CN111996132A - 一种解脂耶氏酵母表面展示方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种解脂耶氏酵母细胞表面展示方法，涉及生物化工技术领域，以解脂耶氏酵母菌为底盘细胞，以pYCSD为载体，使用XPR2 pre分泌信号肽引导目的蛋白质向胞外分泌，使用解脂耶氏酵母内源的YlCWP1(110)作为细胞表面锚定信号，使用柔性连接肽(G4S)2连接目的基因和YlCWP1(110)，从而减少对目的蛋白表达和折叠的影响。将目的基因克隆到pYCSD的克隆位点，转化解脂耶氏酵母，实现目的蛋白在解脂耶氏酵母细胞的表面展示。

Description

一种解脂耶氏酵母表面展示方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种解脂耶氏酵母表面展示的方法及其应用。

背景技术

近年来，多肽、蛋白质递呈技术被广泛应用于生物化学、免疫学、蛋白质工程等生命科学领域，随之出现了一系列的表面展示技术，如：噬菌体、核糖体、酵母菌、杆状病毒等多种表面展示系统。酵母作为具有细胞壁的真核生物，具有真核细胞蛋白质折叠、mRNA加工、蛋白水解、糖基化和异构化等功能，是目前应用最广泛的表面展示宿主。酵母表面展示技术作为真核展示系统并随着该技术的不断完善，它已逐渐成为现代生命科学领域一种十分有效的展示技术，在蛋白质文库筛选、蛋白质定向进化、高亲和性抗体分选、抗原/抗体库构建、亲和力成熟、疫苗的生产、免疫生物催化和生物传感器等多个领域得到发展和应用。近几年来，酵母表面展示技术在微生物酶生产应用中也发挥越来越重要的作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种解脂耶氏酵母细胞表面展示的方法，从而实现以解脂耶氏酵母为底盘，对任意目的蛋白进行细胞表面展示。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种细胞表面展示的方法，所述表面展示方法以解脂耶氏酵母菌为底盘细胞，以pYCSD为载体，将目的蛋白展示在解脂耶氏酵母细胞表面。

可选的，所述解脂耶氏酵母菌为解脂耶氏酵母Po1f。

可选的，所述目的基因为任意需要在解脂耶氏酵母细胞表面展示的蛋白质的编码基因。

相比于现有的技术，本发明具有以下有益效果：本发明以解脂耶氏酵母为底盘细胞，使用XPR2 pre分泌信号肽引导目的蛋白质向胞外分泌，使用解脂耶氏酵母内源的YlCWP1(110)作为细胞表面锚定信号，使用柔性连接肽(G4S)2连接目的基因和YlCWP1(110)，从而减少对目的蛋白表达和折叠的影响。

在本发明实施例中，将增强绿色荧光蛋白的编码基因egfp插入表面展示的载体pYCSD的克隆位点，然后将载体导入解脂耶氏酵母细胞中，在30℃、200rpm条件下培养24小时，分别使用荧光倒置显微镜和酶标仪分析荧光信号，确定EGFP表面展示的效果。

附图说明

图1.解脂耶氏酵母细胞表面展示载体pYCSD的结构。

图2.荧光倒置显微镜分析解脂耶氏酵母表面展示的荧光信号分布。

图3.多功能酶标仪定量分析解脂耶氏酵母的荧光信号。

具体实施方法

本发明提供了一种解脂耶氏酵母细胞表面展示的方法，所述表面展示方法以解脂耶氏酵母菌为底盘细胞，以pYCSD为载体，使用XPR2 pre分泌信号肽引导目的蛋白质向胞外分泌，使用解脂耶氏酵母内源的YlCWP1(110)作为细胞表面锚定信号，使用柔性连接肽(G4S)2连接目的基因和YlCWP1(110)，从而减少对目的蛋白表达和折叠的影响。

本发明所述解脂耶氏酵母菌为解脂耶氏酵母Po1f，所述目的蛋白为任何需要在解脂耶氏酵母表面展示的蛋白质。

下面结合实施例对本发明提供的解脂耶氏酵母表面展示的方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明的保护范围的限定。

实施例1

原料：质粒pYLXP’和解脂耶氏酵母Po1f为商业化购买。

人工DNA片段intron-XPR2 pre-HindIII-(G4S)2linker-YlCWP1(110)由生工生物工程(上海)有限公司合成，并克隆至载体pUC57，人工序列的DNA序列见序列1。其中，intron为部分内含子，用于提高目的蛋白的表达效率；XPR2 pre为分泌信号肽，DNA序列见序列2，编码氨基酸序列见序列3；HindIII为限制性内切酶位点；(G4S)2 linker为连接肽，用于连接目的蛋白与细胞表面锚定信号YlCWP1(110)，DNA序列见序列4，编码的氨基酸序列见序列5；YlCWP1(110)为解脂耶氏酵母细胞表面锚定信号C端编码基因，DNA序列见序列6，编码的氨基酸序列见序列7。使用引物对pYCSD F/pYCSD R从获得的重组质粒上克隆出人工DNA片段，与SnaBI酶切的质粒pYLXP’进行一步克隆，得到解脂耶氏酵母表面展示载体pYCSD。一步克隆使用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒。表面展示载体pYCSD的结构如图1所示。

表1 本专利所使用引物

1.下划线表示同源重叠序列，用于一步克隆。

实施例2

原料：质粒pYLXP’和pYCSD，增强绿色荧光蛋白基因egfp，解脂耶氏酵母Po1f为商业化购买。

以解脂耶氏酵母Po1f为底盘细胞，以增强型绿色荧光蛋白EGFP为探针，验证表面展示方法的可靠性。使用引物对pYLXP-EGFP F/pYLXP-EGFP R扩增egfp基因，并克隆至载体pYLXP’的SnaBI位点，得到重组质粒pYLXP-EGFP；使用引物对pYCSD-EGFP F/pYCSD-EGFP R扩增egfp基因，并克隆至载体pYCSD的HindIII位点，得到重组质粒pYCSD-EGFP。分别将质粒pYLXP’、pYLXP’-EGFP和pYCSD-EGFP导入解脂耶氏酵母细胞中。在30℃、200rpm条件下培养24小时，用荧光倒置显微镜观察酵母细胞的荧光信号。酵母细胞荧光检测显示如图2所示。结果表明，含有pYLXP’的空白对照组未观察到荧光信号，含有pYLXP’-EGFP的解脂耶氏酵母的荧光信号分布于细胞内，而含有pYCSD-EGFP的解脂耶氏酵母的荧光信号主要分布于细胞表面。该结果表明，所构建的解脂耶氏酵母表面展示方法能够有效的将目的基因展示到解脂耶氏酵母细胞表面。

实施例3

如实施例2，分别将含有质粒pYLXP’、pYLXP’-EGFP和pYCSD-EGFP的解脂耶氏酵母Po1f，在30℃、200rpm条件下培养24小时。分别使用多功能酶标仪分析荧光强度，分别设置激发光和发射光波长为488nm和510nm。结果如图3所示，含有pYLXP’的空白对照菌株只有较低的背景荧光信号，含有pYLXP’-EGFP和pYCSD-EGFP的解脂耶氏酵母则可检测到明显的荧光信号；同时分别含有pYLXP’-EGFP和pYCSD-EGFP的解脂耶氏酵母的荧光信号接近，该结果表明，表面展示载体pYCSD所融合表达的细胞表面锚定信号YlCWP1(110)对目的基因的表达和正确折叠等没有影响。

以上所述仅是本发明的可选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 一种解脂耶氏酵母表面展示方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

taaccgcaga agctcgctac cgcctttact attctcacgg ccgttctggc caagcttggt 60

ggtggtggtt ccggtggtgg tggttctggt aacggttacg ctgtcgatga caactccaag 120

tgtgaagacg atggtatccc attcggtgct tacgccgttg ctgacacttc tgctgaatcc 180

tctgctgctc cagcttcttc cgctgctgct gccgaatctt ctgccgcccc atcttctgct 240

gctgaagcta agccaactgc tggtggtaac actggtgctg ttgttactca aattggtgac 300

ggtcaaatcc aagctcctcc atccgctcca ccagccgctc cagaacaagc taacggtgcc 360

gtctccgttg gtgtctctgc tgccgctttg ggtgttgccg ctgctgcttt gttgatttga 420

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

aagctcgcta ccgcctttac tattctcacg gccgttctgg cc 42

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

Lys Leu Ala Thr Ala Phe Thr Ile Leu Thr Ala Val Leu Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

ggtggtggtg gttccggtgg tggtggttct 30

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

ggtaacggtt acgctgtcga tgacaactcc aagtgtgaag acgatggtat cccattcggt 60

gcttacgccg ttgctgacac ttctgctgaa tcctctgctg ctccagcttc ttccgctgct 120

gctgccgaat cttctgccgc cccatcttct gctgctgaag ctaagccaac tgctggtggt 180

aacactggtg ctgttgttac tcaaattggt gacggtcaaa tccaagctcc tccatccgct 240

ccaccagccg ctccagaaca agctaacggt gccgtctccg ttggtgtctc tgctgccgct 300

ttgggtgttg ccgctgctgc tttgttgatt tga 333

<210> 7

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

Gly Asn Gly Tyr Ala Val Asp Asp Asn Ser Lys Cys Glu Asp Asp Gly

1 5 10 15

Ile Pro Phe Gly Ala Tyr Ala Val Ala Asp Thr Ser Ala Glu Ser Ser

20 25 30

Ala Ala Pro Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ala Glu Ser Ser Ala Ala Pro

35 40 45

Ser Ser Ala Ala Glu Ala Lys Pro Thr Ala Gly Gly Asn Thr Gly Ala

50 55 60

Val Val Thr Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln Ala Pro Pro Ser Ala

65 70 75 80

Pro Pro Ala Ala Pro Glu Gln Ala Asn Gly Ala Val Ser Val Gly Val

85 90 95

Ser Ala Ala Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ile

100 105 110

Claims (8)

1.一种解脂耶氏酵母表面展示方法，其特征在于，所述表面展示方法以解脂耶氏酵母菌为底盘细胞，以pYCSD为表面展示载体，将目的蛋白展示在解脂耶氏酵母细胞表面。

2.根据权利要求1所述的表面展示方法，其特征在于，所述目的基因为任何需要进行表面展示的蛋白的编码基因。

3.根据权利要求1所述的表面展示载体pYCSD，其特征在于使用XPR2 pre分泌信号肽引导蛋白质向胞外分泌。

4.根据权利要求1所述的表面展示载体pYCSD，其特征在于使用解脂耶氏酵母的糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)-细胞壁蛋白的C端110个氨基酸(YlCWP1(110)，编码基因为YlCWP1(110))作为细胞表面锚定信号。

5.根据权利要求1所述的表面展示载体pYCSD，其特征在于使用(G4S)2连接肽，连接目的蛋白和细胞表面锚定信号YlCWP1(110)。

6.根据权利要求1所述的表面展示载体pYCSD，其特征在于使用TEF启动子和XPR2终止子控制细胞表面展示元件的表达。

7.根据权利要求1所述的表面展示载体pYCSD，其特征在于使用HindIII作为克隆位点，通过同源重组将目的基因克隆至XPR2 pre分泌信号肽和(G4S)2连接肽之间。

8.权利要求1-7任一项所述表面展示方法在促进解脂耶氏酵母表面展示中的应用。

Images