KR20120118045A - 효모 세포 표면상에 폴리펩티드를 디스플레이하기 위한 방법들 및 조성물들 - Google Patents

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옥시레인 유케이 리미티드
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Abstract

효모 세포의 표면상에 폴리펩티드(예를 들면, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편)를 디스플레이하는 데 사용되는 방법들 및 조성물들이 제공된다. 예시적인 효모는 야로이야(Yarrowia) 종, 예를 들면, 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하여 여기서 개시되는 다양한 방법들 및 조성물들과 함께 사용될 수 있다.

Description

효모 세포 표면상에 폴리펩티드를 디스플레이하기 위한 방법들 및 조성물들{METHODS AND COMPOSITIONS FOR DISPLAYING A POLYPEPTIDE ON A YEAST CELL SURFACE}
효모 세포의 표면상에 폴리펩티드(예를 들면, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편)를 디스플레이하는 데 사용되는 방법들 및 조성물들이 제공된다. 예시적인 효모는 야로이야(Yarrowia) 종, 예를 들면, 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하여 여기서 개시되는 다양한 방법들 및 조성물들과 함께 사용될 수 있다.
고효율의 시약들, 예를 들면, 항체들 또는 그 단편들은 임상적 및 연구적인 응용들 모두에 유용한 도구들이 된다. 대장균(E. Coli) 내에서 리보솜(ribosome) 디스플레이, 파지(phage) 디스플레이 및 주변세포질의(periplasmic) 발현을 포함하여 항체들의 격리와 특성화를 위해 수많은 생체외의(in vitro) 및 생체내의(in vivo) 플랫폼들이 사용되어 왔다. 사용되어 왔던 다른 플랫폼은 효모 세포 표면 디스플레이(YSD)이다.
야로이야(Yarrowia) 세포주의 세포 표면상에 항체들과 그 단편들을 디스플레이 하기 위한 조성물들과 방법들이 유리할 수 있다.
본 발명은 효모 세포의 표면상에 폴리펩티드(예를 들면, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편)를 디스플레이하는 데 사용되는 방법들 및 조성물들을 제공한다. 예시적인 효모는 야로이야(Yarrowia) 종, 예를 들면, 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하여 여기서 개시되는 다양한 방법들 및 조성물들과 함께 사용될 수 있다.
어떤 실시예들에 있어서, 여기세 제공되는 조성물들은 융합 배열(fusion sequence)에 작동 가능하게 연결되는 프로모터(promotor)를 구비하는 발현 카세트(expression cassette)를 포함하며, 상기 융합 배열은 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 제2 핵산 배열에 프레임 내에 융합된 앵커 폴리펩티드(anchor polypeptide)를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 제1 핵산 배열을 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 여기서 제공되는 조성물들은 제1 핵산 배열에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 구비하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 제1 핵산 배열은 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 앵커 뉴클레오티드 배열을 구비하며, 상기 제1 핵산 배열은 제2 핵산 배열에 의해 인코딩되는 대상의 제2 융합 파트너(fusion partner)를 포함하는 융합 폴리펩티드 내의 제1 융합 파트너로서 발현될 수 있다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 발현 카세트는
상기 대상의 제2 융합 파트너, 예를 들면, 제한 부위(restriction site)의 전부 또는 일부를 인코딩하는 제2 핵산 배열을 더 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 대상의 제2 융합 파트너는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드 단편은 scFv 단편, Fab 단편의 중쇄(heavy chain) 또는 Fab 단편의 경쇄(light chain)이다.
어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트의 상기 제1 핵산 배열은 상기 제2 핵산 배열에 대해 융합된 3'로서, 상기 융합 배열로부터 생성된 융합 폴리펩티드가 N-말단 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편 및 C-말단 앵커 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트의 상기 제1 핵산 배열은 상기 제2 핵산 배열에 대해 융합된 5'로서, 상기 융합 배열로부터 생성된 융합 폴리펩티드가 N-말단 앵커 폴리펩티드 및 C-말단 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 지속적(constitutive)인 프로모터를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 유도성 프로모터, 예를 들면, POX2 또는 LIP2 프로모터를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 반지속성(semi-constitutive)인 프로모터, 예를 들면, hp4d 프로모터를 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 리더 폴리펩티드(leader polypeptide)를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 리더 핵산 배열을 포함하며, 상기 리더 핵산 배열은 상기 제1 및 제2 핵산 배열들에 대해 5' 프레임 내에 융합된다. 예시적인 리더 핵산 배열들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, LIP2 pre, LIP2 prepro, XPR2 pre 및 XPR2 prepro를 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 링커 폴리펩티드(linker polypeptide)를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 링커 핵산 배열을 포함한다. 예를 들면, 상기 링커 핵산 배열은 상기 제1 및 상기 제2 핵산 배열들 사이의 프레임 내에 융합될 수 있다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드는 scFv 항체 폴리펩티드를 포함하고, 상기 링커 핵산 배열은 가변 영역을 인코딩하는 중쇄 핵산 배열과 상기 scFv 폴리펩티드의 가변 영역을 인코딩하는 경쇄 핵산 배열 사이의 프레임 내에 융합된다. 링커 폴리펩티드의 제한적이지 않은 예들은 (Gly4Ser)3 또는 (GlySer)5를 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 하나 또는 그 이상의 에피토프 태그들(epitope tags)을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 하나 또는 그 이상의 핵산 배열들을 포함한다. 예시적인 에피토프 태그들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, c-Myc, V5, 헥사히스티딘(hexahistidine), 글루타티온-S-트랜스페라제(glutathione-S-transferase), 스트렙타비딘(streptavidin), 바이오틴(biotin), 헤마글루티닌(hemagglutinin), Flag-태그 및 E-태그를 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 앵커 폴리펩티드를 포함한다. 앵커 폴리펩티드들의 제한적이지 않은 예들은 Ang1p 폴리펩티드 또는 그 단편, Aga2p 폴리펩티드 또는 그 단편 및 Sag1p 폴리펩티드 또는 그 단편을 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편, 앵커 폴리펩티드 또는 모두가 야로이야(Yarrowia) 세포 내의 발현을 위해 코돈(codon) 최적화된 것을 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 여기서 제공되는 조성물들은 상술한 발현 카세트들 중에서 임의의 하나를 구비하는 벡터(vector)를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 벡터는 제타 요소(zeta element)를 포함한다. 예시적인 제타 요소는, 이에 제한되는 것은 아니지만. Ylt1 또는 Tyl6 역전위인자(retrotransposon)와 같은 역전위인자의 긴 말단 반복 순서를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 벡터는 하나 또는 그 이상의 상염색체 복제 요소들(autosomal replication elements), 예를 들면, 동원체(CEN) 및 복제 개시점(ORI)을 포함한다. 예시적인 동원체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, CEN1 또는 CEN3을 포함한다. 예시적인 복제 개시점은, 이에 제한되는 것은 아니지만, ORI1068 또는 ORI3018을 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 벡터는 복제 기점 염기 순서(ARS)를 포함하며, 상기 복제 기점 염기 순서는 동원체 및 복제 개시점을 포함한다. 예시적인 복제 기점 염기 순서는, 이에 제한되는 것은 아니지만, ARS18 및 ARS68을 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택 가능한 마커들(markers)을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 하나 또는 그 이상의 핵산 배열들을 포함한다. 선택 가능한 마커들의 제한적이지 않은 예들은 LEU2, URA3d1, ADE2, Lys, Arg, Gut, Trp, G3p 및 hph를 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 여기세 제공되는 방법들은 야로이야(Yarrowia) 세포의 표면상에 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 디스플레이하는 방법을 포함한다. 예를 들면, 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴크레오티드 배열을 구비하는 제2 핵산 배열에 대해 프레임에 융합된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 제1 핵산 배열을 포함하는 융합 배열에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함하는 제1 벡터를 제1 야로이야(Yarrowia) 세포 내로 도입하는 단계 그리고 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들 하에서 시간 동안 상기 제1 야로이야(Yarrowia) 세포를 배양하는 단계에 의해, 야로이야(Yarrowia) 세포의 표면상에 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편이 디스플레이될 수 있다. 예시적인 제1 벡터들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 전술한 벡터들 중에서 임의의 하나를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드 단편은 scFv 단편, Fab 단편의 중쇄 또는 Fab 단편의 경쇄이다. 어떤 실시예들에 있어서, 방법들은 Fab 단편의 경쇄를 인코딩하는 핵산 배열에 동작 가능하게 연결되는 제2 프로모터를 구비하는 제2 벡터를 상기 제1 야로이야(Yarrowia) 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 제1 야로이야(Yarrowia) 세포는 반수체(haploid)이고, 상기 제2 벡터를 도입하는 단계는 상기 제1 벡터를 포함하는 상기 제1 반수체의 야로이야(Yarrowia) 세포를 상기 제2 벡터를 포함하는 제2 반수체의 야로이야(Yarrowia) 세포와 교배시키는(mating) 단계를 포함하며, 상기 제1 및 제2 야로이야(Yarrowia) 세포들은 반대되는 교배 타입들이다.
어떤 실시예들에 있어서, 상기 제1 핵산 배열이 상기 제2 핵산 배열에 대해 5' 융합되어, 상기 융합 배열로부터 생성되는 융합 폴리펩티드가 N-말단 항체 폴리펩티드 또는 그 항체 폴리펩티드 단편 및 C-말단 앵커 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 제1 핵산 배열이 상기 제2 핵산 배열에 대해 3' 융합되어, 상기 융합 배열로부터 생성되는 융합 폴리펩티드가 N-말단 앵커 폴리펩티드 및 C-말단 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 낮은 유도 온도(induction temperature), 예를 들면, 섭씨 약 15도 내지 섭씨 약 25도 사이의 온도를 포함한다. 낮은 유도 온도의 제한적이지 않은 예는 섭씨 약 20도의 온도를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 짧은 유도 시간(induction time), 예를 들면, 약 24 시간 또는 그 이하, 또는 약 16 시간 또는 그 이하, 혹은 약 16 시간을 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 낮은 pH, 예를 들면, 약 2 내지 약 4 사이의 pH 또는 약 3 사이의 pH를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 높은 통기(aeration) 조건들, 예를 들면, 쉐이크 플라스크(shake flask) 내에서의 배양을 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 상기 제1 야로이야(Yarrowia) 세포의 최소 배지(minimal medium), 예를 들면 효모 추출물, 박토펩톤(bactopeptone) 또는 이들 모두가 결핍된 배지 내에서의 배양을 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 상기 제1 벡터는 야로이야(Yarrowia) 게놈(genome) 내에 통합된다. 어떤 실시예들에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포는 샤프론(chaperone), 예를 들면, 단백질 2황화물 이성질화 효소(protein disulfide isomerase) 및/또는 Kar2/Bip을 발현시킨다.
어떤 실시예들에 있어서, 여기서 제공되는 조성물들은 상술한 방법들 중에서 임의의 하나에 의해 수득되는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 타겟 폴리펩티드를 결합시키는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함하는 야로이야(Yarrowia) 세포를 선별하는 방법들이 제공된다. 예를 들면, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 그 표면상에 디스플레이하는 친야로이야 세포(parent Yarrowia cell)(예를 들면, 전술한 방법들 중에서 임의의 하나에 의해 생성되는 야로이야(Yarrowia) 세포)를 제공하는 단계, 상기 친야로이야 세포를 테스트 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 그리고 상기 디스플레이된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편이 상기 타겟 폴리펩티드를 결합시킬 경우에 상기 친야로이야 세포를 선별하는 단계에 의해, 타겟 폴리펩티드를 결합시키는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함하는 야로이야(Yarrowia) 세포가 선별될 수 있다. 어떤 실시예들에 있어서, 이러한 방법들은, 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편의 제1 발현 카세트를 상기 선별된 친야로이야 세포로부터 격리시키는 단계, 변형된 발현 카세트를 발생시키도록 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열에 하나 또는 그 이상의 변형들을 도입하는 단계, 변형된 야로이야(Yarrowia) 세포를 발생시키도록 상기 제1 발현 카세트가 결핍된 제2 야로이야(Yarrowia) 세포 내로 상기 변형된 발현 카세트를 도입하는 단계, 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들 하에서 시간 동안 상기 변형된 야로이야(Yarrowia) 세포를 배양하는 단계, 상기 변형된 야로이야 세포를 상기 타겟 폴리펩티드에 접촉시키는 단계, 그리고 상기 친야로이야 세포 보다 큰 친화도 또는 결합 활성으로 상기 변형된 야로이야 세포가 상기 타겟 폴리펩티드를 결합시키는 경우에 상기 변형된 야로이야 세포를 선별하는 단계를 포함한다.
어떤 실시예들에 있어서, 키트들(kits)이 여기서 제공된다. 어떤 실시예들에 있어서, 여기서 제공되는 키트들은 상술한 발현 카세트들 중에서 임의의 하나와 같은 발현 카세트를 구비한다. 어떤 실시예들에 있어서, 여기서 제공되는 키트들은 야로이야(Yarrowia) 세포를 포함한다. 어떤 실시예들에 있어서, 여기서 제공되는 키트들은 발현 카세트, 벡터 또는 이들 모두의 사용을 위한 서면 지시를 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한 여기서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 공통적으로 이해될 수 있는 동일한 의미들을 가진다. 본 발명의 설명을 위하여 여기서 개시되는 방법들과 물질들로서 해당 기술 분야에서 알려진 다른 적절한 방법들 및 물질들이 사용될 수 있다. 상기 물질들, 방법들 및 예들은 예시적인 것으로서 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 여기에 언급된 모든 공보들, 특허 출원들, 특허들, 배열들, 데이터베이스 처리들 및 다른 참조 문헌들은 참고로서 기재되어 있다. 모순이 있는 경우에, 정의들을 포함하여 본 명세서를 통해 조절될 수 있을 것이다.
도 1은 발현 피라미드들 및 scFv의 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)의 표시를 위해 사용되는 발현 카세트들 및 패브 프래그먼트들(Fab fragments)의 개략도이다. 도 1a는 조성들 및 랜덤 집적을 위한 야로위아(Yarrowia) 발현 피라미드의 맵(map)을 나타낸다. 표적 유전자(taeget gene)의 발현은 유도성의(inducible) pPOX2 프로모터에 의해서 구동된다. 다른 형질전환 마커들(transformation markers)은 총 내성(Leu2, Ade2, Ura)의 발생을 허용하는 것을 가능하게 한다. 상기 피라미드는 템플릿으로서 사용되어, 다른 항체 절편들을 복제한다. 도 1b는 AGA1, scFv 절편의 수용성 발현 및 L사슬 ck1 도메인(light chain ck1 domain)을 위한 발현 카세트들을 나타낸다. 인공 카세트들은 도시된 제한된 장소들을 사용하는 야로위아(Yarrowia) 발현 피라미드들 내에 복제된다. 도메인들을 다양하게 하는 L사슬은 각각 최종 피라미드들을 복제할 수 있고, 영역들(VL)을 다양하게 하는 L사슬을 포함하는 패브 L사슬 절편(VL-Ck1) 총 길이의 표시 피라미드들 및 L사슬 불변 영역들(light chain constant region)을 생성한다. 도 1c는 도시된 제한된 장소들을 사용하는 야로위아(Yarrowia) 발현 피라미드 내에 복제되는 scF 항체 절편들을 나타낸다. 총 4 개의 인공 합성물들(synthetic constructs)은 형성되어, 다른 융합 모드들에서 부착 및 다른 부착 분자들을 사용하는 부착을 허용한다. 도 1d는 도시된 제한된 장소들을 사용하는 야로위아(Yarrowia) 발현 피라미드 내에 복제되는 패브 CH1 항체 절편들(H사슬 불변 영역(chain constant region) CH1 도메인들을 포함하는 패브 절편들)을 나타낸다. 총 4 개의 인공 합성물들(synthetic constructs)은 형성되어, 다른 융합 모드들에서 부착 및 다른 부착 분자들을 사용하는 부착을 허용한다. 도메인들을 다양하게 하는 H사슬은 각각 최종 피라미드들을 복제할 수 있고, VH로 구성되는 패브 H사슬의 총 길이의 표시 피라미드들 및 H사슬 불변 영역 CH1 도메인(VH-CH1)을 생성한다. 도 1e는 동시 형질전환법들 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 셀들의 표면 상에 발현되는 그들의 적절하게 부착되는 폴리펩티드(polypeptide)펩티드를 구비하는 scFv 및 패브 절편들 각각으로부터 발현되는 다양한 폴리펩티드(polypeptide)들의 개략도를 나타낸다.
도 2는 팔콘(FALCON) 및 진탕 플라스크(shake flask)(SF) 배양 86% 모두를 위한 최소 충족 미디움(MM) 및 리치 미디움(RM)에서 20도로 20시간 동안 유도된 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 셀들 내의 c-Myc 추적용 scFv 발현을 보여주는 1차원적인 형광 유셀 분석(FFC) 연속적인 히스토그램들이다. 셀들은 또한 진탕 플라스크들에서 28도로 MM에서 성장된다. 최상부 패널들은 c-Myc 추적용 scFv 절편들을 위한 FFC 히스토그램들을 나타내는 반면, 하부 패널들은 대형 크기의 단일클론 허셉틴 항체(monoclonal Herceptin antibody)를 발현하는 변형 1T2을 위한 FFC 히스토그램들을 나타낸다. 형광은 다음 실시예 1에서 설명하는 바와 같이 감지된다. 가려진 히스토그램들은 자발 형광(실험군과 대조군)을 나타내는 반면, 실선들은 c-myc 발현을 나타낸다.
도 3은 다양한 시간동안 유도된 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 셀들 내의 c-Myc 추적용 scFv 발현을 보여주는 연속적인 1차원적의 FFC 히스토그램들들이다. 상기 히스토그램들은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 셀들 내의 c-Myc 추적용 scFv의 표면 표시 레벨들 상의 유도 시간의 효과를 보여준다. 셀들은 16, 20, 24, 32 및 43시간동안 성장한다. c-Myc을 발현하는 셀들의 상대적인 비율은 긴 유도 시간들을 감소시킨다.(24시간 이후 54%, 32시간 이후 19%, 43시간 이후 7%) 형광은 실시예 1에 설명하는 바와 같이 감지된다. 가려진 히스토그램들은 자발 형광(실험군과 대조군)을 나타내는 반면, 실선들은 c-myc 발현을 나타낸다.
도 4는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 셀들 내의 c-Myc 추적용 scFv의 표면 표시 레벨들 상의 pH의 효과를 보여주는 연속적인 1차원적의 FFC 히스토그램들이다. 셀들은 24시간 동안 및 32시간동안(하부 패널들) pH 6.8, pH 5 및 pH 3(최상부 패널들)에서 성장된다. 좌측 상의 패널들은 그들의 표면 상에 scFv를 발현하지 않는 셀들의 배경 형광을 나타낸다. 우측 상의 패널들은 그들의 표면 상에 scFv를 발현하는 셀들의 형광을 나타낸다. 형광은 실시예 1에 설명하는 바와 같이 감지된다.
도 5는 두개의 다른 c-Myc 추적용 scFv 절편들: 4-4-20 scFv(그래프에서 "4-4-20"로 표시)의 표면 발현 및 허셉틴(herceptin) scFv(그래프에서 "허셉틴(herceptin) scFv"로 표시)을 보여주는 연속적인 1차원적의 FFC 히스토그램들이다. 총 4개의 피라미드들은 생성되어, 세레비시에(S. cerevisiae) Sag1p(320 C 말단 AA; "A1"으로 표시되는 일렬의 히스토그램들)의 일부의 C 말단으로의 N 말단 융합으로서 scFv 절편의 표시를 허용하고, 세레비시에(S. cerevisiae) Aag2p("A2"로 표시되는 일렬의 히스토그램들)로의 N 말단 융합, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) CwpIp(110 C 말단 AA; "A3"로 표시되는 일렬의 히스토그램들)의 일부의 C 말단으로의 N 말단 융합 및 Aga2("A4"로 표시되는 일렬의 히스토그램들)로의 C 말단 융합으로서 scFv 절편의 표시를 허용한다.
상기 scFv 절편들은 항원("수용체 결합"으로 표시된 칼럼들 내의 패널들)을 결합할 수 있다. 수용체 결합 감지를 위해, 비오틴 항체(biotinylated antigen)는 스트렙타아비딘-피코에리트린(streptavidin-phycoerythrin)과 함께 감지된다. 형광은 실시예 1에 설명하는 바와 같이 감지된다. 각 그래프에 대해, 가려진 히스토그램은 자발 형광(실험군과 대조군)을 나타낸다. 실선들은 c-myc 발현 또는 각 칼럼 상에 표시된 수용체 결합을 나타낸다.
도 6은 c-Myc 추적용 4-4-20 scFv 융합 단백질들(도 6a) 또는 c-Myc 추적용 4-4-20 H사슬 및 L사슬 융합 단백질들(도 6b)을 발현하는 셀들의 면역 형광 현미경 사진들이다. 발현은 항-c-Myc 항체를 갖는 스테이닝(staining)에 의해서 감지된다.
도 7은 두개의 다른 c-Myc 추적용 패브 절편들: 4-4-20 패브(그래프에서 "4-4-20"로 표시)의 표면 발현 및 허셉틴(herceptin) 패브(그래프에서 "허셉틴(herceptin) 패브"로 표시)을 보여주는 연속적인 1차원적의 FFC 히스토그램들이다. 총 4개의 피라미드들은 생성되어, 세레비시에(S. cerevisiae) Sag1p(320 C 말단 AA; "A1"으로 표시되는 일렬의 히스토그램들)의 일부의 C 말단으로의 N 말단 융합으로서 scFv 절편의 표시를 허용하고, 세레비시에(S. cerevisiae) Aag2p("A2"로 표시되는 일렬의 히스토그램들)로의 N 말단 융합, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) CwpIp(110 C 말단 AA; "A3"로 표시되는 일렬의 히스토그램들)의 일부의 C 말단으로의 N 말단 융합 및 Aga2("A4"로 표시되는 일렬의 히스토그램들)로의 C 말단 융합으로서 패브 H사슬 절편의 표시를 허용한다. 패브 L사슬은 수용성의 절편으로서 발현된다. H사슬(HC) 및 L사슬(LC) 발현은 감지된다. 수용체 결합을 위해, 이차 항원(biotinylated antigen)은 트렙타아비딘-피코에리트린(streptavidin-phycoerythrin)과 함께 감지된다. 형광은 실시예 1에 설명하는 바와 같이 감지된다. 각 그래프에 대해, 가려진 히스토그램은 자발 형광(실험군과 대조군)을 나타낸다. 실선들은 c-myc 발현(부착되는 H사슬 절편 발현을 나타내는), V5 발현(L사슬 발현을 나타내는) 또는 각 칼럼 상에 표시된 수용체 결합을 나타낸다.
도 8은 허셉틴(herceptin) 패브의 표면 발현을 보여주는 연속적인 1차원적의 FFC 히스토그램들이다. H사슬은 N 말단 융합에서 세레비시에(S. cerevisiae) Aga2이다. L사슬은 수용성으로 발현된다. H사슬(HC) 및 L사슬(LC)는 개별적으로 감지된다.(각각 "HC", "LC"로 표시된 일렬의 히스토그램들) 두 개의 색 FACS 분석을 사용하는 HC 및 LC("HC + LC"로 표시된 일렬의 히스토그램들)의 동시 표시(labeling)는 각 이스트 셀들의 표면 상의 체인들 모두의 쌍을 보여준다. 형광은 실시예 1에 설명하는 바와 같이 감지된다. 가려진 히스토그램들은 자발 형광(실험군과 대조군)을 나타내는 반면, 실선들은 나타낸 바와 같이, HC 또는 LC 발현을 나타낸다.
도 9는 Her-scFv 및 Her-패브 발현 상의 셰프론들(chaperones)의 효과를 보여주는 바 그래프들의 쌍이다. WT = 야생형, TEF PD = PDI(프로틴 다이설파이드 아이사머레에스)는 TEF 프로모터의 제어 아래 발현된다. POX2 HACI = HACI, UPR(단백질 펴짐 반응)이 유도되는 전사 인사는 POX2 프로모터의 제어 아래 발현된다.
도 10은 표시되는 허셉틴(Herceptin) scFv을 위한 용량 반응 곡선을 보여주는 연속적인 선 그래프이다. 3 가지 독립적인 적정들이 도시된다. preA1-허셉틴(Herceptin) scFv = 허셉틴(Herceptin) scFv는 N 말단 융합으로서 세레비시에(S. cerevisiae) Sag1p의 C 말단 320 아미노 산들로 용해되고, Lip2pre 선도 서열과 함께 발현된다. preproA1-허셉틴(Herceptin) scFv = 허셉틴(Herceptin) scFv는 N 말단 융합로서세레비시에(S. cerevisiae) Sag1p의 C 말단 320 아미노 산들로 용해되고, Lip2prepro 선도 서열과 함께 발현된다. preA2-허셉틴(Herceptin) scFv = 허셉틴(Herceptin) scFv는 N 말단 융합으로서 세레비시에(S. cerevisiae) Sag2p에 용해되고, Lip2pre 선도 서열과 함께 발현된다. "[Ag]" = HER2-Fc 키메라 단백질(chimeric protein)(항원) 농도이다. Y축은 MFI/(MFImax-MFImin)로 계산되고, 정상화되고, 퍼센티지로 표현되는 결합 부분을 나타낸다. 계산된 kDs는 각 적정 곡선에 도시된다.
도 11은 표시되는 scFv의 D1.3 및 돌연변이체(mutant) M3를 위한 용량 반응 곡선을 보여주는 한 쌍의 선 그래프이고, 각각은 난백 라이소자임(hen egg lysozyme)(HEL)을 인식한다. M3는 난백 라이소자임(hen egg lysozyme)을 위해 D1.3에 비해 2-폴드(fold) 고친화성을 포함한다. 표시되는 폴리펩티드(polypeptide)들은 Sag1p(선 그래프에서 "preA1 D1.3 vs M3"로 표시) 및 Aga2p (선 그래프에서 "preA2 D1.3 vs M3"로 표시) 융합 폴리펩티드(polypeptide)들로서 발현된다. 셀들을 표시하는 D1.3 또는 M3는 이차 난백 라이소자임(biotinylated hen egg lysozyme)의 다양한 농도들을 가지며 배양된다. 계산된 kDs는 각 적정 곡선에 도시된다.
도 12는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 변형시키는데 사용되는 복제 벡터의 개략도이다. 상기 복제 벡터는 설계되어 복제 증식(propagatio)을 위한 pPOX2 프로모터 및 ARS1에 의해 구동되는 scFv-AGA2 발현 카세트들을 포함한다.
도 13은 제타 기반의 통합 피라미드(a zeta-based integrative plasmid)(도 13a) 또는 복제 피라미드(도 13b)로 변형되는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 셀들 내의 scFv-AGA2의 셀 표면 발현을 보여주는 한 쌍의 히스토그램들이다. 복제 피라미드들을 위한 데이터는 10개의 클론들의 평균을 나타낸다. 복제 벡터로 변형되는 셀들은 비선택적 및 선택적 분위기 아래에서 성장된다. X축("FL2-H"로 표시)은 이차 항원과 복합된 피코에리트린(phycoerythri)을 사용하는 채널 2에 기록되는 c-myc 형광 신호를 나타낸다. Y축("번수"로 표시)은 셀들의 수를 나타낸다.
도 14는 단일 c-Myc 추적 총 길이 trastuzuma(상품명:허셉틴(herceptin))의 표면 발현을 보여주는 연속적인 일차원적의 FFC 히스토그램들이다. 총 2 개의 표시 피라미드들은 생성되어, 세레비시에(S. cerevisiae) Aga2p("A2"로 표시된 일렬의 히스토그램들)로의 N 말단 융합 및 Aga2p("A4"로 표시된 일렬의 히스토그램들)로의 C 말단 융합으로서의 IgG H사슬의 표시를 허용한다. IgG L사슬은 수용성의 절편으로서 발현된다. H사슬(HC) 및 L사슬(LC) 발현은 감지된다. 형광은 실시예 1에서 설명하는 바와 같이 감지된다. 도 14a는 c-myc 및 V5 발현을 나타내는 점블럿(dot blot)이다. 다시 말해, 모든 셀들은 AGA2로의 N 말단 융합 및 C 말단 융합 모두를 위해 H사슬 및 L사슬의 총 길이의 발현을 동시에 나타낸다. 표시되지 않은 셀들은 에피토프 태그들(epitope tags)의 감지되지 않음을 나타낸다. 가려진 히스토그램들인 도 14b는 두 융합들을 위한 c-myc 및 V5의 발현을 나타낸다.
표시 효율에 있어 현저한 개선은 H사슬이 허셉틴(herceptin) 패브 디스플레이를 위해 관찰되는 것과 유사하게, N 말단 융합과 비교해 볼 때, 부착되는 AGA2의 C 말단에 융합되는 셀들에 대해 관찰될 수 있다.(점선에 의해 표시된 바와 같이) 도 14c는 발현된 HC 및 LC의 개략도를 나타낸다.
도 15는 scFv 친화력 성숙 검사(affinity maturation screening)으로부터 고립된 두 개의 클론들(클론(13), 클론(38))에 대한 용량 반응 곡선들을 보여주는 선 그래프이다. Kd는 평형 적정 곡선 및 야생형 D1.3 Kd와의 비교로부터 결정된다. Kd 값들은 각각 클론(13 내지 38)을 위해 2.2 내지 1.8nM로 결정된다. 상기 값들은 M3 돌연변이체(mutant)를 위한 범위과 동일하게 놓이는 야생형 Kd (4.0nM)와 각각 비교해볼 때, 1.8 내지 2.4 폴드 향상을 나타낸다.
여기서 이스트 셀의 표면 상의 폴리펩티드(polypeptide)(즉, 항원 폴리펩티드 또는 항원 폴리펩티드 절편)를 표시할 때 사용을 위한 방법들 및 조성들이 제공된다. 상술한 다양한 방법들 및 조성들과 함께 사용될 수 있는 예시적인 이스트는 여기서, 야로위아 속(Yarrowia genus)(즉, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)(YI))을 포함한다.
항체 폴리펩티드들 및 항체 폴리펩티드 절편들
다양한 항체 폴리펩티드들 또는 절편들은 여기서 설명하는 방법들 및 조성들과 함께 이스트 셀의 표면 상에 발현될 수 있다.
여기서 사용되는 용어인 "항체 폴리펩티드"는 폴리펩티드를 언급한다. 즉, 또는 면역글로불린(immunoglobulin) H사슬 및/또는 역글로불린(immunoglobulin) L사슬 폴리펩티드로부터 유래된다. 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 야생형 IgG 항원은 일반적으로 두개의 동일한 H사슬 폴리펩티드들 및 두개의 동일한 L사슬 폴리펩티드들을 포함한다. 주어진 항원은 알파(alpha), 델타(delta), 엡실론(epsilon), 감마(gamma) 및 뮤(mu)로 불리는 5가지 종류의 H사슬들 중 하나를 포함하고, 이들의 분류는 H사슬 불변 영역의 아미노산의 서열 상에 기반을 둔다. 사람에게 있어서, 알파 불변 영역들의 2가지 종류들 및 감마 불변 영역들의 4가지 종류들이 있다. 이러한 H사슬들의 다른 종류들은 각각 항원들, IgA(IgA1 내지 IgA2 종류들을 포함하는), IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 종류들을 포함하는) 및 IgM의 다섯가지 종류에 증가를 가져온다. 주어진 항원들은 또한 카파(kappa), 람다(lambda), L사슬 불변 도메인들의 아미노산 서열 상에 기반을 두는 것들의 분류로 불리는 L사슬의 한가지 또는 두가지 종류를 포함한다. 예시적인 실시예들에 있어서(In certain embodiments), 여기서 설명하는 방법들은 이스트(즉, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)와 같은 야로위아(Yarrowia) 변형)의 셀 표면 상의 항체 폴리펩티드의 발현을 제공한다. 예시적인 실시예들에 있어서, H사슬의 총 길이, L사슬의 총 길이 또는 모두는 상기 이스트 내에서 발현된다. 예시적인 실시예들에 있어서, H사슬의 총 길이의 절편, L사슬의 총 길이 또는 모두는 상기 이스트 내에서 발현된다.
여기서 사용되는 용어인 "항원 절편" 또는 "항체 폴리펩티드 절편"은 앞에서 정의된 항체 폴리펩티드 총 길이를 포함하지 않지만 항체 폴리펩티드 총 길이의 적어도 일부를 포함하는 항체 폴리펩티드 분자로부터 유래된 폴리펩티드를 언급한다. 항체 폴리펩티드 절편들은 종종 항체 폴리펩티드 총 길이의 쪼개진 일부를 포함하는 폴리펩티드들을 포함하지만, 상기 용어(term)는 상기 쪼개진 절편들에 한정되지 않는다. 여기서 사용되는 용어는 항체 폴리펩티드 절편이기 때문에, 항체 폴리펩티드들(즉, H사슬 또는 L사슬 항체 폴리펩티드들)로부터 유래된 단일 폴리펩티드 사슬들 절편들을 포함하고, 항원 폴리 펩티드 절편들이 자신들 스스로 항원을 연결하지 않을 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드 절편은 패브 절편 내에 포함되는 H사슬 항체 폴리펩티드의 일부를 포함할 수 있고, 이러한 항체 폴리펩티드 절편이 전형적으로 항원을 연결하지 않는다면, 항체 폴리펩티드 절편은 L사슬 항체 폴리펩티드로(즉, 패브 절편 내에 포함될 수 있는 L사슬 항체 폴리펩티드의 일부)부터 유래된 다른 항체 폴리펩티드 절편과 관련이 있다. 이러한 항원-연결 장소는 재구성된다. 항체 폴리펩티드 절편들은 예를 들어, 패브 절편들 내에 포함될 수 있는 폴리펩티드들, F(ab')2 절편들, scFv (e단일 사슬 Fv) 절편들, Fv 절편들, 디아바디들(diabodies), 선형 항체들, 이중특이성(bispecific), 삼중특이성(trispecific) 및 다중특이성(multispecific) 항체들(즉, 디아바디들(diabodies), 트리아바디들(triabodies), 테트라바디들(tetrabodies))과 같은 다중특이성(multispecific) 항체 절편들, 미니바디들(minibodies), 킬레이트 재조합체 항체들(chelating recombinant antibodies), 트리바디들(tribodies) 또는 바이바디들(bibodes), 인트라바디들(intrabodies), 나노바디들(nanobodies), 소형 모듈 면역제약학적들(small modular immunopharmaceuticals)(SMIP), 결합역 면역글로불린 융합 단백질들(immunoglobulin fusion proteins), 카멜화(camelized)된 항체들 및 VHH를 포함하는 항원들을 포함할 수 있다. "항체 절편들" 또는 "항체 폴리펩티드 절편들"은 "항원-연결 항체 절편들" 및 "항원-연결 항체 폴리펩티드 절편들"을 포함하는 것을 확인할 수 있을 것이다. 미국 특허 번호 7,422,890, 7,422,742 및 7,390,884는 각각 여기에 전체로서 참조된다.
여기서 사용되는 용어인 "인간화 항체 폴리펩티드(Humanized antibody polypeptide)"는 설계되어, 하나 또는 그 이상의 인적 변이 영역(human variable region)(L사슬 및/또는 H사슬), 상기 변이 부위와 함께 비인적 자원(즉, 쥐, 랫트 또는 햄스터) 내의 구조 형성 영역들(framework regions), H사슬 및/또는 L사슬 폴리펩티드들 및 인적 H사슬 불변 영역들 및/또는 L사슬 불변 영역들의 상보 결정 영역들(complementarity-determining regions)(CDRs)를 포함하는 항체 폴리펩티드를 언급한다. 예시적인 실시예들에 있어서, 인간화 항체는 CDRs 영역들을 제외하고 전적으로 사람인 서열을 포함한다. 인간화 황체들은 전형적으로 비인적 자원들과 상대적인 인간들에 더 적은 면역성을 갖고, 즉, 치료학적 용도에 특정한 이점을 제공한다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 인간화 항체들 및 인간화 항체 폴리펩티드들을 형성하기 위한 적절한 기술에 대해 알 수 있을 것이다. 미국 특허 번호 7,442,772, 7,431,927, 6,872,392, 및 5,585,089는 각각 여기에 전체로서 참조된다.
여기서 사용되는 용어인"키메라(Chimeric) 항체 폴리펩티드"는 설계되어 적어도 하나의 인간 불변 영역을 구성하는 항체 폴리펩티드를 언급한다. H사슬(들) 및 또는 L사슬(들)은 인간 불변 영역들을 포함할 수 있다. 키메라 항체들은 전형적으로 전형적으로 비인적 자원들과 상대적인 인간들에 더 적은 면역성을 갖고, 즉, 치료학적 용도에 특정한 이점을 제공한다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 키메라 항체들 및 키메라 항체 폴리펩티드들을 형성하기 위한 적절한 기술에 대해 알 수 있을 것이다. 미국 특허 번호 7,442,772, 7,431,927, 6,872,392, 및 5,585,089는 각각 여기에 전체로서 참조된다.
예시적인 실시예들에 있어서, 발현된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 인간 항체 폴리펩티드 또는 절편이다. 예시적인 실시예들에 있어서, 상기 발현된 항체 폴리펩티드 또는 상기 절편은 비인적 자원 항체 폴리펩티드이다. 즉, 쥐 또는 랫트 항체 폴리펩티드 또는 절편이다. 예시적인 실시예들에 있어서, 발현된 항체 폴리펩티드 또는 절편은 인간 H사슬 불변 영역들 및/또는 L사슬 불변 영역들을 포함하는 키메라이다. 예시적인 실시예들에 있어서, 발현된 항체 폴리펩티드 또는 절편은 인간화되어, 비인적 자원(즉, 쥐, 랫트 또는 햄스터)와 함께 변이 영역 내의 하나 또는 그 이상의 인간 구조 형성 영역들(human framework regions), H사슬 및/또는 L사슬의 상보 결정 영역들(complementarity-determining regions)(CDRs)을 포함한다.
예시적인 실시예들에 있어서, 이스트 셀의 표면 상에 발현되는 항체 폴리펩티드는 항체의 H사슬 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 실시예들에 있어서, H사슬 폴리펩티드의 절편(즉, VH-CH1, Fv 절편 또는 scFv 절편)은 이스트 셀의 표면 상에 발현된다. 예시적인 실시예들에 있어서, 이스트 셀의 표면 상에 발현되는 항체 폴리펩티드는 H사슬 불변 영역의 전부 또는 일부(즉, Fc 영역, 경첩 영역 등)를 포함한다. 예시적인 실시예들에 있어서, 이스트 셀의 표면 상에 발현되는 항체 폴리펩티드는 H사슬 불변 영역을 결핍시킨다. 예시적인 실시예들에 있어서, 이스트 셀의 표면 상에 발현되는 항체 폴리펩티드는 H사슬 불변 영역의 일부(즉, Fc 영역)를 결핍시킨다. 예시적인 실시예들에 있어서, 이스트 셀의 표면 상에 발현되는 항체 폴리펩티드는 항체의 L사슬 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 실시예들에 있어서, L사슬 폴리펩티드의 절편(즉, Fv 절편 또는 scFv 절편)은 이스트 셀의 표면 상에 발현된다. 예시적인 실시예들에 있어서, 이스트 셀의 표면 상에 발현되는 항체 폴리펩티드는 L사슬 사슬 불변 영역을 포함한다. 예시적인 실시예들에 있어서, 이스트 셀의 표면 상에 발현되는 항체 폴리펩티드는 L사슬 불변 영역을 결핍시킨다.
예시적인 실시예들에 있어서, 항체 폴리펩티드 절편은 패브 절편, F(ab')2 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 선형 항체, 이중특이성(bispecific), 삼중특이성(trispecific) 및 다중특이성(multispecific) 항체(즉, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody))과 같은 다중특이성(multispecific) 항체 절편, 미니바디(minibody), 킬레이트 재조합체 항체y(chelating recombinant antibody), 트리바디(tribody) 또는 바이바디(bibody), 인트라바디(intrabody), 나노바디(nanobody), 소형 모듈 면역제약학적(small modular immunopharmaceutical)(SMIP), 결합역 면역글로불린 융합 단백질(immunoglobulin fusion protein), 카멜화(camelized)된 항체 및 VHH를 포함하는 항원의 일부인 아미노산 사슬을 포함하는 폴리펩티드이다. 예시적인 실시예들에 있어서, 항체 폴리펩티드 절편은 scFv 절편이다.
예시적인 실시예들에 있어서, H사슬 항체 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 절편 및 L사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편 모두는 이스트 셀의 표면 상에 발현된다. 예를 들어, 완전한 H사슬 항체 폴리펩티드 및 완전한 L사슬 항체 폴리펩티드 상술한 어떤 이스트 내에 발현될 수 있다. (즉, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)) 다른 실시예에 있어서, 패브 절편, Fv 절편 또는 scFv 절편 내에 포함되는 H사슬 항체 폴리펩티드의 일부는 패브 절편, Fv 절편 또는 scFv 절편 내에 포함되는 L사슬 항체 폴리펩티드의 일부를 따라서 이스트 내에 발현될 수 있다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 H사슬 항체 폴리펩티드 및 L사슬 항체 폴리펩티드(또는 항체 폴리펩티드 절편들)이 이스트 셀의 표면 상에 발현될 때, 이러한 항체 폴리펩티드들 또는 절편들은 서로 관련되어 기능적인 항원-연결 분자로 재구성된다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
예시적인 실시예들에 있어서, H사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 제1 교배형의 반수체 이스트 셀(haploid yeast cell)의 표면 상에 발현되고, L사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 제2 교배형의 반수체 이스트 셀(haploid yeast cell)의 표면 상에 발현되며, 상기 제1 및 제2 교배형 반수체 이스트 셀들(haploid yeast cells)은 교배되어, 배수체 이스트 셀을 형성한다. 이와는 반대로, 상기 L사슬 항체 폴리펩티드 또는 절편은 제1 교배형의 제1 반수체 이스트 셀의 표면 상에 발현되고, 상기 H사슬 항체 폴리펩티드 또는 절편은 제2 교배형의 제2 반수체 이스트 셀의 표면 상에 발현되며, 상기 제1 및 제2 교배형 반수체 이스트 셀들(haploid yeast cells)은 교배되어, 배수체 이스트 셀을 형성한다. 이러한 교배들로 인해 형성되는 이스트 셀들은 상기 H사슬 항체 폴리펩티드 및 상기 L사슬 항체 폴리펩티드(또는 항체 폴리펩티드 절편)를 발현할 것이다. 교배 타입의 이스트는 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 예를 들어, 반수체 형성에 있어, 세레비시에(S. cerevisiae)는 두가지 교배법들: MATA, MATB 중에서 하나에 존재한다. 게다가, MATA 교배법인 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 셀들은 MATB 교배법으로 설계될 수 있다. 반수체 MATA 및 MATB 이스트 셀들은 서로 교배하여 배수체 셀을 형성할 수 있다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 이스트 종들이 교배될 수 있고, 또한, 적절한 교배법을 알 수 있을 것이다.
특정 실시예들에서, H사슬 항체 폴리펩티드(heavy chain antibody polypeptide) 또는 항체 폴리펩티드 절편(ploypeptide fragment)와 L사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편는 모두 두 개의 벡터들(vectors) 또는 발현 카세트들(expression cassettes)로 반수체 이스트 셀(haploid yeast cell)를 변환함으로써 이스트 셀의 표면 상에 발현된다. 이 때, 제 1 벡터 또는 발현 카세트는 H사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편를 인코딩하는 핵산 시퀀스(nucleic acid sequence)를 포함하고, 제 2 벡터 또는 발현 카세트는 L사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편를 인코딩하는 핵산 시퀀스를 포함한다. 특정 실시예들에서, H사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편와 L사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편는 모두 단일 벡터로 반수성 이스트 셀을 변환함으로써 이스트 셀의 표면 상에 발현된다. 이 때, 단일 벡터는 H사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편와 L사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편를 인코딩하는 핵산 시퀀스를 포함하는 발현 카세트들을 포함한다. 그러한 이스트 셀들은 반수체(haploid)일수도 있고, 이배체(diploid)일 수도 있다.
특정 실시예들에서, 이스트 셀의 표면 상에 발현될 H사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편 및/또는 L사슬 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편는 고정 폴리펩티드(anchor polypeptide)(아래의 "고정 폴리펩티드들"로 명명된 부분을 참조)를 포함하는 퓨전(fusion) 폴리펩티드이다. 항체 폴리펩티드 또는 절편를 그것의 H사슬 항체 폴리펩티드 또는 절편를 통해 고정시키는 것이 전형적이라고 할지라도, L사슬 항체 폴리펩티드 또는 절편를 통해 고정하는 것 또한 가능하다. 예를 들어, "Lin et al., App. Microbiol Biotechol, 2003, Aug; 62(2-3):226-32"는 여기에 전체로서 참조된다. 특정 실시예들에서, 항체 폴리펩티드 또는 그의 절편의 H사슬만이 고정 폴리펩티드로 융화(fused)된다. 특정 실시예들에서, 항체 폴리펩티드 또는 그의 절편의 L사슬만이 고정 폴리펩티드로 융화된다. 특정 실시예들에서, 항체 폴리펩티드 또는 그의 절편의 H사슬 및 항체 폴리펩티드 또는 그의 절편의 L사슬 모두가 고정 폴리펩티드로 융화된다. 특정 실시예들에서, 고정 폴리펩티드는 퓨전 폴리펩티드의 아미노산 종단부(amino end)에서 융화된다. 특정 실시예들에서, 고정 폴리펩티드는 퓨전 폴리펩티드의 카복시 종단부(carboxy end)에서 융화된다.
특정 실시예들에서, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편는 여기에 개시되는 다양한 방법들로 얻어질 수 있다. 그러한 항체 폴리펩티드 또는 그의 절편는 상기 셀의 일부로서 얻어질 수 있다. 선택적으로, 항체 폴리펩티드 또는 그의 절편는 그것이 발현된 후에 상기 셀로부터 정제(purified)될 수 있다. 폴리펩티드들을 정제하는 표준 기술들이 사용될 수 있다.
관심있는 폴리펩티드를 발현하는 이스트 셀들은 해당 기술 분야의 당업자에게 알려진 다양한 방법들에 의하여 검출 및 선별(screened)될 수 있다. 예를 들어, 형광 활성 셀 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS)가 채용될 수 있다. 형광 활성 셀 분류에서, 이스트 셀들은 관심있는 폴리펩티드(예를 들어, 본 발명의 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편들에 의해 묶여진 항원(antigen))를 묶는 라벨드 물질(labeled agent)에 접촉한다. 검출될 수 있는 한 어떠한 라벨(label)이라도 사용될 수 있다. 적합한 라벨들은 형광 부분들에 한정되지 않고 화학 발광 부분들(chemiluminescent moieties) 등을 포함한다. 해당 기술 분야의 당업자는 적합한 라벨들을 알 수 있을 것이다. 특정 실시예들에서, 물질은 간접 라벨(indirect label)로 식별된다. 간접 라벨은 간접 라벨을 묶는 검출 라벨드 물질(detectably-labeled agent)(예를 들어, 형광 또는 화학 발광 부분들)를 묶음으로써 검출될 수 있다. 다양한 간접 라벨들이 해당 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 간접 라벨들은 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)에 의해 묶여질 수 있는 비오틴(biotin), 에피토프 택들(epitope tags) 등이 있으나, 그에 한정되는 것은 아니다. 에피토프 택들은 특정 에피토프 택에 특정된 절편들의 라벨드 항체들을 이용하여 검출될 수 있다. 또는, 에피토프 택들은 특정 에피토프 택에 특정된 제 1 항체 또는 그의 절편를 묶고, 제 1 항체 또는 절편를 라벨드 제 2 항체 또는 그의 절편로 검출함으로써 검출될 수 있다. 이후, 이스트 셀들은 셀들을 분리하는 셀 분류기(cell sorter)를 거치고, 라벨드 물질이 각각의 개별 셀들과 연관되는지 여부를 결정한다. 형광을 보이는 셀들은 그들의 표면에 관심있는 폴리펩티드를 발현한다. 또는, 셀들은 관심있는 항체 폴리펩티드 또는 절편(예를 들어, 항원)를 묶는 물질로 코팅된 플레이트들 상에 팬(panned)될 수 있다. 또는, 셀들은 관심있는 항체 폴리펩티드 또는 절편를 묶는 물질과 링크(linked)된 고체 지지대(solid support)(예를 들어, 비드(bead))로 묶여질 수 있다. 이후, 고체 지지대는 고립(예를 들어, 원심 분리, 고체 지지대가 상자성(paramagnetic)인 경우 자성 제거 등에 의해서)될 수 있다. 고체 지지대에 묶여진 셀들은 그들의 표면에 관심있는 폴리펩티드를 발현한다. 해당 기술 분야의 당업자는 그들의 표면에 관심있는 폴리펩티드를 발현하는 이스트 셀들을 고립시키고 식별하는 다른 적합한 방법들을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, "Yeung and Wittrup, Biotechnol. Prog., Mar-Apr; 18(2):212-20, 2002", "Ackerman et al., Biotechnol. Prog., May-Jun; 25(3):774-83, 2009", "Wang et al., J. Immunol. Methods, Sep; 304(1-2):30-42, 2005" 및 "Chao et al., Nat. Protoc., 1(2):755-68, 2006"은 여기에 전체로서 참조된다.
해당 기술 분야의 당업자는 여기에 개시된 방법들 및 구성들에 따른 이스트(예를 들어, Yarrowia lipolytica) 셀의 표면 상에 발현될 수 있는 다른 항체 폴리펩티드들 및 절편들을 알 수 있을 것이다.
다양한 고정 폴리펩티드들이 여기에 개시된 방법들 및 구성들에 따른 이스트 셀의 표면 상에 폴리펩티드(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)를 발현하기 위하여 사용될 수 있다.
여기에서 사용되는 "고정 폴리펩티드"라는 용어는 셀의 표면에 매어지는(tethered) 폴리펩티드를 말한다. 또한, "고정 폴리펩티드"는 다른 폴리펩티드들(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)을 셀의 표면에 매기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 고정 폴리펩티드는 트랜스멤브레인(transmembrane) 또는 글리코실포스파티다일리노시톨(glycosylphosphatidylinositol; GPI) 셀벽 단백질(cell wall protein) 등과 같은 셀벽 단백질일 수 있다. 다양한 고정 폴리펩티드들이 해당 기술 분야에 알려져 있다. 또한, 다양한 고정 폴리펩티드들은 여기에 개시된 이스트의 표면 상에 폴리펩티드를 발현하기 위한 구성들 및 방법들에 따라 사용될 수 있다. 이러한 고정 펩티드는 S. cerevisiae Aga1-Aga2 (mating type Aagglutinin gene) heterodimer, S. cerevisiae alpha-agglutinin (Sag1p), Pir1p, Pir2p, Pir4p, Flo1p, Yarrowia CWPI, 및 그들의 절편들을 포함할 수 있으나, 그에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, "Ueda et al., J. Biosci. Bioeng. 90:125-36, 2000", "Abe, H., Shimma et al., Pir. Glycobiology 13, 87-95, 2003", "Andres, I., et al., Biotechnol Bioeng 89, 690-7, 2005", "Wang, Q., et al., Curr. Microbiol. 56, 352-7, 2008", "Tanino, T., et al., Biotechnol. Prog. 22, 989-93, 2006" 및 "Yue et al., J. Microbiol. Methods. 2008 Feb; 72(2):116-23"는 여기에 전체로서 참조된다.
일 실시예에서, 고정 폴리펩티드(anchor polypeptide)는 관심 폴리펩티드(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)를 이스트 셀의 표면, 예를 들어 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 셀의 표면에 묶도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 고정 폴리펩티드는 상기 관심 폴리펩티드에 융합됨으로써, 상기 고정 폴리펩티드 및 상기 관심 폴리펩티드 모두가 상기 셀 표면에 발현될 수 있다.
일 실시예에서, 관심 폴리펩티드(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)를 발현하는 이스트 셀은 고정 폴리펩티드를 부호화하는 제2 핵산 서열(nucleic acid sequence)로 프레임에 맞추어 융합된(fused in frame) 상기 관심 폴리펩티드를 부호화하는 제1 핵산 서열을 포함하는 벡터 또는 발현 카세트("발현 카세트들 및 벡터들" 참조)로 상기 이스트 셀을 변형함으로써 생성될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제1 핵산 서열은 상기 제2 핵산 서열에 융합(5')됨으로써, 상기 융합 서열로부터 생성된 융합 폴리펩티드는 N-터미널 관심 폴리펩티드 및 C-터미널 고정 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제1 핵산 서열을 상기 제2 제2 핵산 서열에 융합(3')됨으로써, 상기 융합 서열로부터 생성된 융합 폴리펩티드는 N-터미널 고정 폴리펩티드 및 C-터미널 관심 폴리펩티드를 포함할수 있다. 일 실시예에서, 상기 제1 핵산 서열은 상기 제2 핵산 서열에 프레임에 맞추어 직접 융합될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제1 핵산 서열은 링커 서열에 융합되고, 상기 링커 서열은 상기 제2 핵산 서열에 융합될 수 있다. "발현 카세트들 및 벡터들"에서 상세히 후술될 바와 같이, 일반적으로 링커 서열은, GlySer 링커 폴리펩티드(예를 들어, (Gly4Ser)3 또는 (Gly4Ser)5)와 같은 링커 폴리펩티드(다만, 이에 한정되지 않는다)를 부호화한다.
발현 카세트들 및 벡터들(Expression Cassettes and Vector)
특정 실시예들에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 상기 폴리펩티드를 핵산 시퀀스를 인코딩(encoding)하는 핵산 시퀀스를 포함하는 발현 카세트와 함께 상기 효모(yeast)를 변환함으로써 효모 세포의 표면상에서 변형된다. 여기에서 "발현 카세트"라는 용어는, 최소한 (1)관심있는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드, 및 (2)관심있는 상기 폴리펩티드의 발현을 일으키게 하는 뉴클레오티드 시퀀스(예를 들어, 프로모터(promoter)를 포함하는 액산 시퀀스를 의미한다.
특정 실시예들에 있어서, 관심있는 폴리펩티드는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편(fragment)을 포함하는 상기 발현 카세트의 뉴클레오티드 시퀀스에 의해서 인코딩된다. 발현 카세트는 여기에서 설명되는 모든 항체 폴리펩티드 또는 절편, 예를 들어, Fab 절편, Fv 절편, 또는 scFv 절편으로부터 유도된 항체 폴리펩티드 또는 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 관심있는 폴리펩티드는 Fab 절편의 중쇄(heavy chain)이다. 특정 실시예들에 있어서, 관심있는 폴리펩티드는 Fab 절편의 경쇄(light chain)이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 발현 카세트의 뉴클레오티드 시퀀스에 의해서 인코딩되는 관심있는 폴리펩티드는 앵커 폴리펩티드(anchor polypeptide)를 포함한다. 발현 카세트는 여기에서 설명하는 모든 앵커 폴리펩티드, 예를 들어, S. cerevisiae Aga1-Aga2 heterodimer, S. cerevisiae alpha agglutinin (Sag1p), Pir1p, Pir2p, Pir4p, Flo1p, 야로이야(Yarrowia CWPI), 및 이들의 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 발현 카세트의 뉴클레오티드 시퀀스에 의해서 인코딩되는 관심있는 폴리펩티드는 앵커 폴리펩티드로 융합된(fused in frame to) 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 포함한다. 예를 들어, 발현 카세트는 항체 폴리펩티드 또는 절편을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있고, 상기 제1 뉴클레오티드 시퀀스는 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 시퀀스로 융합된다. 특정 실시예들에 있어서, 항체 폴리펩티드 또는 절편을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 시퀀스는 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 시퀀스로 5'방향으로 융합되어서, 상기 뉴클레오티드 시퀀스가 발현될 때, 상기 항체 폴리펩티드 또는 절편은 상기 앵커 폴리펩티드에 대해서 N-말단이다. 특정 실시예들에 있어서, 항체 폴리펩티드 또는 절편을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 시퀀스는 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 시퀀스로 3'방향으로 융합되어서, 상기 뉴클레오티드 시퀀스가 발현될 때, 상기 항체 폴리펩티드 또는 절편은 상기 앵커 폴리펩티드에 대해서 C-말단이다.
특정 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스로 융합되는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하여서, 삽입(intervening) 뉴클레오티드 잔류물들이 존재하지 않는다. 그러한 실시예들에 있어서, 상기 발현 카세트로부터 발현되는 상기 폴리펩티드는 삽입(inteevening) 아미노산 잔류물들 없이, 상기 앵커 폴리펩티드와 직접적으로 융합되는 항체 폴리펩티드 또는 절편을 포함할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 링커(linker) 폴리펩티드를 인코딩하는 링커 시퀀스로 융합되는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 상기 링커 시퀀스는 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스로 융합되어서, 상기 링커 시퀀스는 상기 항체 폴리펩티드 또는 절편을 인코딩하는 상기 제1 뉴클레오티드 시퀀스와 상기 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 제2 뉴클레오티드 시퀀스 사이에 융합된다. 그러한 실시예들에 있어서, 상기 발현 카세트로부터 발현되는 상기 폴리펩티드는 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편, 상기 링커 폴리펩티드 및 상기 앵커 폴리펩티드를 포함할 것이다. 이 문단에서 설명된 모든 실시예들에 있어서, 항체 폴리펩티드 또는 절편을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 시퀀스는 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 시퀀스에 5' 또는 3' 방향으로 융합될 수 있다.
링커 폴리펩티드들의 모든 변형들이 아래 설명되는 조성들(compositions)과 방법들에 의해서 사용될 수 있다. 링커 폴리펩티드는 융합(fusion) 폴리펩티드 내에 포함되는 2개의 폴리펩티드들 상이에 스페이서(spacer)로 역할을 할 수 있다. 링커 폴리펩티드는 유리하게 상기 관심있는 2개의 폴리펩티드들의 기능을 방해하지 않거나 또는 오직 미세한 정도로만 방해한다. 특정 실시예들에 있어서, 링커 폴리펩티드는 상기 관심있는 2개의 폴리펩티드들에 상당한 형태적 자유도(conformational freedom)를 부여하므로, 상기 관심있는 2개의 폴리펩티드들은 서로에 대해서 다양한 공간상 위치 및 방향을 취할 수 있다. 링커 폴리펩티드들의 비한정적인 예들은 GlySer 링커 폴리펩티드, 예를 들어 (Gly4Ser)3(서열 번호(SEQ ID NO):14) 또는 (GlySer)5(서열 번호: 15)일 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 링커 폴리펩티드는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편의 2개 부분들 사이에 위치할 수 있다. 예를 들어, 링커 폴리펩티드를 인코딩하는 링커 시퀀스는 1) scFv 절편의 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)을 인코딩하는 중쇄 핵산 시퀀스와 2) scFv 절편의 경쇄 가변 영역(light chain variable region)을 인코딩하는 경쇄 핵산 시퀀스 사이에 융합될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 관심있는 폴리펩티드는 하나 이상의 링커 시퀀스를 포함한다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드는 scFv 항체 폴리펩티드 절편일 수 있고, 이는 1) scFv 절편의 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 사이에 위치하는 제1 링커 폴리펩티드, 2) 앵커 폴리펩티드, 및 3) 상기 scFv 항체 폴리펩티드 및 상기 앵커 폴리펩티드 사이에 제2 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자(이하, 당업자)는 다른 적합한 링커 폴리펩티드들과 이들을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스들을 알 수 있을 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 리더 폴리펩티드(leader polypeptide)를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 리더 핵산 시퀀스(leader nucleic acid sequence)를 포함한다. 리더 폴리펩티드의 모든 변형들은 아래 설명되는 조성들(compositions)과 방법들에 의해서 사용될 수 있다. 리더 폴리펩티드는 분비 기작(secretion apparatus)을 통해서 폴리펩티드의 과정(process)이 진행되는 것을 돕는 작용을 하고, 결국 적절하게 처리된 표면을 보이드 폴리펩티드(properly processed surface displayed polypeptide)를 야기한다. 리더 시퀀스들은 과정(processing)이 진행되는 동안 상기 폴리펩티드로부터 떨어져 나오며, 완전히 처리된(fully-processed) 폴리펩티드의 부분이 아니다. 당업자에 의해서 이해되는 바와 같이, 리더 핵산 시퀀스는 전형적으로 관심있는 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 시퀀스에 5'방향으로 융합될 수 있어서, 상기 리더 폴리펩티드는 상기 발현 융합 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 리더 폴리펩티드들의 비한정적인 예들은 LIP2 pre, LIP2 prepro, XPR2 pre, 및 XPR2 prepro을 포함한다. 예를 들어, Pignde et al.(J. Bacteriol., May;182(10):2802-10, 2000); Davidow et al.(J. Bacteriol., Oct;169(10):4621-9, 1987); 및 Madzak et al.(J. Biotechnol., Apr 8;109(1-2):63-81, 200)을 참조하며, 이들 각각은 여기서 참조문헌으로서 병합됨. 당업자는 다른 적합한 리더 폴리펩티드들 및 이들을 인코딩하는 핵산 시퀀스들을 알 수 있을 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 에피토프 태그(epitope tag)를 인코딩하는 핵산 시퀀스를 포함하는 에피토프 핵산 시퀀스(epitope nucleic acid sequence)를 포함한다. 에피토프 태그들의 모든 변형들은 아래 설명되는 조성들(compositions)과 방법들에 의해서 사용될 수 있다.모든 변형들은 아래 설명되는 조성들(compositions)과 방법들에 의해서 사용될 수 있다. 에피토프 태그는 전형적으로 발현된 폴리펩티드의 검출(detection), 측정, 계수(quantitation) 및/또는 정제(purification)(또는 분리)를 용이하게 하는 짧은 폴리펩티드 시퀀스이다. 에피토프 태그는 예를 들어, N-말단, C-말단 또는 내부와 같이 주어진 폴리펩티드 내에 어디에나 위치할 수 있다. 에피토프 태그들의 비한정적인 예들은 c-Myc (골수세포증 세포 종양유전자(myelocytomatosis cellular oncogene)), V5 (유인원 바이러스 5(Simian Virus 5)의 P 및 V 단백질의 C-말단 시퀀스로부터 유도됨), 폴리히스티딘(polyhistidine) (예를 들어, 6-his, 또는 헥사히스티딘(hexahistidine)), 글투타티온 S-전달효소(glutathione-S-transferase), 스트렙타아비딘(streptavidin), 비오틴(biotin), 헤마글루티닌(hemagglutinin), Flag-tag(FLAG 옥타펩티드(octapeptide)), 및 E-tag (GAPVPYPDPLEPR, 서열 번호: 13)을 포함한다. 당업자는 다른 적합한 에피토프 태그들 및 이들을 인코딩하는 핵산 시퀀스들을 알 수 있을 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 프로모터(promoter)를 포함한다. 프로모터, 당해 분야에서 알려진 바와 같이, 다운스트림 뉴클레오티드 시퀀스(downstream nucleotide sequence)의 리보핵산(ribonucleic acid; 이하 RNA)으로의 전사를 진행하게 하는 뉴클레오티드 시퀀스이고, 상기 전사는 모든 다양한 전사 인자들(transcription factors)을 통해서 조정된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 전사된 RNA는 관심있는 폴리펩티드를 인코딩한다. 특정 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 (1)항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 제1 핵산 시퀀스 및 (2)이에 융합되며, 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 핵산 시퀀스를 포함하는 제2 핵산 시퀀스를 포함하는 융합 시퀀스에 작동 가능하게 링크된(linked) 프로모터를 포함한다.
유리한 프로모터들은 관심있는 세포 내에서 전형적으로 작용한다. 예를 들어, 많은 프로모터들은 효모 내에서, 예를 들어 제한없이 Yarrowia lipolytica와 같은 야로이야 종들(Yarrowia species) 내에서 작용하는 것으로 알려졌다. 특정 실시예들에서, Yarrowia lipolytica 내에서 작용하는 프로모터는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 RNA의 발현을 진행시키는 것에 이용된다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia lipolytica 내에서 작용하는 프로모터는 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA의 발현을 진행시키는 것에 이용된다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia lipolytica 내에서 작용하는 프로모터는 앵커 폴리펩티드에 융합된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 RNA의 발현을 진행시키는 것에 이용된다.
프로모터들의 모든 변형들이 아래 설명되는 효모(yeast) 세포의 포면 상에서 관심있는 폴리펩티드를 발현하는 방법들과 조성들(compositions)에 의해서 사용될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)를 발현하는데 이용된 프로모터는 구조적(constitutive) 프로모터이다. 많은 구조적 프로모터들이 당해 기술 분야에 알려져 있으며, 이들은 제한없이 TEF1 및 glyceraldehyce-3-phosphate dehydrogenase 프로모터를 포함할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)를 발현하는데 이용된 프로모터는 유도 가능한(inducible) 프로모터이다. 유도할 수 있는 프로모터는 관심있는 폴리펩티드가 발현될 때, 실험자(practitioner)가 이를 제어하고자 할 때, 유용하다. 많은 유도 가능한 프로모터들이 당해 기술 분야에 알려져 있으며, 이들은 제한없이 POX3 및 LIP2 프로모터들을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)를 발현하는데 이용된 프로모터는 반-구조적(semi-constitutive) 프로모터이다. "반-구조적 프로모터"란 용어는 완전히 구조적이지 않고, 특정 조건들에서 대략적으로 또는 특정 조건들에서만 특정 유전자들의 발현을 진행시키는 프로모터를 의미한다. 예를 들어, 반-구조적 프로모터는 성장기-의존 방식(growth phase dependent manner)으로 유전자 발현을 진행시킬 수 있다. 많은 반-구조적 프로모터들이 당해 기술 분야에 알려져 있으며, 이들은 제한없이 hd4d 프로모터들을 포함한다. 당업자는 관심있는 세포 내에서, 예를 들어 제한없이 Yarrowia lipolytica와 같은 야로이야 종들(Yarrowia species) 내에서 작용하는 다른 적합한 구조적, 유도 가능한, 반-구조적 프로모터들을 알 수 있을 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)는 예를 들어, 여기에서 설명되는 모든 발현 카세트들과 같은 발현 카세트를 포함하는 벡터(vector)와 함께 상기 효모(yeast)를 변환함으로써 효모 세포의 표면상에서 발현된다. "벡터"라는 용어는 여기에서, 발현 카세트를 포함하고, 하나 또는 그 이상의 추가적인 구성 요소들을 포함하는 핵산을 의미한다. 특정 실시예들에 있어서, 벡터는 선택된 조건들 하에서 상기 벡터의 복제(replication), 상동 또는 비상동 병합(homologous or non-homologous integration) 및/또는 유지를 용이하게 하는 구성 요소를 포함한다.
벡터들의 모든 변형들이 아래 설명되는 효모 세포의 표면상에서 관심있는 폴리펩티드를 발현하는 방법들 및 조성들(composition)에 의해서 이용될 수 있다. 상기 벡터들의 비한정적인 예시들은 미국공개특허 2008-0171359에 개시되어 있으며, 상기 특허는 전체로서 여기에 병합되어 참조된다. 당업자는 관심있는 주어진 세포(예를 들어, 효모 세포) 내에서 사용되는 다른 적합한 벡터들을 알 수 있을 것이다. 게다가, 상기 벡터들의 모든 변형들은 효모 세포의 표면상에서 관심있는 폴리펩티드를 발현하는데 사용되기 위해서 변형될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 또는 다른 벡터가 주어진 효모 중들에서 사용이 적합할 수 있으나, 그러한 벡터는 (1) 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 제1 핵산 시퀀스 및 (2)이와 융합되며, 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 핵산 시퀀스를 포함하는 제2 핵산 시퀀스를 포함하는 융합 시퀀스에 작동 가능하게 링크된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함하지 않을 수 있다. 그러한 벡터는 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편 및 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 시퀀스들 및 프로모터를 포함하도록 변형될 수 있다. 반은 분자 생물학적 기술들이 벡터들을 변형하는데 용이하며, 이들 중 다수는 Sambrook, J., Fritsch, E. F.와 Maniatis의 "T. 분자 클로닝"(T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)에 기재되어 있으며, 이는 전체로서 여기에 병합되어 참조될 수 있다. 당업자는 효모 (예를 들어, Yarrowia lipolytica) 세포의 표면상에서 관심있는 폴리펩티드를 발현하는데 이용되는 벡터 변형에 적합한 다른 다양한 분자 생물학적 기술을 알 수 있을 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 벡터는 선택 가능한 마커(selectable marker)를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. "선택 가능한 마커"란 용어는 여기에서, 상기 선택 가능한 마커를 포함하는 세포가 상기 선택 가능한 마커를 포함하지 못한 세포가 생존하고 증식할 수 없는 환경에서 생존하고 증식할 수 있도록 하는 폴리펩티드를 의미한다. 선택 가능한 마커의 용어 및 개념은 당업자에게 널리 알려져 있다. 선택 가능한 마커의 비한정적인 예들은 류신(leucine)(예를 들어, LEU2), 우라실(uracil) (예를 들어, URA3d1), 아데닌(adenine)(예를 들어, ADE2), 라이신(lysine; Lys), 아르기닌(arginine; Arg), 글리세롤 유틸리제이션(glycerol utilization; Gut), 트립토판(tryptophan; Trp), 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나아제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase; G3p), 및 히그로마이신 B 파시퍼트랜스퍼라아제(hygromycin B phosphotransferase; hph)를 포함한다. 당업자는 여기에서 개시된 방법 및 조성들에 따라 이용될 수 있는 다른 적합한 마커들을 할 수 있을 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 벡터는 세포(예를 들어, Yarrowia lipolytica와 같은 Yarrowia 세포)의 게놈(genome)으로 병합된다. 벡터를 세포의 게놈으로 병합하는 다양한 기술들이 당해 분야에서 알려져 있다. 특정 실시예들에 있어서, 벡터는 제타 구성요소(zeta element)를 포함한다. 제타 구성요소는 상동 재조합에 의해서 Ylt1 역전위인자(retrotransposon)를 운반하는 Y. lipolytica 스트레인(strain)의 게놈으로 또는 상기 Ylt1 역전위인자가 없는 효모 내에서 비상동 재조합에 의해서 벡터를 병합하는 것을 가능하게 한다. 특정 실시예들에 있어서, 제타 구성요소는 한정없이 Ylt1 또는 Tyl6 역전위인자와 같은 역전위인자의 긴말단반복순서(long terminal repeat)를 포함한다. 당업자는 여기에서 기재된 방법들 및 조성들에 따른 벡터들 내에서 이들을 이용할 수 있는 다른 구성요소들을 알 수 있을 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 벡터는 세포의 게놈으로 병합되지 않는다. 예를 들어, 복제형 벡터(replicative vector)는 예를 들어 변형(transformation)에 의해서 효모 세포 내로 도입될 수 있다. 복제형 벡터들은 호스트 세포(host cell) 내에서 유지, 복제 및/또는 다른 기능들을 위한 적합한 구성 요소들을 포함한다. 예를 들어, 벡터는 하나 또는 그 이상의 상염색체 복제 구성요소들(autosomal replication elements)을 포함할 수 있다. 그러한 상염색체 복제 구성요소들의 비한정적 예들은 동원체(centromere; CEN) 및 복제개시점(origin of replication; ORI)을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 동원체는 CEN1 또는 CEN3 (Vernis, L., et al.(Mol. Cell Biol. 17, 1995-2004, 2007), 여기에서 참조문헌으로 병합됨)을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 복제개시점은 ORI1068 또는 ORI3018 (Fournier et al., Yeast, Jan;7(1):25-36, 1991, 여기에서 참조문헌으로 병합됨)을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 세포의 게놈에 병합되지 않는 벡터는 복제기점시퀀스(autonomously replicating sequence; 이하 ARS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fournier, et al.(Yeast 7, 2536, 1991) 및 Matsuoka et al.(Mol. Gen. Genet. 237, 327333, 1993)을 참조하며, 각각은 여기에서 전체로서 병합 인용된다. 특정 실시예들에 있어서, ARS는 동원체 및 복제개시점을 포함한다. ARS의 비한정적인 예들은 ARS18 및 ARS18을 포함한다.
특정 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 핵산 시퀀스, 앵커 뉴클레오티드 시퀀스에 작동 가능하게 링크된 프로모터를 포함하고, 상기 앵커 핵산 시퀀스는 관심있는 제2 융합 파트너(fusion partner)를 포함하는 제1 단백질 내에서 제1 융합 파트너로 발현될 수 있다. 그러한 특정 실시예들에 있어서, 발현 카세트는 상기 관심있는 제2 융합 파트너를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 다른 핵산 시퀀스를 포함한다. 관심있는 제2 융합 파트너는 폴리펩티드들의 모든 변형들일 수 있다. 예를 들어, 비록 제2 융합 파트너들이 항체 폴리펩티드들 또는 절편들에 의해서 제한되는 것은 아니지만, 관심있는 제2 융합 파트너는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편일 수 있다. 상기 제2 융합 파트너는 앵커 폴리펩티드에 융합될 수 있기 때문에, 상기 제2 융합 파트너는 또한 상기 세포의 표면상에서 발현될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 본 문단에서 설명된 발현 카세트는 관심있는 제2 융합 파트너를 용이하게 융합하기 위한 제한 부위(restriction site)를 포함한다. 제한 부위들의 모든 변형들은 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 당업자는 적합한 제한 부위들을 알 수 있으며, 이를 포함하는 발현 카세트를 조작할 수 있을 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 관심있는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 상기 폴리펩티드가 발현되는 기관(organism)(예를 들어, 효모 세포) 내에서 코돈 최적화(codon optimization)된다. 코돈 최적화는 관심있는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 조작하여 상기 뉴클레오티드 시퀀스가 특정 기관 내에서 발현하는데 최적화되지만, 상기 폴리펩티드의 아미노산 시퀀스는 동일하게 남아있는 과정을 의미한다. 코돈은 세포에 의해서 주어진 아미노산으로 번역되는(translated) 3개의 뉴클레오티드 시퀀스이다. 20개의 자연적으로 인코딩된 아미노산들이 존재하나, 3개의 뉴클레오티드 시퀀스의 가능한 조합은 64개이므로, 대부분의 아미노산들은 복수의 코돈에 의해서 코드(coded)된다. 주어진 종들에 대해서 특정 코돈들은 종종 동일한 아미노산을 인코딩하는 다른 코돈들보다 더 우수하게 번역되고, 각각의 종들은 그 코돈 선호도가 다르다. 그러므로 한 종에서 얻어진 유전자는 다른 종 내로 도입될 때, 저조하게 발현될 수 있다. 이러한 문제점을 극복하는 한 방법은 상기 유전자 코드(genetic code)의 축퇴(degeneracy)를 이용하고, 관심있는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 변형하여, 상기 뉴클레오티드 시퀀스가 관심있는 종들 내에서 유용하게 이용되는 코돈들을 포함하지만, 상기 뉴클레오티드 시퀀스가 여전히 동일한 폴리펩티드를 인코딩하도록 하는 것이다. 관심있는 기관 내에서 가장 폭 넓게 사용되는 것이 어떤 코돈인지 결정하는 것이 가능하다. 실제로, 이것은 Yarrowia lipolytica를 포함하는 다양한 기관들에 대해서 이미 수행되었다. 2,945,919 코돈들을 기반으로 Y. lipolytica에 대한 샘플 코돈 최적화 차트가 표 1에 나타내어진다. 당업자는 다른 기관들에 대해서 코돈 사용을 알고 결정할 수 있을 것이다.
표 1: Yarrowia lipolytica 코돈 사용표
UUU 15.9( 46804) CU 21.8( 64161) AU 6.8( 20043) GU 6.1( 17849)
UUC 23.0( 67672) CC 20.6( 60695) AC 23.1( 68146) GC 6.1( 17903)
UUA 1.8( 5280) CA 7.8( 22845) AA 0.8( 2494) GA 0.4( 1148)
UUG 10.4( 30576) CG 15.4( 45255) AG 0.8( 2325) GG 12.1( 35555)
CUU 13.2( 38890) CU 17.4( 51329) AU 9.6( 28191) GU 6.0( 17622)
CUC 22.6( 66461) CC 23.3( 68633) AC 14.4( 42490) GC 4.4( 12915)
CUA 5.3( 15548) CA 6.9( 20234) AA 9.8( 28769) GA 21.7( 63881)
CUG 33.5( 98823) CG 6.8( 20042) AG 32.1( 94609) GG 7.7( 22606)
AUU 22.4( 66134) CU 16.2( 47842) AU 8.9( 26184) GU 6.7( 19861)
AUC 24.4( 71810) CC 25.6( 75551) AC 31.3( 92161) GC 9.8( 28855)
AUA 2.2( 6342) CA 10.5( 30844) AA 12.4( 36672) GA 8.4( 24674)
AUG 22.6( 66620) CG 8.5( 25021) AG 46.5(136914) GG 2.4( 7208)
GUU 15.8( 46530) CU 25.5( 75193) AU 21.5( 63259) GU 16.6( 48902)
GUC 21.5( 63401) CC 32.7( 96219) AC 38.3(112759) GC 21.8( 64272)
GUA 4.0( 11840) CA 11.2( 32999) AA 18.8( 55382) GA 20.9( 61597)
GUG 25.7( 75765) CG 8.9( 26190) AG 46.2(136241) GG 4.4( 12883)
참조: 표의 내용은 [트리플렛(triplet)][주파수(frequency: per thousand][번호(number)] 순서로 표시되었다. 데이터는 5,967 코딩 시퀀스 내에 존재하는 2,945,919 코돈들로부터 얻어졌다. 표의 내용들은 코돈 사용 데이터베이스(Codon Usage Database)로부터 얻어졌고, URL www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=284591에서 찾을 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 서열 번호: 1 내지 12의 상기 Yarrowia lipolytica 코돈-최적화된 핵산 시퀀스를 포함하는 발현 카세트들 또는 벡터들은, 아래에서 보이는 바와 같이, 발현을 위해서 Yarrowia lipolytica 내로 변형될 수 있다. 각각의 코돈 최적화된 핵산 시퀀스들은 내의 관련된 코딩 시퀀스들(coding sequences)은 볼드와 밑줄로 표시된다.
서열 번호: 1: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized C-terminal S. cerevisiae SAG1p (320 C-terminal amino acids) (SfiI/NotI flanked)
[gaatgcagcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggtcgacctcgagtggcggcggaggctctggcggaggcggatctggcggcggtggcagtgcacaggtccaactgcaggagctcgatatcaaacgggcggccgcagagcagaagctgatctctgaggaagatctgtccggcggaggcggctccggtggcggcggttctggcggtggcggctctcatatg tct gccaagtcctctttcatctctaccaccaccaccgacctgacctctatcaacacctctgcctactctaccggctctatctctaccgtggagaccggcaaccgaaccacctctgaagtgatctctcacgtggtgaccacttctaccaagctgtctcccaccgccaccacctccctgaccattgcccagacctctatctactccaccgactccaacatcaccgtgggcaccgacatccacaccacctccgaggtcatttccgacgtggagaccatctcccgagagaccgcctctaccgtggtggccgctcctacctctaccaccggctggaccggcgccatgaacacctacatctctcagttcacctcttcttccttcgccaccatcaactctacccccatcatctcttcctctgccgtgttcgagacctctgacgcctctatcgtgaacgtccacaccgagaacattaccaacaccgccgctgttccctctgaggaacccacctttgtgaacgccacccgaaactccctgaactctttctgttcttctaagcagccctcctctccctcttcctacacctcttcccccctggtgtcctctctgtctgtgtctaagaccctgctgtctacctctttcaccccctctgtgcccacctctaacacctacattaagaccaagaacaccggctacttcgagcacaccgccctgaccacctcttctgtgggcctgaactccttctctgagaccgccgtgtcctctcagggcaccaagatcgacacctttctggtctcctccctgatcgcctacccctcttctgcctctggctctcagctgtctggcatccagcagaacttcacctctacctccctgatgatctctacctacgagggcaaggcctctatcttcttctctgccgagctgggctctatcatcttcctgctgctgtcttacctgctgttctaacctagg]
서열 번호: 2: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized C-terminal S. cerevisiae AGA2p (SfiI/NotI flanked)
[gaatgcagcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggtcgacctcgagtggcggcggaggctctggcggaggcggatctggcggcggtggcagtgcacaggtccaactgcaggagctcgatatcaaacgggcggccgcagagcagaagctgatctctgaggaagatctgtccggcggaggcggctccggtggcggcggttctggcggtggcggctctcatatg cag gaactgaccaccatctgcgagcagattccctctcccaccctggagtctaccccctactctctgtctaccaccaccatcctggccaacggcaaggccatgcagggcgtgttcgagtactacaagtctgtgaccttcgtgtctaactgtggctctcacccctctaccacctctaagggctctcccatcaacacccagtacgtgttctaacctagg]
서열 번호: 3: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized C-terminal Yarrowia lipolytica CWPI (SfiI/NotI flanked)
[gaatgcagcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggtcgacctcgagtggcggcggaggctctggcggaggcggatctggcggcggtggcagtgcacaggtccaactgcaggagctcgatatcaaacgggcggccgcagagcagaagctgatctctgaggaagatctgtccggcggaggcggctccggtggcggcggttctggcggtggcggctctcatatg ggc aacggttacgccgtcgacgacaactccaagtgcgaggacgacggaatccccttcggcgcctacgctgttgctgacacctccgcagagtcttctgccgcccccgcctcttctgccgccgctgccgagtcctctgccgccccctcttccgctgctgaggccaagcccaccgctggaggtaacaccggcgccgtcgtcacccagatcggtgacggccagatccaggctcccccctctgctcctcccgctgcccccgagcaggccaacggcgccgtctctgtcggtgtttctgccgccgctctcggtgtcgctgccgccgctctcctcatttaacctagg]
서열 번호: 4: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized N-terminal Yarrowia lipolytica AGA2 (SfiI/NotI flanked)
[gaatgca cag gaactgaccaccatctgcgagcagattccctctcccaccctggagtctaccccctactctctgtctaccaccaccatcctggccaacggcaaggccatgcagggcgtgttcgagtactacaagtctgtgaccttcgtgtctaactgtggctctcacccctctaccacctctaagggctctcccatcaacacccagtacgtgttctcttctggcggcggaggctctggcggaggcggatctggtggcggaggatctgcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggtcgacctcgagtggaggcggcggatctggcggtggcggctccggcggtggaggcagtgcacaggtccaactgcaggagctcgatatcaaacgggcggccgcagagcagaagctgatctctgaggaagatctgcgaaccggccaccaccaccaccaccactaacctagg]
서열 번호: 5: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized Herceptin scFv (SfiI/NotI flanked)
[ggcccagccggcc gag gtgcagctggtcgagtctggcggcggactggtgcagcccggtggctctctgcgactgtcttgtgccgcctctggcttcaacatcaaggacacctacatccactgggtgcgacaggctcccggaaagggcctggagtgggtggcccgaatctaccccaccaacggctacacccgatacgccgactctgtgaagggccgattcaccatctctgccgacacctctaagaacaccgcctacctgcagatgaactctctgcgagccgaggacaccgctgtgtactactgttctcgatggggaggcgacggcttctacgccatggactactggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctctggcggaggcggctccggcggaggcggatctggtggcggaggctctgacatccagatgacccagtctccctcttctctgtctgcctctgtgggcgaccgagtgaccatcacctgtcgagcctctcaggacgtgaacaccgccgtggcctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactctgcctctttcctgtactctggcgtgccctctcgattctctggctctcgatctggcaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagcctgaggatttcgccacctactactgtcagcagcactacaccaccccccccaccttcggccagggaaccaaggtggagatcaaggcggccgc]
서열 번호: 6: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized 4-4-20 scFv (SfiI/NotI flanked)
[ggcccagccggcc gac gtgaagctggacgagactggaggaggcctggtgcagcccggacgacccatgaagctgtcttgtgtggcctctggcttcaccttctctgactactggatgaactgggtgcgacagtctcccgagaagggcctggagtgggtggcccagatccgaaacaagccctacaactacgagacctactactctgactctgtgaagggccgattcaccatgtcccgagatgactctaagtcctctgtgtacctgcagatgaacaacctgcgagtggaggacatgggcatctactactgtaccggctcttactacggcatggactactggggccagggcacctctgtgaccgtgtcctctggcggcggaggctctggcggaggcggatctggtggcggaggatctgacgtggtgatgacccagacccccctgtctctgcccgtgtctctgggcgaccaggcctctatctcttgtcgatcttctcagtctctggtccactctaacggcaacacctacctgcgatggtatctgcagaagcccggccagtctcccaaggtgctgatctacaaggtgtctaaccgattctctggcgtgcccgaccgattctccggctctggctctggcaccgacttcaccctgaagatctcccgagtggaggccgaggacctgggcgtgtacttctgttctcagtctacccacgtgccctggaccttcggcggaggcaccaagctggagatcaaggcggccgc]
서열 번호: 7: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized anti-HEL D1.3 scFv (SfiI/NotI flanked)
[ggcccagccggcc cag gtgcagctgcaggaatctggccccggactggtggccccctctcagtctctgtctatcacctgtaccgtgtctggcttctctctgaccggctacggcgtgaactgggtgcgacagccccctggcaagggcctggagtggctgggcatgatctggggcgacggcaacaccgactacaactctgccctgaagtctcgactgtctatctctaaggacaactctaagtctcaggtgttcctcaagatgaactctctccacaccgacgacaccgcccgatactactgtgcccgagagcgagactaccgactggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgtcctctggcggtggaggctctggcggaggcggatctggtggcggaggatctgacatcgagctgacccagtctcccgcctctctgtctgcctctgtgggcgagaccgtgaccatcacctgtcgagcctctggcaacatccacaactacctggcctggtatcagcagaagcagggcaagtctccccagctgctggtgtactacaccaccaccctggccgacggcgtgccctctcgattctctggctctggatctggcacccagtactccctgaagatcaactccctgcagcccgaggacttcggctcttactactgtcagcacttctggtctaccccccgaaccttcggcggaggcaccaagctggagatcaagcgagcggccgc]
서열 번호: 8: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized anti-HEL M3 scFv (SfiI/NotI flanked)
[ggcccagccggcc cag gtgcagctgcaggaatctggccccggactggtggccccctctcagtctctgtctatcacctgtaccgtgtctggcttctctctgaccggctacggcgtgaactgggtgcgacagctgcctggcaagggcctggagtggctgggcatgatctggggcgacggcaacaccgcctacaactctgccctgaagtctcgactgtctatctctaaggacaactctaagtctcaggtgttcctcaagatggactctctccacaccgacgacaccgcccgatactactgtgcccgagagcgagactaccgactggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgtcctctggcggtggaggctctggcggaggcggatctggtggcggaggatctgacatcaagctgacccagtctcccgcctctctgtctgcctctgtgggcgagaccgtgaccatcacctgtcgagcctctggcaacacccacaactacctggcctggtatcagcagaagcagggcaagtctccccagctgctggtgtactacaccaccaccctggccgacggcgtgccctctcgattctctggctctggatctggcacccagtactccctgaagatcaactccctgcagcccgaggacttcggctcttactactgtcagcacttctggtctaccccccgatctttcggcggaggcaccaagctggagatcaagcgagcggccgc]
서열 번호: 9: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized 4-4-20 Fab heavy chain (SfiI/NotI flanked)
[ggcccagccggcc gac gtgaagctggacgagactggaggaggcctggtgcagcccggacgacccatgaagctgtcttgtgtggcctctggcttcaccttctctgactactggatgaactgggtgcgacagtctcccgagaagggcctggagtgggtggcccagatccgaaacaagccctacaactacgagacctactactctgactctgtgaagggccgattcaccatgtcccgagatgactctaagtcctctgtgtacctgcagatgaacaacctgcgagtggaggacatgggcatctactactgtaccggctcttactacggcatggactactggggccagggcacctctgtgaccgtgtcctctgctagcaccaagggaccttctgtgtttcctctggccccctcttctaagtctacctctggtggaactgctgctctgggatgtctggtgaaggactactttcctgagcctgtgactgtgtcttggaactctggcgctctgacttctggtgttcacaccttccctgctgttctgcagtcctctggactgtactctctctcttctgtggtgaccgtgccttcttcttctctgggaacccagacctacatctgtaacgtgaaccacaagccctctaacactaaggtggacaagcgagtggagcctgcggccgc]
서열 번호: 10: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized 4-4-20 Fab light chain (SfiI/NotI flanked)
[ggcccagccggcc gac gtggtgatgacccagacccccctgtctctgcccgtgtctctgggcgaccaggcctctatctcttgtcgatcttctcagtctctggtccactctaacggcaacacctacctgcgatggtatctgcagaagcccggccagtctcccaaggtgctgatctacaaggtgtctaaccgattctctggcgtgcccgaccgattctccggctctggctctggcaccgacttcaccctgaagatctcccgagtggaggccgaggacctgggcgtgtacttctgttctcagtctacccacgtgccctggaccttcggcggaggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggctgctccttctgtgttcattttccccccctctgacgagcagctgaagtctggaactgcttctgttgtgtgcctgctgaacaacttttacccccgagaggctaaggttcagtggaaggtggacaacgctctgcagtctggaaactctcaggagtctgttactgagcaggactctaaggactcgacctactctctctcttctaccctgaccctgtctaaggctgactacgagaagcataaggtgtacgcttgtgaggttacccatcagggactgtcctctcccgtgaccaagtcttttaaccgaggcgagtgcgcggccgc]
서열 번호: 11: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized Herceptin Fab heavy chain (SfiI/NotI flanked)
[ggcccagccggcc gag gtgcagctggtcgagtctggcggcggactggtgcagcccggtggctctctgcgactgtcttgtgccgcctctggcttcaacatcaaggacacctacatccactgggtgcgacaggctcccggaaagggcctggagtgggtggcccgaatctaccccaccaacggctacacccgatacgccgactctgtgaagggccgattcaccatctctgccgacacctctaagaacaccgcctacctgcagatgaactctctgcgagccgaggacaccgctgtgtactactgttctcgatggggaggcgacggcttctacgccatggactactggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctctgctagcaccaagggaccttctgtgtttcctctggccccctcttctaagtctacctctggtggaactgctgctctgggatgtctggtgaaggactactttcctgagcctgtgactgtgtcttggaactctggcgctctgacttctggtgttcacaccttccctgctgttctgcagtcctctggactgtactctctctcttctgtggtgaccgtgccttcttcttctctgggaacccagacctacatctgtaacgtgaaccacaagccctctaacactaaggtggacaagcgagtggagcctgcggccgc]
서열 번호: 12: Synthetic Yarrowia lipolytica codon optimized Herceptin Fab light chain (SfiI/NotI flanked)
[ggcccagccggcc gac atccagatgacccagtctccctcttctctgtctgcctctgtgggcgaccgagtgaccatcacctgtcgagcctctcaggacgtgaacaccgccgtggcctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactctgcctctttcctgtactctggcgtgccctctcgattctctggctctcgatctggcaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagcctgaggatttcgccacctactactgtcagcagcactacaccaccccccccaccttcggccagggaaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgctccttctgtgttcattttccccccctctgacgagcagctgaagtctggaactgcttctgttgtgtgcctgctgaacaacttttacccccgagaggctaaggttcagtggaaggtggacaacgctctgcagtctggaaactctcaggagtctgttactgagcaggactctaaggactcgacctactctctctcttctaccctgaccctgtctaaggctgactacgagaagcataaggtgtacgcttgtgaggttacccatcagggactgtcctctcccgtgaccaagtcttttaaccgaggcgagtgc]
효모(Yeast)
효모들의 모든 변형들은 여기에서 설명된 방법 및 조성들(compositions)에 의해서 적용될 수 있다. 효모는 균류 진핵세포(fungal eukaryotic) 미세-기관들이다. 효모는 일차적으로 단일세포(unicellular) 형태로 존재하지만, 예를 들어 Yarrowia 종들과 같은 일부 종들은 2형 진균이고, 즉 이들은 단일세포 형태 또는 분절 형태(hyphal form)로 존재할 수 있다. 게다가, 일부 종들은 "pseudohyphae"로 알려진 연결된 버딩 세포(budding cell)의 스트링(string)의 형성에 의해서 다세포(multicellular)로 존재할 수 있다.
많은 효모들이 당업자들에 알려져 있다. 얘기에서 설명된 조성들(composition) 및 방법들에 의해서 사용될 수 있는 예시적인 효모들은(다만, 이에 의해서 제한되지 않음) Aciculoconidium aculeatum, Candida albicans, Candida albicans var. stellatoidea, Candida bentonensi, Candida catenulata, Candida curvata, Candida famata, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida hispaniensis, Candid humicola, Candida intermedia, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lipolytica, Candida loxderi, Candida macedoniensis, Candida magnoliae, Candida maltosa, Candida melinii, Candida nitratophila, Candida parapsilosis, Candida pelliculosa, Candida pintolopesii, Candida pinus, Candida pulcherrima, Candida robusta, Candida rugosa, Candida tropicalis, Candida utilis, Candida zeylanoides, Clavispora lusitaniae, Cryptococcus albidus, Cryptococcus albidus var. diffluens, Cryptococcus kuetzingii, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus luteolus, Cryptococcus neoformans var. gattii, Cryptococcus neoformans var. neoformans, Cryptococcus terreus, Cryptococcus uniguttulatus, Debaryomyces hansenii var. hansenii, Debaryomyces polymorphus, Endomycopsis burtonii, Endomycopsis fibuligera, Filobasidium capsuligenum, Geotrichum candidum, Hansenula anomala, Hansenula capsulata, Hansenula glucozyma, Hansenula jadinii, Hansenula petersonii, Hansenula polymorpha, Hansenula wickerhamii, Kloeckera boidinii, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Malassezia furfur, Malassezia pachydermatis, Pichia fermentans, Pichia membranaefaciens, Pichia pastoris, Pichia pinus, Pichia subpelliculosa, Rhodotorula acheniorum, Rhodotorula araucariae, Rhodotorula graminis, Rhodotorula glutinus, Rhodotorula minuta, Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces pombe, Sporobolomyces holsticus, Sporobolomyces roseus, Sporobolomyces salmonicolor, Torulaspora delbrueckii, Trichosporon capitatum, Trichosporon cutaneum, Trichosporon fennicum, Trichosporon fermentans, Trichosporon pullulans, Yarrowia lipolytica, 및 Zygosaccharomyces을 포함한다.
특정 실시예들에 있어서, 여기에서 개시된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 디스플레이하는 방법들 및 조성들에 따라서 적용되는 효모 종은 Yarrowia genus의 효모이다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편, 예를 들어, 여기에서 설명된 모든 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 Yarrowia lipolytica 효모 세포의 표면상에 디스플레이될 수 있다.
Yarrowia lipolytica는 hemiascomycetous 효모의 상업적으로 유용한 종이고, 호기적(aerobic) 조건에서 탄화수소를 동화하고, n-알칸들, 식물성 오일들 또는 글루코즈(glucose)로부터 시트르산(citric acid)을 생산하는 것으로 알려졌다. 예를 들어, Yarrowia lipolytica는 팜 오일 폐수, 티엔티(TNT), 알칸들, 지방산들, 지방들 및 오일들과 같은 다른 탄화소로를 분해하는 것으로 알려졌다. Yarrowia lipolytica는 멀게 대부분의 다른 효모 종들과 연관되고, 곰팡이(filamentous fungi)와 많은 공통적 특징을 공유한다. Yarrowia lipolytica는 하프로-이배체 사이클(haplo-diplontic cycle)을 가지므로, 반수체(haploid)와 이배체(diploid) 페이스 사이를 변환한다.
특정 실시예들에 있어서, 효모 세포는 관심있는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터와 함께 변환(transform)된다. 효모 변화 발병의 모든 변형들이 여기에서 기재된 방법들 및 조성들에 따라 이용될 수 있다. 변환 방법의 비한정적인 예들은 열충격(heat shock), 전기천공법 및 리튬 아세테이트- 조정 변환(lithium acetate-mediated transformation)을 포함한다. 당업자는 상기 효모를 변화하는데 적합한 효모 변환 방법들을 알 수 잇을 것이다.
성장 조건들(Growth Conditions)
특정 실시예들에 있어서, 효모 세포(예를 들어, 여기에서 설명된 모든 효모 세포들)는 배양 조직 내에서 형성되고 전파(propagated)된다. 예를 들어, 본 섹션에서 "발현 카세트들 또는 벡터들"로 불리는 하나 또는 그 이상의 발현 카세트들 또는 벡터들은 배양 조직 내에 성장되고 전파될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 예를 들어, Yarrowia lipolytica와 같은 Yarrowia 속(genus)의 효모는 배양 조직 내에서 성장되고 전파된다.
특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 Yarrowia 세포 동작 조건(Yarrowia cell operating condition) 하에서 배양된다. "Yarrowia 세포 동작 조건"이란 용어는 Yarrowia 세포가 상기 Yarrowia 세포 동작 조건에서 성장하지 않았을 때와 비교하여, 상기 Yarrowia 세포가 그 표면상에서 폴리펩티드(얘를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)의 향상된 디스플레이(display)를 나타내는 성장 또는 배양 조건을 의미한다. 예를 들어, Yarrowia 세포 동작 조건 하에서 성장된 Yarrowia 세포는: 그 표면상에서 증가된 수준의 폴리펩티드, 상기 발현된 폴리펩티드의 형태 또는 기능, 향상된 안정성, 또는 증가된 시간 동안 상기 폴리펩티드의 발현의 유지를 보여준다.
특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포 동작 조건은 낮은 유도 온도(induction temperature)를 포함한다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 발현하는 벡터 또는 발현 카세트를 포함하는 Yarrowia 세포는 낮은 유도 온도에서 상기 세포 배양 조직의 일부 또는 전부에 대해서 성장될 수 있다. 아래 실험예 3에서 설명된 것과 같이, 폴딩 스트레스(folding stress)는 일반적으로 낮은 배양 온도에서 감소된다. 이에 따라, 폴딩 스트레스 및 다른 해로운 과정들은 Yarrowia 세포를 낮은 유도 온도에서 성장시킴으로써 감소되거나 제거될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 약 15ㅀC 내지 약 25ㅀC 사이의 온도, 예를 들면, 약 15ㅀC 내지 약 24ㅀC 사이, 약 15ㅀC 내지 약 23ㅀC 사이, 약 15ㅀC 내지 약 22ㅀC 사이, 약 15ㅀC 내지 약 21ㅀC 사이, 약 15ㅀC 내지 약 20ㅀC 사이, 약 16ㅀC 내지 약 25ㅀC 사이, 약 17ㅀC 내지 약 25ㅀC 사이, 약 18ㅀC 내지 약 25ㅀC 사이, 약 19ㅀC 내지 약 25ㅀC 사이, 약 20ㅀC 내지 약 25ㅀC 사이 및 모든 온도 범위의 유도 온도에서 성장된다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 약 15ㅀC, 약 16ㅀC, 약 17ㅀC, 약 18ㅀC, 약 19ㅀC, 약 20ㅀC, 약 21ㅀC, 약 22ㅀC, 약 23ㅀC, 약 24ㅀC, 또는 약 25ㅀC의 유도 온도에서 성장된다. "약"이란 용어는 여기에서 주어진 온도값의 주변 범위의 온도를 의미한다. 일반적으로, 주어진 온도값을 기준으로 사용될 때, "약"이란 용어는 상기 온도값의 ㅁ 10% 내의 범위, 예를 들어, 상기 값의 ㅁ 9% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 8% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 7% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 6% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 5% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 4% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 3% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 2% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 1% 내의 범위, 또는 그 이하의 범위를 의미한다. 주어진 온도값을 기준으로 사용될 때, "약"이란 용어는 정확한 값, 예를 들어, 실험적 오차 내에서 정해지는 값을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 상기 세포 배양의 일부 동안(예를 들어, 초기 일부) 보다 높은 온도 또는 온도 범위에서 성장되지만, 상기 세포 배양의 다른 일부(예를 들어, 마지막 일부) 동안 보다 낮은 유도 온도 또는 온도 범위에서 성장된다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 관심있는 폴리펩티드가 발현될 때, 상기 세포 배양의 특정 부분 동안 보다 낮은 유도 온도 또는 온도 범위에서 성장된다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 유도 가능한 프로모터(inducible promoter)에 작동 가능하게 링크될 수 있으며, 상기 Yarrowia 세포는 상기 프로모터가 유도되어서 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편이 발현될 때, 상기 세포 배양의 특정 부분 동안 보다 낮은 유도 온도 또는 온도 범위에서 성장될 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포 동작 조건은 짧은 유도 시간을 포함한다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 발현하는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 Yarrowia 세포는 세포 배양 조직 내에서 짧은 유도 시간 동안 성장될 수 있다. 아래 실험예 4에서 설명된 바와 같이, 보다 짧은 유도 시간은 항체 폴리펩티드 절편들의 증가된 발현 레벨을 야기한다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간 또는 이들 값들 사이의 모든 유도 시간 동안 성장된다. 유도 시간값을 기준으로 "약"이라는 용어는 주어지 값 주변의 범위를 의미한다. 일반적으로, 주어진 유도 시간값을 기준으로 사용될 때, "약"이란 용어는 상기 시간값의 ㅁ 10% 내의 범위, 예를 들어, 상기 값의 ㅁ 9% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 8% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 7% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 6% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 5% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 4% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 3% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 2% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 1% 내의 범위, 또는 그 이하의 범위를 의미한다. 주어진 유도 시간값을 기준으로 사용될 때, "약"이란 용어는 정확한 값, 예를 들어, 실험적 오차 내에서 정해지는 값을 포함한다.
특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포 동작 조건은 낮은 pH값을 포함한다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 발현하는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 Yarrowia 세포는 상기 세포 배양 조직의 일부 또는 전부에 대해서 낮은 pH값에서 성장될 수 있다. 아래 실험예 5에서 설명된 바와 같이, Yarrowia 세포의 pH값은 이형태성 변천(dimorphic transition)을 조절하는 하나의 인자는 상기 성장 매질의 pH값이다. 균사체 형성은 pH값이 중성일 때 최대이고, pH값이 감소될수록 감소하여, pH값이 3일 때 거의 영(0)에 가까워진다. 이에 따라, Yarrowia 세포를 낮은 pH값 배양 조직에서 성장시킴으로서 균사체 형성이 감소되거나 제거될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 약 2 내지 약 4 사이의 pH값 범위, 예를 들어, 약 2.1 내지 약 4 사이, 약 2.2 내지 약 4 사이, 약 2.3 내지 약 4 사이, 약 2.4 내지 약 4 사이, 약 2.5 내지 약 4 사이, 약 2.6 내지 약 4 사이, 약 2.7 내지 약 4 사이, 약 2.8 내지 약 4 사이, 약 2.9 내지 약 4 사이, 약 3 내지 약 4 사이, 약 2 내지 약 3.9 사이, 약 2 내지 약 3.8 사이, 약 2 내지 약 3.7 사이, 약 2 내지 약 3.6 사이, 약 2 내지 약 3.5 사이, 약 2 내지 3.4 사이, 약 2 내지 약 3.3 사이, 약 2 내지 약 3.2 사이, 약 2 내지 약 3.1 사이, 약 2 내지 약 3 사이, 약 2.5 내지 약 3.5 사이, 약 2.5 내지 약 3 사이, 약 3 내지 약 3.5 사이 또는 이들 사이의 모든 pH값 범위에서 성장될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 약 2, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 또는 약 4의 pH값에서 성장된다. "약"이란 용어는 여기에서 주어진 pH값의 주변 범위의 pH값을 의미한다. 일반적으로, 주어진 pH값을 기준으로 사용될 때, "약"이란 용어는 상기 pH값의 ㅁ 10% 내의 범위, 예를 들어, 상기 값의 ㅁ 9% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 8% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 7% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 6% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 5% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 4% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 3% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 2% 내의 범위, 상기 값의 ㅁ 1% 내의 범위, 또는 그 이하의 범위를 의미한다. 주어진 pH값을 기준으로 사용될 때, "약"이란 용어는 정확한 값, 예를 들어, 실험적 오차 내에서 정해지는 값을 포함한다. Yarrowia 세포는 상기 세포 배양의 일부 동안(예를 들어, 초기 일부) 보다 높은 pH값 또는 pH값 범위에서 성장되지만, 상기 세포 배양의 다른 일부(예를 들어, 마지막 일부) 동안 보다 낮은 pH값 또는 pH값 범위에서 성장된다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 관심있는 폴리펩티드가 발현될 때, 상기 세포 배양의 특정 부분 동안 보다 낮은 pH값 또는 pH값 범위에서 성장된다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 유도 가능한 프로모터에 작동가능하게 링크될 수 있으며, 상기 Yarrowia 세포는 상기 프로모터가 유도되어서 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편이 발현될 때, 상기 세포 배양의 특정 부분 동안 보다 낮은 ph값 또는 pH값 범위에서 성장될 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포 동작 조건은 높은 에어레이션(aeration)을 포함한다. 예를 들어 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 발현하는 벡터 또는 발현 카세트를 포함하는 Yarrowia 세포는 높은 에어레이션에서 상기 세포 배양 조직의 일부 또는 전부에 대해서 성장될 수 있다. 아래 실험예 3에서 설명된 것과 같이, 세포 배양 조직의 에어레이션을 증가시키는 것은 발현된 항체 폴리펩티드 절편의 세포 표면 디스플레이(display)를 향상시킨다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 에어레이션을 향상시키기 위해서 셰이크 플라스크(shake flask) 내에서 성장된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 배양 조직의 산소 포화 퍼센트가 측정되었고, 상기 배양 조직이 충분히 높은 에어레이션 조건들 하에서 성장되었다는 것을 보장하기 위해서, 상기 주어진 범위를 유지하였다. 예를 들어, 발효기 조건 하에서, 높은 에어레이션 조건은 약 30% 내지 약 50% 산소 포화, 예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 보다 높은 산도 포화에서 달성될 수 있다. 세포 배양 조직 에어레이션을 향상시키는데 유용한 다른 실험 용기들은 당업자에게 널리 알려져 있다.
특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포 동작 조건은 상기 배양 조직을 최소의 매질 내에서 성장시키는 것을 포함한다. 아래 실험예 3에서 설명된 바와 같이, 세포 배양 조직을 최소한의 매질에서 배양시키는 것은 발현된 항체 폴리펩티드 절편의 세포 표면 디스플레이를 향상시킨다. "최소의 매질"이란 용어는 세포 배양 조직(예를 들어, Yarrowia 세포 배양 조직)의 성장을 지원하는 데 필요한 최소의 구성요소들을 포함하는 매질을 의미한다. 최소의 매질은 전형적으로 성장을 위한 탄소 공급원(예를 들어, 글루코오스), 염 형태의 다양한 미량 원소(trace element)(예를 들어, 마그네슘, 질소, 인 및/또는 황), 질소 공급원 및 물을 포함한다. 최소의 매질은 효모 추출물, bactopeptone 또는 이들 모두를 포함하지 않는다. 주어진 조작은 하나의 최소의 매질에서 성장할 수 있으나, 다른 최소의 매질에서는 성장하지 못할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포 동작 조건은 상기 배양 조직은 최소의 보충된 매질 내에서 성장시키는 단계를 포함한다. "최소의 보충된 매질"이란 용어는 여기에서 아미노산들이 모충된 최소의 매질을 의미한다. 최소의 보충된 매질은 하나 또는 소수의 아미노산들로 보충되거나 대부분의 기관(organism)들에서 사용되는 모든 20개의 아미노산의 완벽한 세트로 보충될 수 있다. 당업자는 다양한 최소의 매질을 알 수 있으며, 여기에서 설명된 방법 및 조성에 따라 주어진 기관(organism)의 성장을 지원하는데 이용될 수 있는 최소의 매질을 선택할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 두개 또는 그 이상의 Yarrowia 세포 동작 조건에서 동시에 성장된다. 예를 들어, Yarrowia 세포는 낮은 유도 온도, 짧은 유도 시간, 낮은 pH값, 높은 에어레이션, 최소의 매질 내에서 성장 또는 이들의 조합을 포함하는 그룹에서 선택된 2개 또는 그 이상의 Yarrowia 세포 동작 조건 하에서 성장된다.
폴리펩티드의 표면 디스플레이(surface display)를 위한 벡터와 함께 변경된 Saccharomyces cerevisiae 세포들의 60% 내지 80%가 실질적으로 이들의 포면 상에 폴리펩티드를 발현한다는 것일 일반적으로 보고 되었다. 대조적으로, 여기에서 설명된 방법들 및 조성들을 사용함으로써, 하나 또는 그 이상의 Yarrowia 세포 작동 조건들 하에서 성장된 Yarrowia 세포의 보다 더 높은 퍼센트는 이들의 표면들 상에 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 보여준다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 Yarrowia 세포 작동 조건들 하에서 성장된 Yarrowia 세포의 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%는 이들의 표면상에 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 보여준다. "약" 이란 용어는 표면상에 항체 폴리펩티드 또는 절편을 보여주는 Yarrowia 세포의 개수를 기준으로, 상기 값의 약 5%의 범위 내의 값 및 또한 정확한 값을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 Yarrowia 세포 작동 조건들 하에서 성장된 Yarrowia 세포의 약 99% 이상(예를 들어, 100%)은 이들의 표면상에 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 보여준다.
특정 조건들에 있어서, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 발현하기 위한 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 Yarrowia 세포는 추가적으로 셰프론(chaperon) 폴리펩티드를 포함한다. 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 셰프론 폴리펩티드는 비공유 폴딩 및/또는 다른 폴리펩티드들의 결합을 보조한다. 실험예 7에서 설명된 바와 같이, S. cerevisiae 및 P. pastoris에서 단백질 이황화물 이성질화효소(protein disulfide isomerase; PDI) 및 면역글로블린-결합 단백질(immunoglobulin binding protein; Kar2/Bi)과 같은 분자 셰프론들의 과발현은 scFv 및 Fab 절편들의 발현을 향상시킨다. 효모 내에서, BiP/GRP78은 상기 KAR2 유전자에 의해서 인코딩된다. 이에 따라, 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 셰프론 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 핵산과 함께 변환된다. 여기에서 설명된 방법들 및 조성들에 따라서 유리하게 사용될 수 있는 셰프론 폴리펩티드들의 비한정적인 예들은 PDI, Kar2/Bip, 및 HACI를 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 프로모터의 제어 하에서 셰프론 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 핵산과 함께 변환된다. 예를 들면, 셰프론은 구조적, 반구조적(semi-constitutive) 또는 유도 가능한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 셰프론 폴리펩티드는 관심있는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편)와 같이 세포 배양 조직의 동일한 부분 동안 발현된다. 당업자는 다른 셰프론 폴리펩티드들을 알 수 있으며, 여기에서 설명된 방법들 및 조성들을 이용할 때, 이들을 사용하고, 이들의 효율성을 평가할 수 있을 것이다.
활용들(Applications)
여기에서 설명된 조성들 및 방법들은 다양한 활용 분야에서 이용될 수 있다. 하나의 비한정적인 예시는, 여기에서 설명된 조성들 및 방법들은 주어진 항원과 결합하는 능력에 대해서, 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들의 라이브러리를 스크린 하는데 이용될 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 효모 세포(예를 들어, Yarrowia lipolytica 와 같은 Yarrowia 세포)는 그 표면상에 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 디스플레이하고, 상기 세포는 주어진 항원과 결합하는 능력에 대해서 시험된다. 특정 실시예들에 있어서, 효모 세포들은 2개의 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 발현하고, 이들 항체 폴리펩티드들 또는 이의 절편들은 서로 연관되어서, 이들은 항원과 결합할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 Fab 절편 및 경쇄 Fab 절편은 효모의 상기 세포 표면상에 디스플레이될 수 있으며, 상기 Fab 절편들은 서로 연관되어서, 기능적 항원-결합 부분(moiety)을 형성한다. 특정 실시예들에 있어서, scFv 항체 폴리펩티드 절편은 효모의 상기 세포 표면상에 디스플레이되고, 상기 scFv 절편은 주어진 항원을 결합할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 효모 세포(예를 들어, Yarrowia lipolytica와 같은 Yarrowia 세포)는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 핵산 시퀀스를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터와 함께 변환된다. 특정 실시예들에 있어서, 효모 세포(예를 들어, Yarrowia lipolytica와 같은 Yarrowia 세포)는 2개 또는 그 이상의 벡터들 및/또는 발현 카세트들과 함께 변환되고, 이들 각각은 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 핵산 시퀀스를 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 효모 세포(예를 들어, Yarrowia lipolytica와 같은 Yarrowia 세포)는 2개 또는 그 이상의 핵산 시퀀스들을 포함하는 벡터들 및 발현 카세트들과 함께 변환되고, 이들 각각은 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 핵산 시퀀스를 포함한다.
특정 실시예들에 있어서, 복수의 효모 세포들(예를 들어, Yarrowia lipolytica와 같은 Yarrowia 세포)은 벡터들 또는 발현 카세트들의 라이브러리와 함께 변화되고, 상기 라이브러리는 복수의 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스들을 포함하는 복수의 핵산 시퀀스들을 포함하여서, 항체 폴리펩티드 효모 라이브러리를 형성한다. 여기에서 사용된 것과 같이, "항체 폴리펩티드 효모 라이브러리"는 그 표면상에 복수의 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 디스플레이하는 복수의 효모 세포들을 의미한다. 그러한 항체 폴리펩티드 효모 라이브러리는 상기 라이브러리 내에서 하나 또는 그 이상의 특정 항원들과 결합하는 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 스크린 하는데 이용될 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 복수의 효모 세포들(예를 들어, Yarrowia lipolytica와 같은 Yarrowia 세포)은 벡터들 도는 발현 카세트들의 라이브러리와 함께 변환되고, 이들 라이브러리는 복수의 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스들을 포함하는 복수의 핵산을 포함한다. 예를 들어, 벡터들 또는 발현 카세트들의 라이브러리는 복수의 scFv 항체 폴리펩티드 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스들을 포함하는 복수의 핵산 시퀀스들을 포함할 수 있다. 그러한 복수의 변환된 효모 세포들은 하나 또는 그 이상의 특정 항원들과 결합하는 scFv 항체 폴리펩티드 절편들을 스크린 하는데 이용될 수 있다.
실시예들에 있어서, 다수개의 제1 반수 효모 세포들(haploid yeast cells)(예를 들면, Yarrowia lipolytica와 같은 Yarrowia 세포)은 벡터들 또는 표현 카세트들의 라이브러리와 함께 변형되고, 라이브러리는 다수개의 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 다수개의 핵산의 염기서열들을 포함하고, 다수개의 제2 반수 효모 세포들(예를 들면, Yarrowia lipolytica와 같은 Yarrowia 세포)은 벡터들 또는 표현 카세트들의 라이브러리와 함께 변형되고, 라이브러리는 다수개의 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 다수개의 핵산의 염기서열들을 포함한다. 실시예들에 있어서, 상기 다수개의 제1 및 제2 반수 효모 세포들은 무겁고 가벼운 체인 항체 폴리펩티드들 또는 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 라이브러리와 함께 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 다수개의 제1 및 제2 반수 효모 세포들은 동일한 라이브러리와 함께 변형될 수 있다. 예를 들면, 제1 및 제2 반수 효모 세포들은 무겁고 가벼운 체인 항체 폴리펩티드들 또는 절편들 모두를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들과 함께 변형될 수 있다. 실시예들에 있어서, 상기 다수개의 제1 및 제2 반수 효모 세포들은 다른 라이브러리와 함께 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 다수개의 제1 반수 효모 세포들은 무거운 체인 항체 폴리펩티드들 또는 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 라이브러리와 함께 변형되는 한편, 상기 다수개의 제2 반수 효모 세포들은 가벼운 체인 항체 폴리펩티드들 또는 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 라이브러리와 함께 변형될 수 있다.
실시예들에 있어서, 라이브러리와 함께 변형된 다수개의 제1 및 제2 반수 효모 세포들은 서로 짝을 이루어 각각의 라이브러리로부터 벡터들 또는 표현 카세트들을 포함하는 다수개의 반수 효모를 형성한다. 예를 들면, 무거운 체인 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 라이브러리와 함께 변형된 상기 다수개의 제1 반수 효모 세포들은 가벼운 체인 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 라이브러리와 함께 변형된 다수개의 제2 반수 효모 세포들과 짝을 이루어 무겁고 가벼운 체인 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편들 모두를 포함하는 다수개의 반수 효모 세포들을 형성한다. 이러한 다수개의 반수 효모 세포들은 하나 또는 그 이상의 특정 항원들을 결합시키는 항체 폴리펩티드들 또는 절편들을 스크린하는 데 사용될 수 있다. 이러한 실시예들은 무겁고 가벼운 체인 항체 폴리펩티드들 또는 항체 폴리펩티드 절편들의 매우 다양한 다른 조합들을 스크리닝할 수 있는 장점이 있다.
실시예들에 있어서, 특정 항원에 대한 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편의 결합 특이성은 개선되거나 최적화된다. 인위적 진화(directed evolution) 또는 친화성 성숙(affinity maturation)이 사용되어 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편의 결합 특이성을 개선시키거나 최적화시킬 수 있다. 예를 들면, Fujii(Antibody Engineering, Vol. 248, pp. 345-359, 2004, 여기서 전체적으로 참조문헌으로서 병합됨)는 항체들에 대한 친화성 성숙의 과정을 기술하고 있다. 유사하게, Border et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Sep 26;97(20):10701-5, 2000, 여기서 참조문헌으로서 병합됨)는 scFv 절편들의 인위적 진화를 기술하고 있다. 이러한 기술들은 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편의 결합 특이성을 개선하거나 최적화하는 데 사용될 수 있다.
실시예들에 있어서, 특정한 항체를 결합시키거나 결합시킨다고 의심되는 항체 폴리펩티드 또는 절편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 염기서열(nucleic acid sequence)이 분리될 수 있다. 이러한 핵산의 염기서열은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기들(nucleotide residues)을 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 실시예들에 있어서, 상기 핵산의 염기서열은 벡터 또는 표현 카세트의 일부이다. 상기 변경된 핵산 또는 핵산들에 대하여 항원(예를 들면, 원래의 항원 또는 이와 다른 항원)을 결합시키는 능력이 테스트될 수 있다. 예를 들면, 변경된 핵산들은 효모 세포(yeast cell) 내부로 도입(예를 들면, 변형(transformation))될 수 있고, 효모 세포는 성장 조건들(예를 들면, Yarrowia 동작 조건들) 하에서 배양되어 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편이 세포 표면 상에 발현될 수 있다. 상기 효모는 관심이 있는 항원에 접촉되어 결합이 테스트될 수 있다.
핵산의 염기서열을 변경시키기 위한 다양한 기술들이 알려져 있으며, 일부는 현재 개시된 방법들 및 화합물들에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면, 방사선(radiation), 화학적 돌연변이 유발원들(chemical mutagens), error-prone PCR 또는 포화 돌연변이법(saturation mutagenesis)이 사용될 수 있다. 다른 기술들은 Sambrook, J., Fritsch, E. F., 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Muanual. 2.sup.nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989에서 발견될 수 있으며, 이러한 문헌들의 내용들은 여기서 전체적으로 참조문헌으로서 병합된다. 당업자는 핵산의 염기서열들을 변경하기 위한 적당한 기술들을 알고 있을 것이다.
주어진 항체에 대해서 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 보여주는 세포의 결합 테스트를 위한 다양한 기술들은 알려져 있고, 일부는 여기서 개시된 방법들 및 화합물들에 따라 사용될 수 있다. 비제한적인 예시로서, ELISA 어세이가 사용될 수 있다.
실시예들에 있어서, Yarrowia 세포는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 부모 벡터 또는 부모 표현 카세트를 포함하고, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 상기 세포 표면 상에 디스플레이되고 특정 항원(예를 들면, 타겟 폴리펩티드)과 결합한다. 실시예들에 있어서, 상기 부모 벡터 또는 부포 표현 카세트는 상술한 바와 같이 분리되고 변경이 가해져 하나 또는 그 이상의 변경된 벡터들 또는 표현 구조물들을 발생시킨다. 실시예들에 있어서, 이러한 변경은 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편을 인코딩하는 핵산의 염기서열에서 일어난다. 상기 하나 또는 그 이상의 변경된 벡터들 또는 표현 구조물들은 상기 부모 벡터 또는 부모 표현 카세트가 없는 하나 또는 그 이상의 제2 Yarrowia 세포들로 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 하나 또는 그 이상의 변경된 벡터들 또는 표현 구조물들은 Yarrowia 세포 작동 조건들 하에서 성장되는 다수개의 Yarrowia 세포들로 변형되어 Yarrowia 항체 폴리펩티드 효모 라이브러리를 형성할 수 있으며, 이러한 효모 라이브러리의 멤버들(members)은 다수개의 변경된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편들을 보여준다. 상기 Yarrowia 항체 폴리펩티드 효모 라이브러리의 멤버들에 대하여 특정 항원, 예를 들면, 상기 부모 벡터 또는 부모 표현 카세트에 의해 인코딩되는 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편에 의해 결합되는 항원과의 결합 능력을 테스트할 수 있다. 상기 항원에 대한 개선된 결합을 나타내는(예를 들면, 더욱 큰 특이성 또는 친화력을 나타내는) 상기 Yarrowia 항체 폴리펩티드 효모 라이브러리의 이러한 멤버들로부터 변경된 벡터들 또는 표현 카세트들은 분리될 수 있다. 실시예들에 있어서, 이러한 순서의 단계들은 한번 또는 그 이상 반복된다. 실시예들에 있어서, 이러한 순서의 단계들은 원하는 결합 레벨을 나타내는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편이 획득될 때까지 반복된다.
부모 벡터 또는 부모 표현 카세트에서 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 변경됨으로써 상기 변경된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 상기 부모 벡터 또는 부모 표현 카세트에 의해 인코딩된 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편에 의해 결합된 동일한 항원에 대하여 개선된 또는 최적화된 결합을 나타낸다. 실시예들에 있어서, 부모 벡터 또는 부모 표현 카세트에서 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 변경됨으로써 상기 변경된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편은 상기 부모 벡터 또는 부모 표현 카세트에 의해 인코딩된 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편에 의해 결합된 다른 항체에 대하여 개선된 또는 최적화된 결합을 나타낸다. 예를 들면, 제1 항원을 결합시키는 것으로 알려진 항체 폴리펩티드 또는 절편은 변경됨으로써 자신의 항원 특이성도 변경될 수 있다.
당업자는 다른 적용들을 알 수 있을 것이고, 이러한 적용들에서의 사용을 위해 여기서 개시된 화합물들 및 방법들을 채용할 수 있을 것이다.
키트들(Kits)
실시예들에 있어서, 여기서 개시된 하나 또는 그 이상의 화합물들을 포함하는 키트들이 제공된다. 실시예들에 있어서, 여기서 개시된 하나 또는 그 이상의 방법들을 수행하기 위한 키트들이 제공된다. 실시예들에 있어서, 키트는 관심의 대상이 되는 폴리펩티드, 예를 들면, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편, 앵커 폴리펩티드(anchor polypetide), 또는 둘 다를 효모 세포(yeast cell)의 표면 상에 나타내기 위한 성분들을 포함한다. 예를 들면, 키트는 효모를 변형(transforming) 또는 배양(culturing)하기 위한 하나 또는 그 이상의 표현 카세트들, 벡터들, 효모들, 및/또는 성분들을 포함한다. 실시예들에 있어서, 효모를 변형 또는 배양하기 위한 표현 카세트, 벡터, 효모, 및/또는 성분은 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 것이다.
실시예들에 있어서, 키트는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편, 앵커 폴리펩티드, 또는 둘 다를 인코딩하는 뉴틀레오티드 서열을 포함하는 핵산의 염기서열을 포함하는 표현 카세트 또는 벡터를 포함한다. 실시예들에 있어서, 키트는, 예를 들면, Yarrowia lipolytica 세포인, Yarrowia 세포와 같은 효모를 포함한다. 실시예들에 있어서, 키트의 Yarrowia 세포는 변형을 위한 성분이다. 실시예들에 있어서, 키트의 Yarrowia 세토는 변형을 위한 상기 Yarrowia 세포 성분을 만드는 데 사용될 수 있는 하나 또는 그 이상의 성분들과 함께 패키지된다.
실시예들에 있어서, 키트는 상기 키트의 표현 카세트, 벡터 또는 다른 성분을 사용하기 위한 서면 지시사항들, 예를 들면, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드(예를 들면, 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 절편, 앵커 폴리펩티드, 또는 둘 다)를 효모 세포의 표면 상에 나타내도록 상기 키트의 상기 표현 카세트, 벡터 또는 다른 성분을 사용하기 위한 서면 지시사항들을 포함한다.
실험예들
실험예 1. 물질들 및 방법들
사용된 변형들 : E. coli MC1061은 표준 DNA 증폭 및 복제(cloning)으로 사용되었다. 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) PO1d (MatA, leu2-270, xpr2-322), PO1d (MatA, ura3-302, leu2-270, xpr2-322) 및 PO1d (MatA, ura3-302, leu2-270, Ade2-844, xpr2-322)이 벡터 변환(vector transformation)을 위한 수혜자로서 사용되었다.
ScFv 표현 플라즈미드들(plasmids) : 4개의 합성 구조들은 분자 앵커 서열(molecular anchor sequence)의 scFV 분절 상류의 SfiI/NotI 복제를 가능하게 하기 위해 만들어 졌다. SfiI 제한 사이트의 N-말단에, a BsmI 제한 사이트는 상기 최종 표현 플라즈미드들에 있는 LIP2pre 또는 LIP2프레프로(LIP2prepro)의 C-종점에서 융합을 위해 추가되었다. Not 제한 사이트의 하류, Ic-Myc 태크(Ic-Myc tag)는 앵커리지 도메인들(anchorage domains)을 교환하기 위해 (Gly4Ser)3 링커((Gly4Ser)3 linker) 및 NdeI & AvrII 제한 사이트들에 뒤이어 추가되었다. 앵커리지를 위해, 서열들이 최적화된 상기 다음 야로위아 코돈은 상기 NheI 및 AvrII 사이트들 사이에 합성 구조: 1)S.세레비시에(S. cerevisiae) SAG1 (ID 853460)의 C-말단 끝(960 bp), 2)S.세레비시에 AGA2 (ID 852851) 또는 3)야로위아 리포리티카 CWPI(접속 번호 AY084077)의 C-말단 끝(333 bp)로 삽입되었다. 제2 합성 구조는 상기 AGA2 분자 앵커는 상기 scFv의 N-말단에 놓여 만들어졌다. 여기서, 원숙한 S.세레비시에 AGA2이 최적화된 코돈은 an BsmI 사이트에 앞섰으며, (Gly4Ser)3 링커((Gly4Ser)3 linker), scFv 코딩 서열, c-myc 및 6-히스 에피토프 태크들(6-his epitope tags)로 둘러싸인 SfiI/Not 및 AvrII 제한 사이트에 뒤이었다. 상기 완성 합성 구조들은 BsmI (T4) 및 SacII(T4)/AvrII-소화된 pYLPLXL2pre에 복제된 AvrII를 통해 소화되었다. AGA1의 표현을 위해, BsmI(T4)에 앞서고 AvrII에 뒤이은 원숙한 S.세레비시에 AG12이 최적화된 코돈은은 BsmI(T4) 및 AvrII를 통해 소회되었으며 SacII(T4)/AvrII-소화된 pYLPUXL2pre로 복제되었다.
scFv 분절들의 용해 표현을 허용하기 위해, 분비구조가 최적화된 코돈인 야로위아는 합성적으로 만들어졌다. 이 구조는 scFv 복제를 위해 SfiI/NotI 제한 사이트들을 통해 상기 5' 말단에서 앞서는 상기 V5 및 6-히스 데피토프 태그들을 유지했다. 이 구조는 BsmI(T4) 및 AvrII를 통해 소화되었으며 SacII(T4)/AvrII-소화된 pYLPUXL2pre로 복제되었다. 트라스투주마브(trastuzumab) scFv 및 4-4-20 scFv가 최적화된 코돈뿐 아니라 상기 항-HEL scFv's D1.3 및 M3은 상기 SfiI 및 NotI 제한 사이트들 사이에서 상기 기재된 플라즈미드들로 합성되었고 복제되었다. 항- 플루오레세인 4-4-20 항체는 S.세레비시에 표면 디스플레이 플랫폼의 발달을 위한 모델 단백질로서 사용되어 왔다(Boder, E.T. & Wittrup, K.D., Nat. 바이오에탄올(Biotechnol). 15, 553-7, 1997, 전체 참조에 의해 여기에 포함된). 상기 세포 표면으로 안티젠 HER-2/neu 프로토-발암유전자(antigen HER-2/neu proto-oncogene)와 결합하는 트라스투주마브(허셉틴)은 임상적으로 유방암 치료를 위해 허용된다(Cho et al., Nature, 전체 참조에 의해 여기에 포함된).
Fab 표현 구조들: 상기 헤비 체인 표현 플라즈미드들(heavy chain expression plasmids)을 위해, 헤비 체인 상수 영역 CH1 도메인이 최적화된 상기 야로위아 코돈은 SfiI 및 NotI를 사용하여 scFv 복제를 위해 기재된 것으로서 상기 4개 합성 구조들로 복제된다. 이후, VH를 위한 cDNA는 SfiI 및 NotI를 사용하여 이 플라즈미드들로 복제되었다. 마지막으로, Fab 표현 카세트들(Fab expression cassettes)은 scFv를 위한 것과 유사하게 pYLPLXL2pre로 복제되었다.
상기 라이트 체인 표현 플라즈미드(light chain expression plasmid)는 상기 scFv 표현 플라즈미드 상에 형성되었다. 그러므로 C1(라이트 체인 상수 영역 카파)이 최적화된 야로위아 코돈은 SfiI 및 NotI를 사용하여 이 벡터로 삽입도었다. 이후, 상기 VL을 위한 cDNA는 SfiI 및 BsiWI를 사용하여 이 플라즈미드로 복제되었다.
트라스투주마브 및 4-4-20 다양한 도메인들은 상기 발달된 Fab 표현 플라즈미드들로의 복제를 위해 상기 제공된 제한 사이트들의 추가를 통한 scFv 표현 플라즈미드들로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 상기 최종 플라즈미드들은 완전히 상보적인 최종 변형을 형성하기 위해 상기 기재된 것과 같이 적절한 야로위아 리포리티카 변형들로 변형되었다.
성장 조건들: 야로위아 리포리티카 변형들은 풍부한 YPD 배지(1% 이스트 농축, 1% 박토펩톤(bactopepton), 1% 글루코스) 또는 CSM(MSM; 0.67% 아미노산 및 황화암모늄이 없는 이스트 아민(nitrogen base), 0.4% NH4Cl, 0.079% CSM)이 보충되고 글루코스 2% 또는 탄소 공급으로서 올레산 2%가 보충된 최소 배지에서 50 mM 인산 완충액, pH 6.8, 28℃ 조건에서 배양되었다. pH 테스트 실험들을 위해 50 mM 인산-시트르산염 완충액이 pH 5 또는 pH 3에서 사용되었다.
세표 표면 디스플레이를 유도하기 위해, 이스트 세포들이 최소 글루코스 배지에서 28℃ 및 180rpm 조건에서 24시간 동안 성장되었다. 다음날, 상기 배양의 OD600은 측정되었고, 세포들은 dH2O로 두 번 세척되었으며, 최소 올레산 배지에 있는 0.1의 OD600에서 16시간 동안 20℃, 180rpm 조건에서 재부유(resuspended)되었다. 세포는 50 mL 팔콘 튜브들(FALCON tubes)에서 5 mL 배양되거나 또는 차단된 혼합 플라스크들에 있는250 mL에서 20mL 배양된 것으로 성장되었다.
유동세포계수법: 표면 표현은 상기 c-Myc 또는 V5 에피토프에 대한 항체를 통한 간접적 면역염색법에 의해 설명되었다. 그러므로 유도 이후에, 0.1% BSA (PBS/BSA)를 통해 보충되는 1 ml PBS (pH7.2)에 있는 2x106 세포들은 1g/ml 항 c-Myc 항체 (Sigma 사) 또는 항-V5 항체 (Invitrogen 사)를 통해 30분간 배양되었다. 적절한 경우, 바이오티닐레이티드(biotinylated) HEL (Sigma 사) 또는 재조합체 HER2-Fc 쉬메릭(chimeric) 단백질(R&D Systems 사)가 사용되었다. Pierce 사의 EZ-링크 마이크로 바이오티닐레이션 키트들(EZ-Link Micro Biotinylation Kits)이 HEL의 바이오티닐레이션을 위해 사용되었다. 이후, 세포들은 냉각 PBS/BSA로 세척되었으며, 제2 감지 시양을 통해 30분간 배양되었다. 염소 항-쥐 알렉사-488(Goat anti-mouse Alexa-488) 또는 항체들이 결합된 피코에리트린(phycoerythrin)이 상기 결합 항-c-Myc 또는 항-V5 항체를 감지하기 위해 사용되었다. 세포들은 FACSCalibur 유동계수기 상의 분석에 앞서 냉각 PBS/BSA로 두 번 세척되었다.
Kd 결정 : 세포들은 앞서 기재된 것과 같이 성장되었고 유도되었다. 200㎕ PBS/BSA에 있는 1 x 106 분자들의 부분 표본은 상기 적절한 안티젠을 통해 0.01nM 내지 1M 농도의 범위에서 배양되었고, 60분간의 배양을 통해 25℃에서 평형에 도달하도록 허용되었다. 세포들은 다음으로 원심분리를 통해 펠릿(pelleted)되었고, 냉각 PBS/BSA로 세척되었으며, FACSCalibur 유동계수기 상의 분석을 위해 1ml 냉각 PBS/BSA에서 재부유되었다. 세포들의 상기 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)은 기록되었다. 비선형의 최소-스퀘어 커브 피트(fit)는 상기 형광 데이터로부터 상기 평형 분리 상수(Kd)를 측정하기 위해 사용되었다.
PCR 하기 쉬운 오류를 이용한 여러 가지 레퍼토리들(repertoires)의 구조: 상기 항-HEL scFv 분절 D1.3(anti-HEL scFv fragment D1.3)은 PCR 하기 위운 오류를 이용하여 앞서 기재한 것과 같이 무작위로 변형되었다(Chao et al., Nat. Protoc. 1 참조, 755-68, 2006, 전체 참조에 의해 여기에 포함된). 간략하게, 상기 scFv ORF는 프라이머들 pPOX2Fw 및 zetaRv를 사용하여 pYLPUXL2preA2D1.3로부터 증폭되었다(Chao et al., Nat. Protoc. 1, 755-68, 2006). 정화 이후, 상기 PCR 산물들은 SfiI 및 NotI를 통해 소화되었다. 상기 소화된 산물들은 젤-정화되었고(gel-purified), 야생 타입 D1.3을 함유하는 유사 처리(SfiI 및 NotI로 소화된)된 벡터로 복제되었다. 플라즈마 DNA는 퀴아젠 플라이즈미드 정화 키트(Qiagen plasmid purification kit)를 사용하여 이 라이브러리들(libraries)로부터 준비되었으며 상기 기재된 것과 같이 순차적으로 상기 야로위아 변형 pO1d로 변형되었다.
라이브러리 선택: 상기 돌연변이 D1.3 레퍼토리는 성장되었고 항체 표현은 상기 기재된 것과 같이 16시간 동안 유도되었다. 상기 레퍼토리는 20분간 비표지된 HEL과의 경쟁에 뒤이어 평형에 도달할 때까지(3시간) 항-c-Myc (1 g/ml) 및 300 nM 바이오티닐레이티드 HEL를 통해 표지되었다. 다음으로, 세포들은 염소 항-쥐 IgG (1 g/ml)로 표지된 제2 알렉사-488 및 스트렙타비딘(streptavidin)-피코에리트린(1 g/ml)을 통해 표지되었다. 세포들은 모든 배양 단계에 이어 1 ml PBS/BSA를 통해 두 번 세척되었다. 상기 마지막 세척 이후, 세포들은 안티젠 분리를 방지하기 위해 냉각상태로 유지되었다. 표본들은 에픽스 알트라 유동계수기(Epics Altra flow cytometer) 상에서 대략 2000 cells/s의 분류 속도를 통해 분류되었다. 세포들은 높은 안티젠 결합 수(population)의 작은 비율을 게이팅(gating)함에 따라 증가하는 엄격을 통해 연이은 3회에 걸쳐 분류되었다. 상기 선택된 클론들의 서열 분석은 두 개의 클론들(클론들 13 및 클론 38)이 돌연변이들 [I160V] (클론 13) 및 [I160V T228A] (클론 38)을 포함하고 있음을 드러내었다. 이 클론들은 안티젠 결합을 위해 평형 적정을 통해 측정되었고, 친화도가 향상된 1.8 및 2.4 중을 나타내어, 상기 M3 돌연변이에 있어서도 상기 동일한 범위에 놓여있다(도 18참조).
실험예 2. scFv , Fab 및 전체 길이 IgG 디스플레이 플라즈미드들의 세트 구조
포괄적 표면 디스플레이 플랫폼은 다른 앵커링 분자들을 사용하여 scFv 분절들의 디스플레이를 허용하기 위해 생성되었다. 4개 디스플레이 플라즈미드들의 총괄은 1) S.세레비시에 Sag1p의 C-말단 부분으로 N-말단 융합 (320 C-말단 AA; A1), 2) S.세레비시에 Aga2p로 N-말단 융합(A2), 3) 야로위아 리포리티카 Cwpip의 C-말단 부분으로 N-말단 융합(110 C-말단 AA; A3) 및 4) Aga2p로 C-말단 융합(A4)으로서 scFv 분절의 디스플레이를 허용하며 생성된다. 표현은 상기 유도 가능한 pPOX2 프로모터에 의해 유도되었으며, 궁극적으로 적절히 처리된 표면 디스플레이 된 단백질로 이어지는 상기 분리장치를 통해 각 폴리펩티드의 과정을 유도하기 위해 상기 LIP2pre 리더(leader) 서열은 상기 scFv의 N-말단에 첨부되었다. 변형으로 인해, 상기 LIP2 프레프로는 또한 디스플레이 레벨들(levels)의 비교를 허용하기 위해 알파-아글티닌 융합(alpha-aggltinin fusion (A1))에서 상기 트라스투주마브 scFv를 위한 리더로서 사용되었다. 이 실험적 전략은 상기 앵커가 상기 scFv의 N- 또는 C-말단부로 융합되는지 또는 이전에 나타난 사실인 Fab 분절이 디스플레이 된 scFv의 결합 특성들에 영향을 미치는지에 의존하여, 다중 디스플레이 방식들의 사용이 단지 성공의 기회를 증가시킬 수 있을 뿐 아니라, 자유 카르복시 또는 아미노 말단들을 통한 항체 분절들의 디스플레이를 허용할 수 있는 이유에 근거했다(Wang, Z. et al., Protein Eng. Des. Sel. 18, 337-43, 2005, 전체 참조에 의해 여기에 포함된). 에피토프 태크(c-Myc)의 추가는 각 폴리펩티드 디스플레이의 모니터링을 허용하였으며, 정상화된 선택을 허용하였다.
Fab 디스플레이를 위해, 상기 헤비 체인 Fab 분절은 scFv 분절들(A1-4)을 위해 기재된 것으로서 상기 동일한 앵커링 분자들을 사용하여 상기 이스트 표면에 정박되었고, 반면 상기 라이트 체인 Fab 분절은 용해 가능한 분절(FabLC)로서 표현되었다. 체인들 둘 다 화학정략적 양들(stochiometric amounts)로 나타내는 것을 허용하기 위해, 두 표현 카세트들은 리더 서열로서 LIP2pre를 사용하여 상기 유도 가능한 pPOX2 프로모터에 의해 유도되었다. Fab 헤비 체인(CH1-VH), (c-Myc) 및 라이트 체인(C-말단 V5 및 6-히스 에피토프 태그들)의 다른 에피토프 태그들의 존재는 동시적이며 독립적인 각 폴리펩티드의 시각화를 위해 허용되었다.
전체 길이 IgG 디스플레이를 위해, 상기 전체 길이 트라스투주마브 헤비 체인은 scFv 및 Fab에서 기재된 것과 같은 상기 앵커링 분자 두 개(A2 및 A4 (AGA2 각각의 N- 및 C-말단 테터링(tethering)))를 사용하여 상기 이스트 세표 표면에 정박되었다. 체인들 둘 다 화학정략적 양들로 나타내는 것을 허용하기 위해, 두 표현 카세트들은 리더 서열로서 LIP2pre를 사용하여 상기 유도 가능한 pPOX2 프로모터에 의해 유도되었다. 헤비 체인 (HC), (c-Myc) 및 라이트 체인 (LC), (C-말단 V5 및 6-히스 에피토프 태그들)을 위한 다른 에피토프 태그들의 존재는 동시적이며 독립적인 각 폴리펩티드의 시각화를 위해 허용되었다.
코돈 최적화는 일반적으로 비상동 단백질 표현 레벨의 이중 향상을 야기하는 것으로 나타났기 때문에 모든 디스플레이 카세트들은 야로위와 리포리티카를 위해 최적화된 코돈이었다. 상기 디스플레이 시스템들은 두 개의 잘 특성화된 항체들의 패널: S.세페비시에 표면 디스플레이 플랫폼의 발달을 위한 모델 단백질로서 사용되어온 항-형광 4-4-20 항체 및 상기 세포 표면 안티젠 HER-2/neu 프로토-온코젠(antigen HER-2/neu proto-oncogene)에 결합되며 유방암 치료를 위해 임상적으로 허용된 트라스투주마브(허셉틴)을 사용해 분석되었다.
모든 벡터들은 제타 요소들(zeta elements, (상기 Ylt1 RNA유래전이인자에서 기인한 긴 말단 반복들, LTRs))을 이동시켰으며, 이는 Y.리포리티카 변형들에서의 상동재조합 또는 이 RNA유래전이인자(retrotransposon)가 없는 변형들에서의 비상동재조합에 의한 통합을 위해 상기 벡터들을 허용하였다. 상기 Fab 헤비 체인(CH1-VH) 표현 구조들 뿐만 아니라 모든 scFv 표현 구조들은 상기 LEU2 영양요구성 마커(auxotrophic marker)를 이동시켰다. 상기 Fab 라이트 체인 분절 표현 플라즈미드들은 상기 URA3d1 마커를 이동시켰다. 상기 Aga2p 융합의 디스플레이를 위해, 상기 S.세레비시에 AGA1을 표현하는 추가적인 표현 구조는 존재하였다. AGA1은 AGA2의 헤테로디메리세이션 파트너(heterodimerisation partner)이다. 그러므로 두 구조들은 (영양요구성 마커들 URA3 및 ADE2를 통해) pPOX2 프로모터 아래 AGA1의 표현 및 상기 원숙한 Aga1p를 위한 리더로서 LIP2pre 사용을 허용하기 위해 만들어졌다. 상기 표현 구조들의 변형은 완전히 상보적인 변형에 있어 모든 경우를 야기했다. 도 1은 scFv 및 Fab 분절들의 디스플레이를 위해 구성된 상기 표현 플라즈미드들을 위한 도식이다.
실험예 3. 세포적 디스플레이 향상
초기 실험들을 위해, 디스플레이 변형들의 포지티브 변형들은 250 ml 플라스크들에 있는 YPD 배지의 50ml에서 28℃ 조건에서 밤새 성장되었다. 그 후에, 세포들은 dH20에서 세척되었고, 올레산 풍족 배지에서 재부유되었으며, 250 ml 플라스크들에서 28℃에서 48시간 동안 성장되었다. 상기 초기 실험들에 있어서, 표면 표현은 상기 c-Myc 에피토프-테크 및 FACS 분석 상에서 면역적 염색(immunological staining)을 사용하여 감지될 수 없었다(도시하지 않음). 그러므로 다른 성장 조건들이 시험되었다.
스트레스 반응 및 단백질 폴딩(folding)을 포함하는 많은 중요한 세포적 과정들은 사기 성장 온도들의 변화에 영향을 받는다. 폴딩 스트레스는 많은 효과적 비상동 단백질 분비/ 표면 디스플레이 레벨들을 가능하게 하면서 일반적으로 낮은 배양 온도들에서 감소한다. 예를 들어, 전체 참조에 의해 여기에 포함된Dragosits, M. et al., J. Proteome Res., 2009를 참조하라. 그러므로 상기 scFv 및 Fab 분절들의 표면 표현 레벨들은 20℃ 및 28℃의 유도 온도에서 비교되었다.
상기 세포벽은 많은 다양한 단백질 수(population)를 함유하는 높은 의존성 세포 기관이다. 상기 존재하는 폴리머 네트워크로의 새로운 메크로분자들(macromolecules)(예를 들어, GPI 정박된 단백질들)의 삽입이 활성 세포벽 생체 내 합성 사이트에서, 예를 들어, 상기 성장 딸세포의 사이트에서 주로 발생하는 것이 S. 세리비시에에서 나타나고 있다(Klis, F.M., et al., Yeast 23, 185-202, 2006, 전체 참조에 의해 여기에 포함된). 야로위아 리포리티카의 세포벽의 분자적 조직은 S.세레비시에의 그것과 유사한 것으로 믿어진다. 세포벽 형성이 늦춰질 수 있으며, 그러므로 세포벽 생체 내 합성 사이트에서 더 많은 상기 비상동 단백질이 축적되는 것을 허용하는 20℃에서 성장할 수 있는지 시험하였다. 또한 통기(aeration)의 영향을 연구하기 위해, 세포들은 250 ml 혼합 플라스크들 뿐만 아니라, 공기가 통하지 않는 50 ml 팔콘 튜브들에서 성장되었다. 마지막으로, 최소 보충 배지(MM)에서의 성장이 시험되었다. 4-4-20 알파-아글티닌(Sag1p)을 나타내는 변형은 이번 실험에서 사용되었다. 조절 변형으로서, 전체 크기 단일항체 트라스투주마브 항체 생성 변형(표면 표현 카세트를 포함하지 않는 변형 1T2)이 선택되었다.
도 2에서 도시된 것과 같이, 큰 c-Myc 포지티브 수(large c-Myc positive population)는 팔콘(76%) 및 혼합 플라스크(86%) 배양들 모두에서 20분간 20℃의 최소 보충된 배지에서 세포들이 유도되었을 때, 디스플레이 레벨들(2-폴드에 의해 구별된 MFI (mean fluorescence intensity))이 약간 높게 나타나는 혼합 플라스크 배양들을 통해 FACS 분석을 하자마자 나타났다. 세포들이 28℃의 RM에서 성장되었을 때, 세포들의 작은 분절만이 상기 항체 분절들을 나타내었다. 유도 40시간에서 분석하자마자, 모든 성장 조건들이 시험되어 모든 c-Myc 감지가 폐지되었다(데이터는 도시하지 않음). 이론을 통해 결합될 수 있는 가능성 없이, 이는 상기 디스플레이 된 단백질의 단백질 가수분해 또는 형태학적 변화들 또는 세포벽 구조에서의 변화들에 의한 상기 c-Myc 에피토프의 가림(hiding)에 의해 설명될 수 있다.
실험예 4. 표현 디스플레이 레벨들에서 유도 시간의 영향
c-Myc 포지티브 세포들이 더 긴 유도 시간들에서 사라지기 때문에, 시간-운동 실험(time-kinetics experiment)은 다양한 유도 시간들에서 디스플레이 레벨들을 측정하기 위해 수행되었다. 그러므로 변형 n1 (pO1d이 변형된 4-4-20 scFv Sag1)의 FACS 분석은 16, 20, 24, 32 및 43 시간 유도에서 수행되었다.
도 3의 상부 패널들에서 도시된 것과 같이, 최대 표현 레벨은 유도 16시간에 도달되었고, 95%의 세포들이 적절한 표현 레벨들(상기 배경에서 10-폴드)을 나타내었다. c-Myc를 나타내는 세포들의 상대적 비율은 더 긴 유도 시간에 따라 감소되었다(16시간 이후 95%, 20 시간 이후 86%, 24시간 이후 53%, 32시간 이후 19% 및 43시간 이후 7%). 또한, 유도 동안 상기 자발형광(5-폴드) 및 포지티브 세포들의 상기 평균 형광(20-폴드)에서 감소가 측정되었다. 이론을 통해 결합될 수 있는 가능성 없이, 상기 감소된 자발 형광은 감소된 세포 크기의 결과인 것 같다. 상기 FSC/SSC(앞-옆 분사(forward-sideward scatter): 이 측정들은 상대적 세포 크기 및 세포들의 과립모양(granulosity)을 나타낸다.)로 인해, 중요한 변화들이 감지되며, 이는 상기 형태학적 발달에서 급격한 변화를 반영하였다. 이론을 통해 결합될 수 있는 가능성 없이, 상기 세포들이 유도 도중 이스트-균사 전이를 겪는 것이 이 변화들에 대한 일 설명이다. 현미경을 통해 확인하면, 상기 세포들은 더 긴 유도에 따라 더 많은 비정상적으로 가늘고 긴 구조들을 형성하며, 이 가설을 지지하였다. 균사 형성에서 중요한 것은, 상기 세포벽 단백질 컨텐츠(content)는 감소될 것으로 앞서 나타났으며, 또한 이는 낮은 표면 디스플레이 레벨들을 설명할 수 있다.
실험예 5. 표현 디스플레이 레벨들에서 pH의 영향
Y.리포리티카는 이스트-유사 및 단균사체(short mycelial) 세포들의 혼합으로서 성장한다. 상기 동종이형 변형을 조절하는 일 요소는 성장 배지의 상기 pH이다(Ruiz-Herrera, J. & Sentandreu, R., Arch. Microbiol. 178, 477-83, 2002, 전체 참조에 의해 여기에 포함된). 군사체 형성은 중성에 가까운 pH에서 최대이며, pH가 낮아질수록 감소하여 pH 3(Id.)에서 거의 일어나지 않게 된다.
유도의 초기 상태 동안 이스트-균사 전이를 피하기 위한 시도에서, scFv 디스플레이 변형은 다른 pH 값: pH 6.8, pH 5및 pH3에서 성장된다. 도4에서 도시한 것과 같이, 유도 24시간에서, pH 5 및 6.8에서 상기 성장 배지를 위해 이동은 세포들의 50% 손실을 통해 발생했다. 반면, pH 3에서 세포들 100%는 세포적 디스플레이를 유지하였다. pH3에서 상기 전체 디스플레이 레벨들은 pH 6.8에 대비하여 증가하지 않았다. 유도 32 시간에서, c-Myc 신호의 완전한 손실이 pH 5 및 6.8에서 측정되었고, 반면 모든 세포들은 pH 3에서 scFv 디스플레이를 유지하였다. 단지 pH 3에서 더 긴 유도 시간 동안에 최대 표현 레벨들에 있어 약간의 감소가 측정되었다. 유사한 변화들은 표면 디스플레이된 Fab 분절들을 위해 나타났다(데이터는 도시하지 않음). 급격한 차이들은 형태학적 변화들을 반영하는 다른 pH들에 있는 성장 배지들 사이에 FSC/SSC 프로파일들에서 관찰되었다. pH 3에서 매우 적은 균사체 세포들로 유도된 이스트 수(population)는 더 긴 유도 시간들에서 유지되었으며, 반면 pH 5 및 6.8에서 아마도 가-균사체 성장(pseudo-hyphal growth)에 대한 전이를 반영하는 더 많은 분산된 세포 수(population)가 측정되었다.
요약하면, 이 실험예는 낮은 pH 성장은 표면 디스플레이 단백질들의 감지를 연장하나 전체 디스플레이 레벨들을 감소시키지는 않는 것으로 설명한다.
실험예 6. 발달된 scFv, Fab 및 전체 길이 IgG 변형들의 표현 분석
상기 새로운 디스플레이 시스템은 두 개의 다른 scFv 분절 융합 단백질들: 4-4-20 scFv 및 트라스투주마브(허셉틴) scFv을 사용한 FACS를 통해 입증되었다. scFv 표현은 상기 scFv 산물의 표현 및 보정 폴딩(correct folding)을 나타내는 면역 형광 염색 현미경 및 c-Myc 태그의 유동세포계수 감지에 의해 입증되었다. 도 5는 상기 다른 디스플레이 방식들에서 두 개 scFv 분절들 모두를 위한 표현 및 리간드(ligand) 결합 데이터를 나타내고 있다. 나타난 바와 같이, 표현은 Aga2p 융합들을 달성하기 위한 높은 레벨들(상기 배경에서 MFI는 30 폴드)을 통한 Sag1p(도 5의 막대 그래프 행에 표지된 "A1") 및 Aga2p(도 5의 막대 그래프 행에 표지된 "A2")로의 상기 N-말단 융합을 위한 두 개 scFv 분절들을 위해 나타난다. 중요한 것은, S.세레비시에에서, 상기 표면 단백질을 표현하지 않는 세포들의 네가티브 수(negative population)(40-80%)가 존재한다는 것이며, 반면 이 현상은 야로위아 리포리티카에 있는 scFv들이 융합을 사용하여 디스플레이 될 때 관찰되지 않는다. 이론을 통해 결합될 수 있는 가능성 없이, 이에 관한 일 잠재적 설명은 상기 표현 카세트가 에피솜 플라즈미드들(episomal plasmids)이 사용되는 곳에서 안정적으로 S.세레비시에에 관한 Y.리포리티카의 상기 게놈으로 통합되는 것이다. 리간드-결합 감지에 관하여, 바이오디닐레이티드 안티젠은 스트렙타비딘-피코에리트린를 통해 감지되었다. 상기 scFs들은 또한 그들의 보정 과정 및 폴딩을 확고히 하며 안티젠으로 결합될 수 있었다(도 5에서 "리간드 결합"으로 표지된 행들 참조). 다중 복제들이 시험된 경우에도, CwpIp (도 5의 막대 그래프 행에 표지된 "A3")으로의 N-말단 융합 및 Aga2p (도 5의 막대 그래프 행에 표지된 "A4")으로의 C-말단 융합을 위해 표현은 감지될 수 없었다. 첫째로, CWPI를 사용한 야로위아에 있는 단백질들의 성공적인 디스플레이는 ofhp4d 프로모터 및 리더 서열로서 Xpr2 pre를 사용하여 지금까지 이루어져왔다. 일 가능성은 표현 구조들에서 차이들이 표현의 부재가 관찰되는 것에 관해 책임이 있다는 것이다. 둘째로, 이는 감지가 가능하지 않은 디스플레이 된 단백질을 만들 수 있는 상기 에피토프 태그들의 단백질 분해에 기여할 수 있다. 상기 LIP2 프레피로가 리더로 사용되었을 때, 대략 3중 폴드는 트라스투주마브(허셉틴) Sag1p 융합을 위해 나타났다(데이터는 도시하지 않음). 면역 형광 염색 현미경은 디스플레이된 scFv의 상기 세표 표면 국지화를 분명하게 설명한다(도 6A 참조).
측정하기 위해 만약 야로위아 세포들이 기능적으로 헤테로디메릭(heterodimeric) Fab 분절들을 조립할 수 있다면, 두 개의 다른 fab 분절들(4-4-20 및 트라스투주마브(허셉틴) 항체로부터 유도된)의 표현은 면역 형광 염색 현미경 및 유동 세포계수법에 의한 표현 분석에 뒤이어 유도될 수 있다. 야로위아 변형 pO1d는 최종적으로 안전히 상보적인 변형들을 야기하기 위해 AGA1(ADE2 마커를 사용하여), 헤비 체인 분절(URA3 마커를 사용하여) 및 라이트 체인 분절(LEU2 마커를 사용하여)에 관한 상기 표현 카세트들을 통해 연속하여 변형되었다. 상기 야로위아 세포들은 상기 융합된 에피토프 태그들(HC Fab 분절에 관한 c-myc 및 LC-분절에 관한 V5)에 대한 면역적 변형에 의한 헤비 체인 및 라이트 체인 표현에 관해 표지되었고, 안티젠 결합은 측정되었다.(도 7 참조). CwpIp로의 모든 구조들 제외 융합에 관하여, fab 헤비 체인(CH1-VH) 및 라이트 체인 모두의 디스플레이는 확정되었다. 모든 경우에 있어서, 상기 세포수 100%는 상기 기재된 scFv 분절들을 통해 획들된 결과들을 확고히 하면서, 기능적으로 헤테로디메릭 fab 분절을 표현하였다(도 7 참조; 두 피크(peak)(하나의 네가티브(자발형광) 피크 및 하나의 포지티브 피크)의 출현보다 상기 전체 피크의 이동이 측정되었다.). 두 색 FACS 분석을 사용한 HC 및 LC 드라스투주마브(허셉틴) Fab 분절들의 동시 라벨링은 각 개별의 이스트 세포들의 표면 상에서 두 체인들 모두의 상기 페어링(pairing)을 설명하였다(도 8의 막대그래프의 행에 표지된 "HC +LC" 참조). 나아가, 허셉틴 HC Fab 분절의 부재에 있어서, 상기 트라스투주마브(허셉틴) LC 분절은 상기 복합체의 레테로디메릭 구성을 설명하면서 이스트 세포들의 상기 표면상에서 감지될 수 없었다(도 8의 막대그래프의 중간행 참조). 안티젠 결합은 두 개의 안티젠들에 관하여 확고히 디었다(도 7의 막대그래프의 행에 표지된 "리간드 결합" 참조) 그러나 상기 안티젠을 통한 상기 크기는 항체 융합의 분자적 조직에 관하여 결합될 수 있다. 또한, 상기 두 개의 항체 클로들에 관한 다른 디스플레이 모드들을 비교할 때, 디스플레이 효율성에서의 변형들이 관찰되었다(도 7의 점선 참조). 면역 형광 염색 현미경은 헤비 및 라이트 체인들 모두의 콜로칼리제이션(colocalization)을 나타내었다(도 6B 참조). 도 6에서, Fab 및 scFv 4-4-20 항체 분절들은 표현되었다. 감지는 앵거된 헤비 체인 분절에 관한 c-myc 변형 및 라이트 체인 분절에 관한 V5 변형이었다.
야로이야(Yarrowia) 세포들이 그들 표면이 전체 길이의 IgG 상에 기능적으로 조립될 수 있는 지를 평가하기 위하여, 단일 IgG 헤르셉틴(Herceptin) 트라스투주맙(trastuzumab)의 발현이 면역 형광기(immunofluorescence microscopy) 및 유세포 분석에 의한 발현 분석에 수한하여 유도되었다. 따라서 양 사슬들의 발현 카세트들이 Fab를 위해 수행된 경우와 유사하게 완전히 보완된 세포주를 발생시키도록 단일 야로이야(Yarrowia) pO1 세포주로 변형되었다. 디스플레이는 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 중쇄 및 경쇄의 동시 염색(각기 c-myc 및 V5 염색)에 의해 입증되었다. 도 17은 상기 2개의 모드들 A2 및 A4에서 전체 길이 트라스투주마브 (헤르셉틴(Herceptine)) 디스플레이의 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 나타낸다. 또한 보여진 바와 같이, 모든 세포들은 전체 길이 중쇠 및 경쇠의 발현을 동시에 보여준다. 디스플에이 효율에서 급격한 향상이 상기 중쇄가 N-말단 융합과 비교하여 상기 AGA2 앵커의 C-말단 융합되는 경우에 관찰되었고, 유사하게 트라스투주마브 (헤르셉틴(Herceptine)) Fab 디스플레이의 경우에도 관찰되었다.
실시예 7: 항체 절편들의 향상된 발현을 위한 표시 변형들의 설계
항체 절편들(scFv 및 패브)의 생산 내의 속도 제한 단계들은 종종 단백질 폴딩(folding), 이황화물 다리(disulfide bridge)형성 및 소포체(endoplasmic reticulum)(ER) 내의 기능성 어셈블리이다. 세레비시에(S. cerevisiae) 내의
PDI 및 Kar2/Bip와 같은 샤프론 분자(molecular chaperones)의 과다발현(overexpression)은 scFv 생산(여기서 전체로서 참조되는 Shusta, E.V. 등의 Nat. Biotechnol. 16, 773-7, 1998.)에 긍정적인 효과를 갖는다는 것이 나타나있다. 또한, P. pastoris에 PDI 동시발현(coexpression)은 패브 과다발현(overexpression) 상의 폴딩 응력을 완화시키고, 생산 레벨들을 적절하게 증가시키는 결과를 도출한다는 것이 나타나있다.(여기서 전체로서 참조되는 Gasser, B. 등의 Biotechnol. Bioeng. 94, 353-61, 2006.) 그러나, 몇몇 사례들에서, 샤프론 동시발현은 노차지 또는 발현 레벨들의 일정한 감소로 인해 도출된다. 항체 분비를 향상시키는 또 다른 가능성은 HACL 전사 요인의 과다 발현(overexpression)에 의해서 언폴딩된 단백질 반응(unfolded protein response)(UPR)을 유도하고, 패브 분비 내의 적절한 향상은 미리 보고되는 것이다.(Id)
양쪽 표면 디스플레이된 및 분비된 단백질이 동일한 분비 경로를 통해서 이용함에 따라, 세표 표면 디스플레이는 분비 능력과 밀접한 연관성이 있다는 것은 잘 알려져 있다(Shusta, E.V., et al., Nat. Biotechnol. 16, 773-7, 1998, 여기에서 . 참조문헌으로 인용됨). 이에 따라, 표면 디스플레이 레벨들은 발현 레벨들에 대해서 용이한 리드아웃 링킹 개별 세포들(readout linking individual cells)로 기능한다.
여기에서 scFv 및 Fab 생성물 상에서 Yarrowia PDI 및 HACI 발현의 효과는 상술한 상기 디스플레이 플렛폼을 이용하여 Yarrowia lipolytica 내에서 처음으로 시험되었다. Yarrowia PDI는 TEF 프로모터의 제어 하에서 구성적으로(constitutive) 발현되었고, Yarrowia HACI 전사 인자는 pPOX2 프로모터의 제어하에서 유도 가능하게 발현되었다. 양쪽 카세트들은 트라스투주마브 헤르셉틴(Herceptine) scFv 및 Fab 디스플레잉 스트레인들(상술됨)로 같이 변환되었고, 올바른 게놈 병합이 PCR에 의해서 확정되었다. 도 9에서 도시되 바와 같이, 구조적 PDI 공시 발현은 트라스투주마브 헤르셉틴(Herceptine) scFv-Sag1p 디스플레이의 2-폴드 증가(c-myc MFI에 의해서 측정됨)와 트라스투주마브 헤르셉틴(Herceptine) Fab-Aga2 디스플레이의 1.2 폴드 증가를 야기한다. 반면에, 유도된 HACI 동시 발연은 양쪽 scFv 및 Fab 절편들의 감소를 야기한다. 이들 결과들은 이황화물 결합의 형성이 scFv 및 Fab 절편들의 분비 과정에서 속도 결정 단계임을 보여준다. 하지만, UPR(unfolded protein response) 경로의 유도는 극단적으로 주적적인 충격을 준다. 이것은 scFv의 디스플레이에 대해서 이전에 관찰되었고(Rakestraw, A. & Wittrup, K.D., Biotechnol. Bioeng. 93, 896-905, 2006, 여기에서 참조문헌으로 인용됨), 이것은 적절하게 폴드되지 않은 단백질들이 ER degradation 경로(ERAD)로 보내어지고, 이것은 또한 UPR 유도 동안 제어되지 않는다는 사실에 의해서 설명될 수 있다.
실험예 8: 디스플레이된 트라스투주마브(Transtuzumab) 헤르셉틴(Herceptine) scFv를 위한 용량 반응 곡선
트라스투주마브 헤르셉틴(Herceptine) 표면-디스플레이된 scFv의 결합 친화도를 평형 결합 적정 곡선들로부터 결정하였다. 항체 융합을 각기 디스플레이하는 세포들은 HER2-Fc 키메라 단백질(chimeric protein)의 농도를 변화시키면서 25℃에서 3시간 동안 배양되었다. 세포 오염들의 평균 형광은 유세포 분석(flow cytometry)으로 측정되었다. 도 10은 3개의 독립적인 적정(titrations)의 결과를 나타낸다. "preA1-Herceptin scFv"라는 표식의 그래프 선은 S. 세레비시에(S. cerevisiae) Sag1p의 C-말단 320 아미노산들에 대한 N-말단 융합으로서 융합되고, Lip2pre 리더 배열과 함께 발현된 트라스투주마브 헤르셉틴(Herceptine) scFv를 위한 용량 반응을 나타낸다, "preproA1-Herceptin scFv"라는 표식의 그래프 선은 S. 세레비시에 Sag1p의 C-말단 320 아미노산들에 대한 N-말단 융합으로서 융합되고, Lip2prepro 리더 배열과 함께 발현된 트라스투주마브 헤르셉틴(Herceptine) scFv를 위한 용량 반응을 나타낸다. "preA2-Herceptin scFv"라는 표식의 그래프 선은 S. 세레비시에 Aga2p에 대한 N-말단 융합으로서 융합되고, Lip2pre 리더 배열과 함께 발현된 트라스투주마브 헤르셉틴(Herceptine) scFv를 위한 용량 반응을 나타낸다. Y축은 마찰 경계(fraction bound)를 나타내며, MFI/(MFImax-MFImin)으로서 계산되고, 정규화되며, 퍼센트로서 발현된다. 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant; Kd)는 비선형 리스트 스퀘어들(nonlinear least squares)로 맞춰졌다. HER2-Fc(Kd=1.9nM)를 위한 효모-디스플레이된 트라스투주마브 헤르셉틴(Herceptine)-Sag1p 융합의 친화도는 트라스투주마브 헤르셉틴(Herceptin)-Aga2p(Kd=0.7 nM)을 위한 경우 보다 2.7 폴드(fold) 높았다.
실험예 9: 직접 평가를 위한 스카폴드(Scaffold)로서 야로이야( Yarrowia ) 디스플레이 플랫폼의 확인
최대의 직접적인 평가 효율을 얻기 위하여, 스카폴드(scaffold)가 친화도의 미소한 차이로 클론들(clones) 사이를 효과적으로 판별할 수 있어야 한다. 이전에, 친화도의 2-폴드 차이로 항체 클론들 사이를 효모 디스플레이가 정밀한 판별을 가능하게 하는 점을 보인 바 있다(참고로 기재된 VanAntwerp, J.J. 및 Wittrup, K.D., Biotechnol. Prog. 16, 31-7, 2000을 참조 바람). 안티-헨(anti-hen) 계란 리소좀(lysozyme; HEL) scFv M3는 헬(HEL)을 위해 안티-헬(anti-HEL) scFv D1.3에 비하여 2-폴드 높은 친화도를 가진다. 디스플레이된 폴리펩티드들은 Sag1p("preA1 D1.3 vs M3"라는 표식의 그래프) 및 Aga2p("preA2 D1.3 vs M3"라는 표식의 그래프) 융합 폴리펩티드들로서 발현되었다. 상기 D1.3 또는 M3 디스플레이 세포들은 바이오티닐화된(biotinylated) HEL의 농도를 변화시키며 배양되었다. 다음에, 평균 형관은 유세포 분석으로 특정하였다. 디스플레이된 항체의 각 표면의 결합 친화도는 평형 결합 적정 곡선들에 의해 결정되었다. 도 11은 3개의 독립적인 적정들의 평균적인 결과들을 나타내며, 이에 대한 곡선은 비선형 리스트 스퀘어들로서 맞춰졌다. 헬(HEL)을 위한 D1.3의 친화도는 헬(HEL_을 위한 M3의 친화도에 비교하여 Sag1p 및 Aga2p 융합들을 위한 경우보다 각기 2,9 및 2.7 폴드 낮은 것으로 결정되었다.
이러한 실험예는 발달된 야로이야(Yarrowia) 디스플레이 스카폴드가 단지 미소한 친화도의 차이들로 클론들 사이를 효과적으로 판별할 수 있음을 나타내며, 본 시스템의 검사 능력(screening potential)을 확인케 한다.
실험예 10: 유세포 분석기(FACS)를 사용한 심화 모델 실시예
D1.3 및 개선된 돌연변이 M3를 디스플레이 하는 효모 세포들의 혼합체를 사용하여 단일 패스 심화들이 수행되었다. 상기 M3 돌연변이 scFv를 디스플레이 하는 세포들은 히그로미신(hygromicin) 발현 카세트와 함께 추가적으로 변형되었다. 발현 레벨들 상에서 어떠한 중요한 효과도 관찰되지 않았다. M3 세포들은 배경 D1.3 세포들 내로 1/10000의 비율로 혼합되었고, 최적의 판별을 위해 0.3nM의 안티겐(antigen) 농도로 평형이 도달될 때까지 배양되었다. 세포들은 대략 0.1%(도시되지 않음)의 분류 윈도우로 고 순도 모드로 분류되었다. 심화 요소들은 선택적인 플레이트들 상의 적정에 의해 결정되었고, 800의 최대 심화가 수득되었다. 심화는 심화 전에 또는 후에 선택적인 플레이트들 상의 복제 플레이팅에 의해 계산될 수 있다.
실험예 11: 야로이야 리폴리티카( Yarrowia lipolytica ) 내의 복제형 벡터들을 사용한 표면 디스플레이
복제형 벡터들은 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 내의 복제적인 진행(도 15 참조)을 위한 pPOX2 프로모터 및 ARS18에 의해 동작된 scFv-AGA2 발현 카세트를 함유하도록 구성되었다. AGA1 발현 카세트(AGA1-AGA2 헤테로디메리세이션(heterodimerisation)을 위한)를 함유하는 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포주 내로의 변형에 따라, 1.2ㅧ 106/g의 변형 효율이 관찰되었다. 이러한 효율은 제타 기준의 통합을 사용하는 임의의 통합을 위해 관찰될 수 있는 경우에 비하여 20배 높았다. 라이브러리 구성을 위하여, 높은 변형 효율이 원하는 복잡성을 얻기에 유리하다. 플라스미드 번식을 보존하기 위하여, 세포들은 류신(leucine)이 결핍된 선택적인 조건들 하에서 성장되었다.
발현 연구는 선택적인 조건들(CSM-류신이 보충된 최소한의 배지) 및 비선택적인 조건들(CSM이 보충된 MM) 모두 하에서 성장된 10개의 클론들에 대해 수행되었다. 통한되는 플라스미드들(도 16A)을 위해 관찰된 것에 대조적으로, 복제형 벡터로 변형되는 세포들의 유도에 따라, 세포들의 군은 scFv를 발현시키는 않게 존재한다. 심지어는 세포들이 선택적인 압력(도 16b) 하에서 성장되는 경우에도 존재하는 이러한 네거티브한 군은, 플라스미드의 손실이 이러한 관찰에 근거하지 않음을 나타낸다. 이와 같은 현상은 표면 디스플레이를 위해 복제형 플라스미드들을 이용하는 S. 세레비시에에서 관찰되는 경우와 유사하다. 10개의 클론들에 대한 분석은 세포들의 평균 43%가 scFv (도 16b 참조)의 표면 발현에 적극적인 점을 나타내었다. 평균 형광 강도는 통합적인 플라스미드들을 사용하여 관찰되는 결과들과 다르지 않았다(즉, 평균 형광 평균치의 범위가 동일하였다).
실험예 12: 유세포 분석기(FACS)를 사용한 심화 실시예
D1.3의 다양하게 발현된(diversefied) 라이브러리를 디스플레이 하는 효모 세포들의 혼합체를 사용하여 1nM의 안티겐 농도에서 심화가 수행되었다. 세포들은 대략 0.1%(도시되지 않음)의 분류 윈도우로 고 순도 모드로 분류되었다. 3개의 연속되는 분류 순번 회수가 수행되었다. 2개의 높은 친화도 클론들이 격리되었고; 클론 1은 1.7nM의 친화도(Ile160Val, Thr228Ala)를 나타내었고, 클론 2는 2.2nM의 친화도(Ile160Val)를 나타내었다.
다른 실시예들
본 발명을 그 상세한 설명과 함께 설명하였지만. 전술한 설명은 예시적인 것이고, 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위의 범위에 의해 본 발명의 범주가 정해진다. 다른 측면들, 이점들 및 변형예들도 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 있음을 이해할 수 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Oxyrane UK Limited <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DISPLAYING A POLYPEPTIDE ON A YEAST CELL SURFACE <130> 18990/0024WO1 <150> 61/297,093 <151> 2010-01-21 <160> 15 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 1 gaatgcagcg gcccagccgg ccatggccca ggtgcagctg caggtcgacc tcgagtggcg 60 gcggaggctc tggcggaggc ggatctggcg gcggtggcag tgcacaggtc caactgcagg 120 agctcgatat caaacgggcg gccgcagagc agaagctgat ctctgaggaa gatctgtccg 180 gcggaggcgg ctccggtggc ggcggttctg gcggtggcgg ctctcatatg tctgccaagt 240 cctctttcat ctctaccacc accaccgacc tgacctctat caacacctct gcctactcta 300 ccggctctat ctctaccgtg gagaccggca accgaaccac ctctgaagtg atctctcacg 360 tggtgaccac ttctaccaag ctgtctccca ccgccaccac ctccctgacc attgcccaga 420 cctctatcta ctccaccgac tccaacatca ccgtgggcac cgacatccac accacctccg 480 aggtcatttc cgacgtggag accatctccc gagagaccgc ctctaccgtg gtggccgctc 540 ctacctctac caccggctgg accggcgcca tgaacaccta catctctcag ttcacctctt 600 cttccttcgc caccatcaac tctaccccca tcatctcttc ctctgccgtg ttcgagacct 660 ctgacgcctc tatcgtgaac gtccacaccg agaacattac caacaccgcc gctgttccct 720 ctgaggaacc cacctttgtg aacgccaccc gaaactccct gaactctttc tgttcttcta 780 agcagccctc ctctccctct tcctacacct cttcccccct ggtgtcctct ctgtctgtgt 840 ctaagaccct gctgtctacc tctttcaccc cctctgtgcc cacctctaac acctacatta 900 agaccaagaa caccggctac ttcgagcaca ccgccctgac cacctcttct gtgggcctga 960 actccttctc tgagaccgcc gtgtcctctc agggcaccaa gatcgacacc tttctggtct 1020 cctccctgat cgcctacccc tcttctgcct ctggctctca gctgtctggc atccagcaga 1080 acttcacctc tacctccctg atgatctcta cctacgaggg caaggcctct atcttcttct 1140 ctgccgagct gggctctatc atcttcctgc tgctgtctta cctgctgttc taacctagg 1199 <210> 2 <211> 446 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 2 gaatgcagcg gcccagccgg ccatggccca ggtgcagctg caggtcgacc tcgagtggcg 60 gcggaggctc tggcggaggc ggatctggcg gcggtggcag tgcacaggtc caactgcagg 120 agctcgatat caaacgggcg gccgcagagc agaagctgat ctctgaggaa gatctgtccg 180 gcggaggcgg ctccggtggc ggcggttctg gcggtggcgg ctctcatatg caggaactga 240 ccaccatctg cgagcagatt ccctctccca ccctggagtc taccccctac tctctgtcta 300 ccaccaccat cctggccaac ggcaaggcca tgcagggcgt gttcgagtac tacaagtctg 360 tgaccttcgt gtctaactgt ggctctcacc cctctaccac ctctaagggc tctcccatca 420 acacccagta cgtgttctaa cctagg 446 <210> 3 <211> 569 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 3 gaatgcagcg gcccagccgg ccatggccca ggtgcagctg caggtcgacc tcgagtggcg 60 gcggaggctc tggcggaggc ggatctggcg gcggtggcag tgcacaggtc caactgcagg 120 agctcgatat caaacgggcg gccgcagagc agaagctgat ctctgaggaa gatctgtccg 180 gcggaggcgg ctccggtggc ggcggttctg gcggtggcgg ctctcatatg ggcaacggtt 240 acgccgtcga cgacaactcc aagtgcgagg acgacggaat ccccttcggc gcctacgctg 300 ttgctgacac ctccgcagag tcttctgccg cccccgcctc ttctgccgcc gctgccgagt 360 cctctgccgc cccctcttcc gctgctgagg ccaagcccac cgctggaggt aacaccggcg 420 ccgtcgtcac ccagatcggt gacggccaga tccaggctcc cccctctgct cctcccgctg 480 cccccgagca ggccaacggc gccgtctctg tcggtgtttc tgccgccgct ctcggtgtcg 540 ctgccgccgc tctcctcatt taacctagg 569 <210> 4 <211> 470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 4 gaatgcacag gaactgacca ccatctgcga gcagattccc tctcccaccc tggagtctac 60 cccctactct ctgtctacca ccaccatcct ggccaacggc aaggccatgc agggcgtgtt 120 cgagtactac aagtctgtga ccttcgtgtc taactgtggc tctcacccct ctaccacctc 180 taagggctct cccatcaaca cccagtacgt gttctcttct ggcggcggag gctctggcgg 240 aggcggatct ggtggcggag gatctgcggc ccagccggcc atggcccagg tgcagctgca 300 ggtcgacctc gagtggaggc ggcggatctg gcggtggcgg ctccggcggt ggaggcagtg 360 cacaggtcca actgcaggag ctcgatatca aacgggcggc cgcagagcag aagctgatct 420 ctgaggaaga tctgcgaacc ggccaccacc accaccacca ctaacctagg 470 <210> 5 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 5 ggcccagccg gccgaggtgc agctggtcga gtctggcggc ggactggtgc agcccggtgg 60 ctctctgcga ctgtcttgtg ccgcctctgg cttcaacatc aaggacacct acatccactg 120 ggtgcgacag gctcccggaa agggcctgga gtgggtggcc cgaatctacc ccaccaacgg 180 ctacacccga tacgccgact ctgtgaaggg ccgattcacc atctctgccg acacctctaa 240 gaacaccgcc tacctgcaga tgaactctct gcgagccgag gacaccgctg tgtactactg 300 ttctcgatgg ggaggcgacg gcttctacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt 360 gaccgtgtcc tctggcggag gcggctccgg cggaggcgga tctggtggcg gaggctctga 420 catccagatg acccagtctc cctcttctct gtctgcctct gtgggcgacc gagtgaccat 480 cacctgtcga gcctctcagg acgtgaacac cgccgtggcc tggtatcagc agaagcccgg 540 caaggccccc aagctgctga tctactctgc ctctttcctg tactctggcg tgccctctcg 600 attctctggc tctcgatctg gcaccgactt caccctgacc atctcttctc tgcagcctga 660 ggatttcgcc acctactact gtcagcagca ctacaccacc ccccccacct tcggccaggg 720 aaccaaggtg gagatcaagg cggccgc 747 <210> 6 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 6 ggcccagccg gccgacgtga agctggacga gactggagga ggcctggtgc agcccggacg 60 acccatgaag ctgtcttgtg tggcctctgg cttcaccttc tctgactact ggatgaactg 120 ggtgcgacag tctcccgaga agggcctgga gtgggtggcc cagatccgaa acaagcccta 180 caactacgag acctactact ctgactctgt gaagggccga ttcaccatgt cccgagatga 240 ctctaagtcc tctgtgtacc tgcagatgaa caacctgcga gtggaggaca tgggcatcta 300 ctactgtacc ggctcttact acggcatgga ctactggggc cagggcacct ctgtgaccgt 360 gtcctctggc ggcggaggct ctggcggagg cggatctggt ggcggaggat ctgacgtggt 420 gatgacccag acccccctgt ctctgcccgt gtctctgggc gaccaggcct ctatctcttg 480 tcgatcttct cagtctctgg tccactctaa cggcaacacc tacctgcgat ggtatctgca 540 gaagcccggc cagtctccca aggtgctgat ctacaaggtg tctaaccgat tctctggcgt 600 gcccgaccga ttctccggct ctggctctgg caccgacttc accctgaaga tctcccgagt 660 ggaggccgag gacctgggcg tgtacttctg ttctcagtct acccacgtgc cctggacctt 720 cggcggaggc accaagctgg agatcaaggc ggccgc 756 <210> 7 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 7 ggcccagccg gcccaggtgc agctgcagga atctggcccc ggactggtgg ccccctctca 60 gtctctgtct atcacctgta ccgtgtctgg cttctctctg accggctacg gcgtgaactg 120 ggtgcgacag ccccctggca agggcctgga gtggctgggc atgatctggg gcgacggcaa 180 caccgactac aactctgccc tgaagtctcg actgtctatc tctaaggaca actctaagtc 240 tcaggtgttc ctcaagatga actctctcca caccgacgac accgcccgat actactgtgc 300 ccgagagcga gactaccgac tggactactg gggccagggc accaccgtga ccgtgtcctc 360 tggcggtgga ggctctggcg gaggcggatc tggtggcgga ggatctgaca tcgagctgac 420 ccagtctccc gcctctctgt ctgcctctgt gggcgagacc gtgaccatca cctgtcgagc 480 ctctggcaac atccacaact acctggcctg gtatcagcag aagcagggca agtctcccca 540 gctgctggtg tactacacca ccaccctggc cgacggcgtg ccctctcgat tctctggctc 600 tggatctggc acccagtact ccctgaagat caactccctg cagcccgagg acttcggctc 660 ttactactgt cagcacttct ggtctacccc ccgaaccttc ggcggaggca ccaagctgga 720 gatcaagcga gcggccgc 738 <210> 8 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 8 ggcccagccg gcccaggtgc agctgcagga atctggcccc ggactggtgg ccccctctca 60 gtctctgtct atcacctgta ccgtgtctgg cttctctctg accggctacg gcgtgaactg 120 ggtgcgacag ctgcctggca agggcctgga gtggctgggc atgatctggg gcgacggcaa 180 caccgcctac aactctgccc tgaagtctcg actgtctatc tctaaggaca actctaagtc 240 tcaggtgttc ctcaagatgg actctctcca caccgacgac accgcccgat actactgtgc 300 ccgagagcga gactaccgac tggactactg gggccagggc accaccgtga ccgtgtcctc 360 tggcggtgga ggctctggcg gaggcggatc tggtggcgga ggatctgaca tcaagctgac 420 ccagtctccc gcctctctgt ctgcctctgt gggcgagacc gtgaccatca cctgtcgagc 480 ctctggcaac acccacaact acctggcctg gtatcagcag aagcagggca agtctcccca 540 gctgctggtg tactacacca ccaccctggc cgacggcgtg ccctctcgat tctctggctc 600 tggatctggc acccagtact ccctgaagat caactccctg cagcccgagg acttcggctc 660 ttactactgt cagcacttct ggtctacccc ccgatctttc ggcggaggca ccaagctgga 720 gatcaagcga gcggccgc 738 <210> 9 <211> 675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 9 ggcccagccg gccgacgtga agctggacga gactggagga ggcctggtgc agcccggacg 60 acccatgaag ctgtcttgtg tggcctctgg cttcaccttc tctgactact ggatgaactg 120 ggtgcgacag tctcccgaga agggcctgga gtgggtggcc cagatccgaa acaagcccta 180 caactacgag acctactact ctgactctgt gaagggccga ttcaccatgt cccgagatga 240 ctctaagtcc tctgtgtacc tgcagatgaa caacctgcga gtggaggaca tgggcatcta 300 ctactgtacc ggctcttact acggcatgga ctactggggc cagggcacct ctgtgaccgt 360 gtcctctgct agcaccaagg gaccttctgt gtttcctctg gccccctctt ctaagtctac 420 ctctggtgga actgctgctc tgggatgtct ggtgaaggac tactttcctg agcctgtgac 480 tgtgtcttgg aactctggcg ctctgacttc tggtgttcac accttccctg ctgttctgca 540 gtcctctgga ctgtactctc tctcttctgt ggtgaccgtg ccttcttctt ctctgggaac 600 ccagacctac atctgtaacg tgaaccacaa gccctctaac actaaggtgg acaagcgagt 660 ggagcctgcg gccgc 675 <210> 10 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 10 ggcccagccg gccgacgtgg tgatgaccca gacccccctg tctctgcccg tgtctctggg 60 cgaccaggcc tctatctctt gtcgatcttc tcagtctctg gtccactcta acggcaacac 120 ctacctgcga tggtatctgc agaagcccgg ccagtctccc aaggtgctga tctacaaggt 180 gtctaaccga ttctctggcg tgcccgaccg attctccggc tctggctctg gcaccgactt 240 caccctgaag atctcccgag tggaggccga ggacctgggc gtgtacttct gttctcagtc 300 tacccacgtg ccctggacct tcggcggagg caccaagctg gagatcaagc gtacggtggc 360 tgctccttct gtgttcattt tccccccctc tgacgagcag ctgaagtctg gaactgcttc 420 tgttgtgtgc ctgctgaaca acttttaccc ccgagaggct aaggttcagt ggaaggtgga 480 caacgctctg cagtctggaa actctcagga gtctgttact gagcaggact ctaaggactc 540 gacctactct ctctcttcta ccctgaccct gtctaaggct gactacgaga agcataaggt 600 gtacgcttgt gaggttaccc atcagggact gtcctctccc gtgaccaagt cttttaaccg 660 aggcgagtgc gcggccgc 678 <210> 11 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 11 ggcccagccg gccgaggtgc agctggtcga gtctggcggc ggactggtgc agcccggtgg 60 ctctctgcga ctgtcttgtg ccgcctctgg cttcaacatc aaggacacct acatccactg 120 ggtgcgacag gctcccggaa agggcctgga gtgggtggcc cgaatctacc ccaccaacgg 180 ctacacccga tacgccgact ctgtgaaggg ccgattcacc atctctgccg acacctctaa 240 gaacaccgcc tacctgcaga tgaactctct gcgagccgag gacaccgctg tgtactactg 300 ttctcgatgg ggaggcgacg gcttctacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt 360 gaccgtgtcc tctgctagca ccaagggacc ttctgtgttt cctctggccc cctcttctaa 420 gtctacctct ggtggaactg ctgctctggg atgtctggtg aaggactact ttcctgagcc 480 tgtgactgtg tcttggaact ctggcgctct gacttctggt gttcacacct tccctgctgt 540 tctgcagtcc tctggactgt actctctctc ttctgtggtg accgtgcctt cttcttctct 600 gggaacccag acctacatct gtaacgtgaa ccacaagccc tctaacacta aggtggacaa 660 gcgagtggag cctgcggccg c 681 <210> 12 <211> 655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia lipolytica codon optimized sequence <400> 12 ggcccagccg gccgacatcc agatgaccca gtctccctct tctctgtctg cctctgtggg 60 cgaccgagtg accatcacct gtcgagcctc tcaggacgtg aacaccgccg tggcctggta 120 tcagcagaag cccggcaagg cccccaagct gctgatctac tctgcctctt tcctgtactc 180 tggcgtgccc tctcgattct ctggctctcg atctggcacc gacttcaccc tgaccatctc 240 ttctctgcag cctgaggatt tcgccaccta ctactgtcag cagcactaca ccaccccccc 300 caccttcggc cagggaacca aggtggagat caagcgtacg gtggctgctc cttctgtgtt 360 cattttcccc ccctctgacg agcagctgaa gtctggaact gcttctgttg tgtgcctgct 420 gaacaacttt tacccccgag aggctaaggt tcagtggaag gtggacaacg ctctgcagtc 480 tggaaactct caggagtctg ttactgagca ggactctaag gactcgacct actctctctc 540 ttctaccctg accctgtcta aggctgacta cgagaagcat aaggtgtacg cttgtgaggt 600 tacccatcag ggactgtcct ctcccgtgac caagtctttt aaccgaggcg agtgc 655 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope tag <400> 13 Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 14 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 15 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10

Claims (74)

  1. 항체 폴리펩티드(antibody polypeptide) 또는 항체 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 제2 핵산 배열에 프레임 내에 융합된 앵커 폴리펩티드(anchor polypeptide)를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 제1 핵산 배열을 포함하는 융합 배열(fusion sequence)에 작동 가능하게 연결되는 프로모터(promotor)를 구비하는 발현 카세트(expression cassette).
  2. 앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 앵커 뉴클레오티드 배열을 구비하는 제1 핵산 배열에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함하며, 상기 제1 핵산 배열이 제2 핵산 배열에 의해 인코딩되는 대상의 제2 융합 파트너(fusion partner)를 포함하는 융합 폴리펩티드 내의 제1 융합 파트너로서 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 대상의 제2 융합 파트너를 인코딩하는 제2 핵산 배열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  4. 제 3 항에 있어서, 제한 부위(restriction site)의 전부 또는 일부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 대상의 제2 융합 파트너는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  6. 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드 단편은 scFv 단편인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  7. 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드 단편은 Fab 단편의 중쇄(heavy chain)인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드 단편은 Fab 단편의 경쇄(light chain)인 것을 특징으로 하는 발현 카세트 벡터.
  9. 제 1 항 또는 제 3 항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 배열은 상기 제2 핵산 배열에 대해 융합된 3'로서, 상기 융합 배열로부터 생성된 융합 폴리펩티드가 N-말단 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편 및 C-말단 앵커 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 배열은 상기 제2 핵산 배열에 대해 융합된 5'로서, 상기 융합 배열로부터 생성된 융합 폴리펩티드가 N-말단 앵커 폴리펩티드 및 C-말단 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 지속적(constitutive)인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  12. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성(inducible)인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 프로모터는 POX2 또는 LIP2 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 반지속성(semi-constitutive)인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 프로모터는 hp4d 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 리더 폴리펩티드(leader polypeptide)를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 리더 핵산 배열을 더 포함하며, 상기 리더 핵산 배열은 상기 제1 및 제2 핵산 배열들에 대해 5' 프레임 내에 융합되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 리더 폴리펩티드는 LIP2 pre, LIP2 prepro, XPR2 pre 및 XPR2 prepro로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 폴리펩티드(linker polypeptide)를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 링커 핵산 배열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 링커 핵산 배열은 상기 제1 및 상기 제2 핵산 배열들 사이의 프레임 내에 융합되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드는 scFv 항체 폴리펩티드를 포함하고, 상기 링커 핵산 배열은 가변 영역을 인코딩하는 중쇄 핵산 배열과 상기 scFv 폴리펩티드의 가변 영역을 인코딩하는 경쇄 핵산 배열 사이의 프레임 내에 융합되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 폴리펩티드는 (Gly4Ser)3(SEQ ID NO:14) 또는 (GlySer)5(SEQ ID NO:15)를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 에피토프 태그들(epitope tags)을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 하나 또는 그 이상의 핵산 배열들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 에피토프 태그들은 c-Myc, V5, 헥사히스티딘(hexahistidine), 글루타티온-S-트랜스페라제(glutathione-S-transferase), 스트렙타비딘(streptavidin), 바이오틴(biotin), 헤마글루티닌(hemagglutinin), Flag-태그 및 E-태그로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 폴리펩티드는Ang1p 폴리펩티드 또는 그 단편, Aga2p 폴리펩티드 또는 그 단편 및 Sag1p 폴리펩티드 또는 그 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드 또는 상기 항체 폴리펩티드 단편, 상기 앵커 폴리펩티드 또는 모두는 야로이야(Yarrowia) 세포 내의 발현을 위해 코돈(codon) 최적화되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 구비하는 것을 특징으로 하는 벡터(vector).
  27. 제 26 항에 있어서, 제타 요소(zeta element)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 제타 요소는 역전위인자(retrotransposon)의 긴 말단 반복 순서인 특징으로 하는 벡터.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 제타 요소는 Ylt1 또는 Tyl6 역전위인자의 긴 말단 반복 순서인 것을 특징으로 하는 벡터.
  30. 제 26 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 상염색체 복제 요소들(autosomal replication elements)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  31. 제 30 항에 있어서, 적어도 하나의 상염색체 복제 요소가 동원체(CEN) 및 복제 개시점(ORI)을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 동원체는 CEN1 또는 CEN3이며, 상기 복제 개시점은 ORI1068 또는 ORI3018인 것을 특징으로 하는 벡터.
  33. 제 26 항에 있어서, 복제 기점 염기 순서(ARS)를 더 포함하며, 상기 복제 기점 염기 순서는 동원체 및 복제 개시점을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 복제 기점 염기 순서는 ARS18을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  35. 제 33 항에 있어서, 상기 복제 기점 염기 순서는 ARS68을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  36. 제 26 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 선택 가능한 마커들(markers)을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 하나 또는 그 이상의 핵산 배열들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  37. 제 30 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 선택 가능한 마커들은 LEU2, URA3d1, ADE2, Lys, Arg, Gut, Trp, G3p 및 hph로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  38. 야로이야(Yarrowia) 세포의 표면상에 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 디스플레이하는 방법에 있어서,
    앵커 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴크레오티드 배열을 구비하는 제2 핵산 배열에 대해 프레임에 융합된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 구비하는 제1 핵산 배열을 포함하는 융합 배열에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함하는 제1 벡터를 제1 야로이야(Yarrowia) 세포 내로 도입하는 단계; 및
    야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들 하에서 시간 동안 상기 제1 야로이야(Yarrowia) 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 제1 벡터는 제 20 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드 단편은 scFv 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드 단편은 Fab 단편의 중쇄인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, Fab 단편의 경쇄를 인코딩하는 핵산 배열에 동작 가능하게 연결되는 제2 프로모터를 구비하는 제2 벡터를 상기 제1 야로이야(Yarrowia) 세포 내로 도입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드 단편은 Fab 단편의 경쇄인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, Fab 단편의 중쇄를 인코딩하는 핵산 배열에 동작 가능하게 연결되는 제2 프로모터를 구비하는 제2 벡터를 상기 제1 야로이야(Yarrowia) 세포 내로 도입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 42 항 또는 제 44 항에 있어서, 상기 제1 야로이야(Yarrowia) 세포는 반수체(haploid)이고, 상기 제2 벡터를 도입하는 단계는 상기 제1 벡터를 포함하는 상기 제1 반수체의 야로이야(Yarrowia) 세포를 상기 제2 벡터를 포함하는 제2 반수체의 야로이야(Yarrowia) 세포와 교배시키는(mating) 단계를 더 포함하며,
    상기 제1 및 제2 야로이야(Yarrowia) 세포들은 반대되는 교배 타입들인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 38 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 배열이 상기 제2 핵산 배열에 대해 5' 융합되어, 상기 융합 배열로부터 생성되는 융합 폴리펩티드가 N-말단 항체 폴리펩티드 또는 그 항체 폴리펩티드 단편 및 C-말단 앵커 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 38 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 배열이 상기 제2 핵산 배열에 대해 3' 융합되어, 상기 융합 배열로부터 생성되는 융합 폴리펩티드가 N-말단 앵커 폴리펩티드 및 C-말단 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 38 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 낮은 유도 온도(induction temperature)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 낮은 유도 온도는 섭씨 약 15도 내지 섭씨 약 25도 사이의 온도를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 낮은 유도 온도는 섭씨 약 20도의 온도를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 38 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 짧은 유도 시간(induction time)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 짧은 유도 시간은 약 24 시간 또는 그 이하를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 짧은 유도 시간은 약 16 시간 또는 그 이하를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 짧은 유도 시간은 약 16 시간을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 38 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 낮은 pH를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 낮은 pH는 약 2 내지 약 4 사이의 pH를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 낮은 pH는 약 3의 pH를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 38 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 높은 통기(aeration) 조건들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 높은 통기 조건들은 쉐이크 플라스크(shake flask) 내에서의 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 38 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들은 상기 제1 야로이야(Yarrowia) 세포의 최소 배지(minimal medium) 내에서의 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 최소 배지는 효모 추출물, 박토펩톤(bactopeptone) 또는 이들 모두가 결핍된 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 38 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터는 야로이야(Yarrowia) 게놈(genome) 내에 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 38 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야로이야(Yarrowia) 세포는 샤프론(chaperone)을 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 샤프론은 단백질 2황화물 이성질화 효소(protein disulfide isomerase), Kar2/Bip 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 38 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 폴리펩티드는 Aga1p 폴리펩티드 또는 그 단편 및 Aga2p 폴리펩티드 또는 그 단편, 혹은 Sag1p 폴리펩티드 또는 그 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 38 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편.
  67. 타겟 폴리펩티드를 결합시키는 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 포함하는 야로이야(Yarrowia) 세포를 선별하는 방법에 있어서,
    항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 그 표면상에 디스플레이하는 친야로이야 세포(parent Yarrowia cell)를 제공하는 단계;
    상기 친야로이야 세포를 테스트 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
    상기 디스플레이된 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편이 상기 타겟 폴리펩티드를 결합시킬 경우에 상기 친야로이야 세포를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 친야로이야 세포는 제 38 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 67 항 또는 제 68 항에 있어서,
    상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편의 제1 발현 카세트를 상기 선별된 친야로이야 세포로부터 격리시키는 단계;
    변형된 발현 카세트를 발생시키도록 상기 항체 폴리펩티드 또는 항체 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열에 하나 또는 그 이상의 변형들을 도입하는 단계;
    변형된 야로이야(Yarrowia) 세포를 발생시키도록 상기 제1 발현 카세트가 결핍된 제2 야로이야(Yarrowia) 세포 내로 상기 변형된 발현 카세트를 도입하는 단계;
    야로이야(Yarrowia) 세포 작동 조건들 하에서 시간 동안 상기 변형된 야로이야(Yarrowia) 세포를 배양하는 단계;
    상기 변형된 야로이야 세포를 상기 타겟 폴리펩티드에 접촉시키는 단계; 및
    상기 친야로이야 세포 보다 큰 친화도 또는 결합 활성으로 상기 변형된 야로이야 세포가 상기 타겟 폴리펩티드를 결합시키는 경우에 상기 변형된 야로이야 세포를 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 구비하는 것을 특징으로 하는 키트(kit).
  71. 제 26 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 구비하는 것을 특징으로 하는 키트.
  72. 제 70 항 또는 제 71 항에 있어서, 야로이야(Yarrowia) 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  73. 제 70 항 또는 제 72 항에 있어서, 상기 발현 카세트의 사용을 위한 서면 지시를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  74. 제 71 항 또는 제 72 항에 있어서, 상기 벡터의 사용을 위한 서면 지시를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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