aggaaatgtt gggagaccgg cttccggagt ttacccaaga ggaacttgcc 900

gtcgtaaagg gatcatccga cttctatggc atgaacacgt acaccaccaa cctttgcaag 960

gccggcggcg acgacgagtt ccagggacac gtcgaatata ccttcacccg accagacggt 1020

acacagctcg gtccgcaagc ccactgcgca tggcttcagg attatgctcc tggtttccga 1080

gacttgctta actacctata caaacgatac cgtaaaccga tctacgttac cgagaatggc 1140

tttgctgtca aggacgagaa ctccatgact atcgagcagg ccctcaagga cgatgctcgt 1200

gtgcactact acgctggtgt caccgacgcc ttgctcaacg ctgtcaacga ggacggcgtc 1260

gacgttcgcg catacttcgg atggagtctg ctcgataact ttgaatgggc tgacggatac 1320

gtcactcgct tcggtgttac ctacgtcgac tacgagaccc agaagcggta ccctaaagat 1380

tcaggaaagt tcttggcgaa gtggttcaag gagcacgtcc ccgcggctga ggctgaggcc 1440

cccaaacccg tcgttgtcgt cgaggctgcg aagcccaagc caatttccaa cggcaaggca 1500

cccgtcgtcg agcagtttca catcgagcaa gcgcagaagg gcgctgcacc actcaagaag 1560

agaaaggcac cgtttgcgcg tttt 1584

Claims

1.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因的序列为序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，所述空载体为pPICZαA载体。

2.一种乳糖酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因重组到pPICZαA载体中，经转化到毕赤酵母宿主菌细胞中并用1000μg/mL Zeocin的YPD平板筛选得到高Zeocin抗性的转化子；

2)将步骤1)所得的转化子用BMGY培养基培养至OD600为10～12，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1～2％，诱导1～3d，筛选高水平分泌表达乳糖酶的转化子；

3)高水平分泌表达乳糖酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，补加甲醇使其质量分数保持在1～2％。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤3)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含30mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含200mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液将目标蛋白洗脱下来即可。

4.根据权利要求2或3所述制备方法得到的蛋白在乳制品中乳糖的转化中的应用。