KR101272817B1 - 항체 생산 세포주 선별 방법 및 선별 키트 - Google Patents

항체 생산 세포주 선별 방법 및 선별 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분열 형광단백질(split fluorescent protein)을 이용하여 항체 생산 세포주를 선별하는 방법 및 항체 생산 세포주를 선별하기 위한 선별 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따라 항체 생산 세포주의 선별에 있어서 분열 형광단백질을 이용하면, 분열 형광단백질의 재결합에 의한 단일 형광색의 발현을 관찰하는 것만으로도 항체 생산 세포주를 용이하게 검출해낼 수 있으며, 따라서 고생산성 항체 생산 세포주의 선별 시간과 선별 비용을 획기적으로 절감할 수 있다.

Description

항체 생산 세포주 선별 방법 및 선별 키트 {Method for Selecting Antibody-producing Cells and Kit for Selecting the Same}
본 발명은 분열 형광단백질(split fluorescent protein)을 이용하여 항체 생산 세포주를 선별하는 방법 및 항체 생산 세포주를 선별하기 위한 선별 키트에 관한 것이다.
동물세포주를 이용한 치료용 항체 생산에 있어서 고생산성을 지닌 세포주의 선별은 중요한 단계 중 하나이다. 종래에 알려진 고생산성을 지닌 동물세포주의 선별 방법으로는 한계희석법(limiting dilution method), 겔미세방울 기법(gel microdrop technology) 및 자동화기기(automated machine) 이용법 등이 있다. 치료용 항체를 생산하는 동물세포주 선별에 있어서, 현재 한계희석법은 방법 자체의 단순함과 저비용으로 인하여 가장 널리 사용되고 있으나, 다른 방법에 비해 비효율적이며 고속탐색법(high throughput screening; HTS)에는 적합하지 않다. 이와는 반대로, 겔미세방울 기법과 자동화기기 이용법은 HTS에 있어서는 큰 장점을 지니고 있으나 방법 자체가 지닌 복잡성과 고비용 문제로 인해 대중적 이용에 문제점을 지니고 있다. 상세히 보면, 겔미세방울 기법은 숙련 과정이 요구되며 낮은 효율의 겔 형성 등에서 한계점을 보인다. 자동화기기 이용법은 상대적으로 높은 비용이 사용상의 큰 문제점이다.
따라서 간단하고 효율적이면서도 저비용으로 항체 고생산성 세포주를 선별할 수 있는 새로운 시스템의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 분열 형광단백질이 가진 재결합력을 이용하여 항체 생산 세포주를 용이하게 선별하는 방법 및 이를 위한 선별 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열과 항체의 중쇄(heavy chain)를 코딩하는 서열을 포함하는 제 1 발현벡터 및 상기 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열과 항체의 경쇄(light chain)를 코딩하는 서열을 포함하는 제 2 발현벡터를 세포에 트랜스펙션하는 단계; 및 형광단백질의 제 1 절편과 제 2 절편의 재결합에 의해 나타나는 형광을 확인하여 항체 생산 세포주를 선별하는 단계를 포함하는 항체 생산 세포주의 선별 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열과 항체의 중쇄(heavy chain)를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역을 포함하는 제 1 발현벡터; 및 상기 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열과 항체의 경쇄(light chain)를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역을 포함하는 제 2 발현벡터를 포함하는 항체 생산 세포주 선별 키트를 제공한다.
본 발명에 따라 항체 생산 세포주의 선별에 있어서 분열 형광단백질을 이용하면, 분열 형광단백질의 재결합에 의한 단일 형광색의 발현을 관찰하는 것만으로도 항체 생산 세포주를 용이하게 검출해낼 수 있으며, 따라서 고생산성 항체 생산 세포주의 선별 시간과 선별 비용을 획기적으로 절감할 수 있다.
도 1은 그린 형광단백질(GFP)의 N 말단 절편과 C 말단 절편이 각각 발현되어 형성된 재결합 GFP가 나타내는 그린 형광이 항체의 중쇄 및 경쇄구조의 동시 발현에 의한 항체 생성을 나타내는 표지자로써 이용이 가능하며 이를 이용해 항체 생산 동물세포주의 선별이 가능함을 보여주는 본 발명의 개략적 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따라 GFP의 N 말단 절편과 항체의 경쇄구조를 동시 발현하는 벡터인 pNGFP-Light과 GFP의 C 말단 절편과 항체의 중쇄구조를 동시 발현하는 벡터인 pCGFP-Heavy의 구조에 대한 모식도이다.
도 4a는 본 발명에 따라 발현벡터 pNGFP-Light과 pCGFP-Heavy의 동시발현을 통한 재결합 GFP의 형성을 공초점현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4b는 본 발명에 따라 발현벡터 pNGFP-Light과 pCGFP-Heavy의 동시발현을 통해 생성된 항체량을 효소면역검사법을 통해 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따라 발현벡터 pNGFP-Light과 pCGFP-Heavy를 동시발현하는 CHO 세포주(비분리풀)에서 GFP를 고발현하는 개별세포(상위 1%)를 유세포분리기로 분리하여 확립된 1차분리풀 및 2차분리풀의 GFP 발현 세포비율과 항체 비생산성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 확립된 30개의 개별 세포주에 대한 GFP 발현 정도와 항체 비생산성간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열과 항체의 중쇄(heavy chain)를 코딩하는 서열을 포함하는 제 1 발현벡터 및 상기 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열과 항체의 경쇄(light chain)를 코딩하는 서열을 포함하는 제 2 발현벡터를 세포에 트랜스펙션하는 단계; 및 형광단백질의 제 1 절편과 제 2 절편의 재결합에 의해 나타나는 형광을 확인하여 항체 생산 세포주를 선별하는 단계를 포함하는 항체 생산 세포주의 선별 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 형광단백질은 예를 들어 그린 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 레드 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 블루 형광 단백질(blue fluorescent protein, BFP), 옐로우 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP) 또는 강화된 형광 단백질(enhanced fluorescent protein, EFP)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 빛의 자극에 의해 형광을 나타내는 형광단백질이면 어느 것이나 사용 가능하다.
본 발명에 따른 형광단백질 절편은 분열 형광단백질(split fluorescent protein)을 의미하는 것으로서, 분열 형광단백질이란 형광단백질이 다수의 절편으로 잘려져 형광을 낼 수 있는 능력을 소실하였다가, 상기 다수의 절편이 재결합(reassembly)되면 다시 형광을 낼 수 있는 능력을 회복하는 형광단백질의 절편을 말한다.
본 명세서에서 사용된 "재결합(reassembly)"이란 형광 발생 능력을 상실한 형광단백질 절편들이 서로 결합하여 형광 발생 능력이 회복된 형광단백질을 구성하도록 결합되는 것을 의미한다.
하기 실시예 1 및 2를 통하여 알 수 있듯이, 형광단백질의 대표적인 예인 그린 형광 단백질(GFP)의 형광단백질 절편을 이용하여 재결합된 형광단백질의 형광 발생 능력의 회복 여부를 실험한 결과, 형광 발생 능력이 상실된 형광단백질의 제 1 절편 및 제 2 절편을 각각 발현하는 두 벡터를 동일한 동물세포에 트랜스펙션하여 발현시킨 경우 상기 형광단백질 절편들이 재결합되면서 형광 발생 능력을 회복하는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열과 항체의 중쇄(heavy chain)를 코딩하는 서열을 포함하는 제 1 발현벡터와 상기 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열과 항체의 경쇄(light chain)를 코딩하는 서열을 포함하는 제 2 발현벡터는, 각각 형광단백질의 제 1 절편과 항체의 중쇄를 동시에 발현시키고 형광단백질의 제 2 절편과 항체의 경쇄를 동시에 발현시키므로, 한 벡터 내에서 형광단백질의 각 절편과 항체의 중쇄 또는 연쇄의 발현량 사이에는 상관관계가 있다. 따라서 상기 제 1 발현벡터와 제 2 발현벡터를 동일한 세포에 함께 트랜스펙션시키면, 항체의 중쇄와 경쇄가 결합하여 항체 단백질을 형성하는 비율과 형광단백질의 제 1 절편과 제 2 절편이 재결합하여 형광을 나타내는 비율이 비례하므로, 재결합 형광단백질이 나타내는 형광량은 항체 생성량을 나타내는 표지자로서 이용이 가능하다. 즉, 형광단백질의 제 1 절편과 제 2 절편의 재결합에 의해 나타나는 형광량을 확인함으로써, 형광량이 많은 고생산성 항체 생산 세포주를 용이하게 선별해낼 수 있다. 이 때 세포주의 선별은 당업계에 공지된 어떠한 방법을 사용하여도 무방하며, 예를 들면 유세포분리기(fluorescence activated cell sorting; FACS)를 이용할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 형광단백질의 제 1 절편 및 제 2 절편 중 어느 하나는 형광단백질의 C 말단 절편이고, 나머지 하나는 형광단백질의 N 말단 절편일 수 있다. 즉, 상기 형광단백질의 제 1 절편이 형광단백질의 C 말단 절편이면 형광단백질의 제 2 절편은 형광단백질의 N 말단 절편이고, 형광단백질의 제 1 절편이 형광단백질의 N 말달 절편이면 형광단백질의 제 2 절편은 형광단백질의 C 말단 절편이다.
또한 형광단백질의 제 1 절편 및 제 2 절편을 생성하기 위한 전장(full length) 형광단백질 내의 절단 부위는, 형광단백질의 어느 한 절편 내에 형광발색단(fluorophore)이 보존되어 있어서 각 절편의 재결합에 의해 형광 발생 능력을 회복할 수만 있다면 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있으며, 전장 형광단백질 서열 내에서 일부 서열이 삽입 또는 결실된 것일 수도 있다. 예를 들어 형광단백질로 그린 형광단백질(GFP)를 사용하는 경우, GFP의 제 1 절편 및 제 2 절편을 생성하기 위한 절단 부위는 전장 GFP의 157 및 158 아미노산 잔기 사이일 수 있으나(미국특허 제6,780,599호 참조), 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 제 1 형광단백질 절편을 코딩하는 서열로서 서열번호 5의 서열을 사용하였으며, 제 2 형광단백질 절편을 코딩하는 서열로서 서열번호 11의 서열을 사용하였다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 제 1 발현벡터는 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열에 연결된 제 1 링커 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하며, 상기 제 2 발현벡터는 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열에 연결된 제 2 링커 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하고, 이 때 상기 제 1 링커 펩타이드와 제 2 링커 펩타이드는 상호 결합할 수 있도록 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, "발현벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 외부 DNA 서열을 포함하는 DNA 작제물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 발현벡터는 재조합 펩타이드 또는 단백질을 발현시키기 위한 벡터이다. 또한, 본 발명의 발현벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 재조합 발현벡터는 예컨대, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등일 수 있다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 마커 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 본 발명에 이용되는 발현벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
본 발명에 따른 제 1 발현벡터에서 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열; 상기 서열에 연결된 제 1 링커 펩타이드를 코딩하는 서열; 및 항체의 중쇄(heavy chain)를 코딩하는 서열은 작동 가능하게 연결되어 있으며, 상기 제 2 발현벡터에서 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열; 상기 서열에 연결된 제 2 링커 펩타이드를 코딩하는 서열; 및 항체의 경쇄(light chain)를 코딩하는 서열도 작동 가능하게 연결되어 있다.
"작동 가능하게 연결"되어 있다는 것은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열(예컨대, 형광단백질 절편을 코딩하는 서열)사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역 과정을 조절하게 된다.
상기 제 1 링커 펩타이드와 제 2 링커 펩타이드는 상호 결합할 수 있도록 구성된다. 제 1 링커 펩타이드와 제 2 링커 펩타이드를 코딩하는 서열은 각각 형광단백질의 제 1 절편과 제 2 절편을 코딩하는 서열에 직접 결합되어 있어서, 단백질 발현시 제 1 링커 펩타이드와 형광단백질의 제 1 절편 및 제 2 링커 펩타이드와 형광단백질의 제 2 절편은 각각 융합단백질 형태로 발현된다. 따라서 제 1 링커 펩타이드와 제 2 링커 펩타이드가 상호 결합하면. 형광단백질의 제 1 절편과 제 2 절편이 서로 근접하여 재결합되면서 형광을 나타내는 성질을 회복하게 된다. 상기 링커 펩타이드는 예를 들어 미국특허 제 6,780,599호에 나타난 바와 같이 류신 지퍼(leucine zipper)일 수 있으며, Chen, N. et al. J. Biotechnol., 2009, 142, 205-213 및 Lindman, S. et al. Protein Sci., 2009, 18, 1221-1229 에 나타난 바와 같이 EF1/EF2 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 제 1 링커 펩타이드 서열로서 EF1 서열을 사용하였으며, 제 2 링커 펩타이드 서열로서 EF2 서열을 사용하였다.
본 발명에 따라 한 벡터 내에서 형광단백질 절편과 항체의 중쇄 또는 경쇄를 동시에 발현시키기 위한 벡터의 구성은 당업자에 의해 적절하게 구현될 수 있으며, 예를 들면 바이시스트로닉(bicistronic) 방식의 발현벡터를 이용할 수 있고, pIRES 발현벡터 내부의 내부 리보솜 도입 사이트(internal ribosome entry sites, IRES)를 이용할 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 제 1 발현벡터의 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열과 항체의 중쇄 서열이 도입되는 도입 영역 사이; 및 제 2 발현벡터의 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열과 항체의 경쇄 서열이 도입되는 도입 영역 사이에 IRES(internal ribosome entry site) 서열을 추가로 포함 할 수 있다. IRES를 이용하는 경우, 각 벡터 내에서 형광단백질 절편과 항체의 중쇄 또는 경쇄의 발현 비율을 상이하게 조절할 수 있어서 유리하다.
본 발명에서 이용 가능한 항체 생산 세포주는 일반적으로 동물 세포주이나 특별히 이에 한정되는 것은 아니며, 대장균, 효모 또는 식물 세포주일 수 있다. 또한 세포주가 동물 세포주인 경우, 상기 동물 세포는 예를 들어 HEK293, COS7, HeLa, CHO 세포 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항체 생산 세포주의 선별 방법은 전술한 방법에 의해 선별한 항체 생산 세포주의 항체 생성 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 단계는 형광단백질의 제 1 절편과 제 2 절편의 재결합에 의한 형광 발생량과 항체의 중쇄와 경쇄의 결합에 의한 항체 생성량 사이의 상관관계를 검증하기 위한 추가적인 단계로서, 형광 발생량을 기준으로 1차적으로 선별한 항체 생산 세포주의 실제 항체 생산 능력을 2차적으로 검증함으로써 항체 생산 세포주를 정확하게 선별해낼 수 있다. 항체 생산 세포주의 항체 생성 여부를 확인하는 방법은 당업계에 공지된 어떠한 방법을 사용하여도 무방하며, 예를 들면 효소면역검사법을 통해 확인할 수 있다.
또한 본 발명은 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열과 항체의 중쇄(heavy chain)를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역을 포함하는 제 1 발현벡터; 및 상기 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열과 항체의 경쇄(light chain)를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역을 포함하는 제 2 발현벡터를 포함하는 항체 생산 세포주 선별 키트를 제공한다.
상기 제 1 발현벡터에서 "항체의 중쇄를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역" 또는 제 2 발현벡터에서 "항체의 경쇄를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역"이란, 각각 생산하고자 하는 목적 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 영역을 의미한다. 또는 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않는 경우에는 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 벡터와 외래 DNA 절편이 용이하게 라이게이션(ligation)될 수 있는 구조로 이루어진 영역을 의미한다. 이러한 외래 DNA 절편이 도입될 수 있는 도입 영역의 구체적인 구성은 당업자에 의하여 적절하게 구축될 수 있다.
항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역을 각각 포함하는 제 1 발현벡터 및 제 2 발현벡터를 포함하는 본 발명의 항체 세포주 선별 키트를 이용하면, 원하는 목적 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 서열을 상기 도입 영역에 각각 도입함으로써 목적 항체를 생산하는 세포주를 선별하기 위한 발현벡터를 쉽고 빠르게 제조함으로써 목적 항체를 생산하는 세포주를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 생산 세포주 선별 키트는 상기 제 1 발현벡터 및 제 2 발현벡터 외에도 상기 발현벡터에 목적 항체 유전자를 삽입시키기 위한 제한효소, 프라이머 등과 제조된 발현벡터를 세포에 도입시키기 위한 트랜스펙션 제제, 모세포주 등을 비롯하여 항체 생산 세포주의 선별에 필요한 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 형광단백질은 그린 형광단백질(GFP), 레드 형광단백질(RFP), 블루 형광단백질(BFP), 옐로우 형광단백질(YFP), 시안 형광단백질(CFP; cyan fluorescent protein) 또는 강화된 형광단백질(EFP)일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 형광단백질의 제 1 절편 및 제 2 절편 중 어느 하나는 형광단백질의 C 말단 절편이고, 나머지 하나는 형광단백질의 N 말단 절편일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 제 1 발현벡터는 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열에 연결된 제 1 링커 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하며, 상기 제 2 발현벡터는 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열에 연결된 제 2 링커 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하고, 이 때 상기 제 1 링커 펩타이드와 제 2 링커 펩타이드는 상호 결합할 수 있도록 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 제 1 발현벡터의 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열과 항체의 중쇄를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역 사이; 및 제 2 발현벡터의 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열과 항체의 경쇄를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역 사이에 IRES(internal ribosome entry site) 서열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 구체예들에 따른 선별 키트에 있어서, 상기 선별 키트에 포함되는 제 1 발현벡터 및 제 2 발현벡터의 특징은, 특정 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 대신에 임의의 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 서열이 도입될 수 있는 도입 영역을 포함한다는 점을 제외하고는, 앞서 항체 생산 세포주의 선별 방법에서 사용된 제 1 발현벡터 및 제 2 발현벡터의 특징을 모두 포함하며, 반복된 설명을 피하기 위하여 상세한 설명은 생략하도록 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 발현벡터 pcDNA - NGFP 와 pcDNA - CGFP 제조
그린 형광단백질(GFP)의 N 말단 절편과 C 말단 절편을 동물세포 내에서 발현하는 벡터를 제조하기 위해, 각 말단 절편의 형광단백질 부분은 pEGFP-C1(Clontech사)을 주형으로 사용하여 획득하였고 각 말단 절편의 연결 단백질은 (주)바이오니아사에서 DNA로 합성하였다. 그린 형광단백질의 N 말단 절편을 클로닝하기 위해, pEGFP-C1을 주형으로 F1 프라이머(서열번호 1)와 R1 프라이머(서열번호 2)를 이용하여 92 ℃에서 1분 30초, 55 ℃에서 1분 30초 그리고 72 ℃에서 2분의 조건으로 총 25회 PCR 반응을 실시하여 증폭했다. 증폭한 N 말단 절편 DNA를 Seq-1 DNA(서열번호 5)로 명명했다. EF1 서열과 제한효소 사이트로 이루어진 링커 펩타이드를 합성하기 위한 Seq-2 DNA(서열번호 6)에 해당하는 부분은 (주)바이오니아사에서 합성하였다. Seq-1 DNA와 Seq-2 DNA를 동량 넣고 두 DNA 결합체를 주형으로 F2 프라이머(서열번호 3)와 R2 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 92 ℃ 에서 1분 30초, 50 ℃에서 2분 그리고 72 ℃에서 2분의 조건으로 총 35회 PCR 반응을 실시하여 증폭했다. 제한효소 HindIII와 NotI으로 절단한 다음 동일한 효소로 절단한 발현벡터인 pcDNA3.1/Zeo 벡터(Invitrogen사)에 삽입하여, 이를 발현벡터 pcDNA-NGFP라 명명했다.
그린 형광단백질의 C 말단 절편을 클로닝하기 위해, pEGFP-C1을 주형으로 F3 프라이머(서열번호 7)와 R3 프라이머(서열번호 8)를 이용하여 92 ℃에서 1분 30초, 55 ℃에서 1분 30초, 그리고 72 ℃에서 2분의 조건으로 총 25회 PCR 반응을 실시하여 증폭했다. 증폭한 C 말단 절편 DNA를 Seq-3 DNA(서열번호 11)로 명명했다. EF2 서열과 제한효소 사이트로 이루어진 링커 펩타이드를 합성하기 위한 Seq-4 DNA(서열번호 12)에 해당하는 부분은 (주)바이오니아사에서 합성했다. Seq-3 DNA와 Seq-4 DNA를 동량 넣고 두 DNA 결합체를 주형으로 F4 프라이머(서열번호 9)와 R4 프라이머(서열번호 10)를 이용하여 92 ℃에서 1분 30초, 50 ℃에서 2분 그리고 72 ℃에서 2분의 조건으로 총 35회 PCR 반응을 실시하여 증폭했다. 제한효소 HindIII와 NotI으로 절단한 다음 동일한 효소로 절단한 발현벡터인 pcDNA3.1/Zeo 벡터에 삽입하여, 이를 발현벡터 pcDNA-CGFP라 명명했다.
서열 번호 서열 명칭 서열
1 F1 프라이머 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3'
2 R1 프라이머 5'-CTGCTTGTCGGCCATGAT-3'
3 F2 프라이머 5'-GCGAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3'
4 R2 프라이머 5'-GCGGCGGCCGCTCATGGACCCTTCAGCAAACTGGG-3'
5 Seq-1 DNA 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAG-3'
6 Seq-2 DNA 5'-CTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGGGTGGCTCTGGCTCTGGCTCGAGCAAGTCTCCAGAAGAACTGAAGGGCATTTTCGAAAAATATGCAGCCAAAGAAGGTGATCCAAACCAACTGTCCAAGGAGGAGCTGAAGCTACTGCTTCAGACGGAATTCCCCAGTTTGCTGAAGGGTCCATGA-3'
7 F3 프라이머 5'-AAGAACGGCATCAAGGTG-3'
8 R3 프라이머 5'-TCAGTACAGCTCGTCCAT-3'
9 F4 프라이머 5'-GCGAAGCTTGCCACCATGAGCACCCTCGATGAGCTTTTTGAAG-3'
10 R4 프라이머 5'-GCGGCGGCCGCTCAGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'
11 Seq-3 DNA 5'-AAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACTGA-3'
12 Seq-4 DNA 5'-AGCACCCTCGATGAGCTTTTTGAAGAACTAGACAAGAATGGAGATGGAGAAGTTAGTTTCGAAGAATTCCAGGTGTTGGTGAAAAAGATATCCCAGACGTCGGGTGGAAGCGGTAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACA-3'
실시예 2: 발현벡터 pcDNA - NGFP 와 pcDNA - CGFP 의 동시발현을 통한 재결합 형광단백질의 형성 및 공초점현미경을 통한 형광 관찰
실시예 1을 통해 제조된 그린 형광단백질의 N 말단 절편과 C 말단 절편을 각각 발현하는 벡터를 이용하여 세포 내에서 재결합 GFP를 형성해 형광을 유도하는지 여부를 확인하기 위해, pcDNA-NGFP와 pcDNA-CGFP를 HEK293 세포에 트랜스펙션했다. 10% FBS(Invitrogen사)와 4 mM 글루타민(Sigma사)을 추가로 첨가한 동물세포배지 DMEM(HyClone사)에서 HEK293 세포를 계대배양했다. HEK293 세포가 부착 가능한 커버스립을 12-웰 플레이트(Nunc사) 바닥에 부착시킨 뒤, HEK293 세포를 12시간 동안 배양했다. 다음으로 0.5 mg 벡터를 1.5 mL 트랜스펙션액(Stratagene사)을 이용하여 세포에 트랜스펙션했다. 대조군으로써, GFP를 발현하는 벡터인 pEGFP-C1과 pcDNA3.1/Zeo를 HEK293 세포에 트랙스펙션했다. 실험군으로써, 형광단백질의 N 말단 절편과 C 말단 절편을 발현하는 벡터인 pcDNA-NGFP와 pcDNA-CGFP를 각각 독립적으로 트랜스펙션했다. 마지막으로, pcDNA-NGFP와 pcDNA-CGFP를 섞어서 트랜스펙션했다. 트랜스펙션된 세포들은 30 ℃에서 24시간 동안 추가적으로 배양했다. 공초점현미경(confocal microcsopy)으로 재결합 GFP의 형광을 관찰하기 위해, 12-웰 플레이트에서 배양액을 제거했다. 바닥에 부착된 커버슬립 위의 트랜스펙션된 HEK293 세포들을 PBS 용액으로 1회 세척한 후, 2% 파라포름할데하이드(paraformaldehyde)가 포함된 PBS 용액으로 10분간 고정화했다. 고정된 세포를 PBS 용액으로 2회 세척한 후, 핵 염색이 가능한 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)가 포함된 마운팅(mounting) 용액을 처리했다. 최종적으로 트랜스펙션된 HEK293 세포가 부착된 커버스립을 공초점현미경(Zeiss사)을 이용하여 관찰했다.
그 결과, pcDNA-NGFP와 pcDNA-CGFP를 섞어서 트랜스펙션한 경우에 그린색의 GFP가 관찰되었음을 확인하였다.
실시예 3: 발현 벡터 pNGFP - Light 와 pCGFP - Heavy 의 제조
두가지 유전자가 동시발현되는 벡터인 pIRES(Clontech사)의 MCS(multi cloning site)-A 위치에 항체의 경쇄(light chain)구조를 삽입하기 위해, (주)파멥신사에서 제공받은 모델 항체의 경쇄구조에 해당하는 cDNA를 주형으로 F5 프라이머(서열번호 13)와 R5 프라이머(서열번호 14)를 이용하여 92 ℃에서 1분 30초, 55 ℃에서 1분 30초 그리고 72 ℃에서 1분의 조건으로 총 25회 PCR 반응을 실시하여 증폭했다. 증폭한 DNA를 제한효소 NheI과 MluI으로 절단한 다음 동일한 효소로 절단한 발현벡터인 pIRES에 삽입하여, 이를 발현벡터 pIRES-Light라 명명했다.
형광단백질의 N 말단 절편은 실시예 1에서 제조된 pcDNA-NGFP를 주형으로 F6 프라이머(서열번호 15)와 R6 프라이머(서열번호 16)를 이용하여 92 ℃에서 1분 30초, 55 ℃에서 1분 30초 그리고 72 ℃에서 1분의 조건으로 총 25회 PCR 반응을 실시하여 증폭했다. 증폭한 DNA를 제한효소 XbaI과 SalI으로 절단한 다음 동일한 효소로 절단한 발현벡터인 pIRES-Light의 MCS-B에 삽입하여, 이를 발현벡터 pNGFP-Light라 명명했다(도 3).
발현벡터인 pIRES의 MCS-A 위치에 항체의 중쇄(heavy chain)구조를 삽입하기 위해, (주)파멥신사에서 제공받은 모델 항체의 중쇄구조에 해당하는 cDNA를 주형으로 F7 프라이머(서열번호 17)와 R7 프라이머(서열번호 18)를 이용하여 92 ℃에서 1분 30초, 55 ℃에서 1분 30초 그리고 72 ℃에서 2분의 조건으로 총 25회 PCR 반응을 실시하여 증폭했다. 증폭한 DNA를 제한효소 EcoRI으로 절단한 다음 동일한 효소로 절단한 발현벡터인 pIRES에 삽입하여, 이를 발현벡터 pIRES-Heavy라 명명했다.
형광단백질의 C 말단 절편은 실시예 1에서 제조된 pcDNA-CGFP를 주형으로 F8 프라이머(서열번호 19)와 R8 프라이머(서열번호 20)를 이용하여 92 ℃에서 1분 30초, 55 ℃에서 1분 30초 그리고 72 ℃에서 1분의 조건으로 총 25회 PCR 반응을 실시하여 증폭했다. 증폭한 DNA를 제한효소 XbaI과 SalI으로 절단한 다음 동일한 효소로 절단한 발현벡터인 pIRES-Heavy의 MCS-B에 삽입하여, 이를 발현벡터 pCGFP-Heavy라 명명했다(도 3).
서열 번호 서열 명칭 서열
13 F5 프라이머 5'-CTAGCTAGCGCCACCATGGGATGGAGCTATATC-3'
14 R5 프라이머 5'-CGACGCGTCTAACACTCTCCCCTGTT-3'
15 F6 프라이머 5'-TGCTCTAGAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3'
16 R6 프라이머 5'-GCGTGTCGACTCATGGACCCTTCAGCAA-3'
17 F7 프라이머 5'-CCGGAATTCGCCACCATGGGATGGAGCTATATC-3'
18 R7 프라이머 5'-CCGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAG-3'
19 F8 프라이머 5'-TGCTCTAGAGCCACCATGAGCACCCTCGATGAG-3'
20 R8 프라이머 5'-GCGTGTCGACTCAGTACAGCTCGTCCAT-3'
실시예 4: 발현벡터인 pNGFP - Light 와 pCGFP - Heavy 의 동시 트랜스펙션 후의 형광 검증 및 항체 생성여부 확인
실시예 3을 통해 제조된 발현벡터 pNGFP-Light와 pCGFP-Heavy에서 각각 항체의 두 유닛인 중쇄구조와 경쇄구조, 형광단백질의 N 말단 절편과 C 말단 절편을 생성하는지 여부를 확인하기 위해, 발현벡터 pNGFP-Light와 pCGFP-Heavy를 동량으로 섞어서 HEK293 세포에 트랜스펙션했다. 10% FBS와 4 mM 글루타민을 추가로 첨가한 동물세포배지 DMEM에서 HEK293 세포를 계대배양했다. 실시예 3에 기술한 바와 같이 트랜스펙션한 후 효소면역검사법을 위하여 HEK293 세포 배양액을 원심분리(21,000×g, 20분, 4 ℃)하였고, 그 후 -80 ℃에서 보관했다. 트랜스펙션된 HEK293 세포가 부착된 커버스립은 실시예 2에서와 같이 고정화 단계를 거쳤으며, 공초점현미경으로 재결합 GFP의 형광을 관찰했다.
그 결과 도 4a에 나타낸 바와 같이, 발현벡터 pNGFP-Light와 pCGFP-Heavy를 섞어서 트랜스펙션한 경우에 그린색의 GFP가 관찰되었음을 확인했다.
상기에서 발현벡터 pNGFP-Light와 pCGFP-Heavy가 섞여 트랜스팩션된 HEK293 세포의 배양액에서 항체의 두 유닛인 중쇄구조와 경쇄구조가 항체를 형성하는지 여부를 확인하기 위해 항체에 대한 효소면역검사법을 수행했다. 염소 항-인간 IgG(goat anti-human IgG, Pierce사)를 2% 탈지유(skim milk, BD bioscience사)가 포함된 PBS 용액에 희석한 뒤 12시간 동안 4 ℃에서 96-웰 플레이트(Nunc사)에 코팅(coating)했다. PBS 용액을 이용하여 플레이트를 3회 세척한 후, 2% 탈지유가 포함된 PBS 용액으로 1시간 동안 상온에서 블로킹(bloking)했다. 0.05% 트윈20(Tween20)이 포함된 PBS 용액인 PBST 용액으로 3회 세척한 후, 배양액과 스탠다드 항체를 플레이트에 로딩하고 1시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 반응 후, 다시 PBST 용액으로 3회 세척한 후 알칼라인 포스파타아제가 결합된 염소 항-인간 IgG(Alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG, Pierce사)로 1시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. PBST 용액으로 3회 세척한 후, 최종적으로 TMB용액(BD bioscience사)을 기질로써 첨가했다. 황산을 이용하여 반응을 종료한 뒤, 다목적 플레이트 리더기(BioTek사)상에서 흡광도 450 nm에서 측정했다.
그 결과 도 4b에 나타낸 바와 같이, 발현벡터 pNGFP-Light와 pCGFP-Heavy를 섞어서 트랜스펙션한 경우에 HEK293 세포가 항체를 생성함을 확인했다.
실시예 5: 유세포분리기를 이용한 GFP 를 발현하는 개별세포의 분리 및 항체생산 검증
그린 형광단백질의 N 말단 절편과 C 말단 절편이 동시 발현되어 재결합 GFP를 형성함으로써 그린색 형광을 나타내는 세포가 항체 생산 동물세포주인지를 검증하기 위해, 실시예 3을 통해 제조된 발현벡터 pNGFP-Light와 pCGFP-Heavy를 Chinese hamster ovay-K1(이하 CHO-K1) 세포에 트랜스펙션하고 10% FBS와 4 mM 글루타민, 500 μg/mL G418을 추가로 첨가한 동물세포배지 IMDM에서 3회 계대배양 후 이를 비 분리풀(pool)이라 명명하였다. GFP 재결합을 위해 0.7 × 105 cells/mL의 농도로 T-25 플라스크에 접종 후 37℃에서 3일간 배양한 뒤 30℃에서 2일 추가 배양시켰다. 다음으로 유세포분리기를 이용하여 비 분리풀 중 상위 1%의 높은 GFP 형광을 나타내는 세포를 분리 후 같은 배지에서 3회 계대배양 후 이를 1차 분리풀이라 명명하였다. 같은 방법으로 유세포분리기를 이용하여 1차 분리풀 중 상위 1%의 높은 GFP 형광을 나타내는 세포를 분리 후 같은 배지에서 3회 계대배양 후 이를 2차 분리풀이라 명명하였다.
비 분리풀과 1차 분리풀, 2차 분리풀 내에서 GFP 형광을 나타내는 세포의 비율 측정을 위해 30℃에서 2일 배양한 후 유세포분리기를 통해 이를 검증하였다. 또한, 각 풀의 세포주를 0.7 × 105 cells/mL의 농도로 T-25 플라스크에 접종 후 37℃에서 배양 중 2일과 4일에 각각 총 생존세포 수를 측정하고 효소면역검사법으로 생산된 항체를 측정한 후 비생산성(specific antibody productivity)을 측정하였다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 각 풀의 총 세포수 중 재결합된 GFP를 포함하는 세포의 비율이 유세포분리기를 통한 분리 후 증가하였다. 또한 재결합된 GFP를 포함하는 세포의 비율이 증가한 풀일수록 높은 비생산성을 보였다.
실시예 6: 유세포분리기를 이용한 분리가 세포주 선별에 주는 유용성 검증
GFP를 표지자로 이용하여 유세포분리기를 이용한 1차 세포주 선별이 항체 고생산 동물세포주 선별에 주는 유용성을 검증하기 위해, 실시예 5에서 확립된 비 분리풀과 2차 분리풀에서 한계희석법을 이용하여 116개의 클론을 무작위적으로 선별하였다. 96-웰플레이트에 1 cell/3 well 농도로 접종 후 계대배양을 통해 T-25 플라스크까지 확장 배양한 뒤 각각의 클론들을 3.0 × 105 cells/mL의 농도로 T-25 플라스크에 접종하였다. 이를 37℃에서 3일 배양한 후 효소면역검사법으로 생산된 항체를 측정하였다.
표 3에서 보듯이, 비 분리풀에서는 분리된 116개의 클론 중 1개의 클론만이 0.5 ~ 1.0 mg/L의 항체 생산량을 보였지만, 유세포분리기를 통해 선별 과정을 거친 2차 분리풀에서는 10.0 mg/L 이상을 초과하는 고농도 항체 생산 클론이 4개나 선별되었다.
항체생산기준(mg/L) 비 분리풀 2차 분리풀
0.5 이하 115개/116개 33개/116개
0.5 초과 1.0 이하 1개/116개 1개/116개
1.0 초과 5.0 이하 0개/116개 28개/116개
5.0 초과 10.0 이하 0개/116개 50개/116개
10.0 초과 0개/116개 4개/116개
실시예 7: 형광단백질이 동시 발현되어 재결합된 GFP 를 형성한 동물세포와 항체 생산 동물세포의 상관관계 검증
재결합된 GFP 발현 정도와 항체 생산량과의 상관관계를 검증하기 위하여, 유세포분리기 분석과 효소면역검사법을 수행함으로써 개별적으로 분리된 클론 30개의 GFP 발현 정도와 항체 비생산성을 측정하였다. 유세포분리기를 통한 GFP 발현 정도 측정은 각각의 클론을 0.7 × 105 cells/mL의 농도로 T-25 플라스크에 접종 후 37℃에서 3일간 배양한 뒤 30℃에서 2일 추가 배양을 통한 GFP 재결합 유도 후 유세포분리기를 이용하여 GFP mean 값을 측정하였다. 효소면역검사법을 통한 항체 비생산성의 측정은 각각의 클론을 0.7 × 105 cells/mL의 농도로 T-25 플라스크에 접종한 후 37℃에서 배양 중 2일과 4일에 각각 총 생존세포 수를 측정하고 효소면역검사법으로 생산된 항체를 측정한 후 비생산성을 측정하였다. 각각의 클론에 대한 항체 비생산성과 GFP mean 값 사이의 상관관계를 그래프로 표시하였다.
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 항체 비생산성과 GFP mean 값 사이에 높은 상관관계가 있음을 알 수 있었으며, 이를 통해 GFP가 고농도 항체 생산 세포주를 고르는 유용한 표지자임을 확인하였다.
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Claims (7)

  1. 형광 단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열과 항체의 중쇄(heavy chain)를 코딩하는 서열을 포함하는 제 1 발현벡터 및 상기 형광 단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열과 항체의 경쇄(light chain)를 코딩하는 서열을 포함하는 제 2 발현벡터를 세포에 트랜스펙션하는 단계;
    상기 항체의 중쇄 및 경쇄가 결합하여 항체 단백질을 생산하는 것을 확인하기 위해, 형광 단백질의 제 1 절편과 제 2 절편의 재결합에 의해 나타나는 형광을 확인하여 항체 생산 세포주를 선별하는 단계; 및
    선별한 항체 생산 세포주의 항체 생성 여부를 확인하는;
    단계를 포함하는 항체 생산 세포주의 선별 방법으로,
    상기 제 1 발현벡터의 형광 단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열과 항체의 중쇄 서열이 도입되는 도입 영역 사이; 및 제 2 발현벡터의 형광 단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열과 항체의 경쇄 서열이 도입되는 도입 영역 사이에 IRES(internal ribosome entry site) 서열이 포함되는 것인, 항체 생산 세포주의 선별 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 형광단백질은 그린 형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 레드 형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 블루 형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 옐로우 형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 시안 형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP) 또는 강화된 형광단백질(enhanced fluorescent protein, EFP)인 항체 생산 세포주의 선별 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 형광단백질의 제 1 절편 및 제 2 절편 중 어느 하나는 형광단백질의 C 말단 절편이고, 나머지 하나는 형광단백질의 N 말단 절편인 항체 생산 세포주의 선별 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제 1 발현벡터는 형광단백질의 제 1 절편을 코딩하는 서열에 연결된 제 1 링커 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하며,
    상기 제 2 발현벡터는 형광단백질의 제 2 절편을 코딩하는 서열에 연결된 제 2 링커 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하고,
    상기 제 1 링커 펩타이드와 제 2 링커 펩타이드는 상호 결합할 수 있도록 구성된 것을 특징으로 하는
    항체 생산 세포주의 선별 방법.
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  6. 삭제
  7. 삭제
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