CN102803491A - 用于在酵母细胞表面上展示多肽的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文中提供了用于在酵母细胞的表面上展示多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）的方法和组合物。可以与本文中公开的各种方法和组合物联合使用的例示性酵母包括耶氏酵母属(Yarrowia)的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

Description

用于在酵母细胞表面上展示多肽的方法和组合物

发明领域

本文中提供了用于在酵母的细胞表面上展示多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）的方法和组合物。可以与本文中公开的各种方法和组合物联合使用的例示性酵母包括耶氏酵母属(Yarrowia)的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

发明背景

高亲和力试剂，例如抗体或其片段对于临床和研究应用两者都是有用的工具。许多体外和体内平台已经用于分离和表征抗体，包括核糖体展示、噬菌体展示、和大肠杆菌(E.coli)中的周质表达。已经使用的另一种平台是是酵母细胞表面展示(YSD)。

用于在耶氏酵母属菌株的细胞表面上展示抗体及其片段的组合物和方法会是有利的。

发明概述

本文中提供了用于在酵母细胞的表面上展示多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）的方法和组合物。可以与本文中公开的各种方法和组合物联合使用的例示性酵母包括耶氏酵母属的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母。

在某些实施方案中，本文中提供的组合物包含表达盒，所述表达盒包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含与第二核酸序列以符合读码框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，本文中提供的组合物包含表达盒，所述表达盒包含与第一核酸序列可操作连接的启动子，所述第一核酸序列包含编码锚多肽的锚核苷酸序列，其中所述第一核酸序列可以在融合多肽中作为第一融合配偶体表达，所述融合多肽包含由第二核酸序列编码的感兴趣的第二融合配偶体。在某些实施方案中，表达盒进一步包含编码所述感兴趣的第二融合配偶体的第二核酸序列，例如，整个或部分的限制性位点。在某些实施方案中，所述感兴趣的第二融合配偶体包含抗体多肽或抗体多肽片段。在某些实施方案中，抗体多肽片段是scFv片段、Fab片段的重链、或Fab片段的轻链。

在某些实施方案中，在第二核酸序列3’融合表达盒的第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗体多肽或抗体多肽片段和C端锚多肽。在某些实施方案中，在第二核酸序列5’融合表达盒的第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端抗体多肽或抗体多肽片段。

在某些实施方案中，表达盒包含组成性启动子。在某些实施方案中，表达盒包含诱导型启动子，例如，POX2或LIP2启动子。在某些实施方案中，表达盒包含半诱导型启动子，例如ph4d启动子。

在某些实施方案中，表达盒包含前导核酸序列，所述的前导核酸序列包含编码前导多肽的核苷酸序列，其中在所述第一和第二核酸序列的5’以符合读码框的方式融合所述前导核酸序列。例示性的前导核酸序列包括但不限于前LIP2(LIP2 pre)、前原LIP2(LIP2 prepro)、前XPR2(XPR2 pre)、和前原XPR2(XPR2 prepro)。

在某些实施方案中，表达盒包含接头核酸序列，所述接头核酸序列包含编码接头多肽的核苷酸序列。例如，所述接头核酸序列可以在所述第一和第二核酸序列间以符合读码框的方式融合。在某些实施方案中，所述抗体多肽包含scFv抗体多肽，且所述接头核酸序列在编码所述scFv多肽的可变区的重链核酸序列和编码可变区的轻链核酸序列间以符合读码框的方式融合。接头多肽的非限制性例子包括(Gly4Ser)₃或(GlySer)₅。

在某些实施方案中，表达盒包含一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列包含编码一种或多种表位标签的核苷酸序列。例示性的表位标签包括但不限于c-Myc、V5、六组氨酸、谷胱甘肽-S-转移酶、链霉亲合素、生物素、血凝素、Flag标签、和E标签。

在某些实施方案中，表达盒包含锚多肽。锚多肽的非限制性例子包括Aga1p多肽或其片段、Aga2p多肽或其片段、和Sag1p多肽或其片段。

在某些实施方案中，表达盒包含抗体多肽或抗体多肽片段、锚多肽、或这两者，其经密码子优化以在耶氏酵母属细胞中表达。

在某些实施方案中，本文中提供的组合物包含一种载体，其包含上文描述的任何表达盒。在某些实施方案中，载体包含捷塔（zeta，ζ）元件。例示性的捷塔元件包括但不限于反转录转座子的长末端重复，诸如例如Ylt1或Tyl6反转录转座子。在某些实施方案中，载体包含一种或多种常染色体复制元件，例如，包含着丝粒(CEN)和复制起点(ORI)的常染色体复制元件。例示性的着丝粒包括但不限于CEN1和CEN3。例示性的复制起点包括但不限于ORI1068或ORI3018。在某些实施方案中，载体包括自主复制序列(ARS)，其包含着丝粒和复制起点。例示性的ARS包括但不限于ARS18和ARS68。在某些实施方案中，载体包含一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列包含编码一种或多种选择标志的核苷酸序列。选择标志的非限制性例子包括LEU2、URA3d1、ADE2、Lys、Arg、Gut、Trp、G3p、和hph。

在某些实施方案中，本文中提供的方法包括用于在耶氏酵母属细胞的表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段的方法。例如，可以如下在耶氏酵母属细胞的表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段，即将第一载体导入第一耶氏酵母属细胞中，所述第一载体包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含与第二核酸序列以符合读码框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列，并将所述第一耶氏酵母属细胞在耶氏酵母属细胞操作条件下温育一段时间。例示性的第一载体包括但不限于上文描述的任何载体。在某些实施方案中，抗体多肽片段是scFv片段、Fab片段的重链、或Fab片段的轻链。在某些实施方案中，方法可以包括将第二载体导入所述第一耶氏酵母属细胞中，所述第二载体包含与编码Fab片段轻链或Fab片段重链的核酸序列可操作连接的第二启动子。在某些实施方案中，第一耶氏酵母属细胞是单倍体，且导入所述第二载体的步骤包括将包含第一载体的第一单倍体耶氏酵母属细胞与包含第二载体的第二单倍体耶氏酵母属细胞交配，所述第一和第二耶氏酵母属细胞是相反交配型的。

在某些实施方案中，在第二核酸序列5’融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗体多肽或其抗体多肽片段和C端锚多肽。在某些实施方案中，在第二核酸序列3’融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端抗体多肽或抗体多肽片段。

在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包含低诱导温度，例如，约15摄氏度和25摄氏度间的温度。非限制性的低诱导温度包括约20摄氏度的温度。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包括短诱导时间，例如，约24小时或更少、约16小时或更少、或约16小时。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包括低pH，例如，约2和约4间的pH，或约3的pH。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包括高通气条件，例如，在摇瓶中温育。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包括在极限培养基，例如，缺乏酵母提取物、细菌用蛋白胨、或这两者的培养基中温育。

在某些实施方案中，将第一载体整合入耶氏酵母属基因组中。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞表达蛋白伴侣，例如，蛋白质二硫键异构酶，和/或Kar2/Bip。

在某些实施方案中，本文中提供的组合物包含通过上文描述的任何方法获得的抗体多肽或抗体多肽片段。

在某些实施方案中，提供了选择包含结合靶多肽的抗体多肽或抗体多肽片段的耶氏酵母属细胞的方法。例如，可以如下选择包含结合靶多肽的抗体多肽或抗体多肽片段的耶氏酵母属细胞，即提供在其表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段的亲本耶氏酵母属细胞(例如，通过上文描述的任何方法生成的耶氏酵母属细胞)，使所述亲本耶氏酵母属细胞与测试多肽接触，并且如果所述展示的抗体多肽或抗体多肽片段结合所述靶多肽，那么选择所述亲本耶氏酵母属细胞。在某些实施方案中，此类方法包括自所述选定的亲本耶氏酵母属细胞分离所述抗体多肽或抗体多肽片段的第一表达盒，在编码所述抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列中引入一处或多处变化以生成经修饰的表达盒，将所述经修饰的表达盒导入缺乏所述第一表达盒的第二耶氏酵母属细胞中以生成经修饰的耶氏酵母属细胞，将所述经修饰的耶氏酵母属细胞在耶氏酵母属细胞操作条件下温育一段时间，将所述经修饰的耶氏酵母属细胞与所述靶多肽接触，并且如果所述经修饰的耶氏酵母属细胞以比所述亲本耶氏酵母属细胞更大的亲和力或亲合力结合所述靶多肽，那么选择所述经修饰的耶氏酵母属细胞。

在某些实施方案中，本文中提供了试剂盒。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包含表达盒，诸如上文描述的任何表达盒。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包含载体，诸如上文描述的任何载体。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包含耶氏酵母属细胞。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包含关于使用表达盒、载体、或这两者的书面用法说明书。

除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。本文中描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域中已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和例子仅是例示性的，而并不意图为限制性的。通过提及而完整收录本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它参考文献。在矛盾的情况中，应以本说明书，包括定义为准。

从以下发明详述和附图，及从权利要求书看，本发明的其它特征和优点会是显而易见的。

附图简述

图1是用于scFv和Fab片段的解脂耶氏酵母展示的表达质粒和表达盒的图示。图1A显示用于随机整合的耶氏酵母属表达质粒的构件和图。靶基因的表达由诱导型pPOX2启动子驱动。不同转化标志物可用于容许创建完全互补的菌株(Leu2,Ade2,Ura3)。使用此质粒作为模板来克隆不同抗体片段。图1B显示用于AGA1、scFv片段和Fab片段轻链ck1域的可溶性表达的表达盒。使用显示的限制性位点将合成的盒克隆入耶氏酵母属表达质粒中。可以将轻链可变域分开克隆入所得的质粒中，创建含有轻链可变区(VL)和轻链恒定区的全长Fab轻链片段(VL-Ck1)的展示质粒。图1C显示使用显示的限制性位点克隆入耶氏酵母属表达质粒中的scFv抗体片段。生成总共4种合成构建体，其容许以不同融合模式并使用不同锚定分子锚定。图1D显示使用显示的限制性位点克隆入耶氏酵母属表达质粒中的Fab CH1抗体片段（含有重链恒定区CH1域的Fab片段）。生成总共4种合成构建体，其容许以不同融合模式并使用不同锚定分子锚定。可以将重链可变域分开克隆入所得的质粒中，创建由VH和重链恒定区CH1域构成的全长Fab重链(VH-CH1)的展示质粒。图1E显示就像它们会在解脂耶氏酵母细胞表面上表达那样自scFv和Fab片段之每种及其合适的锚多肽表达的各种多肽的共转化策略和图示。

图2是一系列一维荧光流式细胞术(FFC)直方图，其描绘了对于FALCON和摇瓶(SF)培养物(86%)两者在极限补充培养基(MM)和丰富培养基(RM)中于20°C诱导20小时的解脂耶氏酵母细胞中加有c-Myc标签的scFv表达。还将细胞在MM中于28°C在摇瓶中培养。顶部小图显示加有c-Myc标签的scFv片段的FFC直方图，而底部小图显示表达完全大小单克隆赫赛汀抗体的菌株1T2的FFC直方图。检测荧光，如下文实施例1中所描述的。加阴影的直方图显示自身荧光（阴性对照），而实线代表c-myc表达。

图3是一系列一维FFC直方图，其描绘了诱导不同时间量的解脂耶氏酵母细胞中加有c-Myc标签的scFv表达。直方图描绘了诱导时间对加有c-Myc标签的scFv在解脂耶氏酵母细胞中表面展示水平的影响。将细胞培养16、20、24、32和43小时。表达c-Myc的细胞的相对比例随诱导时间延长而降低（24小时后的54%、32小时后的19%、和43小时后的7%）。检测荧光，如实施例1中所描述的。加阴影的直方图显示自身荧光（阴性对照），而实线代表c-myc表达。

图4是一系列一维FFC直方图，其描绘了pH对加有c-Myc标签的scFv在解脂耶氏酵母细胞中表面展示水平的影响。将细胞于pH 6.8、pH 5和pH3培养24小时（顶部小图）和32小时（底部小图）。左侧小图显示不在其表面上表达scFv的细胞的背景荧光。右侧小图显示在其表面上表达scFv的细胞的荧光。检测荧光，如实施例1中所描述的。

图5是一系列一维FFC直方图，其描绘了两种不同加有c-Myc标签的scFv片段的表面表达：4-4-20scFv（在“4-4-20scFv”标记下的图）和赫赛汀scFv（在“赫赛汀scFv”标记下的图）。创建总共4种展示质粒，其容许以与酿酒酵母(S.cerevisiae)Sag1p的C端部分（320个C端AA；标记为“A1”的行中的直方图）的N端融合物、与酿酒酵母Aga2p的N端融合物（标记为“A2”的行中的直方图）、与解脂耶氏酵母CwpIp的C端部分（110个C端AA）的N端融合物（标记为“A3”的行中的直方图）和与Aga2p的C端融合物（标记为“A4”的行中的直方图）展示scFv片段。scFv片段能够结合抗原（标记为“配体结合”的栏中的小图）。对于配体结合检测，用链霉亲合素-藻红蛋白检测生物素化的抗原。检测荧光，如实施例1中所描述的。对于每幅图，加阴影的直方图代表自身荧光（阴性对照）。实线代表c-myc表达或配体结合，如每栏上方标示的。

图6是表达加有c-Myc标签的4-4-20scFv融合蛋白（图6A）或加有c-Myc标签的4-4-20重和轻链融合蛋白（图6B）的细胞的一系列免疫荧光显微图。通过用抗c-Myc抗体染色检测表达。

图7是一系列一维FFC直方图，其描绘了两种不同加有c-Myc标签的Fab片段的表面表达：4-4-20Fab（在“4-4-20Fab”题目下的直方图）和赫赛汀Fab（在“赫赛汀Fab”题目下的直方图）。创建总共4种展示质粒，其容许以与酿酒酵母Sag1p的C端部分（320个C端AA）的N端融合物（标记为“A1”的行中的直方图）、与酿酒酵母Aga2p的N端融合物（标记为“A2”的行中的直方图）、与解脂耶氏酵母CwpIp的C端部分（110个C端AA）的N端融合物（标记为“A3”的行中的直方图）和与Aga2p的C端融合物（标记为“A4”的行中的直方图）展示Fab重链片段。Fab轻链以可溶性片段表达。检测重链(HC)和轻链(LC)表达。对于配体结合检测，用链霉亲合素-藻红蛋白检测生物素化的抗原。检测荧光，如实施例1中所描述的。对于每幅图，加阴影的直方图代表自身荧光（阴性对照）。实线代表c-myc表达（指示锚定的重链片段表达）、V5表达（指示轻链表达）或配体结合，如每栏上方标示的。

图8是一系列一维FFC直方图，其描绘了赫赛汀Fab的表面表达。重链是与酿酒酵母Aga2p的N端融合物。可溶性表达轻链。个别检测重链(HC)和轻链(LC)（分别标记为“HC”和“LC”的行中的直方图）。使用二色FACS分析的HC和LC的同时标记（标记为“HC+LC”的行中的直方图）表明这两条链在各个酵母细胞表面上配对。检测荧光，如实施例1中所描述的。加阴影的直方图代表自身荧光（阴性对照），而实线代表HC或LC表达，如标示的。

图9是一对柱形图，其描绘了蛋白伴侣对Her-scFv和Her-Fab表达的影响。WT=野生型。TEF PD=在TEF启动子控制下表达的PDI（蛋白质二硫键异构酶）。POX2HACI=在POX2启动子控制下表达的HACI，即一种诱导UPR（解折叠蛋白质应答）的转录因子。

图10是一系列线图，其描绘了展示的赫赛汀scFv的剂量响应曲线。显示了三次独立滴定。前A1-赫赛汀scFv=以与酿酒酵母Sag1p的C端320个氨基酸的N端融合物融合并在前Lip2前导序列的情况中表达的赫赛汀scFv。前原A1-赫赛汀scFv=以与酿酒酵母Sag1p的C端320个氨基酸的N端融合物融合并在前原Lip2前导序列的情况中表达的赫赛汀scFv。前A2-赫赛汀scFv=以与酿酒酵母Aga2p的N端融合物融合并在前Lip2前导序列的情况中表达的赫赛汀scFv。“[Ag]”=HER2-Fc嵌合蛋白（抗原）浓度。Y轴显示结合的分数，其以MFI/(MFI最大-MFI最小)计算，标准化，并以百分比表示。对每个滴定曲线显示计算的kD。

图11是一对线图，其描绘了展示的scFv D1.3和突变体M3（它们各自识别鸡蛋溶菌酶(HEL)）的剂量响应曲线。M3比D1.3具有高2倍的针对鸡蛋溶菌酶的亲和力。展示的多肽以Sag1p（标记为“前A1D1.3对M3”的线图）和Aga2p（标记为“前A2D1.3对M3”的线图）融合多肽表达。将D1.3或M3展示细胞与不同浓度的生物素化的鸡蛋溶菌酶一起温育（X轴显示以nM计的浓度）。对每个滴定曲线显示计算的kD。

图12是用于转化解脂耶氏酵母的复制型载体的示意图。将复制型载体构建为含有由pPOX2启动子驱动的scFv-AGA2表达盒和用于复制性增殖的ARS18。

图13是一对直方图，其描绘了scFv-AGA2在用基于捷塔的整合型质粒（图13A）或复制型质粒（图13B）转化的解脂耶氏酵母细胞中的细胞表面表达。关于复制型质粒的数据代表10个克隆的平均值。将用复制型载体转化的细胞在非选择性和选择性条件下培养。X轴（标记为“FL2-H”）显示c-myc荧光信号，其使用经藻红蛋白缀合的二抗在通道2中记录。Y轴（标记为“计数”）显示细胞数目。

图14是一系列一维FFC直方图，其描绘单一加c-Myc标签的全长曲妥单抗（赫赛汀）IgG的表面表达。创建总共2种展示质粒，其容许以与酿酒酵母Aga2p的N端融合物（标记为“A2”的行中的直方图)和与Aga2p的C端融合物（标记为“A4”的行中的直方图）展示IgG重链。IgG轻链以可溶性片段表达。检测重链(HC)和轻链(LC)表达。检测荧光，如实施例1中所描述的。图14A是显示c-myc和V5表达的点图。清楚地，对于与AGA2的N和C端融合物两者，所有细胞同时显示全长重链和轻链的表达。未标记的细胞没有显示表位标签的检出。图14B加阴影的直方图对这两种融合物显示c-myc和V5表达。与对赫赛汀Fab展示观察到的事情类似，与N端融合物相比，可以对将重链在AGA2锚的C端融合的细胞观察到展示效率的显著改善（如通过虚线标示的）。图14C显示表达的HC和LC的图示。

图15是一副线图，其描绘了来自scFv亲和力成熟筛选的两种分离的克隆（克隆13和克隆38）的剂量响应曲线。自平衡滴定曲线测定Kd，并与野生型D1.3Kd比较。对于克隆13和克隆38，Kd值分别测定为2.2和1.8nM。与野生型Kd(4.0nM)相比，这分别代表1.8和2.4倍改善，其与M3突变体位于相同范围中。

发明详述

本文中提供了用于在酵母细胞的表面上展示多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）的方法和组合物。可以与本文中公开的各种方法和组合物联合使用的例示性酵母包括耶氏酵母属的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母(Yl)。

抗体多肽和抗体多肽片段

依照本文中描述的方法和组合物，可以在酵母细胞表面上表达多种抗体多肽或其片段之任一种。

“抗体多肽”在该术语在本文中使用时指作为或源自免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链多肽的多肽。如本领域中已知的，野生型IgG抗体一般包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽。给定的抗体包括五类重链（称作α、δ、ε、γ和μ）之一，其分类基于重链恒定区的氨基酸序列。在人类中，存在有α恒定区的两种亚类和γ恒定区的四种亚类。这些不同类的重链分别产生五类抗体，即IgA（包括IgA1和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)和IgM。给定的抗体还包含两类轻链（称作κ或λ）之一，其分类基于轻链恒定域的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文中公开的方法提供了在酵母，例如耶氏酵母属菌株诸如解脂耶氏酵母的细胞表面上表达抗体多肽。在某些实施方案中，在酵母中表达全长重链、全长轻链、或这两者。在某些实施方案中，在酵母中表达全长重链、全长轻链、或这两者的片段。

“抗体片段”或“抗体多肽片段”在该术语在本文中使用时指不包括如上文所定义的全长抗体多肽，但是仍至少包含全长抗体多肽的一部分的自抗体多肽分子衍生的多肽。抗体多肽片段经常包含如下的多肽，其包含全长抗体多肽的切割部分，尽管该术语不限于此类经切割的片段。因为抗体多肽片段在该术语在本文中使用时涵盖包含自抗体多肽（例如重或轻链抗体多肽）衍生的单一多肽链的片段，所以应当理解抗体多肽片段独自可以不结合抗原。例如，抗体多肽片段可以包含重链抗体多肽中会包含在Fab片段中的那部分；此类抗体多肽片段通常不会结合抗原，除非它与自轻链抗体多肽衍生的另一抗体多肽片段（例如，轻链抗体多肽中会包含在Fab片段中的那部分）联合，使得抗原结合位点得到重建。抗体多肽片段可以包括例如如下的多肽，其会包含在Fab片段、F(ab’)₂片段、scFv（单链Fv）片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、多特异性抗体片段诸如双特异性、三特异性、和多特异性抗体（例如，双抗体、三抗体、四抗体）、微型抗体、螯合重组抗体、三体(tribody)或二体(bibody)、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、结合域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼源化(camelize)抗体、和含有V_HH的抗体中。应当领会，“抗体片段”或“抗体多肽片段”包括“抗原结合抗体片段”和“抗原结合抗体多肽片段”。见例如美国专利号7,422,890、7,422,742、和7,390,884，通过提及而将每篇完整收入本文。

“人源化抗体多肽”在该术语在本文中使用时指已经工程化改造为包含其可变区中的一个或多个人可变区（轻和/或重链）框架区以及重和/或轻链多肽的非人（例如，小鼠、大鼠、或仓鼠）互补决定区(CDR)和人重和/或轻链恒定区的抗体多肽。在某些实施方案中，人源化抗体包含除了CDR区外的完全人的序列。相对于非人源化抗体，人源化抗体对人通常不太有免疫原性，并且如此在治疗应用中提供某些益处。本领域普通技术人员会知道人源化抗体，而且还会知道适合于生成人源化抗体多肽的技术。见例如美国专利号7,442,772、7,431,927、6,872,392、和5,585,089，通过提及而将每篇完整收入本文。

“嵌合抗体多肽”在该术语在本文中使用时指已经工程化改造为包含至少一个人恒定区的抗体多肽。重和或轻链可以具有人恒定区。相对于非嵌合抗体，嵌合抗体对人通常不太有免疫原性，并且如此在治疗应用中提供某些益处。本领域普通技术人员会知道嵌合抗体，而且还会知道适合于生成嵌合抗体多肽的技术。见例如美国专利号7,442,772、7,431,927、6,872,392、和5,585,089，通过提及而将每篇完整收入本文。

在某些实施方案中，表达的抗体多肽或抗体多肽片段是人抗体多肽或片段。在某些实施方案中，表达的抗体多肽或其片段是非人抗体多肽或其片段,例如，小鼠或大鼠抗体多肽或其片段。在某些实施方案中，表达的抗体多肽或其片段是嵌合的，即它含有人重和/或轻链恒定区。在某些实施方案中，表达的抗体多肽或其片段是人源化的，即它含有可变区中的一个或多个人框架区以及重和/或轻链的非人（例如，小鼠、大鼠或仓鼠）互补决定区(CDR)。

在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽包含抗体的重链多肽。在某些实施方案中，在酵母细胞的表面上表达重链多肽的片段，例如，重链多肽中会包含在Fab片段（例如，VH-CH1）、Fv片段、或scFv片段中的那部分。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽包含整个或部分的重链恒定区，例如，Fc区、铰链区，等等。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽缺乏重链恒定区。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽缺乏重链恒定区的一部分，例如，Fc区。

在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽包含抗体的轻链多肽。在某些实施方案中，在酵母细胞的表面上表达轻链多肽的片段，例如，Fv片段、或scFv片段。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽包含轻链恒定区。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽缺乏轻链恒定区。

在某些实施方案中，抗体多肽片段是包含如下的氨基酸链的多肽，其作为Fab片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、多特异性抗体片段诸如双特异性、三特异性、或多特异性抗体（例如，双抗体、三抗体、四抗体）、微型抗体、螯合重组抗体、三体或二体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、结合域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼源化抗体、或含有V_HH的抗体的一部分。在某些实施方案中，抗体多肽片段是scFv片段。

在某些实施方案中，在酵母细胞的表面上表达重链抗体多肽或抗体多肽片段和轻链抗体多肽或抗体多肽片段两者。例如，可以在本文中描述的任何酵母（例如，解脂耶氏酵母）中表达完全重链抗体多肽和完全轻链抗体多肽。作为另一个例子，可以与轻链抗体多肽中包含在Fab片段、Fv片段、或scFv片段中的那部分一起在酵母中表达重链抗体多肽中包含在Fab片段、Fv片段、或scFv片段中的那部分。如本领域普通技术人员会理解的，在酵母细胞表面上表达重链抗体多肽和轻链抗体多肽（或其抗体多肽片段）时，此类抗体多肽或片段可以彼此联合以重建功能性抗原结合分子。

在某些实施方案中，在第一交配型的第一单倍体酵母细胞表面上表达重链抗体多肽或抗体多肽片段，在第二交配型的第二单倍体酵母细胞表面上表达轻链抗体多肽或抗体多肽片段，并将第一和第二单倍体酵母细胞交配以生成二倍体酵母细胞。相反地，在第一交配型的第一单倍体酵母细胞表面上表达轻链抗体多肽或其片段，在第二交配型的第二单倍体酵母细胞表面上表达重链抗体多肽或其片段，并将第一和第二单倍体酵母细胞交配以生成二倍体酵母细胞。由于此类交配生成的此类二倍体酵母细胞会表达重链抗体多肽和轻链抗体多肽（或其抗体多肽片段）。酵母交配型是本领域中已知的。例如，在单倍体形式中，酿酒酵母(S.cerevisiae)以两种交配型之一存在：MATA和MATB。此外，可以将MATA交配型解脂耶氏酵母细胞工程化改造成MATB交配型。单倍体MATA和MATB酵母细胞可以彼此交配以形成二倍体酵母细胞。本领域普通技术人员会知道可以交配的酵母物种，而且还会知道合适的交配型。

在某些实施方案中，可以如下生成表达抗体多肽或抗体多肽片段的单倍体酵母细胞，即用包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核酸序列的载体或表达盒（见题目为“表达盒和载体”的部分）转化单倍体酵母细胞。或者，可以如下生成表达抗体多肽或其片段的单倍体酵母细胞，即用包含编码抗体多肽或其片段的核酸序列的载体转化二倍体酵母细胞，并使经转化的二倍体酵母细胞形成孢子以生成单倍体酵母细胞。

在某些实施方案中，通过用两种载体或表达盒（包含编码重链抗体多肽或抗体多肽片段的核酸序列的第一载体或表达盒和包含编码轻链抗体多肽或抗体多肽片段的核酸序列的第二载体或表达盒）转化单倍体酵母细胞而在酵母细胞表面上表达重链抗体多肽或抗体多肽片段和轻链抗体多肽或抗体多肽片段两者。在某些实施方案中，通过用单一载体转化单倍体酵母细胞而在酵母细胞表面上表达重链抗体多肽或抗体多肽片段和轻链抗体多肽或抗体多肽片段两者，所述载体包含表达盒，该表达盒包含编码重链抗体多肽或抗体多肽片段和轻链抗体多肽或抗体多肽片段的核酸序列。此类酵母细胞可以是单倍体或二倍体。

在某些实施方案中，要在酵母细胞表面上表达的重链抗体多肽或抗体多肽片段和/或轻链抗体多肽或抗体多肽片段是包含锚多肽（见下文题目为“锚多肽”的部分）的融合多肽。虽然经由其重链抗体多肽或片段来锚定抗体多肽或片段是典型的，但是经由轻链抗体多肽或片段进行锚定也是有可能的。见例如Lin等,App.Microbiol Biotechol,2003年8月;62(2-3):226-32，通过提及而将其完整收入本文。在某些实施方案中，仅将抗体多肽或其片段的重链与锚多肽融合。在某些实施方案中，仅将抗体多肽或其片段的轻链与锚多肽融合。在某些实施方案中，将抗体多肽或其片段的重链和抗体多肽或其片段的轻链两者与锚多肽融合。在某些实施方案中，在融合多肽的氨基端融合锚多肽。在某些实施方案中，在融合多肽的羧基端融合锚多肽。

在某些实施方案中，通过本文中公开的多种方法之任一种获得抗体多肽或抗体多肽片段。此类抗体多肽或其片段可以作为细胞的一部分获得。或者，抗体多肽或其片段可以在其表达后自细胞纯化。可以使用用于纯化多肽的标准技术。

可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法之任一种来检测和筛选表达感兴趣多肽的酵母细胞。例如，可以采用FACS（荧光激活细胞分选）。在FACS中，使酵母细胞与结合感兴趣多肽（例如，本公开内容的抗体多肽或抗体多肽片段结合的抗原）的经标记试剂接触。可以使用任何标记物，只要它是可检测的。合适的标记物包括但不限于荧光模块、化学发光模块，等等。本领域普通技术人员会知道合适的标记物。在某些实施方案中，用间接标记物标记试剂，所述间接标记物可以通过结合与间接标记物结合的经可检测标记的试剂（例如，荧光或化学发光模块）来检测。多种间接标记物是本领域中已知的，包括但不限于生物素（其可以被亲合素或链霉亲合素结合）、表位标签（例如本文中描述的任何表位标签），等等。可以使用对特定表位标签特异性的经标记抗体或其片段来检测表位标签。或者，可以通过结合对特定表位标签特异性的第一抗体或其片段，并用经标记的第二抗体或其片段检测第一抗体或片段来检测表位标签。然后，将酵母细胞通过细胞分选仪，其分开细胞并且测定经标记药剂是否与每个个别细胞联合。展现荧光的那些细胞在其表面上表达感兴趣多肽。或者，可以在用结合感兴趣抗体多肽或片段的药剂（例如抗原）包被的平板上“淘选”细胞。或者，可以将细胞结合至固体支持物（例如珠），其与结合感兴趣抗体多肽或片段的药剂（例如抗原）连接。然后，可以分离固体支持物（例如，通过离心、若支持物是顺磁性的，则磁性除去，等等）；结合固体支持物的任何细胞在其表面上表达感兴趣多肽。本领域普通技术人员会知道适合于鉴定和分离在其表面上表达感兴趣多肽的酵母细胞的其它方法。见例如Yeung和Wittrup,Biotechnol.Prog.,Mar-Apr;18(2):212-20,2002；Ackerman等,Biotechnol.Prog.,May-Jun;25(3):774-83,2009；Wang等,J.Immunol.Methods,Sep;304(1-2):30-42,2005；及Chao等,Nat.Protoc.,1(2):755-68,2006，通过提及而将每篇完整收入本文。

本领域普通技术人员会知道可以依照本文中描述的方法和组合物在酵母（例如，解脂耶氏酵母）细胞表面上表达的其它抗体多肽和片段。

锚多肽

可以依照本文中描述的方法和组合物使用多种锚多肽之任一种在酵母细胞表面上表达多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）。

“锚多肽”在该术语在本文中使用时指拴系至细胞表面，并且如此可以用于将其它多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）与拴系至细胞表面的多肽。例如，锚多肽可以是跨膜或细胞壁蛋白，诸如例如，糖基磷脂酰肌醇(GPI)细胞壁蛋白。多种锚多肽是本领域中已知的，并且可以依照本文中公开的组合物和方法用于在酵母表面上表达多肽。此类锚肽包括但不限于酿酒酵母Aga1-Aga2（交配型A凝集素基因）异二聚体、酿酒酵母α-凝集素(Sag1p)、Pir1p、Pir2p、Pir4p、Flo1p、耶氏酵母属CWPI及其片段（见例如Ueda等,J.Biosci.Bioeng.90:125-36,2000；Abe,H.,Shimma等,Pi r.Glycobiology 13,87-95,2003；Andres,I.,等,Biotechnol Bioeng 89,690-7,2005；Wang,Q.,等,Curr.Microbiol.56,352-7,2008；Tanino,T.,等,Biotechnol.Prog.22,989-93,2006；Yue等,J.Microbiol.Methods.2008年2月;72(2):116-23；通过提及而将每篇完整收入本文）。

在某些实施方案中，使用锚多肽将感兴趣多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）与酵母细胞表面，例如，解脂耶氏酵母细胞的表面拴系在一起。例如，可以将锚多肽与感兴趣多肽融合，使得在细胞表面上表达锚多肽和感兴趣多肽两者。

在某些实施方案中，可以通过用载体或表达盒（见题目为“表达盒和载体”的部分）转化酵母细胞来生成表达感兴趣多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）的酵母细胞，所述载体或表达盒包含与编码锚多肽的第二核酸序列以符合读码框的方式融合的编码感兴趣多肽的第一核酸序列。在某些实施方案中，在第二核酸序列5’融合第一核酸序列，使得自融合序列生成的融合多肽包含N端感兴趣多肽和C端锚多肽。在某些实施方案中，在第二核酸序列3’融合第一核酸序列，使得自融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端感兴趣多肽。在某些实施方案中，将第一核酸序列与第二核酸序列以符合读码框的方式直接融合。在某些实施方案中，将第一核酸序列与接头序列融合，将接头序列与第二核酸序列融合。如题目为“表达盒和载体”的部分中更为详细描述的，接头序列通常编码接头多肽，诸如不限于GlySer接头多肽，例如，(Gly₄Ser)₃或(GlySer)₅。

表达盒和载体

在某些实施方案中，在酵母细胞表面上表达多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）通过用包含编码所述多肽的核酸序列的表达盒转化所述酵母来进行。如本文中使用的，术语“表达盒”指如下的核酸序列，其最低限度包含：(1)编码感兴趣多肽的核苷酸序列，和(2)驱动感兴趣多肽表达的核苷酸序列（例如，启动子）。

在某些实施方案中，由表达盒的核苷酸序列编码的感兴趣多肽包含抗体多肽或抗体多肽片段。表达盒可以包含编码本文中描述的任何抗体多肽或片段，例如自Fab片段、Fv片段、或scFv片段衍生的抗体多肽或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，感兴趣多肽是Fab片段的重链。在某些实施方案中，感兴趣多肽是Fab片段的轻链。

在某些实施方案中，由表达盒的核苷酸序列编码的感兴趣多肽包含锚多肽。表达盒可以包含编码本文中描述的任何锚多肽，例如酿酒酵母Aga1-Aga2异二聚体、酿酒酵母α凝集素(Sag1p)、Pir1p、Pir2p、Pir4p、Flo1p、耶氏酵母属CWPI及其片段的核苷酸序列。

在某些实施方案中，由表达盒的核苷酸序列编码的感兴趣多肽包含与锚多肽以符合读码框的方式融合的抗体多肽或抗体多肽片段。例如，表达盒可以包含编码抗体多肽或片段的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与编码锚多肽的第二核苷酸序列以符合读码框的方式融合。在某些实施方案中，在编码锚多肽的第二核苷酸序列5’以符合读码框的方式融合编码抗体多肽或片段的第一核苷酸序列，使得在表达核苷酸序列时，抗体多肽或片段在锚多肽的N端。在某些实施方案中，在编码锚多肽的第二核苷酸序列3’以符合读码框的方式融合编码抗体多肽或片段的第一核苷酸序列，使得在表达核苷酸序列时，抗体多肽或片段在锚多肽的C端。

在某些实施方案中，表达盒包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，其与编码锚多肽的核苷酸序列以符合读码框的方式融合，使得没有居间核苷酸残基。在此类实施方案中，自表达盒表达的多肽会包含在无居间氨基酸残基的情况中与锚多肽直接融合的抗体多肽或片段。在某些实施方案中，表达盒包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，其与编码接头多肽的接头序列以符合读码框的方式融合，所述接头序列与编码锚多肽的核苷酸序列以符合读码框的方式融合，使得接头序列在编码抗体多肽或片段的第一核苷酸序列与编码锚多肽的核苷酸序列间以符合读码框的方式融合。在此类实施方案中，自表达盒表达的多肽会包含抗体多肽或抗体多肽片段、接头多肽、和锚多肽。在此段中描述的任何实施方案中，可以在编码锚多肽的核苷酸序列5’或3’融合编码抗体多肽或片段的核苷酸序列。

可以依照目前描述的组合物和方法使用多种接头多肽之任一种。接头多肽充当融合多肽内包含的两种感兴趣多肽间的间隔物。有利地，接头多肽不干扰两种感兴趣多肽的功能，或仅以微小的程度干扰。在某些实施方案中，接头多肽容许两种感兴趣多肽有显著的构象自由，使得两种感兴趣多肽相对于彼此能够采取多种空间位置和取向。接头多肽的非限制性例子是GlySer接头多肽，例如，(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:14)或(GlySer)₅(SEQ ID NO:15)。在某些实施方案中，接头多肽可以位于抗体多肽或抗体多肽片段的两部分间。例如，可以将编码接头多肽的接头序列在1)编码scFv片段的重链可变区的重链核酸序列和2)编码scFv片段的轻链可变区的轻链核酸序列间以符合读码框的方式融合。在某些实施方案中，感兴趣多肽包含超过一个接头序列。例如，融合多肽可以包含1)scFv抗体多肽片段，其可以包含scFv片段的重和轻链可变区多肽间的第一接头多肽、2)锚多肽、和3)scFv抗体多肽和锚多肽间的第二接头多肽。本领域普通技术人员会知道其它合适的接头多肽及其编码核苷酸序列。

在某些实施方案中，表达盒包含前导核酸序列，其包含编码前导多肽的核苷酸序列。可以依照目前描述的组合物和方法使用多种前导多肽之任一种。前导多肽经由分泌装置发挥功能以帮助驱动对多肽的加工，最终导致正确加工的表面展示的多肽。前导序列在加工期间自多肽切割，并且不是完全加工的多肽的一部分。如本领域普通技术人员会理解的，前导核酸序列通常会在编码感兴趣多肽的核苷酸序列5’以符合读码框的方式融合，使得前导多肽在表达的融合多肽的N端。前导多肽的非限制性例子包括前LIP2、前原LIP2、前XPR2、和前原XPR2。见例如Pignède等,J.Bacteriol.,May;182(10):2802-10,2000；Davidow等,J.Bacteriol.,Oct;169(10):4621-9,1987；及Madzak等,J.Biotechnol.,4月8日;109(1-2):63-81,2004，通过提及而将每篇完整收入本文。本领域普通技术人员会知道其它合适的前导多肽及其编码核苷酸序列。

在某些实施方案中，表达盒包含表位核酸序列，其包含编码表位标签的核苷酸序列。可以依照目前描述的组合物和方法使用多种表位标签之任一种。表位标签通常是短的多肽序列，其便于表达多肽的检测、测量、定量、和/或纯化（或分离）。表位标签可以位于给定多肽内的任何地方，例如，在N端、在C端、或在内部。表位标签的非限制性例子包括c-Myc（髓细胞组织增生(myelocytomatosis)细胞癌基因）、V5（自猿病毒5的P和V蛋白的C端序列衍生）、多组氨酸（例如，6-his，或六组氨酸）、谷胱甘肽-S-转移酶、链霉亲合素、生物素、血凝素、Flag标签（FLAG八肽）、和E标签[GAPVPYPDPLEPR,SEQ ID NO:13]。本领域普通技术人员会知道其它合适的表位标签及其编码核苷酸序列。

在某些实施方案中，表达盒包含启动子。如本领域中已知的，启动子是驱动下游核苷酸序列转录成核糖核酸(RNA)的核苷酸序列，所述转录是经由多种转录因子之任一种介导的。在某些实施方案中，转录的RNA编码感兴趣多肽。在某些实施方案中，表达盒包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含：(1)第一核酸序列，其包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，其以符合读码框的方式融合(2)第二核酸序列，其包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列。

有利的启动子是那些通常在感兴趣的细胞中发挥功能的。例如，已知在酵母中，例如在耶氏酵母属物种，诸如但不限于解脂耶氏酵母中发挥功能的许多启动子。在某些实施方案中，使用在解脂耶氏酵母中发挥功能的启动子来驱动编码抗体多肽或抗体多肽片段的RNA表达。在某些实施方案中，使用在解脂耶氏酵母中发挥功能的启动子来驱动编码锚多肽的RNA表达。在某些实施方案中，使用在解脂耶氏酵母中发挥功能的启动子来驱动编码与锚多肽融合的抗体多肽或抗体多肽片段的RNA表达。

可以依照目前描述的组合物和方法使用多种启动子之任一种以在酵母细胞表面上表达感兴趣多肽。在某些实施方案中，用于表达多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）的启动子是组成性的。多种组成性启动子是本领域中已知的，包括但不限于TEF1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。在某些实施方案中，用于表达多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）的启动子是诱导型的。在从业人员期望控制何时表达感兴趣多肽时，诱导型启动子是有用的。许多诱导型启动子是本领域中已知的，包括但不限于POX3和LIP2启动子。在某些实施方案中，用于表达多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）的启动子是半组成性的。“半组成性启动子”在该术语在本文中使用时指不是完全组成性的，并且很大程度上或仅在某些条件下驱动某些基因表达的启动子。例如，半组成性启动子可以以生长阶段依赖性方式驱动基因表达。许多半组成性启动子是本领域中已知的，包括但不限于hp4d启动子。本领域普通技术人员会知道在感兴趣的细胞中，例如在耶氏酵母属物种，诸如但不限于解脂耶氏酵母中发挥功能的合适的组成性、诱导型和半组成性启动子。

在某些实施方案中，在酵母细胞表面上表达多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）通过用包含表达盒，例如本文中描述的任何表达盒的载体转化所述酵母来进行。“载体”如该术语在本文中使用时指包含表达盒，而且进一步包含一种或多种别的元件的核酸。在某些实施方案中，载体包含便于载体在选择条件下复制、同源或非同源整合、和/或维持的元件。

可以依照目前描述的组合物和方法使用多种载体之任一种来在酵母细胞表面上表达感兴趣多肽。可以使用的载体的非限制性例子包括那些在美国专利公开文本No.2008-0171359中披露的，通过提及而将其完整收入本文。本领域普通技术人员会知道用于给定的感兴趣细胞（例如，酵母细胞）的其它合适的载体。此外，可以修饰多种载体之任一种以用于在酵母细胞表面上表达感兴趣多肽。例如，商品化或其它载体可以适合于用于给定的酵母物种，但是此类载体可以不包含如下的表达盒，所述表达盒包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含：(1)第一核酸序列，其包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，其以符合读码框的方式融合(2)第二核酸序列，其包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列。此类载体可以修饰为包含启动子和编码抗体多肽或抗体多肽片段和锚多肽的核酸序列。许多分子技术适合于修饰载体，其中许多可参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989，通过提及而将其内容完整收入本文。本领域普通技术人员会知道适合于修饰载体以用于在酵母（例如，解脂耶氏酵母）细胞表面上表达感兴趣多肽的多种其它分子技术。

在某些实施方案中，载体包含编码选择标志的核苷酸序列。“选择标志”在该术语在本文中使用时指容许含有选择标志的细胞在缺乏选择标志的细胞不能存活和/或增殖的条件下存活和/或增殖的多肽。选择标志的术语和概念是本领域普通技术人员公知的。选择标志的非限制性例子包括那些关于亮氨酸（例如，LEU2）、尿嘧啶（例如，URA3d1）、腺嘌呤（例如，ADE2）、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、甘油利用(Gut)、色氨酸(Trp)、甘油-3-磷酸脱氢酶(G3p)、和潮霉素B磷酸转移酶(hph)的。本领域普通技术人员会知道可以依照本文中公开的组合物和方法使用的其它合适的标志物。

在某些实施方案中，将载体整合入细胞（例如，耶氏酵母属细胞诸如解脂耶氏酵母）的基因组中。用于将载体整合入细胞的基因组中的多种技术是本领域中已知的。在某些实施方案中，载体包含捷塔元件。捷塔元件是容许载体通过同源重组整合入携带Ylt1反转录转座子的解脂耶氏酵母菌株的基因组中，或者在缺乏Ylt1反转录转座子的酵母中通过非同源重组来整合的序列。在某些实施方案中，捷塔元件包含反转录转座子，诸如但不限于Ylt1或Tyl6反转录转座子的长末端重复。本领域普通技术人员会知道其它元件，而且会能够依照本文中公开的组合物和方法在载体中使用它们。

在某些实施方案中，不将载体整合入细胞的基因组中。例如，可以例如通过转化将复制型载体导入酵母细胞中。复制型载体含有适合于在宿主细胞中维持、复制和/或其它功能的元件。例如，载体可以含有一种或多种常染色体复制元件。此类常染色体复制元件的非限制性例子包括着丝粒(CEN)和复制起点(ORI)。在某些实施方案中，着丝粒包含CEN1或CEN3（Vernis,L.等,Mol.Cell Biol.17,1995-2004,2007，通过提及而将其完整收入本文）。在某些实施方案中，复制起点包含ORI1068或ORI3018（Fournier等,Yeast,Jan;7(1):25-36,1991，通过提及而将其完整收入本文）。在某些实施方案中，不整合入细胞的基因组中的载体可以含有自主复制序列(ARS)。见例如Fournier等,Yeast 7,25-36,1991和Matsuoka等,Mol.Gen.Genet.237,327-333,1993，通过提及而将每篇完整收入本文）。在某些实施方案中，ARS包含着丝粒和复制起点。ARS的非限制性例子包括ARS18和ARS18。

在某些实施方案中，表达盒包含与锚核苷酸序列核酸序列可操作连接的启动子，所述锚核苷酸序列核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列，其中所述锚核酸序列可以在包含感兴趣的第二融合配偶体的融合蛋白中作为第一融合配偶体表达。在某些此类实施方案中，表达盒包含另一核酸序列，其包含编码感兴趣的第二融合配偶体的核苷酸序列。感兴趣的第二融合配偶体可以是多种多肽之任一种。例如，感兴趣的第二融合配偶体可以是抗体多肽或抗体多肽片段，尽管第二融合配偶体不限于此类抗体多肽或片段。因为第二融合配偶体会与锚多肽融合，所以第二融合配偶体也会在细胞表面上表达。在某些实施方案中，此段中包括的表达盒包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含限制性位点以容易融合感兴趣的第二融合配偶体。多种限制性位点之任一种可以包含在表达盒中。本领域普通技术人员会知道合适的限制性位点，而且会能够工程化改造包含它们的表达盒。

在某些实施方案中，编码感兴趣多肽的核苷酸序列经密码子优化以用于表达多肽的生物体（例如，酵母细胞）。密码子优化是将编码感兴趣多肽的核苷酸序列修饰为使得核苷酸序列经优化以在特定生物体中表达，但是多肽的氨基酸序列保持相同的过程。密码子是被细胞翻译成给定氨基酸的三个核苷酸的序列。因为存在着20种天然编码的氨基酸，但是三个核苷酸的序列存在有64种可能的组合，所以大多数氨基酸由多种密码子编码。给定物种中某些密码子经常比编码相同氨基酸的其它密码子更好地得到翻译，并且每种物种在其密码子偏爱上有所不同。因此，来自一种物种的基因在导入另一种物种中时可以较差地表达。一种克服此问题的方式是利用遗传密码的简并性，并且修饰编码感兴趣多肽的核苷酸序列，使得核苷酸序列现在含有在感兴趣的物种中有效使用的密码子，但是该核苷酸序列仍编码相同多肽。有可能确定哪些密码子在感兴趣的生物体中最广泛使用。实际上，这已经对多种生物体，包括解脂耶氏酵母完成。下文表1中显示了基于2,945,919个密码子的解脂耶氏酵母样品密码子优化表。本领域普通技术人员会知道而且会能够确定其它生物体的密码子选择。

表1：解脂耶氏酵母密码子选择表

UUU 15.9(46804)	CU 21.8(64161)	AU 6.8(20043)	GU 6.1(17849)
				UUC 23.0(67672)	CC 20.6(60695)	AC 23.1(68146)	GC 6.1(17903)
UUA 1.8(5280)	CA 7.8(22845)	AA 0.8(2494)	GA 0.4(1148)
				UUG 10.4(30576)	CG 15.4(45255)	AG 0.8(2325)	GG 12.1(35555)
				CUU 13.2(38890)	CU 17.4(51329)	AU 9.6(28191)	GU 6.0(17622)
CUC 22.6(66461)	CC 23.3(68633)	AC 14.4(42490)	GC 4.4(12915)
				CUA 5.3(15548)	CA 6.9(20234)	AA 9.8(28769)	GA 21.7(63881)
CUG 33.5(98823)	CG 6.8(20042)	AG 32.1(94609)	GG 7.7(22606)
AUU 22.4(66134)	CU 16.2(47842)	AU 8.9(26184)	GU 6.7(19861)
				AUC 24.4(71810)	CC 25.6(75551)	AC 31.3(92161)	GC 9.8(28855)

AUA 2.2(6342)	CA 10.5(30844)	AA 12.4(36672)	GA 8.4(24674)
				AUG 22.6(66620)	CG 8.5(25021)	AG 46.5(136914)	GG 2.4(7208)
				GUU 15.8(46530)	CU 25.5(75193)	AU 21.5(63259)	GU 16.6(48902)
GUC 21.5(63401)	CC 32.7(96219)	AC 38.3(112759)	GC 21.8(64272)
				GUA 4.0(11840)	CA 11.2(32999)	AA 18.8(55382)	GA 20.9(61597)
GUG 25.7(75765)	CG 8.9(26190)	AG 46.2(136241)	GG 4.4(12883)

图例：表栏以[三联体][频率：每千]([数目])显示。数据自存在于5,967种编码序列中的2,945,919个密码子推导。自密码子选择数据库获得的表内容可参见URL www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=284591。

在某些实施方案中，可以将包含下文显示的经解脂耶氏酵母密码子优化的核酸序列SEQ ID NO:1-12中的一种或多种的载体或表达盒转化入解脂耶氏酵母中进行表达。下述每种经密码子优化的核酸序列内的相关编码序列以粗体、加下划线的文本标示。

SEQ ID NO:1：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的C端酿酒酵母 SAG1p（320个C端氨基酸）（SfiI/NotI侧翼的）

[gaatgcagcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggtcgacctcgagtggcggcggaggctctggcggaggcggatctggcggcggtggcagtgcacaggtccaactgcaggagctcgatatcaaacgggcggccgcagagcagaagctgatctctgaggaagatctgtccggcggaggcggctccggtggcggcggttctggcggtggcggctctcatatg

gccaagtcctctttcatctctaccaccaccaccgacctgacctctatcaacacctctgcctactctaccggctctatctctaccgtggagaccggcaaccgaaccacctctgaagtgatctctcacgtggtgaccacttctaccaagctgtctcccaccgccaccacctccctgaccattgcccagacctctatctactccaccgactccaacatcaccgtgggcaccgacatccacaccacctccgaggtcatttccgacgtggagaccatctcccgagagaccgcctctaccgtggtggccgctcctacctctaccaccggctggaccggcgccatgaacacctacatctctcagttcacctcttcttccttcgccaccatcaactctacccccatcatctcttcctctgccgtgttcgagacctctgacgcctctatcgtgaacgtccacaccgagaacattaccaacaccgccgctgttccctctgaggaacccacctttgtgaacgccacccgaaactccctgaactctttctgttcttctaagcagccctcctctccctcttcctacacctcttcccccctggtgtcctctctgtctgtgtctaagaccctgctgtctacctctttcaccccctctgtgcccacctctaacacctacattaagaccaagaacaccggctacttcgagcacaccgccctgaccacctcttctgtgggcctgaactccttctctgagaccgccgtgtcctctcagggcaccaagatcgacacctttctggtctcctccctgatcgcctacccctcttctgcctctggctctcagctgtctggcatccagcagaacttcacctctacctccctgatgatctctacctacgagggcaaggcctctatcttcttctctgccgagctgggctctatcatcttcctgctgctgtcttacctgctgttctaacctagg]

SEQ ID NO:2：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的C端酿酒酵母 AGA2p（SfiI/NotI侧翼的）

[gaatgcagcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggtcgacctcgagtggcggcggaggctctggcggaggcggatctggcggcggtggcagtgcacaggtccaactgcaggagctcgatatcaaacgggcggccgcagagcagaagctgatctctgaggaagatctgtccggcggaggcggctccggtggcggcggttctggcggtggcggctctcatatg

gaactgaccaccatctgcgagcagattccctctcccaccctggagtctaccccctactctctgtctaccaccaccatcctggccaacggcaaggccatgcagggcgtgttcgagtactacaagtctgtgaccttcgtgtctaactgtggctctcacccctctaccacctctaagggctctcccatcaacacccagtacgtgttctaacctagg]

SEQ ID NO:3：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的C端解脂耶氏酵母 CWPI（SfiI/NotI侧翼的）

[gaatgcagcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggtcgacctcgagtggcggcggaggctctggcggaggcggatctggcggcggtggcagtgcacaggtccaactgcaggagctcgatatcaaacgggcggccgcagagcagaagctgatctctgaggaagatctgtccggcggaggcggctccggtggcggcggttctggcggtggcggctctcatatg

aacggttacgccgtcgacgacaactccaagtgcgaggacgacggaatccccttcggcgcctacgctgttgctgacacctccgcagagtcttctgccgcccccgcctcttctgccgccgctgccgagtcctctgccgccccctcttccgctgctgaggccaagcccaccgctggaggtaacaccggcgccgtcgtcacccagatcggtgacggccagatccaggctcccccctctgctcctcccgctgcccccgagcaggccaacggcgccgtctctgtcggtgtttctgccgccgctctcggtgtcgctgccgccgctctcctcatttaacctagg]

SEQ ID NO:4：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的N端解脂耶氏酵母 AGA2（SfiI/NotI侧翼的）

[gaatgca

gaactgaccaccatctgcgagcagattccctctcccaccctggagtctaccccctactctctgtctaccaccaccatcctggccaacggcaaggccatgcagggcgtgttcgagtactacaagtctgtgaccttcgtgtctaactgtggctctcacccctctaccacctctaagggctctcccatcaacacccagtacgtgttctcttctggcggcggaggctctggcggaggcggatctggtggcggaggatctgcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggtcgacctcgagtggaggcggcggatctggcggtggcggctccggcggtggaggcagtgcacaggtccaactgcaggagctcgatatcaaacgggcggccgcagagcagaagctgatctctgaggaagatctgcgaaccggccaccaccaccaccaccactaacctagg]

SEQ ID NO:5：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的赫赛汀(Herceptin) scFv（SfiI/NotI侧翼的）

[ggcccagccggcc

gtgcagctggtcgagtctggcggcggactggtgcagcccggtggctctctgcgactgtcttgtgccgcctctggcttcaacatcaaggacacctacatccactgggtgcgacaggctcccggaaagggcctggagtgggtggcccgaatctaccccaccaacggctacacccgatacgccgactctgtgaagggccgattcaccatctctgccgacacctctaagaacaccgcctacctgcagatgaactctctgcgagccgaggacaccgctgtgtactactgttctcgatggggaggcgacggcttctacgccatggactactggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctctggcggaggcggctccggcggaggcggatctggtggcggaggctctgacatccagatgacccagtctccctcttctctgtctgcctctgtgggcgaccgagtgaccatcacctgtcgagcctctcaggacgtgaacaccgccgtggcctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactctgcctctttcctgtactctggcgtgccctctcgattctctggctctcgatctggcaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagcctgaggatttcgccacctactactgtcagcagcactacaccaccccccccaccttcggccagggaaccaaggtggagatcaaggcggccgc]

SEQ ID NO:6：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的4-4-20 scFv （SfiI/NotI侧翼的）

[ggcccagccggccgtgaagctggacgagactggaggaggcctggtgcagcccggacgacccatgaagctgtcttgtgtggcctctggcttcaccttctctgactactggatgaactgggtgcgacagtctcccgagaagggcctggagtgggtggcccagatccgaaacaagccctacaactacgagacctactactctgactctgtgaagggccgattcaccatgtcccgagatgactctaagtcctctgtgtacctgcagatgaacaacctgcgagtggaggacatgggcatctactactgtaccggctcttactacggcatggactactggggccagggcacctctgtgaccgtgtcctctggcggcggaggctctggcggaggcggatctggtggcggaggatctgacgtggtgatgacccagacccccctgtctctgcccgtgtctctgggcgaccaggcctctatctcttgtcgatcttctcagtctctggtccactctaacggcaacacctacctgcgatggtatctgcagaagcccggccagtctcccaaggtgctgatctacaaggtgtctaaccgattctctggcgtgcccgaccgattctccggctctggctctggcaccgacttcaccctgaagatctcccgagtggaggccgaggacctgggcgtgtacttctgttctcagtctacccacgtgccctggaccttcggcggaggcaccaagctggagatcaaggcggccgc]

SEQ ID NO:7：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的抗HEL D1.3 scFv （SfiI/NotI侧翼的）

[ggcccagccggcc

gtgcagctgcaggaatctggccccggactggtggccccctctcagtctctgtctatcacctgtaccgtgtctggcttctctctgaccggctacggcgtgaactgggtgcgacagccccctggcaagggcctggagtggctgggcatgatctggggcgacggcaacaccgactacaactctgccctgaagtctcgactgtctatctctaaggacaactctaagtctcaggtgttcctcaagatgaactctctccacaccgacgacaccgcccgatactactgtgcccgagagcgagactaccgactggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgtcctctggcggtggaggctctggcggaggcggatctggtggcggaggatctgacatcgagctgacccagtctcccgcctctctgtctgcctctgtgggcgagaccgtgaccatcacctgtcgagcctctggcaacatccacaactacctggcctggtatcagcagaagcagggcaagtctccccagctgctggtgtactacaccaccaccctggccgacggcgtgccctctcgattctctggctctggatctggcacccagtactccctgaagatcaactccctgcagcccgaggacttcggctcttactactgtcagcacttctggtctaccccccgaaccttcggcggaggcaccaagctggagatcaagcgagcggccgc]

SEQ ID NO:8：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的抗HEL M3 scFv （SfiI/NotI侧翼的）

[ggcccagccggcc

gtgcagctgcaggaatctggccccggactggtggccccctctcagtctctgtctatcacctgtaccgtgtctggcttctctctgaccggctacggcgtgaactgggtgcgacagctgcctggcaagggcctggagtggctgggcatgatctggggcgacggcaacaccgcctacaactctgccctgaagtctcgactgtctatctctaaggacaactctaagtctcaggtgttcctcaagatggactctctccacaccgacgacaccgcccgatactactgtgcccgagagcgagactaccgactggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgtcctctggcggtggaggctctggcggaggcggatctggtggcggaggatctgacatcaagctgacccagtctcccgcctctctgtctgcctctgtgggcgagaccgtgaccatcacctgtcgagcctctggcaacacccacaactacctggcctggtatcagcagaagcagggcaagtctccccagctgctggtgtactacaccaccaccctggccgacggcgtgccctctcgattctctggctctggatctggcacccagtactccctgaagatcaactccctgcagcccgaggacttcggctcttactactgtcagcacttctggtctaccccccgatctttcggcggaggcaccaagctggagatcaagcgagcggccgc]

SEQ ID NO:9：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的4-4-20Fab重链 （SfiI/NotI侧翼的）

[ggcccagccggcc

gtgaagctggacgagactggaggaggcctggtgcagcccggacgacccatgaagctgtcttgtgtggcctctggcttcaccttctctgactactggatgaactgggtgcgacagtctcccgagaagggcctggagtgggtggcccagatccgaaacaagccctacaactacgagacctactactctgactctgtgaagggccgattcaccatgtcccgagatgactctaagtcctctgtgtacctgcagatgaacaacctgcgagtggaggacatgggcatctactactgtaccggctcttactacggcatggactactggggccagggcacctctgtgaccgtgtcctctgctagcaccaagggaccttctgtgtttcctctggccccctcttctaagtctacctctggtggaactgctgctctgggatgtctggtgaaggactactttcctgagcctgtgactgtgtcttggaactctggcgctctgacttctggtgttcacaccttccctgctgttctgcagtcctctggactgtactctctctcttctgtggtgaccgtgccttcttcttctctgggaacccagacctacatctgtaacgtgaaccacaagccctctaacactaaggtggacaagcgagtggagcctgcggccgc]

SEQ ID NO:10：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的4-4-20Fab轻链 （SfiI/NotI侧翼的）

[ggcccagccggcc

gtggtgatgacccagacccccctgtctctgcccgtgtctctgggcgaccaggcctctatctcttgtcgatcttctcagtctctggtccactctaacggcaacacctacctgcgatggtatctgcagaagcccggccagtctcccaaggtgctgatctacaaggtgtctaaccgattctctggcgtgcccgaccgattctccggctctggctctggcaccgacttcaccctgaagatctcccgagtggaggccgaggacctgggcgtgtacttctgttctcagtctacccacgtgccctggaccttcggcggaggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggctgctccttctgtgttcattttccccccctctgacgagcagctgaagtctggaactgcttctgttgtgtgcctgctgaacaacttttacccccgagaggctaaggttcagtggaaggtggacaacgctctgcagtctggaaactctcaggagtctgttactgagcaggactctaaggactcgacctactctctctcttctaccctgaccctgtctaaggctgactacgagaagcataaggtgtacgcttgtgaggttacccatcagggactgtcctctcccgtgaccaagtcttttaaccgaggcgagtgcgcggccgc]

SEQ ID NO:11：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的赫赛汀Fab重链 （SfiI/NotI侧翼的）

[ggcccagccggcc

gtgcagctggtcgagtctggcggcggactggtgcagcccggtggctctctgcgactgtcttgtgccgcctctggcttcaacatcaaggacacctacatccactgggtgcgacaggctcccggaaagggcctggagtgggtggcccgaatctaccccaccaacggctacacccgatacgccgactctgtgaagggccgattcaccatctctgccgacacctctaagaacaccgcctacctgcagatgaactctctgcgagccgaggacaccgctgtgtactactgttctcgatggggaggcgacggcttctacgccatggactactggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctctgctagcaccaagggaccttctgtgtttcctctggccccctcttctaagtctacctctggtggaactgctgctctgggatgtctggtgaaggactactttcctgagcctgtgactgtgtcttggaactctggcgctctgacttctggtgttcacaccttccctgctgttctgcagtcctctggactgtactctctctcttctgtggtgaccgtgccttcttcttctctgggaacccagacctacatctgtaacgtgaaccacaagccctctaacactaaggtggacaagcgagtggagcctgcggccgc]

SEQ ID NO:12：合成的经解脂耶氏酵母密码子优化的赫赛汀Fab轻链 （SfiI/NotI侧翼的）

[ggcccagccggcc

atccagatgacccagtctccctcttctctgtctgcctctgtgggcgaccgagtgaccatcacctgtcgagcctctcaggacgtgaacaccgccgtggcctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactctgcctctttcctgtactctggcgtgccctctcgattctctggctctcgatctggcaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagcctgaggatttcgccacctactactgtcagcagcactacaccaccccccccaccttcggccagggaaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgctccttctgtgttcattttccccccctctgacgagcagctgaagtctggaactgcttctgttgtgtgcctgctgaacaacttttacccccgagaggctaaggttcagtggaaggtggacaacgctctgcagtctggaaactctcaggagtctgttactgagcaggactctaaggactcgacctactctctctcttctaccctgaccctgtctaaggctgactacgagaagcataaggtgtacgcttgtgaggttacccatcagggactgtcctctcccgtgaccaagtcttttaaccgaggcgagtgc]

酵母

可以依照本文中描述的方法和组合物采用多种酵母之任一种。酵母是真菌真核微生物。酵母主要以单细胞形式存在，尽管一些物种，例如耶氏酵母属物种是二态的，即，它们也可以以单细胞或菌丝形式存在。此外，一些物种经由形成称为“假菌丝”的一串连接的出芽细胞变为多细胞的。

许多酵母是本领域普通技术人员已知的。可以依照目前公开的组合物和方法使用的例示性酵母包括但不限于：尖针芽孢酵母(Aciculoconidiumaculeatum)、白色假丝酵母(Candida albicans)、白色假丝酵母类星状变种(Candida albicans var.stellatoidea)、Candida bentonensi、链状假丝酵母(Candida catenulate)、弯假丝酵母(Candida curvata)、著明假丝酵母(Candidafamata)、光滑假丝酵母(Candida gabrata)、吉利蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)、西班牙假丝酵母(Candida hispaniensis)、土生假丝酵母(Candidhumicola)、中型假丝酵母(Candida intermedia)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、克鲁斯氏假丝酵母(Candida krusei)、溶脂假丝酵母(Candida lipolytica)、Candida loxderi、马其顿假丝酵母(Candida macedoniensis)、木兰假丝酵母(Candida magnoliae)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、Candida melinii、Candida nitratophila、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、菌膜假丝酵母(Candida pelliculosa)、Candida pintolopesii、Candida pinus、铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)、粗壮假丝酵母(Candida robusta)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、产朊假丝酵母菌(Candida utilis)、涎沫假丝酵母(Candida zeylanoides)、卢西坦棒孢(Clavisporalusitaniae)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、白色隐球菌液化变种(Cryptococcus albidus var.diffluens)、枸杞隐球酵母(Cryptococcus kuetzingii)、劳伦梯氏隐球菌(Cryptococcus laurentii)、淡黄隐球菌(Cryptococcus luteolus)、新型隐球菌盖替变种(Cryptococcus neoformans var.gattii)、新型隐球菌新型变种(Cryptococcus neoformans var.neoformans)、土隐球菌(Cryptococcusterreus)、单咽隐球菌(Cryptococcus uniuttulatus)、汉逊德巴利酵母汉逊变种(Debaryomyces hansenii var.hansenii)、多形德巴利酵母(Debaryomycespolymorphus)、伯顿拟内孢霉(Endomycopsis burtonii)、扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)、Filobasidium capsuligenum、念珠地丝菌(Geotrichum candidum)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、碎囊汉逊酵母(Hansenula capsulata)、Hansenula glucozyma、杰丁汉逊酵母(Hansenulajadinii)、Hansenula petersonii、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、魏氏汉逊酵母(Hansenula wickerhamii)、博伊丁克勒克酵母(Kloeckera boidinii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母乳酸变种(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、厚皮病马拉色菌(Malassezia pachydermatis)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、松毕赤酵母(Pichia pinus)、亚膜汉逊酵母(Pichia subpelliculosa)、瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)、橙黄红酵母(Rhodotorula araucariae)、牧草红酵母(Rhodotorula graminis)、粘红酵母(Rhodotorula glutinus)、小红酵母(Rhodotorula minuta)、深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、椭圆酵母(Saccharomyces ellisdoideus)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、不对称掷孢酵母(Sporobolomyces holsticus)、玫瑰色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)、戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、头状毛孢子菌(Trichosporoncapitatum)、皮肤毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)、Trichosporon fennicum、发酵丝孢酵母(Trichosporon fermentans)、芽毛孢子菌(Trichosporon pullulans)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、和鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。本领域普通技术人员会知道可以依照目前公开的组合物和方法使用的其它合适的酵母。

在某些实施方案中，要依照本文中公开的用于展示抗体多肽或抗体多肽片段的组合物和方法采用的酵母物种是耶氏酵母属的酵母。例如，可以在解脂耶氏酵母酵母细胞的表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段，例如，本文中描述的任何抗体多肽或片段。

解脂耶氏酵母是半子囊菌(hemiascomycetous)酵母的一种商业上有用的物种，已知其同化碳氢化合物，并且在有氧条件下自n-烷、植物油或葡萄糖生成柠檬酸。例如，已知解脂耶氏酵母降解棕榈油压榨机流出物、TNT、和其它碳氢化合物诸如烷、脂肪酸、脂肪和油。解脂耶氏酵母与大多数其它酵母物种远缘相关，并且与丝状真菌共享许多共同特性。解脂耶氏酵母具有单-二倍体循环，即它在单倍体和二倍体阶段间交替。

在某些实施方案中，用包含编码感兴趣多肽的核苷酸序列的载体或表达盒转化酵母细胞。可以依照本文中公开的组合物和方法使用多种酵母转化方法之任一种。转化方法的非限制性例子包括热休克、电穿孔和乙酸锂介导的转化。本领域普通技术人员会知道适合于要转化的酵母的酵母转化方法。

生长条件

在某些实施方案中，将酵母细胞（例如，本文中描述的任何酵母细胞）在培养物中培养或增殖。例如，可以将用如本文中在题目为“表达盒或载体”的部分中描述的一种或多种表达盒或载体转化的酵母细胞在培养物中培养或增殖。在某些实施方案中，将耶氏酵母属，例如，解脂耶氏酵母的酵母在培养物中培养或增殖。在某些实施方案中，在耶氏酵母属细胞操作条件下培养耶氏酵母属细胞。如本文中所使用的，术语“耶氏酵母属细胞操作条件”指与不在所述耶氏酵母属细胞操作条件下培养的耶氏酵母属细胞相比耶氏酵母属细胞展现出多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）在其表面上的展示改善的生长或培养条件。例如，在耶氏酵母属细胞操作条件下培养的耶氏酵母属细胞可以展现出：其表面上的多肽水平升高、表达多肽的稳定性、构象或功能改善、或多肽的表达维持的时间长度延长。

在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包含低诱导温度。例如，可以将包含用于表达抗体多肽或抗体多肽片段的载体或表达盒的耶氏酵母属细胞对一些或整个细胞培养于低诱导温度培养。如下文实施例3中所描述的，一般地，折叠应激于较低的培养温度是降低的。如此，可以通过在低诱导温度下培养此类耶氏酵母属细胞来降低或消除折叠应激和其它有害过程。在某些实施方案中，于约15和约25摄氏度间，例如，约15和约24摄氏度间、约15和约23摄氏度间、约15和约22摄氏度间、约15和约21摄氏度间、约15和约20摄氏度间、约16和约25摄氏度间、约17和约25摄氏度间、约18和约25摄氏度间、约19和约25摄氏度间、约20和约25摄氏度间的诱导温度范围及中间的任何范围培养耶氏酵母属细胞。在某些实施方案中，于约15摄氏度、约16摄氏度、约17摄氏度、约18摄氏度、约19摄氏度、约20摄氏度、约21摄氏度、约22摄氏度、约23摄氏度、约24摄氏度、或约25摄氏度的诱导温度培养耶氏酵母属细胞。“约”在该术语在本文中提及温度使用时指给定温度数值左右的范围。一般地，在提及给定的温度数值使用时，术语“约”指在所述数值的+/-10％，例如，所述数值的+/-9%、所述数值的+/-8%、所述数值的+/-7%、所述数值的+/-6%、所述数值的5%、所述数值的+/-4%、所述数值的+/-3%、所述数值的+/-2%、所述数值的+/-1%或更小内的数值范围。在提及给定的温度数值使用时，术语“约”涵盖精确的数值，例如，如在实验误差内确定的。在某些实施方案中，将耶氏酵母属细胞在细胞培养的一部分（例如，初始部分）期间于较高的诱导温度或温度范围，但是在细胞培养的不同部分（例如，最终部分）期间于较低的诱导温度或温度范围培养。在某些实施方案中，将耶氏酵母属细胞在细胞培养中表达感兴趣多肽的那部分期间于较低的诱导温度或温度范围培养。例如，编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列可以与诱导型启动子可操作连接，并且可以将耶氏酵母属细胞在细胞培养中诱导启动子以表达抗体多肽或抗体多肽片段的那部分期间于较低的诱导温度或温度范围培养。

在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包含短诱导时间。例如，可以将包含用于表达抗体多肽或抗体多肽片段的载体或表达盒的耶氏酵母属细胞在细胞培养中培养短的诱导时间。如下文实施例4中所描述的，较短的诱导时间导致抗体多肽片段的表达水平升高。在某些实施方案中，将耶氏酵母属细胞培养约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时的诱导时间，或这些数值间的任何诱导时间。“约”在该术语在本文中提及诱导时间数值使用时指给定数值左右的范围。一般地，在提及给定的诱导时间数值使用时，术语“约”指在所述数值的+/-10%，例如，所述数值的+/-9%、所述数值的+/-8%、所述数值的+/-7%、所述数值的+/-6%、所述数值的5%、所述数值的+/-4%、所述数值的+/-3%、所述数值的+/-2%、所述数值的+/-1%，或更小内的数值范围。在提及给定诱导时间数值使用时，术语“约”涵盖精确的数值，例如，如在实验误差内确定的。

在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包含低pH。例如，可以将包含用于表达抗体多肽或抗体多肽片段的载体或表达盒的耶氏酵母属细胞对一些或整个细胞培养于低pH培养。如下文实施例5中所描述的，pH是调节耶氏酵母属的二态转变的一种因素，是生长培养基的pH；菌丝体形成于接近中性的pH是最大的，并且随pH下降而降低，于pH 3几乎变为零的。如此，可以通过在低pH培养物中培养耶氏酵母属细胞来降低或消除菌丝体形成。在某些实施方案中，将耶氏酵母属细胞于约2和约4间，例如约2.1和约4间、约2.2和约4间、约2.3和约4间、约2.4和约4间、约2.5和约4间、约2.6和约4间、约2.7和约4、约2.8和约4、约2.9和约4、约3和约4、约2和约3.9、约2和约3.8、约2和约3.7、约2和约3.6、约2和约3.5、约2和约3.4、约2和约3.3、约2和约3.2、约2和约3.1、约2和约3、约2.5和3.5、约2.5和3、约3和3.5的pH范围或中间的任何pH范围培养。在某些实施方案中，将耶氏酵母属细胞于约2、约2.1、约2、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、或约4的pH培养。“约”在该术语在本文中提及pH使用时，指给定数值左右的范围。一般地，在提及给定的pH数值使用时，术语“约”指所述数值的+/-10%，例如，所述数值的+/-9%、所述数值的+/-8%、所述数值的+/-7%、所述数值的+/-6%、所述数值的5%、所述数值的+/-4%、所述数值的+/-3%、所述数值的+/-2%、所述数值的+/-1%，或更小内的数值范围。在提及给定的pH数值使用时，术语“约”涵盖精确的数值，例如，如在实验误差内确定的。在某些实施方案中，将耶氏酵母属细胞在细胞培养的一部分（例如，初始部分）期间于较高的pH或pH范围，但是在细胞培养的不同部分（例如，最终部分）期间于较低的pH或pH范围培养。在某些实施方案中，将耶氏酵母属细胞在细胞培养中表达感兴趣多肽的那部分期间于较低的pH或pH范围培养。例如，编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列可以与诱导型启动子可操作连接，并且可以将耶氏酵母属细胞在细胞培养中诱导启动子以表达抗体多肽或抗体多肽片段的那部分期间于较低的pH或pH范围培养。

在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包含高通气。例如，可以将包含用于表达抗体多肽或抗体多肽片段的载体或表达盒的耶氏酵母属细胞对一些或整个细胞培养在高通气条件下培养。如下文实施例3中所描述的，提高细胞培养的通气改善表达的抗体多肽片段的细胞表面展示。在某些实施方案中，将耶氏酵母属细胞在摇瓶中培养以改善通气。在某些实施方案中，测量培养物的百分比氧饱和，并保持在给定水平以上以确保在足够高的通气条件下培养培养物。例如，在发酵罐条件下，高通气条件可以于30-50%氧饱和，例如，至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或更高实现。可用于改善细胞培养通气的其它容器会是本领域普通技术人员已知的。

在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包含在极限培养基中培养培养物。如下文实施例3中所描述的，在极限培养基中温育细胞培养物改善表达的抗体多肽片段的细胞表面展示。“极限培养基”在该术语在本文中使用时指包含支持细胞培养物（例如，耶氏酵母属细胞培养物）生长需要的最低限度元素的培养基。极限培养基通常含有供生长用的碳源（例如，葡萄糖）、盐形式的各种痕量元素（例如，镁、氮、磷、和/或硫）、氮源、和水。极限培养基缺乏酵母提取物、细菌用蛋白胨、或这两者。给定的生物体在一种极限培养基中培养时可能能够生长，但是在另一种极限培养基中培养时可能不能生长。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包含在极限补充培养基中培养培养物。“极限补充培养基”在该术语在本文中使用时指补充有氨基酸的极限培养基。极限补充培养基可以补充有一种或几种氨基酸，或可以补充有大多数生物体使用的整组的所有20种氨基酸。本领域普通技术人员会知道多种极限培养基，而且依照本文中公开的组合物和方法会能够确定可以使用哪种极限培养基来支持给定生物体的生长。

在某些实施方案中，将耶氏酵母属细胞同时在两种或更多种耶氏酵母属细胞操作条件下培养。例如，将耶氏酵母属细胞在选自下组的两种或更多种耶氏酵母属细胞操作条件下培养：低诱导温度、短诱导时间、低pH、高通气、在极限培养基中生长及其组合。

一般地，报告了60-80%的用供表面展示多肽用的载体转化的酿酒酵母细胞实际上在其表面上表达多肽。相反，使用本文中描述的方法和组合物，高得多的百分比的在一种或多种耶氏酵母属操作条件下培养的耶氏酵母属细胞在其表面上展现出抗体多肽或抗体多肽片段。例如，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%的在一种或多种耶氏酵母属操作条件下培养的耶氏酵母属细胞在其表面上展现出抗体多肽或抗体多肽片段。如提及在其表面上展现出抗体多肽或片段的耶氏酵母属细胞的数目使用的，“约”指所述数值的5%内的数值，而且还包括精确的数值。在某些实施方案中，超过约99%（例如，100%）的在一种或多种耶氏酵母属操作条件下培养的耶氏酵母属细胞在其表面上展现出抗体多肽或抗体多肽片段。

在某些实施方案中，包含用于表达抗体多肽或抗体多肽片段的载体或表达盒的耶氏酵母属细胞进一步包含蛋白伴侣多肽。如本领域中已知的，蛋白伴侣多肽帮助其它多肽的非共价折叠和/或装配。如实施例7中所描述的，分子蛋白伴侣，诸如蛋白质二硫键异构酶(PDI)和免疫球蛋白结合蛋白(Kar2/BiP)在酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中的过表达改善scFv和Fab片段的表达。在酵母中，BiP/GRP78由KAR2基因编码。如此，在某些实施方案中，用包含编码蛋白伴侣多肽的核苷酸序列的核酸转化耶氏酵母属细胞。可以依照本文中公开的组合物和方法有利使用的蛋白伴侣多肽的非限制性例子包括PDI、Kar2/Bip、和HACI。在某些实施方案中，用包含在启动子控制下的编码蛋白伴侣多肽的核苷酸序列的核酸转化耶氏酵母属细胞。例如，蛋白伴侣可以在组成性、半组成性、或诱导型启动子的控制下。在某些实施方案中，在细胞培养中与感兴趣多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段）相同的部分期间表达蛋白伴侣多肽。本领域普通技术人员会知道其它蛋白伴侣多肽，而且会能够在与目前公开的组合物和方法一起使用时使用它们并评估它们的效力。

应用

可以在多种应用中使用本文中公开的组合物和方法。作为一个非限制性例子，可以使用本文中公开的组合物和方法来对抗体多肽或抗体多肽片段文库筛选结合给定抗原的能力。

在某些实施方案中，酵母细胞（例如，耶氏酵母属细胞，诸如解脂耶氏酵母）在其表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段，并对细胞测试其结合给定抗原的能力。在某些实施方案中，酵母细胞表达两种抗体多肽或抗体多肽片段，该抗体多肽或其片段彼此联合，使得它们一起能够结合抗原。例如，重链Fab片段和轻链Fab片段可以在酵母的细胞表面上展示，所述Fab片段彼此联合以形成功能性抗原结合模块。在某些实施方案中，在酵母的细胞表面上展示scFv抗体多肽片段，所述scFv片段可以结合给定的抗原。在某些实施方案中，用包含如下的核酸序列的载体或表达盒转化酵母细胞（例如，耶氏酵母属细胞，诸如解脂耶氏酵母），所述核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，用两种或更多种载体和/或表达盒（它们各包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列）转化酵母细胞（例如，耶氏酵母属细胞诸如解脂耶氏酵母）。在某些实施方案中，用包含两种或更多种核酸序列（它们各包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列）的载体或表达盒转化酵母细胞（例如，耶氏酵母属细胞诸如解脂耶氏酵母）。

在某些实施方案中，用载体或表达盒的文库转化多个酵母细胞（例如，耶氏酵母属细胞诸如解脂耶氏酵母）以生成抗体多肽酵母文库，所述文库包含多种核酸序列，所述多种核酸序列包含编码多种抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列。如本文中使用的，术语“抗体多肽酵母文库”指在其表面上展示多种抗体多肽或抗体多肽片段的多种酵母细胞。可以使用此类抗体多肽酵母文库来筛选文库中结合一种或多种特定抗原的抗体多肽或抗体多肽片段。

在某些实施方案中，用载体或表达盒的文库转化多个酵母细胞（例如，耶氏酵母属细胞诸如解脂耶氏酵母），该文库包含多种核酸序列，所述多种核酸序列包含编码多种抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列。例如，文库或载体或表达盒可以包含多种核酸序列，其包含编码多种scFv抗体多肽片段的核苷酸序列。可以使用此类多种经转化的酵母细胞来筛选结合一种或多种特定抗原的scFv抗体多肽片段。

在某些实施方案中，用如下的载体或表达盒的文库转化第一多个单倍体酵母细胞（例如，耶氏酵母属细胞诸如解脂耶氏酵母），该文库包含多种核酸序列，所述多种核酸序列包含编码多种抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，并用如下的载体或表达盒的文库转化第二多个单倍体酵母细胞（例如，耶氏酵母属细胞诸如解脂耶氏酵母），该文库包含多种核酸序列，所述多种核酸序列包含编码多种抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，用相同文库转化第一和第二多个单倍体酵母细胞。例如，可以用包含编码重和轻链抗体多肽或片段两者的核苷酸序列的文库转化第一和第二多个单倍体酵母细胞。在某些实施方案中，用不同文库转化第一和第二多个单倍体酵母细胞。例如，可以用包含编码重链抗体多肽或片段的核苷酸序列的文库转化第一多个单倍体酵母细胞，而可以用包含编码轻链抗体多肽或片段的核苷酸序列的文库转化第二多个单倍体酵母细胞。

在某些实施方案中，将用文库转化的第一和第二多个单倍体酵母细胞彼此交配以形成包含来自每种文库的载体或表达盒的多个二倍体酵母。例如，可以将用包含编码重链抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列的文库转化的第一多个单倍体酵母细胞与用包含编码轻链抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列的文库转化的第二多个单倍体酵母细胞交配以生成包含重和轻链抗体多肽或抗体多肽片段两者的多个二倍体酵母细胞。可以使用此类多个二倍体酵母细胞来筛选结合一种或多种特定抗原的抗体多肽或片段。此类实施方案的有利之处在于它们容许筛选重和轻链抗体多肽或抗体多肽片段的极其多种不同组合。

在某些实施方案中，改善或优化抗体多肽或抗体多肽片段对特定抗原的结合特异性。可以使用定向进化或亲和力成熟来改善或优化抗体多肽或抗体多肽片段的结合特异性。例如，Fujii（Antibody Engineering,第248卷,第345页-第359页,2004，通过提及而将其完整收入本文）描述了抗体的亲和力成熟的方法。类似地，Boder等（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.Sep26;97(20):10701-5,2000，通过提及而将其收入本文）描述了scFv片段的定向进化。可以在改善或优化抗体多肽或抗体多肽片段的结合特异性中采用这些和其它技术。

在某些实施方案中，可以分离包含编码如下的抗体多肽或片段的核苷酸序列的核酸序列，所述抗体多肽或片段结合或怀疑结合特定的抗原。然后，可以通过改变一个或多个核苷酸残基来修饰此类核酸序列。在某些实施方案中，核酸序列是载体或表达盒的一部分。然后，可以对经修饰的一种或多种核酸测试结合抗原（例如，初始抗原或另一种不同抗原）的能力。例如，可以将经修饰的核酸导入（例如通过转化）酵母细胞中，将该酵母细胞在生长条件（例如，耶氏酵母属操作条件）下温育，使得在其细胞表面上表达抗体多肽或其抗体多肽片段。然后，可以使酵母与感兴趣抗原接触，并且可以测试结合。

用于修饰核酸序列的多种技术是本领域中已知的，任何所述技术可以依照目前公开的方法和组合物使用。例如，可以使用放射、化学诱变剂、易错PCR或饱和诱变。其它技术可参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2增补版,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989，通过提及而将其内容完整收入本文。本领域普通技术人员会知道适合于修饰核酸序列的技术。

用于测试展示抗体多肽或抗体多肽片段的细胞对给定抗原的结合的多种技术是本领域中已知的，任何所述技术可以依照目前公开的方法和组合物使用。作为一个非限制性例子，可以使用ELISA测定法。

在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的亲本载体或亲本表达盒，所述抗体多肽或抗体多肽片段在细胞表面上展示，并且结合特定的抗原（例如，靶多肽）。在某些实施方案中，如上文所描述的，将亲本载体或亲本表达盒分离并进行修饰以生成一种或多种经修饰的载体或表达构建体。在某些实施方案中，编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列中存在此类修饰。然后，可以将一种或多种经修饰的载体或表达构建体转化入缺乏亲本载体或亲本表达盒的一种或多种第二耶氏酵母属细胞中。例如，然后，可以将一种或多种经修饰的载体或表达构建体转化入多个耶氏酵母属细胞中，将所述多个耶氏酵母属细胞在耶氏酵母属细胞操作条件下培养以生成耶氏酵母属抗体多肽酵母文库，其成员在其表面上展示多种经修饰的抗体多肽或其抗体多肽片段。然后，可以对耶氏酵母属抗体多肽酵母文库的成员测试其结合特定抗原，例如由亲本载体或亲本表达盒编码的抗体多肽或抗体多肽片段结合的抗原的能力。可以自耶氏酵母属抗体多肽酵母文库中展现出对抗原的结合改善（例如，展现出更大的或更特异性的亲和力或亲合力）的那些成员分离经修饰的载体或表达盒。在某些实施方案中，将此步骤系列重复一次或多次。在某些实施方案中，将此步骤系列重复，直至获得展现出期望的结合水平的抗体多肽或抗体多肽片段。

在某些实施方案中，将由亲本载体或亲本表达盒中的核苷酸序列编码的抗体多肽或抗体多肽片段修饰为使得经修饰的抗体多肽或片段展现出对由亲本载体或亲本表达盒编码的抗体多肽或抗体多肽片段结合的相同抗原的结合改善或优化。在某些实施方案中，将由亲本载体或亲本表达盒中的核苷酸序列编码的抗体多肽或抗体多肽片段修饰为使得经修饰的抗体多肽或片段展现出对由亲本载体或亲本表达盒编码的抗体多肽或抗体多肽片段结合的不同抗原的结合改善或优化。例如，可以将已知结合第一抗原的抗体多肽或片段修饰为使得其抗原特异性得到改变。

本领域普通技术人员会知道其它应用，而且会能够采用本文中公开的组合物和方法以用于此类应用。

试剂盒

在某些实施方案中，提供了包含本文中描述的一种或多种组合物的试剂盒。在某些实施方案中，提供了用于实施本文中描述的一种或多种方法的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包含用于在酵母细胞表面上表达感兴趣多肽，例如，抗体多肽或抗体多肽片段、锚多肽、或这两者的组分。例如，试剂盒可以包含用于转化或培养酵母的一种或多种表达盒、载体、酵母、和/或组分。在某些实施方案中，用于转化或培养酵母的表达盒、载体、酵母、和/或组分是诸如本说明书中所描述的。

在某些实施方案中，试剂盒包含表达盒或载体，所述表达盒或载体包含核酸序列，所述核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段、锚多肽、或这两者的核苷酸序列。在某些实施方案中，试剂盒包含酵母诸如耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞。在某些实施方案中，试剂盒的耶氏酵母属细胞是转化感受态的。在某些实施方案中，试剂盒的耶氏酵母属细胞与可以用于使耶氏酵母属细胞成为转化感受态的一种或多种组分包装在一起。

在某些实施方案中，试剂盒包含关于使用试剂盒的表达盒、载体或其它组分的书面用法说明书，例如，关于使用试剂盒的表达盒、载体或其它组分以在酵母细胞表面上表达感兴趣多肽（例如，抗体多肽或抗体多肽片段、锚多肽、或这两者）的书面用法说明书。

实施例

实施例1：材料和方法

使用的菌株：使用大肠杆菌MC1061进行标准的DNA扩增和克隆。使用解脂耶氏酵母PO1d(MatA,leu2-270,xpr2-322)、PO1d(MatA,ura3-302,leu2-270,xpr2-322)和PO1d(MatA,ura3-302,leu2-270,Ade2-844,xpr2-322)作为接受体进行载体转化。

scFv表达质粒：生成4种合成构建体以容许在分子锚序列上游SfiI/NotI克隆scFv片段。在SfiI限制性位点的N端，添加BsmI限制性位点以在最终的表达质粒中在前LIP2或前原LIP2C端进行融合。在NotI限制性位点的下游，添加c-Myc标签，其接着是(Gly4Ser)3接头及NdeI和AvrII限制性位点以更换锚定域。对于锚定，将下列耶氏酵母属密码子优化序列在NheI和AvrII位点间插入合成的构建体中：1)酿酒酵母SAG1的C端末端(960bp)(ID 853460)、2)酿酒酵母AGA2(ID 852851)或3)解脂耶氏酵母CWPI的C端末端(333bp)（登录号AY084077）。生成第二合成构建体，其中AGA2分子锚位于scFv的N端。在这里，经密码子优化的成熟的酿酒酵母AGA2前面有BsmI位点并且后面有(Gly4Ser)3接头、SfiI/NotI围绕的scFv编码序列、c-myc和6-his表位标签和AvrII限制性位点。用BsmI(T4)和AvrII消化完整的合成的构建体，并将其克隆入经SacII(T4)/AvrII消化的pYLPLXL2pre中。对于表达AGA1，将前面有BsmI且后面有AvrII的经密码子优化的成熟的酿酒酵母AGA1用BsmI(T4)和AvrII消化，并克隆入经SacII(T4)/AvrII消化的pYLPUXL2pre中。

为了容许scFv片段的可溶性表达，合成生成经耶氏酵母属密码子优化的分泌构建体。此构建体含有V5和6-his表位标签，其在5’端前面有SfiI/NotI限制性位点以进行scFv克隆。将此构建体用BsmI(T4)和AvrII消化，并克隆入经SacII(T4)/AvrII消化的pYLPUXL2pre中。经密码子优化的曲妥单抗(trastuzumab)scFv和4-4-20scFv及抗HEL scFv的D1.3和M3合成，并在SfiI和NotI限制性位点间插入所描述的质粒中。抗荧光素4-4-20抗体充当用于开发酿酒酵母表面展示平台的模式蛋白质（Boder，E.T.和Wittrup,K.D.,Nat.Biotechnol.15,553-7,1997,通过提及而将其完整收入本文）。曲妥单抗（赫赛汀

）（其结合细胞表面抗原HER-2/neu原癌基因）在临床上批准用于治疗乳腺癌（Cho等,Nature,421,756-760,2003，通过提及而将其完整收入本文）。

Fab表达构建体：对于重链表达质粒，使用SfiI和NotI将经耶氏酵母属密码子优化的重链恒定区CH1域克隆入四种合成构建体中，如对scFv克隆描述的。然后，使用SfiI和NheI将VH的cDNA克隆入这些质粒中。最后，与对scFv完成的事情类似地，将Fab表达盒克隆入pYLPLXL2pre。

在scFv表达质粒上建立轻链表达质粒。因此，用SfiI和NotI将经耶氏酵母属密码子优化的Cκ1（轻链恒定区κ）插入此载体中。然后，使用SfiI和BsiWI将VL的cDNA克隆入此质粒中。

通过PCR自scFv表达质粒扩增曲妥单抗和4-4-20可变域，其中添加需要的限制性位点以克隆入开发的Fab表达质粒中。如上文所描述的，将最终的质粒转化入合适的解脂耶氏酵母菌株中，以创建完全互补的最终菌株。

生长条件：在丰富YPD培养基（1%酵母提取物、1%细菌用蛋白胨、1%葡萄糖）上或在补充有CSM（MSM；0.67%没有氨基酸和硫酸铵的酵母氮基、0.4%NH4Cl、0.079%CSM）且补充有葡萄糖2%或油酸2%作为碳源的极限培养基上在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中于28°C培养解脂耶氏酵母菌株。对于关于pH测试的实验，于pH 5或pH 3使用50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液。

为了诱导细胞表面展示，将酵母细胞在极限葡萄糖培养基中于28°C且以180rpm培养24小时。次日，测量培养物的OD600；将细胞用dH₂O清洗两次，以OD600为0.1在极限油酸培养基中重悬，并于20°C且以180rpm培养16小时。将细胞以5mL培养物在50mL FALCON管中或以20mL培养物在250mL带挡板的摇瓶中培养。

流式细胞术：通过用针对c-Myc或V5表位的抗体的间接免疫染色证明表面表达。因此，在诱导后，将1ml补充有0.1%BSA的PBS(pH7.2)(PBS/BSA)中的2x10⁶个细胞与1μg/ml抗c-Myc抗体(Sigma)或抗V5抗体(Invitrogen)一起温育30分钟。若合适的话，使用生物素化的HEL(Sigma)或重组HER2-Fc嵌合蛋白(R&D Systems)。使用来自Pierce的EZ-Link Micro生物素化试剂盒进行HEL的生物素化。然后，将细胞用冰冷的PBS/BSA清洗，并与第二检测试剂一起温育30分钟。使用山羊抗小鼠Alexa-488或藻红蛋白缀合的抗体检测结合的抗c-Myc或抗V5抗体。对于检测生物素化的抗原，用链霉亲合素-藻红蛋白检测。将细胞用冰冷的PBS/BSA清洗两次，之后在FACSCalibur流式细胞仪上分析。

Kd测定：如前文所描述的，将细胞培养并诱导。将200μl PBS/BSA中1x10⁶个细胞的等分试样与浓度范围为0.01nM至1μM的合适抗原一起温育，并容许于25°C通过温育60分钟接近平衡。接着，通过离心将细胞沉淀，在冰冷的PBS/BSA中清洗，并在1ml冰冷的PBS/BSA中重悬以在FACSCalibur流式细胞仪上分析。记录细胞的均值荧光强度。使用非线性最小二乘方曲线拟合自荧光数据测定平衡解离常数(Kd)。

使用易错PCR构建多样化的全集：使用易错PCR随机突变抗HEL scFv片段D1.3，如先前所描述的（见Chao等,Nat.Protoc.1,755-68,2006，通过提及而将其完整收入本文）。简言之，使用引物pPOX2Fw和ζRv自pYLPUXL2preA2D1.3扩增scFv ORF(Chao等,Nat.Protoc.1,755-68,2006)。扩增后，用SfiI和NotI消化PCR产物。将消化的产物进行凝胶纯化，并克隆入经类似处理的（经SfiI和NotI消化的）含有野生型D1.3的载体中。使用Qiagen质粒纯化试剂盒自这些文库制备质粒DNA，随后将其转化入耶氏酵母属菌株pO1d中，如上文所描述的。

文库选择：将突变体D1.3全集培养，并将抗体表达诱导16小时，如上文所描述的。用抗c-Myc(1μg/ml)和300nM生物素化的HEL标记全集，直至达到平衡（3小时），接着用未标记的HEL竞争20分钟。接着，用第二Alexa-488标记的山羊抗小鼠IgG(1μg/ml)和链霉亲合素-藻红蛋白(1μg/ml)标记细胞。在所有温育步骤后，将细胞用1ml PBS/BSA清洗两次。最后一次清洗后，将细胞在冰上保持以阻止抗原解离。将样品在Epics Altra流式细胞仪上以约2000个细胞/秒的分选速率分选。通过门控更小百分比的最高抗原结合群体在升高严格性的情况中在三个连续轮次中分选细胞。对选定克隆的序列分析揭示了两种克隆（克隆13和克隆38）含有突变[I160V]（克隆13）和[I160V；T228A]（克隆38）。通过平衡滴定对这些克隆评估抗原结合，并且其显示了1.8和2.4倍改善的亲和力，其与M3突变体位于相同范围中（见图18）。

实施例2：构建一组scFv、Fab和全长IgG展示质粒

创建通用表面展示平台，以容许使用不同锚定分子展示scFv片段。创建总共4种展示质粒，其容许以如下形式展示scFv片段：1)与酿酒酵母Sag1p的C端部分（320个C端AA）的N端融合物（A1）、2)与酿酒酵母Aga2p的N端融合物（A2）、3)与解脂耶氏酵母CwpIp的C端部分（110个C端AA）的N端融合物（A3）和4)与Aga2p的C端融合物（A4）。表达由诱导型pPOX2启动子驱动，并且LIP2pre前导序列在N端附加于scFv以经由分泌装置驱动对每种多肽的加工，最终生成正确加工的表面展示蛋白。作为变体，还使用LIP2prepro作为α-凝集素融合物(A1)中曲妥单抗scFv的前导物以容许比较展示水平。此实验策略基于如下的推理，即多种展示形式的使用不仅会提高成功的机会，而且根据锚与scFv或Fab片段的N还是C端融合，还会容许展示具有游离羧基或氨基端的抗体片段，即先前显示影响展示的scFv的结合特征的一项特征（Wang,Z.等,Protein Eng.Des.Sel.18,337-43,2005，通过提及而将其完整收入本文）。表位标签(c-Myc)的添加容许监测每种多肽的展示，而且容许标准化的选择。

对于Fab展示，使用与对scFv片段(A1-4)所描述相同的锚定分子将重链Fab片段锚定于酵母表面，而将轻链Fab片段以可溶性片段(FabLC)表达。为了容许这两条链以化学计算量存在，使用LIP2pre作为前导序列通过诱导型pPOX2启动子驱动这两种表达盒。Fab重链(CH1-VH)(c-Myc)和轻链（C端V5和6-his表位标签）的不同表位标签的存在容许每种多肽的同时且独立显现。

对于全长IgG展示，使用如对scFv和Fab所描述的两种锚定分子：A2和A4（分别是AGA2的N和C端拴系）将全长曲妥单抗重链锚定于酵母细胞表面。为了容许这两条链以化学计算量存在，使用LIP2pre作为前导序列通过诱导型pPOX2启动子驱动这两种表达盒。重链(HC)(c-Myc)和轻链(LC)（C端V5和6-his表位标签）的不同表位标签的存在容许每种多肽的同时且独立显现。

将所有展示盒针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，因为显示了密码子优化一般导致异源蛋白质表达水平的二倍改善。使用一组两种充分表征的抗体：抗荧光素4-4-20抗体（其已经充当用于开发酿酒酵母表面展示平台的模式蛋白质）（Boder,E.T.和Wittrup,K.D.,Nat.Biotechnol.15,553-7,1997，通过提及而将其完整收入本文）和曲妥单抗（赫赛汀

）（其结合细胞表面抗原HER-2/neu原癌基因，并且在临床上批准用于治疗乳腺癌）分析展示系统。

所有载体携带捷塔元件（来自Ylt1反转录转座子的长末端重复(LTR)），其容许载体通过同源重组（在携带Ylt1的解脂耶氏酵母菌株中），或通过非同源重组（在缺乏此反转录转座子的菌株中）来整合。所有scFv表达构建体及Fab重链(CH1-VH)表达构建体携带LEU2营养缺陷型标志物。Fab轻链片段表达质粒携带URA3d1标志物。对于Aga2p融合物的展示，存在另一种表达酿酒酵母AGA1的表达构建体。AGA1是AGA2的异二聚化配偶体。因此，生成两种构建体（具有营养缺陷型标志物URA3和ADE2）以容许在pPOX2启动子下并使用LIP2pre作为成熟的Aga1p的前导物表达AGA1。表达构建体的转化在每种情况中导致完全互补的菌株。图1显示了为了展示scFv和Fab片段构建的表达质粒的示意图。

实施例3：细胞展示的改善

对于初始实验，将展示菌株的阳性转化体于28°C在50ml YPD培养基中在250ml烧瓶中培养过夜。此后，将细胞在dH₂O中清洗，在油酸丰富培养基中重悬，并于28°C在250ml烧瓶中培养48小时。在初始实验中，使用对c-Myc表位标签的免疫学染色和FACS分析没能检出表面表达（数据未显示）。因此，测试不同生长条件。

通过改变生长温度，许多重要的细胞过程受到影响，包括应激响应和蛋白质折叠。一般地，折叠应激于较低的培养温度降低，实现更有效的异源蛋白质分泌/表面展示水平。见例如Dragosits,M.等,J.Proteome Res.,2009，通过提及而将其完整收入本文。因此，于20°C和28°C的诱导温度比较scFv和Fab片段的表面表达水平。

细胞壁是一种含有高度多样性蛋白质群体的高度适应性细胞器。已经在酿酒酵母中显示了主要在活性细胞壁生物发生的部位，即在生长的子细胞的部位发生新的大分子（例如，GPI锚定的蛋白质）对现有聚合物网络的插入（Klis,F.M.,等,Yeast 23,185-202,2006，通过提及而将其完整收入本文）。认为解脂耶氏酵母的细胞壁的分子组织与酿酒酵母的细胞壁的分子组织相似。测试于20°C生长是否会减缓细胞壁形成，如此容许更多异源蛋白在细胞壁生物发生的部位积累。还有，为了研究通气的影响，将细胞在非通气的50mlFALCON管及250ml摇瓶中培养。最后，测试极限补充培养基(MM)中的生长。使用展示4-4-20α-凝集素(Sag1p)的菌株进行此实验。作为对照菌株，选择完全大小单克隆曲妥单抗抗体生成菌株（菌株1T2，其不含表面表达盒）。

如图2中描绘的，对于FALCON(76%)和摇瓶培养物(86%)两者在将细胞于20°C在极限补充培养基中诱导20小时时在FACS分析时出现大的c-Myc阳性群体，其中摇瓶培养物显示略高的展示水平（MFI（均值荧光强度）相差2倍）。在将细胞在MM中于28°C培养时，仅小分数的细胞展示抗体片段。还有，在将细胞在RM中于20°C培养时，表面展示是不明显的。在诱导40小时时分析时，对测试的所有生长条件，所有c-Myc检测消除（数据未显示）。不希望受限于理论，这可以通过对展示蛋白质的蛋白水解或由形态学变化或细胞壁结构变化引起的c-Myc表位隐蔽解释。

实施例4：诱导时间对表面展示水平的影响

因为c-Myc阳性细胞于较长的诱导时间消失，所以实施时间-动力学实验以在多个诱导时间测量展示水平。因此，在16、20、24、32和43小时诱导时实施对菌株n1（经4-4-20scFv Sag1转化的pO1d）的FACS分析。

如图3的顶部小图中所描绘的，在诱导16小时时达到最大表达水平，其中95%的细胞显示适度的表达水平（比背景高10倍）。表达c-Myc的细胞的相对比例随诱导时间延长而降低（16小时后的95%、20小时后的86%、24小时后的53%、32小时后的19%、和43小时后的7%）。还有，在诱导期间观察到自身荧光（5倍）和阳性细胞均值荧光（20倍）的降低。不希望受限于理论，降低的自身荧光可能是降低的细胞大小的结果。对于FSC/SSC（正向-侧向散射：这些测量分别指示细胞大小和细胞粒性），观察到显著的改变，这反映形态学发育的显著变化。不希望受限于理论，这些变化的一种解释是细胞在诱导期间经历酵母-菌丝转变。如通过显微术证实的，细胞在较长的诱导后形成更多延长的结构，这支持此假设。重要地，在菌丝形式中，先前显示细胞壁蛋白质含量是降低的，这也可以解释降低的表面展示水平。

实施例5：pH对表面展示水平的影响

解脂耶氏酵母以酵母样和短菌丝体细胞的混合物生长。调节二态转变的一种因素是生长培养基的pH（Ruiz-Herrera,J.和Sentandreu,R.,Arch.Microbiol.178,477-83,2002，通过提及而将其完整收入本文）。已经描述了菌丝体形成于接近中性的pH是最大的，并且随pH降低而降低，于pH 3几乎变为零的（同上文）。

为了在诱导的初始阶段期间避免酵母-菌丝转变，于不同pH值：pH 6.8、pH 5、和pH3培养scFv展示菌株。如图4中所描绘的，在诱导24小时时，于pH5和6.8培养的培养物发生变换，其中展示细胞丧失50%。相反，于pH 3，100%细胞保留细胞展示。与pH 6.8相比，于pH 3的总体展示水平没有升高。在32小时诱导时，于pH 5和6.8观察到c-Myc信号的完全丧失，而所有细胞于pH 3保留scFv展示。于pH 3对较长的诱导时间仅观察到最大表达水平的略微降低。对表面展示的Fab片段看到相似的变化（数据未显示）。在于不同pH培养的培养物间在FSC/SSC概况上观察到显著差异，反映形态学变化。于pH 3，在较长的诱导时间时保留包含非常少的菌丝体细胞的酵母群体，而于pH 5和6.8，观察到更分散的细胞群体，这可能反映向假菌丝生长的转变。

总之，此实施例表明于低pH的生长延长表面展示蛋白的检测，但是不提高总体展示水平。

实施例6：对开发的scFv、Fab和全长IgG菌株的表达分析

使用两种不同scFv片段融合蛋白：4-4-20scFv和曲妥单抗（赫赛汀）scFv用FACS验证新的展示系统。通过c-Myc标签的免疫荧光显微术和流式细胞术检测确认scFv表达，指示scFv产物的表达和正确折叠。图5显示了不同展示形式的这两种scFv片段的表达和配体结合数据。如显示的，对与Sag1p（图5，标记为“A1”的行中的直方图）和Aga2p（图5，标记为“A2”的行中的直方图）的N端融合的这两种scFv片段看到表达，其中对Aga2p融合物实现最高水平（MFI比背景高30倍）。重要地，在酿酒酵母中，总是有不表达表面蛋白的阴性细胞群体(40-80%)存在，而在使用任一种融合物在解脂耶氏酵母中展示scFv时未观察到此现象。不希望限于理论，这点的一种潜在的解释是与使用附加体质粒的酿酒酵母形成对比，表达盒稳定整合入解脂耶氏酵母的基因组中。对于配体结合检测，用链霉亲合素-藻红蛋白检测生物素化的抗原。scFv也能够结合抗原，确认其正确的加工和折叠（见图5，标记为“配体结合”的栏）。即使在测试多个克隆时，未能对与CwpIp的N端融合物（图5，标记为“A3”的行中的直方图）和与Aga2p的C端融合物（图5，标记为“A4”的行中的直方图）检测到表达。几个原因可以造成这些情况中c-Myc检测的缺乏。第一，使用CWPI在耶氏酵母属中成功展示蛋白质至今利用hp4d启动子和Xpr2pre作为前导序列。一种可能性是表达构建体的差异造成观察到的表达缺乏。第二，它可以归因于对表位标签的蛋白水解，这可以使展示的蛋白质不可检出。在使用LIP2prepro作为前导物时，对曲妥单抗（赫赛汀）Sag1p融合物看到约3倍增加（数据未显示）。免疫荧光显微术清楚地表明展示的scFv的细胞表面定位（见图6A）。

为了评估耶氏酵母属细胞是否可以在其表面上功能性装配异二聚体Fab片段，诱导两种不同Fab片段（自4-4-20和曲妥单抗（赫赛汀）抗体衍生）的表达，接着通过免疫荧光显微术和流式细胞术进行表达分析。用AGA1（使用ADE2标志物）、重链片段（使用URA3标志物）和轻链片段（使用LEU2标志物）的表达盒连续转化耶氏酵母属菌株pO1d以最终生成完全互补的菌株。将细胞培养并诱导，如实施例1中所描述的。通过针对融合的表位标签（对于HC Fab片段为c-myc，而对于LC-片段为V5）的免疫学染色在重链和轻链表达方面标记耶氏酵母属细胞，并评估抗原结合（见图7）。对于除了与CwpIp融合外的所有构建体，确认Fab重链(CH1-VH)和轻链两者的展示。在所有情况中，100%的细胞群体表达功能性异二聚体Fab片段，确认用上文描述的scFv片段获得的结果（见图7；观察到完整峰的移位，而不是出现两个峰（一个阴性（自身荧光）峰和一个阳性））。使用二色FACS分析的HC和LC曲妥单抗（赫赛汀）Fab片段的同时标记表明各个酵母细胞表面上这两条链的配对（见图8，标记为“HC+LC”的行中的直方图）。此外，在没有赫赛汀HC Fab片段的情况中，没能在酵母细胞表面上检测到曲妥单抗（赫赛汀）LC片段，表明复合物的异二聚体组成（见图8，中间行的直方图）。对这两种抗体确认抗原结合（图7，标记为“配体结合”的栏中的直方图）。然而，抗原结合程度随抗体融合物的分子组织而不同。还有，在对两种抗体克隆比较不同展示模型时，观察到展示效率的变化（图7，虚线）。免疫荧光显微术显示重和轻链两者的共定位（见图6B）。在图6中，表达Fab和scFv 4-4-20抗体片段。通过c-myc染色（对于锚定的重链片段）和V5染色（对于轻链片段）检测。

为了评估耶氏酵母属细胞是否可以在其表面上功能性装配全长IgG，诱导单一IgG赫赛汀（曲妥单抗）的表达，接着通过免疫荧光显微术和流式细胞术进行表达分析。因此，与对Fab完成的相似地，将这两条链的表达盒转化至单一耶氏酵母属pO1d菌株以生成完全互补的菌株。通过同时染色重链和轻链（分别为c-myc和V5染色）使用FACS验证展示。图17显示对两种模型A2和A4（分别与AGA2的N和C端融合）中全长曲妥单抗（赫赛汀）展示的流式细胞术分析。如可以看到的，所有细胞都同时显示全长重链和轻链的表达。与对曲妥单抗（赫赛汀）Fab展示观察到的类似地，与N端融合物相比，对将重链在AGA2锚的C端融合的情况观察到展示效率的显著改善。

实施例7：为了抗体片段表达改善而工程化改造展示菌株

生成抗体片段（scFv和Fab）中的限速步骤经常是内质网(ER)中的蛋白质折叠、二硫桥形成和功能性装配。已经显示了分子蛋白伴侣，诸如PDI和Kar2/Bip在酿酒酵母中的过表达对scFv生成具有正面影响（Shusta,E.V.,等,Nat.Biotechnol.16,773-7,1998，通过提及而将其完整收入本文）。还有，已经在巴斯德毕赤酵母中显示了PDI共表达在Fab过表达时减轻折叠应激，导致适度升高的生成水平（Gasser,B.,等,Biotechnol.Bioeng.94,353-61,2006，通过提及而将其完整收入本文）。然而，在一些情况中，蛋白伴侣共表达导致表达水平无变化或甚至降低。改善抗体分泌的另一种可能性是通过过表达HACI转录因子诱导解折叠蛋白质应答(UPR)；先前已经报告了Fab分泌的适度改善（同上文）。

已知细胞表面展示与分泌能力充分相关联，因为表面展示的和分泌的蛋白质两者都经由相同的分泌途径迁移（Shusta,E.V.,等,J.Mol.Biol.292,949-56,1999，通过提及而将其完整收入本文）。因此，表面展示水平功能为连接各个细胞与表达水平的容易读出。

在这里，使用上文开发的展示平台在解脂耶氏酵母中第一次测试耶氏酵母属PDI和HACI表达对scFv和Fab生成的影响。在TEF启动子的控制下组成性表达耶氏酵母属PDI，并在pPOX2启动子的控制下诱导表达耶氏酵母属HACI转录因子。将这两种盒共转化至曲妥单抗（赫赛汀）scFv和Fab展示菌株（上文所描述的），并通过PCR确认正确的基因组整合。如图9中所显示的，组成性PDI共表达导致2倍增加的（如通过c-myc MFI测量的）曲妥单抗（赫赛汀）scFv-Sag1p展示和1.2倍增加的曲妥单抗（赫赛汀）Fab-Aga2展示。相反，诱导的HACI共表达导致scFv和Fab片段两者的减少。这些结果表明二硫键的形成是分泌scFv和Fab片段的限速步骤。然而，UPR（解折叠蛋白质应答）途径的诱导具有显著的负面影响。这先前对scFv展示观察到（Rakestraw，A.&Wittrup,K.D.,Biotechnol.Bioeng.93,896-905,2006，通过提及而将其完整收入本文），并且可以通过如下的实情解释，即不正确折叠的蛋白质被发送至ER降解途径(ERAD)，其在UPR诱导期间也受到上调。

实施例8：展示的曲妥单抗（赫赛汀）scFv的剂量响应曲线

自平衡结合滴定曲线测定曲妥单抗（赫赛汀）表面展示的scFv融合蛋白的结合亲和力。将展示任一种抗体融合物的细胞于25°C在不同浓度的HER2-Fc嵌合蛋白中温育3小时。通过流式细胞术测量细胞群体的均值荧光。图10显示三次独立滴定的结果。标记为“前A1-赫赛汀scFv”的线图显示以与酿酒酵母Sag1p的C端320个氨基酸的N端融合物融合并在前Lip2前导序列的情况中表达的曲妥单抗（赫赛汀）scFv的剂量响应曲线。标记为“前原A1-赫赛汀scFv”的线图显示以与酿酒酵母Sag1p的C端320个氨基酸的N端融合物融合并在前原Lip2前导序列的情况中表达的曲妥单抗（赫赛汀）scFv的剂量响应曲线。标记为“前A2-赫赛汀scFv”的线图显示以与酿酒酵母Aga2p的N端融合物融合并在前Lip2前导序列的情况中表达的曲妥单抗（赫赛汀）scFv的剂量响应曲线。Y轴显示结合的分数，其以MFI/(MFI最大-MFI最小)计算，标准化，并以百分比表示。通过非线性最小二乘方拟合平衡解离常数Kd。酵母展示的曲妥单抗（赫赛汀）-Sag1p融合物对HER2-Fc的亲和力(Kd=1.9nM)比曲妥单抗（赫赛汀）-Aga2p对HER2-Fc的亲和力(Kd=0.7nM)高2.7倍。

实施例9：耶氏酵母属展示平台作为定向进化的支架的确认

为了获得最大定向进化效率，支架应当能够有效区别在亲和力上仅具有微小差异的克隆。先前，显示了酵母展示容许细微区别在亲和力上具有2倍差异的抗体克隆。见VanAntwerp,J.J.和Wittrup,K.D.,Biotechnol.Prog.16,31-7,2000，通过提及而将其完整收入本文。抗鸡蛋溶菌酶(HEL)scFv M3比抗HEL scFv D1.3具有高2倍的针对HEL的亲和力。以Sag1p（标记为“前A1D1.3对M3”的线图）和Aga2p（标记为“前A2D1.3对M3”的线图）融合多肽表达展示的多肽。将D1.3或M3展示细胞与不同浓度的生物素化的HEL一起温育。接着，通过流式细胞术测量均值荧光。通过平衡结合滴定曲线测定每种表面展示的抗体的结合亲和力。图11显示三次独立滴定的平均结果，对其通过非线性最小二乘方进行曲线拟合。与M3对HEL的亲和力相比，D1.3对HEL的亲和力对于Sag1p和Aga2p融合物分别测定为低2.9和2.7倍。

此实施例显示了开发的耶氏酵母属展示支架有效区别在亲和力上仅具有微小差异的克隆，确认此系统的筛选潜力。

实施例10：使用FACS的模型富集实验

使用展示D1.3和改善的突变体M3的酵母细胞混合物实施单次富集(single pass enrichment)。另外，用潮霉素表达盒转化展示M3突变体scFv的细胞。没有观察到对表达水平的显著影响。将M3细胞以比率1/1000混合入背景D1.3细胞中并温育，直至于0.3nM的抗原浓度达到平衡以进行最佳区别。将细胞在高纯度模式中以约0.1%的分选窗分选（未显示）。通过在选择板上滴定测定富集因子，并且获得800的最大富集。可以通过在富集之前和之后在选择板上复制分配来计算富集。

实施例11：在解脂耶氏酵母中使用复制型载体的表面展示

将复制型载体构建为含有由pPOX2启动子驱动的scFv-AGA2表达盒和用于在解脂耶氏酵母中复制性增殖的ARS18（图15）。在转化入含有AGA1表达盒（用于AGA1-AGA2异二聚化）的解脂耶氏酵母菌株后，获得1.2x10⁶/μg的转化效率。与可以对使用基于捷塔的整合的随机整合观察到的事情相比，此效率高20。对于文库构建，高转化效率对于获得期望的复杂性是有利的。为了保持质粒增殖，将细胞在选择性条件下在没有亮氨酸的情况中培养。

使用FACS对在选择性（补充有CSM-亮氨酸的极限培养基）和非选择性条件（补充有CSM的MM）两者下培养的10个克隆实施表达研究。与对整合型质粒观察到的事情相反（图16A），在诱导用复制型载体转化的细胞后，存在不表达scFv的细胞群体。即使在选择性压力下培养细胞时也存在此阴性群体（图16B），指示质粒丧失不是此观察结果的基础。此现象与可以使用复制型质粒进行表面展示在酿酒酵母中观察到的事情相似。对10个克隆的分析揭示了平均43%的细胞在scFv的表面表达方面呈阳性（见图16B）。均值荧光强度与使用整合型质粒获得的结果没有差异（即，均值荧光平均值在相同的范围中）。

实施例12：使用FACS的富集实验

于1nM的抗原浓度实施富集，其使用展示D1.3的多样化文库的酵母细胞混合物。将细胞在高纯度模式中以约0.1%的分选窗分选（未显示）。实施三个连续轮次的分选。分离两个较高亲和力的克隆：显示亲和力1.7nM的克隆1(Ile160Val,Thr228Ala)和显示亲和力2.2nM的克隆2(Ile160Val)。

其它实施方案

应当理解，虽然本发明已经结合其详细描述进行过描述，但是前述说明书意图例示而非限制本发明的范围，其以所附权利要求书的范围限定。其它方面，优点和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (74)

1.一种表达盒，其包含：

与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含与第二核酸序列以符合读码框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列。

2.一种表达盒，其包含：

与第一核酸序列可操作连接的启动子，所述第一核酸序列包含编码锚多肽的锚核苷酸序列，其中所述第一核酸序列可以在融合多肽中作为第一融合配偶体表达，所述融合多肽包含由第二核酸序列编码的感兴趣的第二融合配偶体。

3.权利要求2的表达盒，其进一步包含编码所述感兴趣的第二融合配偶体的第二核酸序列。

4.权利要求3的表达盒，其进一步包含整个或部分的限制性位点。

5.权利要求3的表达盒，其中所述感兴趣的第二融合配偶体包含抗体多肽或抗体多肽片段。

6.权利要求1或权利要求5的表达盒，其中所述抗体多肽片段是scFv片段。

7.权利要求1或权利要求5的表达盒，其中所述抗体多肽片段是Fab片段的重链。

8.权利要求1的表达盒载体，其中所述抗体多肽片段是Fab片段的轻链。

9.权利要求1或3-8中任一项的表达盒，其中在所述第二核酸序列3’融合所述第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗体多肽或抗体多肽片段和C端锚多肽。

10.权利要求1-8的表达盒，其中在所述第二核酸序列5’融合所述第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端抗体多肽或抗体多肽片段。

11.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述启动子是组成性的。

12.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述启动子是诱导型的。

13.权利要求12的表达盒，其中所述启动子是POX2或LIP2启动子。

14.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述启动子是半组成性的。

15.权利要求14的表达盒，其中所述启动子是hp4d启动子。

16.前述权利要求中任一项的表达盒，其进一步包含前导核酸序列，所述前导核酸序列包含编码前导多肽的核苷酸序列，其中在所述第一和第二核酸序列5’以符合读码框的方式融合所述前导核酸序列。

17.权利要求16的表达盒，其中所述前导多肽选自下组：前LIP2、前原LIP2、前XPR2、和前原XPR2。

18.前述权利要求中任一项的表达盒，其进一步包含接头核酸序列，所述接头核酸序列包含编码接头多肽的核苷酸序列。

19.权利要求18的表达盒，其中所述接头核酸序列在所述第一和第二核酸序列间以符合读码框的方式融合。

20.权利要求18的表达盒，其中所述抗体多肽包含scFv抗体多肽，且其中所述接头核酸序列在编码所述scFv多肽的可变区的重链核酸序列和编码可变区的轻链核酸序列间以符合读码框的方式融合。

21.权利要求18-20中任一项的表达盒，其中所述接头多肽包含(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:14)或(GlySer)₅(SEQ ID NO:15)。

22.前述权利要求中任一项的表达盒，其进一步包含一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列包含编码一种或多种表位标签的核苷酸序列。

23.权利要求22的表达盒，其中所述一种或多种表位标签选自下组：c-Myc、V5、六组氨酸、谷胱甘肽-S-转移酶、链霉亲合素、生物素、血凝素、Flag标签、和E标签。

24.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述锚多肽选自下组：Aga1p多肽或其片段、Aga2p多肽或其片段、和Sag1p多肽或其片段。

25.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述抗体多肽或抗体多肽片段、所述锚多肽、或这两者经密码子优化以在耶氏酵母属细胞中表达。

26.一种包含前述权利要求中任一项的表达盒的载体。

27.权利要求26的载体，其进一步包含捷塔（zeta）元件。

28.权利要求27的载体，其中所述捷塔元件是反转录转座子的长末端重复。

29.权利要求28的表达盒，其中所述捷塔元件是Ylt1或Tyl6反转录转座子的长末端重复。

30.权利要求26的载体，其进一步包含一种或多种常染色体复制元件。

31.权利要求30的载体，其中至少一种常染色体复制元件包含着丝粒(CEN)和复制起点(ORI)。

32.权利要求31的载体，其中所述着丝粒是CEN1或CEN3，而所述复制起点是ORI1068或ORI3018。

33.权利要求26的载体，其进一步包含自主复制序列(ARS)，其中所述ARS包含着丝粒和复制起点。

34.权利要求33的载体，其中所述ARS包含ARS18。

35.权利要求33的载体，其中所述ARS包含ARS68。

36.权利要求26-35中任一项的载体，其进一步包含一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列包含编码一种或多种选择标志的核苷酸序列。

37.权利要求30的载体，其中所述一种或多种选择标志选自下组：LEU2、URA3d1、ADE2、Lys、Arg、Gut、Trp、G3p、和hph。

38.一种在耶氏酵母属细胞的表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段的方法，该方法包括：

将第一载体导入第一耶氏酵母属细胞中，所述第一载体包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含与第二核酸序列以符合读码框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列；并

将所述第一耶氏酵母属细胞在耶氏酵母属细胞操作条件下温育一段时间。

39.权利要求38的方法，其中所述第一载体是权利要求20-25中任一项的载体。

40.权利要求38或39的方法，其中所述抗体多肽片段是scFv片段。

41.权利要求38或39的方法，其中所述抗体多肽片段是Fab片段的重链。

42.权利要求41的方法，其进一步包括将第二载体导入所述第一耶氏酵母属细胞中，所述第二载体包含与编码Fab片段轻链的核酸序列可操作连接的第二启动子。

43.权利要求38或39的方法，其中所述抗体多肽片段是Fab片段的轻链。

44.权利要求43的方法，其进一步包括将第二载体导入所述第一耶氏酵母属细胞中，所述第二载体包含与编码Fab片段重链的核酸序列可操作连接的第二启动子。

45.权利要求42或44的方法，其中所述第一耶氏酵母属细胞是单倍体，且其中导入所述第二载体的步骤包括将包含所述第一载体的所述第一单倍体耶氏酵母属细胞与包含所述第二载体的第二单倍体耶氏酵母属细胞交配；

其中所述第一和第二耶氏酵母属细胞是相反交配型的。

46.权利要求38-45中任一项的方法，其中在所述第二核酸序列5’融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗体多肽或其抗体多肽片段和C端锚多肽。

47.权利要求38-45中任一项的方法，其中在所述第二核酸序列3’融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端抗体多肽或抗体多肽片段。

48.权利要求38-47中任一项的方法，其中所述耶氏酵母属细胞操作条件包括低诱导温度。

49.权利要求48的方法，其中所述低诱导温度包括约15摄氏度和25摄氏度间的温度。

50.权利要求49的方法，其中所述低诱导温度包括约20摄氏度的温度。

51.权利要求38-50中任一项的方法，其中所述耶氏酵母属细胞操作条件包括短诱导时间。

52.权利要求51的方法，其中所述短诱导时间包括约24小时或更少。

53.权利要求52的方法，其中所述短诱导时间包括约16小时或更少。

54.权利要求53的方法，其中所述短诱导时间包括约16小时。

55.权利要求38-54中任一项的方法，其中所述耶氏酵母属细胞操作条件包括低pH。

56.权利要求55的方法，其中所述低pH包括约2和约4间的pH。

57.权利要求56的方法，其中所述低pH包括约3的pH。

58.权利要求38-57中任一项的方法，其中耶氏酵母属细胞操作条件包括高通气条件。

59.权利要求58的方法，其中所述高通气条件包括在摇瓶中温育。

60.权利要求38-59中任一项的方法，其中耶氏酵母属细胞操作条件包括将所述第一耶氏酵母属细胞在极限培养基中温育。

61.权利要求60的方法，其中所述极限培养基是缺乏酵母提取物、细菌用蛋白胨、或这两者的培养基。

62.权利要求38-61中任一项的方法，其中所述第一载体整合入所述耶氏酵母属基因组中。

63.权利要求38-62中任一项的方法，其中所述耶氏酵母属细胞表达蛋白伴侣。

64.权利要求63的方法，其中所述蛋白伴侣选自下组：蛋白质二硫键异构酶、Kar2/Bip、及其组合。

65.权利要求38-64中任一项的方法，其中所述锚多肽选自下组：Aga1p多肽或其片段、和Aga2p多肽或其片段、或Sag1p多肽或其片段。

66.通过权利要求38-65中任一项的方法获得的抗体多肽或抗体多肽片段。

67.一种选择包含结合靶多肽的抗体多肽或抗体多肽片段的耶氏酵母属细胞的方法，包括：

提供在其表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段的亲本耶氏酵母属细胞；

使所述亲本耶氏酵母属细胞与测试多肽接触；并

如果所述展示的抗体多肽或抗体多肽片段结合所述靶多肽，那么选择所述亲本耶氏酵母属细胞。

68.权利要求67的方法，其中通过权利要求38-65中任一项的方法生成所述亲本耶氏酵母属细胞。

69.权利要求67或68的方法，其进一步包括：

自所述选定的亲本耶氏酵母属细胞分离所述抗体多肽或抗体多肽片段的第一表达盒；

在编码所述抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列中引入一处或多处变化以生成经修饰的表达盒；

将所述经修饰的表达盒导入缺乏所述第一表达盒的第二耶氏酵母属细胞中以生成经修饰的耶氏酵母属细胞；

将所述经修饰的耶氏酵母属细胞在耶氏酵母属细胞操作条件下温育一段时间；

将所述经修饰的耶氏酵母属细胞与所述靶多肽接触；并

如果所述经修饰的耶氏酵母属细胞以比所述亲本耶氏酵母属细胞更大的亲和力或亲合力结合所述靶多肽，那么选择所述经修饰的耶氏酵母属细胞。

70.一种试剂盒，其包含权利要求1-25中任一项的表达盒。

71.一种试剂盒，其包含权利要求26-37中任一项的载体。

72.权利要求70或71的试剂盒，其进一步包含耶氏酵母属细胞。

73.权利要求70或72的试剂盒，其进一步包含关于使用所述表达盒的书面用法说明书。

74.权利要求71或72的试剂盒，其进一步包含关于使用所述载体的书面用法说明书。

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