CN108085332B - 一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明通过设计如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，并将该序列化学合成后连接到pUC57‑simple载体上，然后亚克隆到pMIZY05v2表达载体上，构建重组载体pMIZY05v2‑oEp，经线性化后转化到解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株中，得到可表面展示重组豆壳过氧化物酶的工程菌，然后在含有血红素的PPB培养基中培养2～5d，离心收集细胞即得固定化重组豆壳过氧化物酶。利用通过简单离心收集菌体即可得到重组豆壳过氧化物酶，可以省去过氧化酶繁琐的分离纯化步骤，简化生产工艺，降低生产成本。

Description

一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建 方法与应用

技术领域

本发明涉及一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

过氧化物酶(peroxidase，EC 1.11.1.x)是一类广泛存在于动物、植物及微生物中的氧化还原酶，通常由一条肽链和血红素辅基构成(部分种类还含有Ca²⁺、Mn²⁺等其他金属离子)，能够以H₂O₂或过氧化有机物为电子受体催化多种底物的氧化反应。豆壳过氧化物酶(soybean hull peroxidase，ShP，EC 1.11.1.7)是一种从大豆(Glycine max)豆壳中提取获得的过氧化物酶，属于植物过氧化物酶超家族的第III类(分泌型过氧化物酶)，能以H₂O₂为电子受体催化氧化多种有机和无机底物。天然ShP分子量约40kDa，由304个氨基酸残基组成，等电点3.9，是一种酸性蛋白质。ShP脱辅基蛋白基因cDNA包含一个全长1056bp的开放阅读框，编码含有352个氨基酸残基的前体蛋白。前体蛋白翻译后经过多种修饰最终才能成为有功能的全酶，前体蛋白首先切除N-末端26个信号肽，然后暴露出来的N-末端谷氨酰胺残基环化成焦谷氨酸，之后经切除C-末端22个氨基酸残基的酶原肽(propeptide)、糖基化修饰、结合辅因子、二硫键形成后才能成为成熟的功能酶。糖基化修饰约占该酶总分子量的18％，对于蛋白维持构象和防止降解有重要作用。除血红素外结合位点外，该酶还带有2个Ca²⁺结合位点，对于维持酶的结构和活性具有重要作用。

在第III类植物过氧化物酶中，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)因其研究较早而为人所熟知，目前广泛应用于环保、食品添加剂、酶免疫技术、生物传感器等多种领域。与之相比，ShP具有热稳定好、pH适用范围广等多种优势，在多种领域可完全替代HRP而获得更广泛的应用。如美国American Qualex和Enzymol International公司已将ShP应用于病毒、细菌、寄生虫诊断试剂盒的生产。国内王炳全等利用ShP成功研制了H₂O₂检测生物传感器，具有响应时间短、检测灵敏度高、热稳定性好和耐储存等多种优点。ShP用于环保行业，可催化酚、胺等有毒物质的氧化解毒。目前，国外已经有公司将ShP应用于处理工业废水。ShP作为绿色食品添加剂可替代溴酸钾用于面粉中类胡萝卜素的脱色，并抑制蛋白质分解，缩短面粉的成熟期，赋予面粉更好的弹性和强度，在焙烤制品中获得了令人满意的效果。总之，ShP因其多种优点获得了市场青睐。

由于应用范围广、开发潜力大，ShP的生产备受业界关注。目前，ShP的生产主要有豆壳抽提法和工程菌发酵法两大类。抽提法的原材料主要是大豆加工的副产品——豆壳，虽然来源广泛、价格低廉，但是豆壳作为ShP的抽提原材料不易储存，且供给存在明显的季节性，难以满足长时间连续生产的需要。ShP抽提的流程主要有豆壳破碎和浸泡、回收滤液、硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换、亲和层析和疏水层析等，过程冗长，操作要求高产物回收率低。如Sessa等通过该法分离纯化ShP，回收率只有4％。文禹撷等人采用双水相金属螯合萃取分离纯化ShP，回收率虽然提高到95％，但操作繁琐，对试剂和操作要求极高。由于抽提法的种种弊端，微生物发酵法生产重组ShP受到越来越多的关注。用于生产重组ShP的平台主要有大肠杆菌(Escherichia coli)和酵母。E.coli表达系统是开发最早、应用最多、技术最成熟的开发平台，具有工艺简单、产量高、周期短等优点。然而，E.coli属于原核生物，分泌能力差，缺乏蛋白翻译后的修饰功能，胞内表达的ShP一般以无活性的包涵体形式出现。即便ShP胞内表达有活性，但因其催化氧化特性，胞内表达会对宿主细胞本身产生毒性，造成最终活性偏低。而且发酵产酶过程中需要添加异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)等昂贵的诱导剂。酵母是单细胞真核生物，具有营养要求低、遗传操作简单、安全可靠等优点，并且具有蛋白翻译后的修饰能力，适合表达结构相对复杂的蛋白质。某些种类，如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白分泌能力强，分泌的背景蛋白少，具有信号肽剪切、二硫键形成、蛋白糖基化和磷酸化修饰的能力，已被成功开发为商业化的蛋白表达系统。林剑辉等在巴斯德毕赤酵母中成功实现了ShP的分泌表达。但毕赤酵母分泌表达，需要使用剧毒易燃的甲醇做诱导剂，存在较大的安全隐患，而且分泌表达后仍需要复杂的分离纯化工艺。而另外一种常见的酵母表达系统，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)分泌能力差，且表达的蛋白一般存在超糖基化，影响重组酶的产量和活性。由此可见，目前天然ShP的生产过程中，原材料不易存贮、有季节性限制，且分离提纯操作繁琐、工艺复杂；工程菌生产重组ShP也存在活性低、生产成本高等缺点，均不适合大规模工业化生产。

发明内容

为解决现有技术中天然ShP分离纯化工艺复杂、胞内表达重组ShP无活性或活性低及对宿主细胞产生毒性、分泌表达ShP纯化困难的问题，本发明提供一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用，具体提供了染色体整合有序列优化的ShP基因并在细胞表面展示表达ShP的基因工程解脂耶罗威亚酵母菌(Yarrowialipolytica)并利用该工程菌发酵生产细胞表面固定化重组ShP，采用的技术方案如下：

本发明提供了一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

1)化学合成基因序列优化过的豆壳过氧化酶基因oEp，将其连接到克隆载体pUC57-simple中，得到豆壳过氧化物酶基因克隆质粒pUC57S-oEp；所述基因序列优化过的豆壳过氧化酶基因oEp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示或与SEQ ID NO.1的核苷酸序列具有80％至100％相似性；

2)采用限制性内切酶SfiI和BamHI对豆壳过氧化物酶基因克隆质粒pUC57S-oEp进行双酶切，回收豆壳过氧化酶基因片段，并连接到经同样双酶切消化的表面展示载体pMIZY05v2中，得到豆壳过氧化物表面展示质粒pMIZY05v2-oEp；

3)采用限制性内切酶NotI对豆壳过氧化酶表面展示质粒pMIZY05v2-oEp进行单酶切消化，电泳分离酶切产物，回收纯化大片段，并将其转化至解脂耶罗威亚酵母菌宿主细胞中，获得细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌。

优选地，所述表面展示载体pMIZY05v2带有糖基磷脂酰肌醇(glycosylphophatidylionositol，GPI)锚定序列。

优选地，步骤3)所述解脂耶罗威亚酵母宿主细胞为解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株。

本发明中解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)为尿嘧啶缺陷型菌株。

本发明还提供了一种按照上述构建方法构建的细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌株。

本发明还提供了一种上述细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌在发酵生产豆壳过氧化物酶中的应用。

优选地，所述应用是将细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌接种于含有血红素的液体培养基中培养，离心获得表面展示有有豆壳过氧化物酶的重组酵母细胞，即得固定化的重组豆壳过氧化物酶。

优选地，所述培养是在20～30℃、150～250rpm的条件下振荡培养2～5d。

优选地，所述含有血红素的液体培养基中血红素的终浓度为10μM。

优选地，所述含有血红素的液体培养基为添加有血红素的PPB培养基，所述PPB培养基包括如下组分：蔗糖或甘油20g/L，酵母浸粉1.32g/L，KH₂PO₄ 0.32g/L，NH₄Cl 1.32g/L，MgSO₄ 0.132g/L，盐酸硫胺素0.334mg/L，在使用时加入1/10000体积的0.1M氯化血红素溶液使其终浓度为10μM。

本发明还提供了一种固定化豆壳过氧化物酶，该豆壳过氧化物酶通过GPI锚定以共价结合的方式固定于重组酵母细胞表面；所述重组酵母细胞按照上述方法构建。

本发明中的表面展示载体pMIZY05v2可以将连接到其多克隆位点的外源基因，以表面展示的方式表达在细胞表面。

本发明豆壳过氧化物酶来源于大豆，未经加工的脱辅基蛋白分子，N-端带有26个氨基酸残基组成的信号肽，C-端带有20个氨基酸组成的酶原肽，成熟豆壳过氧化物酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，根据成熟肽序列和宿主对表达外源蛋白的要求，通过电脑辅助设计核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，将上述核苷酸序列化学合成后连接到pUC57-simple载体上，然后亚克隆到pMIZY05v2表达载体上，构建了重组载体pMIZY05v2-oEp，经线性化后转化到解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株中，得到了可表面展示重组豆壳过氧化物酶的工程菌，然后在含有血红素的PPB培养基中培养2～5d，离心收集细胞即得固定化重组豆壳过氧化物酶。

本发明有益效果：

1、现有技术生产ShP主要从豆壳中分离纯化或者利用工程菌在胞内表达或者分泌表达重组蛋白。从豆壳中分离ShP的过程存在原材料不易存贮、有季节性限制、提纯操作繁琐、工艺复杂等缺点；胞内表达ShP存在重组ShP蛋白无活性或者重组ShP蛋白有活性但对宿主有细胞毒性、总活性低的问题；分泌表达蛋白存在活性低、分离纯化困难的问题。因此，以上方法均不能用于大规模工业生产。本发明提供了一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌的构建方法，通过该方法可以获得细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌，该方法首次构建了能够在细胞表面展示表达豆壳过氧化物酶的菌株，克服了现有技术中天然ShP分离纯化困难、胞内表达ShP无活性或活性低及对宿主细胞产生毒性的问题，利用本发明方法获得的细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌，发酵培养后，在获得菌株的同时即可获得重组ShP，克服了分泌表达ShP分离纯化操作繁琐的问题。

2、本发明细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌所生产的ShP活性较高，可高达4185U/mL，而现有技术中报道的重组ShP最高酶活仅510U/mL。

3、利用本发明的构建方法获得的细胞表面固定有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌株在廉价的培养基中通过简单的发酵即可获得大量固定在酵母细胞表面的重组豆壳过氧化物酶，菌株发酵结束后，通过简单离心收集菌体即可得到重组豆壳过氧化物酶，可以省去过氧化酶繁琐的分离纯化步骤，简化生产工艺，降低生产成本。并且该酵母工程菌株营养要求简单，便于大规模培养。

4、本发明所用的表面展示载体pMIZY05v2在转化宿主酵母细胞前，采用酶切消化去掉了细菌源序列，可防止抗性基因在环境中的传播。此外，该载体采用生长期依赖强启动子——hp4d启动外源蛋白的表达，与宿主解脂耶罗威亚酵母配合，宿主细胞生长到指数生长期后期时即可启动重组蛋白的大量表达，无须添加额外的诱导剂，克服了重组酶生产过程中添加IPTG、甲醇等或昂贵或有毒诱导剂的问题。

附图说明

图1是pMIZY05v2分泌表达载体质粒图谱。

图2是序列优化豆壳过氧化物酶基因克隆质粒图谱。

图3是豆壳过氧化物酶表面展示重组质粒图谱。

图4是固定化豆壳过氧化物酶催化ABTS变色。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明以及创新之处。所列出的实施例仅用于具体说明本发明而非对本发明的进一步限定，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

以下实施例中，除非特别说明，均为常规实验方法。

生物材料来源：

大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；

解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株，由法国国家农业研究所馈赠。

以下实施例中用到的培养基及其他溶液配制方法如下(如无特别说明百分比均指重量体积比)：

LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％。制作固体培养基时，额外加入1.5％的琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。使用时，可加入适当浓度的抗生素。

YPD培养基：蛋白胨2％，酵母浸粉1％，葡萄糖2％。制作固体培养基时，额外加入1.5％的琼脂。115℃高压蒸汽灭菌30min。

YNB-N₅₀₀₀培养基：无氨基酸酵母氮源(不含硫酸铵)0.17％，硫酸铵0.5％，葡萄糖1％，3种成分混合溶解后，用0.22μm膜过滤除菌。制作固体培养基时，琼脂单独灭菌，冷却至50℃后，加入以上溶液，使琼脂终浓度为2％。

PPB培养基：蔗糖或甘油20g/L，酵母浸粉1.32g/L，KH₂PO₄ 0.32g/L，NH₄Cl 1.32g/L，MgSO₄ 0.132g/L，盐酸硫胺素0.334mg/L，溶解于20mM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)。115℃高压蒸汽灭菌30min。使用时加入1/10000体积的0.1M氯化血红素溶液(终浓度为10μM)。

TE缓冲液：(1)1M Tris-HCl(pH 8.0)的配制：称取6.057g Tris-base，加入40mL超纯水溶解，滴加浓HCl约2.1mL，调节pH 8.0，定容至50.0ml，高压灭菌，室温保存；(2)0.5MEDTA(pH 8.0)50.0mL的配制：称取9.306g EDTA-Na₂·2H₂O，加入超纯水35mL，剧烈搅拌，用约1g NaOH颗粒调节pH 8.0，定容至50.0mL；(3)1×TE：取1.0mL 1M Tris-HCl(pH 8.0)、0.5mL0.5M EDTA(pH 8.0)，加入超纯水，定容至1.0L，高压蒸汽灭菌，室温保存。

0.1M LiAc溶液：称取1.02g LiAc·2H₂O溶于80mL超纯水中，用冰醋酸调节pH6.0，加超纯水定容至100.0mL，高压蒸汽灭菌，室温保存。

40％(w/v)PEG 4000溶液：称取2.0g PEG 4000，溶于3mL 0.1M LiAc中，60℃加热溶解，冷却后定容至5.0mL，0.22μm无菌滤器过滤除菌，-20℃保存。

1M DTT溶液：称取1.542g二硫苏糖醇，溶于8mL超纯水中，定容至10.0mL，0.22μm无菌滤器过滤除菌，-20℃保存。

0.1M氯化血红素溶液：称取6.52g氯化血红素，溶于80mL超纯水中，定容至100.0mL，分装成小管，-20℃保存。

1M NaOH溶液：称取8.0g NaOH，溶于160mL超纯水中，定容至200.0mL。

0.2M磷酸缓冲液(pH 6.0)：称取31.2g NaH₂PO₄·2H₂O，于800mL超纯水中，用1MNaOH溶液调节pH6.0，定容至1000.0mL，4℃保存。

0.5mM ABTS溶液：称取0.28g ABTS[2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐，Diammonium 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)，ABTS]，溶于800mL 0.2M磷酸缓冲液中，定容至1000.0mL，4℃保存。

H₂O₂稀释液：取0.1mL 30％的H₂O₂溶液，梯度稀释3000倍，现配现用。

实施例1

豆壳过氧化物酶表面展示质粒构建，步骤如下：

设计如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，送第三方公司合成并克隆到pUC57-simple载体上，获得pUC57S-oEp质粒(质粒图谱如图2所示)，经SfiI/BamHI限制性内切酶消化后，回收目的片段，连接到经相同酶消化的pMIZY05v2表达载体(质粒图谱如图1所示)上。

SEQ ID NO.1(下划线部分分别为SfiI和BamHI限制性酶切位点)：

GTGGCCGTTCTGGCCCAGCTGACCCCCACCTTCTACCGAGAGACCTGTCCCAACCTGTTCCCCATCGTGTTCGGCGTCATTTTCGACGCCTCTTTCACCGACCCCCGAATCGGAGCTTCCCTGATGCGACTGCACTTCCACGACTGTTTCGTGCAGGGTTGCGACGGCTCTGTCCTGCTGAACAACACCGACACCATCGAGTCTGAGCAGGACGCCCTGCCCAACATCAACTCCATTCGAGGACTGGACGTGGTCAACGACATTAAGACCGCTGTGGAGAACTCTTGTCCCGACACCGTCTCCTGCGCCGACATCCTGGCTATTGCCGCTGAGATCGCTTCTGTGCTGGGTGGAGGTCCCGGATGGCCCGTCCCTCTGGGTCGACGAGACTCCCTGACCGCCAACCGAACCCTGGCTAACCAGAACCTGCCCGCTCCCTTCTTCAACCTGACCCAGCTGAAGGCCTCTTTCGCTGTGCAGGGACTGAACACCCTGGACCTGGTCACCCTGTCCGGTGGACACACCTTCGGTCGAGCTCGATGTTCTACCTTCATTAACCGACTGTACAACTTCTCCAACACCGGAAACCCCGACCCCACCCTGAACACCACCTACCTGGAGGTCCTGCGAGCTCGATGCCCTCAGAACGCTACCGGCGACAACCTGACCAACCTGGACCTGTCTACCCCCGACCAGTTCGACAACCGATACTACTCCAACCTGCTGCAGCTGAACGGTCTGCTGCAGTCTGACCAGGAGCTGTTCTCCACCCCTGGTGCTGACACCATCCCTATTGTGAACTCCTTCTCTTCCAACCAGAACACCTTCTTCTCTAACTTCCGAGTGTCCATGATCAAGATGGGAAACATTGGTGTCCTGACCGGCGACGAGGGAGAGATTCGACTGCAGTGCAACTTCGTGAACGGTGACTCTTTCGGCCTGGCCTCTGTCGCTTCCAAGGACGCCAAGCAGAAGCTGGTGGCTCAGTCCAAGGGATCC

质粒酶切体系如表1-2所示：

表1 pUC57S-oEp质粒酶切体系

表2 pMIZY05v2载体酶切体系

上述反应体系，37℃、50℃先后温育1h。琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段。

连接，体系如表3所示：

表3连接体系

上述反应体系，16℃温育1h。

取5.0μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，步骤如下：

(1)从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，置于冰上解冻。

(2)加入5.0μL DNA连接溶液，轻轻摇匀，冰浴30min。

(3)42℃水浴中热激90s，迅速置于冰上冷却3min。

(4)向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1h。

(5)将上述菌液涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃静置培养14～16h。

挑取单菌落，转接于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养14h，提取质粒，经SfiI/BamHI双酶切验证无误后即得耐热β-淀粉酶-海藻糖合成酶融合酶分泌表达重组质粒pMIZY05v2-oEp，质粒图谱如图3所示。

实施例2

重组菌株的获得，步骤如下：

(1)重组片段制备将pMIZY05v2-oEp重组质粒采用NotI限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳检测。pMIZY05v2-oEp经酶切后预期出现两条片段，大小分别为4.5kbp和2.7kbp。重组载体NotI酶切消化电泳结果如图3所示，两片段与预期一致。回收大片段，备用

(2)酵母感受态细胞制备将解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株接种到YPD固体培养基上，28℃培养过夜；挑取单菌落接种于5.0mL液体YPD培养基中，28℃振荡培养过夜；以终浓度5.0×10⁶cells/mL接种于50.0mL液体YPD培养基中，在28℃条件下，转速200rpm振荡培养4h；4℃条件下，1500×g离心5min收集细胞，用25.0mL TE溶液洗涤菌体2次；重悬细胞于1.0mL TE中，10000×g离心10s，弃上清；重悬细胞于600.0μL 0.1M LiAc(pH 6.0)中，28℃水浴静置孵育1h；1500×g离心2min，弃上清，轻轻悬浮细胞于80.0～120.0μL LiAc中，此细胞悬液即为感受态细胞。

(3)酵母细胞转化取40.0μL感受态细胞，加入2.0μL鲑鱼精DNA、3.0μL回收的重组载体DNA，28℃水浴静置15min；加入360.0μL 40％的PEG 4000、16.0μL 1M的DTT，28℃静置水浴1h；加入40.0μL DMSO，39℃水浴10min；加入600.0μL 0.1M LiAc，混合均匀，涂布于5个选择性(YNB-N₅₀₀₀)平板上，28℃静置培养2～3d。

(4)长出的菌落即为重组菌株，提取单菌落在YNB-N₅₀₀₀平板上划线纯化。

实施例3

重组菌株产固定化酶能力验证，步骤如下：

(1)挑取重组酵母单菌落接种于5.0mL YPD液体培养基中，28℃振荡培养过夜，此为种子液。

(2)取1.0mL种子液，转接于50.0mL PPB培养基中，25℃振荡培养3～5d，所得发酵液即为粗酶液。

(3)ABTS法检测粗酶液中ShP活性，颜色越深活性越高，由此筛选高活性菌株。对于颜色较深的，测定ShP活性具体值，反应液体系如下：

在35℃、pH6.0条件下下温育5min，反应后颜色变化如图4所示(绿色)。测定颜色较深的420nm吸光度值的变化，通以下过公式计算酶活，其中酶活力单位定义为1min内转化1μM底物所需的酶量。

N：粗酶液稀释倍数；ΔA：420nm吸光度值的变化；Vt：反应总体积，本实验取2mL；ε：ABTS的摩尔吸光值，3.6×10⁴L·M^-1·cm^-1；d：比色杯厚度，此处取1cm；Ve：酶液体积，此处取0.1mL；T：反应时间，此处取5min。

最后得到一株编号为CM05B的转化子，其重组豆壳过氧化物酶活性可达4185U/mL。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 基因序列优化过的豆壳过氧化酶基因oEp

<400> 1

gtggccgttc tggcccagct gacccccacc ttctaccgag agacctgtcc caacctgttc 60

cccatcgtgt tcggcgtcat tttcgacgcc tctttcaccg acccccgaat cggagcttcc 120

ctgatgcgac tgcacttcca cgactgtttc gtgcagggtt gcgacggctc tgtcctgctg 180

aacaacaccg acaccatcga gtctgagcag gacgccctgc ccaacatcaa ctccattcga 240

ggactggacg tggtcaacga cattaagacc gctgtggaga actcttgtcc cgacaccgtc 300

tcctgcgccg acatcctggc tattgccgct gagatcgctt ctgtgctggg tggaggtccc 360

ggatggcccg tccctctggg tcgacgagac tccctgaccg ccaaccgaac cctggctaac 420

cagaacctgc ccgctccctt cttcaacctg acccagctga aggcctcttt cgctgtgcag 480

ggactgaaca ccctggacct ggtcaccctg tccggtggac acaccttcgg tcgagctcga 540

tgttctacct tcattaaccg actgtacaac ttctccaaca ccggaaaccc cgaccccacc 600

ctgaacacca cctacctgga ggtcctgcga gctcgatgcc ctcagaacgc taccggcgac 660

aacctgacca acctggacct gtctaccccc gaccagttcg acaaccgata ctactccaac 720

ctgctgcagc tgaacggtct gctgcagtct gaccaggagc tgttctccac ccctggtgct 780

gacaccatcc ctattgtgaa ctccttctct tccaaccaga acaccttctt ctctaacttc 840

cgagtgtcca tgatcaagat gggaaacatt ggtgtcctga ccggcgacga gggagagatt 900

cgactgcagt gcaacttcgt gaacggtgac tctttcggcc tggcctctgt cgcttccaag 960

gacgccaagc agaagctggt ggctcagtcc aagggatcc 999

<210> 2

<211> 304

<212> PRT

<213> 豆壳过氧化物酶的氨基酸序列

<400> 2

Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Arg Glu Thr Cys Pro Asn Leu Phe Pro

1 5 10 15

Ile Val Phe Gly Val Ile Phe Asp Ala Ser Phe Thr Asp Pro Arg Ile

20 25 30

Gly Ala Ser Leu Met Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Gln Gly

35 40 45

Cys Asp Gly Ser Val Leu Leu Asn Asn Thr Asp Thr Ile Glu Ser Glu

50 55 60

Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile Asn Ser Ile Arg Gly Leu Asp Val Val

65 70 75 80

Asn Asp Ile Lys Thr Ala Val Glu Asn Ser Cys Pro Asp Thr Val Ser

85 90 95

Cys Ala Asp Ile Leu Ala Ile Ala Ala Glu Ile Ala Ser Val Leu Gly

100 105 110

Gly Gly Pro Gly Trp Pro Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Thr

115 120 125

Ala Asn Arg Thr Leu Ala Asn Gln Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Asn

130 135 140

Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ser Phe Ala Val Gln Gly Leu Asn Thr Leu

145 150 155 160

Asp Leu Val Thr Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Arg Ala Arg Cys

165 170 175

Ser Thr Phe Ile Asn Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Asn Pro

180 185 190

Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Glu Val Leu Arg Ala Arg Cys

195 200 205

Pro Gln Asn Ala Thr Gly Asp Asn Leu Thr Asn Leu Asp Leu Ser Thr

210 215 220

Pro Asp Gln Phe Asp Asn Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Leu Gln Leu Asn

225 230 235 240

Gly Leu Leu Gln Ser Asp Gln Glu Leu Phe Ser Thr Pro Gly Ala Asp

245 250 255

Thr Ile Pro Ile Val Asn Ser Phe Ser Ser Asn Gln Asn Thr Phe Phe

260 265 270

Ser Asn Phe Arg Val Ser Met Ile Lys Met Gly Asn Ile Gly Val Leu

275 280 285

Thr Gly Asp Glu Gly Glu Ile Arg Leu Gln Cys Asn Phe Val Asn Gly

290 295 300

Claims (6)

1.一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株在发酵生产豆壳过氧化物酶中的应用，其特征在于，所述应用的方法包括：

(1)构建细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株；所述豆壳过氧化酶基因oEp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(2)将步骤(2)得到的细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株接种于含有10μM血红素的液体培养基中培养，离心获得表面展示有有豆壳过氧化物酶的重组酵母细胞，即得固定化的重组豆壳过氧化物酶。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述构建方法包括以下步骤：

1)化学合成基因序列优化过的豆壳过氧化酶基因oEp，将其连接到克隆载体pUC57-simple中，得到豆壳过氧化物酶基因克隆质粒pUC57S-oEp；所述基因序列优化过的豆壳过氧化酶基因oEp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2)采用限制性内切酶SfiI和BamHI对豆壳过氧化物酶基因克隆质粒pUC57S-oEp进行双酶切，回收豆壳过氧化酶基因片段，并连接到经同样双酶切消化的表面展示载体pMIZY05v2中，得到豆壳过氧化物表面展示质粒pMIZY05v2-oEp；

3)采用限制性内切酶NotI对豆壳过氧化酶表面展示质粒pMIZY05v2-oEp进行单酶切消化，电泳分离酶切产物，回收纯化大片段，并将其转化至解脂耶罗威亚酵母宿主细胞中，经发酵培养后，获得细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述培养是在20℃～30℃、150rpm～250rpm的条件下振荡培养2d～5d。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述含有血红素的液体培养基为添加有血红素的PPB培养基，所述PPB培养基包括如下组分：蔗糖或甘油20g/L，酵母浸粉1.32g/L，KH₂PO₄ 0.32 g/L，NH₄Cl 1.32g/L，MgSO₄ 0.132 g/L，盐酸硫胺素0.334mg/L，在使用时加入1/10000体积的0.1M氯化血红素溶液使其终浓度为10μM。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述构建方法表面展示载体pMIZY05v2带有糖基磷脂酰肌醇GPI锚定序列。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤3)所述解脂耶罗威亚酵母宿主细胞为解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株。

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