CN112912392A - 利用重组酶介导的盒式交换的多特异性抗体筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本文报道了一种利用靶向整合入宿主细胞而制备表达双特异性抗体的重组宿主细胞文库的方法，所述宿主细胞包含整合在所述宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择标志物的第一重组识别序列和第二重组识别序列，以及位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的第三重组识别序列，并且所有的所述重组识别序列均不同；由此用第一载体的文库和第二载体的文库转染所述宿主细胞，所述第一载体各自包含两个重组识别序列，所述两个重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的所述第一重组识别序列和所述第三重组识别序列匹配并且侧接两个外源核苷酸序列和至少一个第二选择标志物，所述第二载体各自包含两个重组识别序列，所述两个重组识别序列与所述整合的外源核苷酸序列上的所述第二重组识别序列和所述第三重组识别序列匹配并且侧接至少两个其他外源核苷酸序列；其中四个所述外源核苷酸序列之一编码所述双特异性抗体的第一轻链、一个第二轻链、一个第一重链和一个第二重链。

Description

利用重组酶介导的盒式交换的多特异性抗体筛选方法
本发明为细胞系构建领域。更精确地，本文报道了在靶向整合过程中通过表达盒随机化产生双特异性抗体表达细胞文库的方法。这些细胞可用作生产细胞系。
背景技术
可以将抗体或抗体样蛋白工程化为与两个不同的靶标结合。轻链和重链的正确组装可以通过许多不同的方式来促进(Brinkmann和Kontermann，2017)。一类这样的蛋白质为具有两个不同Fab片段的IgG样双特异性抗体，其针对两个不同的靶标，例如具有一条相同的轻链和两条不同的重链的IgG(Merchant等人，1998)；或CrossMab，其包含两条不同的轻链以及两条不同的重链((Regula等人，2018；Schaefer等人，2011)。分子工程学用于促进轻链和重链的正确组装。
双特异性抗体可用于同时中和两个可溶性因子(Schaefer等人，2011)。此外，它们具有发挥复杂作用方式的潜力，诸如通过引入蛋白质及其紧靠的且取向适当的激活剂来激活蛋白质底物(Kitazawa等人，2012；Shima等人，2016)。找到能够发挥所需功能的Fab的正确组合可能是一项巨大的努力(Sampei等人，2013)。
分泌的和糖基化的蛋白质(诸如抗体)通常为通过在真核细胞中稳定或瞬时地重组表达而产生的。使用瞬时转染，需要进行大量单独的转染以表达一系列不同的双特异性抗体，每次用质粒的克隆制备物进行转染，以确保上清液仅包含一种双特异性抗体并且适合于筛选。通过随机整合稳定转染也是如此。通常，如果质粒随机转染，则若干质粒整合到宿主基因组中。结果，如果用质粒混合物转染，大多数经转染细胞将分泌一种以上类型的双特异性抗体。即使将编码一种双特异性抗体的所有基因都放在同一质粒上，也会发生这种情况。慢病毒载体已被用来部分克服随机整合的这一局限性，并产生仅具有一个或几个单拷贝整合的重组细胞系。与慢病毒scFv-Fc融合文库同时转导后，这已用于生成和筛选重组细胞系的文库(Zhang等人，2012)。然而，Zhang等人观察到许多经转染细胞系已被一种以上慢病毒转染，且因此产生了重组产物的混合物，这使筛选结果的解释变得复杂。尽管如此，对于Zhang等人，结果证明，scFv-Fc的随机组合为有利的，因为它们意外地能够鉴定有效的双特异性激动结合剂。与scFv-Fc融合蛋白相比，抗体形式包含两种以上的多肽，亚基随机组合的可能性以及产物混合物的复杂性甚至更高，使得几乎无法筛选。
通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)进行靶向整合为一种将外源DNA特异性且有效地引导至真核宿主基因组中预定位点的方法(Turan等人，2011)。
WO 2006/007850公开了抗恒河猴D重组多克隆抗体及其制造方法。为了解决问题，所使用的表达系统使用位点特异性整合入个体宿主细胞的基因组中。所述系统涵盖用于位点特异性整合的抗RhD抗体表达载体的文库，其包含编码抗RhD rpAb的变异体核酸区段。通过预定的重组识别位点的位点特异性整合或重组酶介导的盒式交换程序，将来自文库的个体核酸区段插入到个体细胞相同的预定染色体位置中，从而产生细胞系，其中个体细胞表达抗RhD rpAb的独特成员。
WO 2013/006142公开了用于真核细胞中快速遗传改变的新方法和试剂。进一步公开了遗传改变的真核细胞的近乎同质的群体，其将供体盒稳定地整合入其基因组中，所述供体盒包含强多聚腺苷酸化位点，所述多聚腺苷酸化位点可操作地连接至分离的核酸片段，所述分离的核酸区段包含靶向核酸位点和选择标志物蛋白编码序列，其中分离的核酸片段侧接第一重组位点和第二非相同重组位点。在所述文件中有理由认为，仅在与RMCE受体基因座正确重组的情况下，用强多聚腺苷酸化位点取代在浮选的Pur基因前面的启动子才阻止非特异性整合事件并产生嘌呤霉素抗性集落。
Kawabe,Y.等人(Cytotechnol.64(2011)267-279)公开了使用累积位点特异性基因整合系统将抗体基因重复整合到CHO细胞的预选染色体基因座中。在KR 2011 0068814中公开了一种在大肠杆菌细胞中制备双特异性抗体的方法。WO 00/31246公开了通过体内重组核酸和多肽文库来制备的方法及其用途。在EP 2 692 865 B1中公开了转位介导的特异性结合或功能蛋白的鉴定。
发明内容
本发明的一个方面为一种用于在CHO细胞中产生双特异性抗体的组合表达文库的基于RMCE的方法，其中每个细胞正好表达一种类型的双特异性分子。
本发明的另一方面为载体文库本身，尤其是其规模小。
本发明的又一方面为可用于产生文库本身的载体。
本发明的一个方面为一种用于制备表达多特异性抗体文库的重组宿主细胞文库的方法，其包括：
a)提供靶向整合宿主细胞，其包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中外源核苷酸序列包含第一重组识别序列、第二重组识别序列和第三重组识别序列，第一重组识别序列和第二重组识别序列侧接至少一个第一选择标志物，第三重组识别序列位于第一重组识别序列和第二重组识别序列之间，并且所有的重组识别序列均不同；
b)向a)中所提供的细胞中引入第一载体的文库和第二载体的文库，第一载体各自包含两个重组识别序列，两个重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的第一重组识别序列和第三重组识别序列匹配，其中两个重组识别序列侧接两个或更多个外源核苷酸序列和至少(部分)一个第二选择标志物，且第二载体各自包含两个重组识别序列，两个重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的第二重组识别序列和第三重组识别序列匹配，其中两个重组识别序列侧接两个或更多个(更多)外源核苷酸序列；
c)i)与b)的第一载体的文库和第二载体的文库同时引入一种或多种重组酶；或ii)其后依次引入一种或多种重组酶，其中一种或多种重组酶识别第一载体和第二载体的重组识别序列；(并且任选地，其中一种或多种重组酶进行两次重组酶介导的盒式交换；)
和
d)选择表达第二选择标志物并分泌双特异性抗体的重组宿主细胞，
从而制备表达双特异性抗体文库的重组宿主细胞文库。
在一个实施例中，多特异性抗体为双特异性抗体。
在一个实施例中，两个或更多个外源核苷酸序列彼此独立地为二个至六个、或二个至四个、或三个、或四个、或五个、或六个外源核苷酸序列。在一个实施例中，两个或更多个外源核苷酸序列彼此独立地为二个至三个或二个至四个。在一个实施例中，两个或更多个外源核苷酸序列为两个外源核苷酸序列。
在一个实施例中，其中第一载体和第二载体总共包含四个外源核苷酸序列，其中四个外源核苷酸序列之一编码双特异性抗体的第一轻链、一个第二轻链、一个第一重链和一个第二重链。
在一个实施例中，第一载体和第二载体中的每一个均包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列。
在一个实施例中，第一载体和第二载体中的每一个均包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码同源抗体重链的外源核苷酸序列。
在一个实施例中，第一载体或第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中一个载体包含编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')，并且另一个载体包含编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中编码抗体重链的外源核苷酸序列位于编码抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')。
在一个实施例中，第一载体和第二载体各自包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中在每个载体中编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')。
在一个实施例中，第一载体和第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中编码抗体重链的外源核苷酸序列位于编码抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')。
在一个实施例中，第一载体或第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换。
在一个实施例中，第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换。
在一个优选的实施例中，第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的抗体轻链的外源核苷酸序列位于编码具有结构域交换的抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')。
在一个优选的实施例中，第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的抗体重链的外源核苷酸序列位于编码具有结构域交换的抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')。
在一个实施例中，第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的抗体轻链的外源核苷酸序列位于编码具有结构域交换的抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')；并且第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')，反之亦然。
在一个优选的实施例中，第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的抗体重链的外源核苷酸序列位于编码具有结构域交换的抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')；并且第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')。
本发明的一个方面为一种用于制备表达具有结构域交换的双特异性抗体的重组宿主细胞的方法，其包括：
a)提供靶向整合宿主细胞，其包含整合在所述宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列包含第一重组识别序列、第二重组识别序列和第三重组识别序列，所述第一重组识别序列和第二重组识别序列侧接至少一个第一选择标志物，所述第三重组识别序列位于所述第一重组识别序列和第二重组识别序列之间，并且所有的所述重组识别序列均不同；
b)向a)中所提供的细胞中引入第一载体和第二载体，第一载体各自包含两个重组识别序列，两个重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的第一重组识别序列和第三重组识别序列匹配并侧接两个外源核苷酸序列和至少(部分)一个第二选择标志物编码序列，第二载体各自包含两个重组识别序列，两个重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的第二重组识别序列和第三重组识别序列匹配并侧接至少两个其他外源核苷酸序列；其中第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的抗体重链的外源核苷酸序列位于编码具有结构域交换的抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')；并且第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')。
c)i)与b)的第一载体和第二载体同时引入一种或多种重组酶；或ii)其后依次引入一种或多种重组酶，其中一种或多种重组酶识别第一载体和第二载体的重组识别序列；(并且任选地，其中一种或多种重组酶进行两次重组酶介导的盒式交换；)
和
d)选择表达所述第二选择标志物并分泌所述双特异性抗体的重组宿主细胞，
从而制备表达具有结构域交换的双特异性抗体的重组宿主细胞。
在一个实施例中，第一载体包含与密码子ATG可操作地连接的启动子序列，其中启动子序列上游侧接(两个)外源核苷酸序列(即位于其下游)，且ATG密码子下游侧接重组识别序列(即位于其上游)；并且第二载体包含缺少ATG转录起始密码子的选择标志物，选择标志物上游侧接重组识别序列并且下游侧接(两个)外源核苷酸序列。
本发明的一方面为重组细胞，其包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，
其中外源核苷酸序列包含以下元件：第一重组识别序列、第二重组识别序列和第三重组识别序列、第一选择标志物和第二选择标志物、以及第一表达盒至第四表达盒，
其中所述元件的5'至3'序列为
RRS1-1st EC-2nd EC-RRS3-SM1-3rd EC-4th EC-RRS2-SM2
且
RRS＝重组识别序列，EC＝表达盒，SM＝选择标志物。
在一个实施例中，表达盒各自在5'至3'方向上包含启动子、目的基因和polyA位点以及任选地终止子序列。
在一实施例中
i)第一表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码具有结构域交换的抗体重链的核酸和polyA位点以及任选地终止子序列，
ii)第二表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码具有结构域交换的抗体轻链的核酸和polyA位点以及任选地终止子序列，
iii)第三表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码抗体轻链(无结构域交换)的核酸和polyA位点以及任选地终止子序列，以及
iv)第四表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码抗体重链(无结构域交换)的核酸和polyA位点以及任选地终止子序列。
在一个实施例中，启动子为具有内含子A的人CMV启动子，polyA位点为BGH polyA位点，终止子为hGT终止子。
在一个实施例中，结构域交换为CH1-CL交换，或VH-VL交换，或VH/CH1-VL/CL交换。
在一个实施例中，i)具有结构域交换的轻链和具有结构域交换的重链的可变结构域形成特异性结合第一抗原的结合位点，和ii)无结构域交换的轻链和无结构域交换的重链的可变结构域形成特异性结合第二抗原的结合位点。在一个实施例中，第一抗原为抗原上的第一表位，且第二抗原为抗原上与第一表位不同的第二表位。在一个实施例中，第一抗原和第二抗原为不同的抗原(多肽)。
本发明的一个方面为一种生产双特异性抗体的方法，其包括：
a)提供根据本发明或用根据本发明的方法制备的重组宿主细胞；
b)培养a)中的重组宿主细胞，并从细胞或培养基中回收双特异性抗体。
具体实施方式
本发明至少部分地基于以下发现：重组酶介导的盒式交换(RMCE)可用于在CHO细胞中产生双特异性抗体的组合表达文库，其中每个细胞正好表达一种类型的双特异性分子。
I.定义
杵臼结构二聚模块及其在抗体工程化中的用途在Carter P.、Ridgway J.B.B.、Presta L.G.:Immunotechnology，1996年2月第2卷第1期，第73-73(1)页中有所描述。
抗体重链中的CH3结构域可通过“杵臼结构(knob-into-holes)”技术改变，这一技术在例如WO 96/027011、Ridgway,J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621和Merchant,A.M.等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中以若干实例详细描述。在这一方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加这两个CH3结构域的异二聚化，从而增加包含它们的多肽的异二聚化。(两个重链的)两个CH3结构域中的一个可为“杵(knob)”而另一个为“臼(hole)”。二硫桥的引入进一步稳定化异二聚体(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。
(抗体重链的)CH3结构域中的突变T366W表示为“杵突变”或“突变杵”，而(抗体重链的)CH3结构域中的突变T366S、L368A、Y407V表示为“臼突变”或“突变臼”(根据Kabat EU索引编号)。通过将S354C突变引入具有“杵突变”(表示为“杵-cys-突变”或“突变杵-cys”)的重链的CH3结构域中或通过将Y349C突变引入具有“臼突变”(表示为“臼-cys-突变”或“突变臼-cys”)的重链的CH3结构域(根据Kabat EU索引编号)中，也可使用位于CH3结构域之间的额外的链间二硫桥(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681)。但这在本发明的分子中不存在。
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”。具体地，将Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat的EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3，其在本文中通过在这种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”而进一步分类)。
可用于实施本发明的方法和技术在例如Ausubel,F.M.(ed.),Current Protocolsin Molecular Biology,第I卷至第III卷(1997)；Glover,N.D.,和Hames,B.D.,ed.,DNACloning:A Practical Approach,第I卷和第II卷(1985),Oxford University Press；Freshney,R.I.(ed.),Animal Cell Culture–a practical approach,IRL Press Limited(1986)；Watson,J.D.,等人，Recombinant DNA,第二版，CHSL Press(1992)；Winnacker,E.L.,From Genes to Clones；N.Y.,VCH Publishers(1987)；Celis,J.,ed.,CellBiology,第二版，Academic Press(1998)；Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique,第二版，Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)中所述。
使用重组DNA技术能够产生核酸衍生物。此类衍生物可例如在一个或几个核苷酸位置处通过置换、改变、交换、删除或插入来修饰。例如，可通过定点突变手段进行修饰或衍生。此类修饰可由该领域技术人员容易地进行(参见，例如，Sambrook,J.,等人，MolecularCloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork,USA；Hames,B.D.,和Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–a practicalapproach(1985)IRL Press,Oxford,England)。
必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，“一个细胞”所指的包括多个此类细胞和该领域技术人员已知的其等效物，如此等等。同样，术语“一个/一种”、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/一种”在本文中可互换使用。也应注意的是，术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。
术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5％范围。
术语“包含”也涵盖术语“由...组成”。
术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。全长抗体包含两条全长抗体轻链和两条全长抗体重链，每条全长抗体轻链包含可变结构域和恒定结构域，并且每条全长抗体重链包含可变结构域、第一恒定结构域、铰链区、第二恒定结构域和第三恒定结构域。全长抗体可包含其它结构域诸如，例如，缀合至全长抗体的一条或多条链的额外scFv或scFab。这些缀合物也为术语全长抗体所涵盖。
术语“真核细胞”、“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入一个或多个外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的抗体。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：包含氨基酸残基延伸体的抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在重链可变结构域VH中(H1,H2,H3)，并且三个在轻链可变结构域VL中(L1,L2,L3)。
HVR包括
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia,C和Lesk，A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，其包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“分离的”组合物为已自其自然环境的组分中分离的组合物。在一些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳、CE-SDS)或色谱(例如，体积排阻色谱或离子交换或反相HPLC)测定，将组合物纯化至大于95％或99％的纯度。关于用于评估例如抗体纯度的方法的综述，参见Flatman,S.等人，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“分离的”多肽或抗体是指已从其天然环境的组分中分离的多肽分子或抗体分子。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式呈递)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“单特异性抗体”表示具有关于一种抗原的单个结合特异性的抗体。单特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2)或它们的组合(例如，全长抗体加上额外的scFv或Fab片段)。单特异性抗体不必为单价的，即，单特异性抗体可以包含一个以上特异性结合该一种抗原的结合位点。例如，天然抗体为单特异性但为二价的。
“多特异性抗体”表示具有关于同一抗原上至少两个不同表位或两个不同抗原的结合特异性。多特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)或它们的组合(例如，全长抗体加上额外的scFv或Fab片段)。多特异性抗体至少为二价的，即包含两个抗原结合位点。同样，多特异性抗体至少为双特异性的。因此，二价双特异性抗体为多特异性抗体的最简单形式。具有两个、三个或更多个(例如，四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体也已有报告(参见，例如，US 2002/0004587 A1)。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，由此，铰链区定位在第一恒定结构域与第二恒定结构域之间。类似地，自N-末端至C-末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链结构域(CL)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
如本文所用，术语“重组抗体”表示所有通过重组手段制备、表达、创造或分离的抗体(嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体)。这包括从宿主细胞(诸如NS0、HEK、BHK或CHO细胞)分离的抗体(即，使用重组表达质粒转染到所述宿主细胞中表达的抗体)或从转了人免疫球蛋白基因或抗体的动物(例如小鼠)分离的抗体。
如在本申请中所用的术语“价”表示(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语“二价”“四价”和“六价”分别表示(抗体)分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如本文所报告的双特异性抗体是“二价”的一个优选实施例。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如，Kindt,T.J.等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合具体抗原的抗体可使用VH或VL结构域从结合该抗原的抗体中分离，以分别筛选互补性VL或VH结构域的文库(参见，例如，Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628)。
如本文所用，可互换使用的术语“载体”或“质粒”是指能够增殖与其相链接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作链接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“结构域交换”表示，在一对抗体重链VH-CH1片段与其相应同源抗体轻链中，即，在抗体Fab(片段抗原结合)中，结构域序列与天然抗体序列的序列的不同之处在于，至少一个重链结构域被其相应的轻链结构域置换，反之亦然。结构域交换有三种通常类型，(i)CH1结构域与CL结构域的交换，其通过在轻链中结构域交换导致VL-CH1结构域序列，和通过在重链片段中结构域交换导致VH-CL结构域序列(或具有VH-CL-铰链-CH2-CH3结构域序列的全长抗体重链)，(ii)VH结构域与VL结构域的结构域交换，其通过在轻链中结构域交换导致VH-CL结构域序列，和通过在重链片段中结构域交换导致VL-CH1结构域序列，和(iii)完整轻链(VL-CL)与完整VH-CH1重链片段的结构域交换(“Fab交换”)，其通过结构域交换导致具有VH-CH1结构域序列的轻链，和通过结构域交换导致具有VL-CL结构域序列的重链片段(所有前述结构域序列均以N-末端至C-末端方向指示)。
如本文所用，关于相应重链结构域和轻链结构域的术语“彼此替代”是指前述结构域交换。因此，当CH1结构域和CL结构域“彼此替代”时，是指项目(i)下提及的结构域交换以及所得重链和轻链结构域序列。据此，当VH和VL“彼此替代”时，是指项目(ii)下提及的结构域交换；而当CH1结构域和CL结构域“彼此替代”并且VH结构域和VL结构域“彼此替代”时，是指项目(iii)下提及的结构域交换。例如，在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192中报告了包括结构域交换的双特异性抗体。此类抗体通常称为CrossMab。
在一个实施例中，由通过根据本发明的方法获得的细胞产生的多特异性抗体还包含至少一个Fab片段，该Fab片段包括如上述项目(i)下提及的CH1结构域和CL结构域的结构域交换，或上述项目(ii)下提及的VH结构域和VL结构域的结构域交换，或上述项目(iii)下提及的VH-CH1结构域和VL-VL结构域的结构域交换。在具有结构域交换的多特异性抗体的情况下，特异性结合相同抗原的Fab被构造成具有同一结构域序列。因此，在多特异性抗体中含有超过一个具有结构域交换的Fab的情况下，该Fab特异性结合至同一抗原。
术语“结合至”表示结合位点与其靶标的结合，诸如包含例如抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的抗体结合位点与相应抗原的结合。可以使用例如
Figure BDA0003037162050000151
测定仪(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)确定该结合。即术语“结合(至抗原)”表示抗体在体外测定中与其抗原的结合。在一个实施例中，在结合检测中测定结合，其中抗体结合至表面，并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原至抗体的结合。结合意味着结合亲和性(KD)为10-8M或更低，在一些实施例中为10-13M至10-8M，在一些实施例中为10-13M至10-9M。术语“结合”也包括术语“特异性结合”。
例如，在
Figure BDA0003037162050000152
检测的可能实施例中，抗原结合至表面，并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗体，即其一个或多个结合位点的结合。结合的亲和性由术语ka(缔合常数：缔合以形成复合物的速率常数)、kd(解离常数：复合物解离的速率常数)和KD(kd/ka)定义。另选地，关于共振信号高度和解离行为，SPR传感图的结合信号可直接与参考物质的响应信号比较。
术语“结合位点”表示对靶标显示结合特异性的任何蛋白质实体。这可以为，例如，受体、受体配体、抗运载蛋白(anticalin)、亲和体、抗体等。因此，本文所用的术语“结合位点”表示一种多肽，其可特异性结合至第二多肽或可借由第二多肽被特异性结合。在一个实施例中，结合位点选自由以下组成的多肽的组：抗体重链可变结构域、抗体轻链可变结构域、一对抗体重链和抗体轻链的可变结构域、受体或其功能片段、受体配体或其功能片段、酶或其底物。
在抗体的情况下，结合位点包含至少三个HVR(例如在VHH的情况下)或三个至六个HVR(例如在天然存在的即具有VH/VL对的常规抗体的情况下)。通常，负责抗原结合的抗体的氨基酸残基正在形成结合位点。这些残基通常包含在抗体重链可变结构域和同源抗体轻链可变结构域对中。抗体的抗原结合位点包含来自“高变区”或“HVR”的氨基酸残基。“框架”区或“FR”区为除本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域区。因此，抗体的轻链和重链可变结构域在N-末端至C-末端包含区域FR1、HVR1/CDR1、FR2、HVR2/CDR2、FR3、HVR3/CDR3和FR4(免疫球蛋白框架)。特别地，重链可变结构域的HVR3/CDR3区为对抗原结合起最大作用并定义抗体的结合特异性的区。“功能性结合位点”能够与其靶标特异性结合。术语“特异性结合”表示在一个结合测定的实施例中的体外测定中，结合位点与其靶标的结合。这样的结合测定可以为任何测定，只要可以检测到结合事件即可。例如，一个测定，其中抗体结合至表面，并且通过表面等离子体共振(SPR)测量一个或多个抗原至抗体的结合。另选地，可以使用桥接ELISA。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型，优选Fc区。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“恒定区”表示包含恒定结构域，即CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白重链的区。在一个实施例中，人IgG恒定区从Ala118延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。Fc区由两个重链Fc区多肽组成，它们可以通过形成链间二硫键的铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接。
术语“Fc区”表示包含至少一部分铰链区、CH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白重链的C-末端区域。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Asp221或从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。Fc区由两个重链Fc区多肽组成，它们可以通过形成链间二硫键的铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接。
如本文报道的方法中产生的抗体包含Fc区，在一个实施例中，Fc区源自人来源。在一实施例中，Fc区包含人恒定区的所有部分。抗体的Fc区直接参与补体激活、C1q结合、C3激活和Fc受体结合。尽管抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但与C1q的结合是由Fc区中定义的结合位点引起的。这样的结合位点在现有技术中是已知的，并且例如描述于Lukas,T.J.,等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.,和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.,等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.,等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.,等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.,等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.,等人，Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434。这样的结合位点为例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号)。IgG1、IgG2和IgG3亚类的抗体通常显示补体激活、C1q结合和C3激活，而IgG4不激活补体系统，不结合C1q和不激活C3。“抗体的Fc区”是本领域技术人员众所周知的术语，并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割来定义。在一个实施例中，Fc区为人Fc区。在一个实施例中，Fc区为人IgG4亚类，其包含突变S228P和/或L235E(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施例中，Fc区为人IgG1亚类，其包含突变L234A和L235A以及任选地P329G(根据Kabat的EU索引编号)。
如本文所用，术语“选择标志物”表示这样的基因，其允许在相应的选择剂存在下特异性选择携带该基因的细胞或抵制携带该基因的细胞。例如但不限于，选择标志物可以允许在存在相应选择剂的情况下(选择培养条件)对选择标志物基因转化的宿主细胞进行正选择；非转化宿主细胞将不能在选择性培养条件下生长或存活。选择标志物可以为正的、负的或双功能的。正选择标志物可以允许选择带有标志物的细胞，而负选择标志物可以允许带有标志物的细胞被选择性地消除。选择标志物可以赋予对药物的抗性或补偿宿主细胞中的代谢或分解代谢缺陷。在原核细胞中，可以使用赋予对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素抗性的基因。在真核细胞中用作选择标志物的抗性基因包括但不限于氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。在WO 92/08796和WO 94/28143中描述了其他标志物基因。
除了在存在相应选择剂的情况下促进选择之外，选择标志物另选地可以提供编码细胞中通常不存在的分子的基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、合成GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型YFP(eYFP)、青色荧光蛋白(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。可以例如通过检测由编码的多肽发射的荧光来将带有这种基因的细胞与不带有该基因的细胞区分开。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个或更多个部件的并置，其中所述部件处于允许它们以其预期方式起作用的关系。例如，如果启动子和/或增强子起作用以调节编码序列的转录，则启动子和/或增强子可操作地连接至编码序列。在某些实施例中，“可操作地连接”的DNA序列在单个染色体上为连续的和相邻的。在某些实施例中，例如，当需要连接两个蛋白质编码区，诸如分泌前导区和多肽时，这些序列为连续的、相邻的并且在同一阅读框中。在某些实施例中，可操作地连接的启动子位于编码序列的上游并且可以与其相邻。在某些实施例中，例如，关于调节编码序列表达的增强子序列，尽管不是相邻的，但是两个部件可以可操作地连接。如果增强子增加编码序列的转录，则该增强子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游，并且可以位于距编码序列的启动子相当大的距离处。可操作的连接可以通过本领域已知的重组方法来完成，例如，使用PCR方法和/或通过在方便的限制性位点处进行连接。如果不存在方便的限制性位点，则可以按照常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子或连接基。如果内部核糖体进入位点(IRES)允许以5'端独立的方式在内部位置启动ORF的翻译，则可操作地连接至开放阅读框(ORF)。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，其包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体-抗体片段-融合。
如本文所用，术语“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包括完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原，即其为功能片段。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双特异性抗体、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv或scFab)。
如本文所用，术语“同源序列”是指共享显著的序列相似性的序列，如通过序列比对所确定的。例如，两个序列可以为约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％同源的。比对是通过算法和计算机程序(包括但不限于BLAST、FASTA和HMME)执行的，其可以比较序列并基于因素诸如序列长度、序列同一性和相似性以及序列不匹配和缺口的存在与长度来计算匹配的统计显著性。同源序列可以是指DNA和蛋白质序列两者。如果在上下文中指出，则同源性对于整个核酸序列或蛋白质不是必须存在的，而也可以仅在其一部分中存在。
如本文所用，术语“侧接”是指第一核苷酸序列位于第二核苷酸序列的5'或3'端或两端。侧接核苷酸序列可以与第二核苷酸序列相邻或相距限定的距离。侧接核苷酸序列的长度没有具体限制。例如，侧接序列可以为几个碱基对或几千个碱基对。
如本文所用，术语“外源的”表示核苷酸序列不是源自宿主细胞，而是通过传统的DNA递送方法，例如通过转染、电穿孔或转化方法被引入宿主细胞中。术语“内源的”是指核苷酸序列源自宿主细胞。“外源”核苷酸序列可以具有在碱基组成上相同的“内源”对应物，但是其中例如通过重组DNA技术将“外源”序列引入宿主细胞。
Ⅱ.组合物和方法
常规细胞系发育(CLD)依赖于携带目标序列(SOI)的质粒的随机整合(RI)。
抗体通常为通过在真核细胞中稳定或瞬时重组表达产生的。使用瞬时转染，需要进行大量单独的转染以表达多种不同的双特异性抗体。每个这样的转染都包括质粒的克隆制备物，以确保上清液仅包含一种双特异性抗体，以确保适用于随后的筛选步骤。如果由于编码核酸的随机整合而遵循稳定的转染方法，则同样如此。
通常，如果质粒通过随机方法转染，则若干质粒整合到宿主细胞基因组中。结果，如果用质粒混合物转染，大多数经转染细胞将分泌一种以上类型的双特异性抗体。即使由于多拷贝整合而将编码一种双特异性抗体的所有基因都置于同一质粒上，也会发生这种情况。
因此，对于包含两种以上多肽的抗体形式，亚单位的随机组合和产物混合物的复杂性的可能性很高，使得几乎无法筛选。即使使用工程抗体形式(诸如CrossMab)，也是如此(请参见图1)。
因此，基于RI的过程是不可预测的，而且劳动强度大。因此，需要大量的努力来鉴定高产的RI克隆。
与常规RI CLD不同，靶向整合(TI)CLD将以限定的拷贝数(通常为1-2个拷贝)将转基因引入CHO基因组中的预定“热点”。鉴于低拷贝数和预先测试的整合位点，与RI系相比，TI细胞系应具有更好的稳定性。此外，由于选择标志物仅用于选择具有适当TI的细胞，而不用于选择具有高水平转基因表达的细胞，因此可以应用诱变程度较低的标志物，以最大程度地减少序列变体(SV)的机会，这是部分由于选择剂如甲氨蝶呤(MTX)或蛋氨酸亚磺酰亚胺(MSX)的诱变性。
本发明使用TI方法来筛选和鉴定表达单一双特异性抗体的重组细胞系，即仅包含第一轻链、第二轻链、第一重链和第二重链中的每一个的一个表达盒。本发明提供了使用双质粒重组酶介导的盒式交换(RMCE)产生表达双特异性抗体的重组细胞文库的新方法。除其他事项外，改进之处在于，与RI方法相比，产生文库所需的时间减少了，并且该文库的细胞恰好包含在单个TI基因座中编码双特异性抗体的不同序列的单个拷贝。根据本发明的方法对于双特异性抗体特别有用，该双特异性抗体包括在其轻链之一和相应的重链之间的结构域交换。本发明的方法也是特别有用的，因为可以使用不同整合质粒的库在一次转染中产生不同表达盒的不同序列。因此，提供了具有不同的随机表达盒组合的细胞文库，但是每条链仅一个。其后可以筛选文库中的细胞以获得最佳的产品收率和质量。
本公开的主题不仅提供了筛选表达重组双特异性抗体的重组细胞系的方法，而且还提供了具有双特异性抗体的高产率且具有有利的副产物谱的重组细胞系。
双质粒RMCE方法的优点包括提高了产率，并具有从同一TI基因座共表达多种多肽的不同组合的灵活性。
本文所用的双质粒RMCE策略允许在同一TI基因座中组合插入四个序列(即两个不同的抗体重链(HC)和两个不同的抗体轻链(LC))。利用本文所用的双质粒RMCE方法，可以在盒式交换期间组合不同的半抗体，并从而提供双特异性抗体的文库，其中多样性基于不同半抗体的组合。因此，具有同时靶向四个序列的能力，双质粒RMCE能够调节HC/LC对组合，从而提供表达不同双特异性抗体的细胞的文库。同时，提高了具有多个链的复杂分子的表达的产率。
II.a重组酶介导的盒式交换
靶向整合允许将外源核苷酸序列整合到宿主细胞基因组的预定位点中。在某些实施例中，靶向整合由识别一个或多个重组识别序列(RRS)的重组酶介导。在某些实施例中，靶向整合为通过同源重组介导的。
“重组识别序列”(RRS)为被重组酶识别的核苷酸序列，并且对于重组酶介导的重组事件为必要和充分的。RRS可用于定义核苷酸序列中发生重组事件的位置。
在某些实施例中，RRS选自由以下项组成的组：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1attP序列、Bxb1 attB序列、
Figure BDA0003037162050000213
attP序列和
Figure BDA0003037162050000214
attB序列。如果必须选择多个RRS，则在选择了不同的RRS的情况下，每个序列的选择都取决于另一个。
在某些实施例中，RRS可以被Cre重组酶识别。在某些实施例中，RRS可以被FLP重组酶识别。在某些实施例中，RRS可以被Bxb1整合酶识别。在某些实施例中，RRS可以被
Figure BDA0003037162050000211
整合酶识别。
在某些实施例中，当RRS为LoxP位点时，宿主细胞需要Cre重组酶来进行重组。在某些实施例中，当RRS为FRT位点时，宿主细胞需要FLP重组酶来进行重组。在某些实施例中，当RRS为Bxb1 attP或Bxb1 attB位点时，宿主细胞需要Bxb1整合酶来进行重组。在某些实施例中，当RRS为
Figure BDA0003037162050000212
attP或
Figure BDA0003037162050000221
attB位点时，宿主细胞需要
Figure BDA0003037162050000222
整合酶来进行重组。可以使用包含酶的编码序列的表达载体将重组酶引入宿主细胞。
Cre-LoxP位点特异性重组系统已广泛用于许多生物学实验系统中。Cre为一种38kDa的位点特异性DNA重组酶，可识别34bp的LoxP序列。Cre源自噬菌体P1且属于酪氨酸家族位点特异性重组酶。Cre重组酶可以介导LoxP序列之间的分子内和分子间重组。LoxP序列由侧接两个13bp的反向重复序列的一个8bp的非回文核心区域组成。Cre重组酶与13bp重复序列结合，从而介导8bp核心区域内的重组。Cre-LoxP介导的重组高效发生且不需要任何其他宿主因子。如果将两个LoxP序列以相同的取向放置在同一核苷酸序列上，则Cre介导的重组将切除位于两个LoxP序列之间的DNA序列，成为共价闭合环。如果将两个LoxP序列以反向位置放置在同一核苷酸序列上，则Cre介导的重组将使位于这两个序列之间的DNA序列的取向反向。LoxP序列也可以放置在不同的染色体上，以促进不同染色体之间的重组。如果两个LoxP序列位于两个不同的DNA分子上，并且如果一个DNA分子为环状的，则Cre介导的重组将导致环状DNA序列的整合。
在某些实施例中，LoxP序列为野生型LoxP序列。在某些实施例中，LoxP序列为突变的LoxP序列。已经开发了突变的LoxP序列以提高Cre介导的整合或置换的效率。在某些实施例中，突变的LoxP序列选自由以下项组成的组：LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列和Lox66序列。例如，Lox71序列在左边13bp重复序列中有5bp突变。Lox66序列在右边的13bp重复序列中有5bp突变。野生型和突变的LoxP序列均可介导Cre依赖性重组。
术语“匹配的RRS”表示在两个RRS之间发生重组。在某些实施例中，两个匹配的RRS为相同的。在某些实施例中，两个RRS都为野生型LoxP序列。在某些实施例中，两个RRS都为突变的LoxP序列。在某些实施例中，两个RRS都为野生型FRT序列。在某些实施例中，两个RRS都为突变的FRT序列。在某些实施例中，两个匹配的RRS为不同的序列，但是可以被同一重组酶识别。在某些实施例中，第一匹配RRS为Bxb1 attP序列且第二匹配RRS为Bxb1 attB序列。在某些实施例中，第一匹配RRS为
Figure BDA0003037162050000231
attB序列且第二匹配RRS为
Figure BDA0003037162050000232
attB序列。
II.b示例性靶向整合宿主细胞系
合适的TI宿主细胞包含整合在宿主细胞基因组的基因座内特定位点的外源核苷酸序列，即“登陆位点”。
本公开的主题提供了适合于外源核苷酸序列的靶向整合的宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞包含在宿主细胞，即TI宿主细胞的基因组上的整合位点处整合的外源核苷酸序列。
在某些实施例中，TI宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。在某些实施例中，TI宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。在某些实施例中，TI宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。
在某些实施例中，TI宿主细胞包含整合的外源核苷酸序列，其中外源核苷酸序列包含一个或多个重组识别序列(RRS)。在某些实施例中，外源核苷酸序列包含至少两个RRS。RRS可以被重组酶识别，例如，Cre重组酶、FLP重组酶、Bxb1整合酶或
Figure BDA0003037162050000233
整合酶。RRS可以选自由以下项组成的组：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、
Figure BDA0003037162050000234
attP序列和
Figure BDA0003037162050000235
attB序列。
在某些实施例中，外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS和第三RRS，以及位于第一RRS和第二RRS之间的至少一个选择标志物，并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些实施例中，外源核苷酸序列进一步包含第二选择标志物，并且第一选择标志物和第二选择标志物为不同的。在某些实施例中，外源核苷酸序列可进一步包含第三选择标志物和内部核糖体进入位点(IRES)，其中IRES可操作地连接至第三选择标志物。第三选择标志物可以不同于第一选择标志物或第二选择标志物。
选择标志物可以选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。选择标志物还可以选自由以下项组成的组：绿色荧光蛋白(GFP)标志物、增强型GFP(eGFP)标志物、合成GFP标志物、黄色荧光蛋白(YFP)标志物、增强型YFP(eYFP)标志物、青色荧光蛋白(CFP)标志物、mPlum标志物、mCherry标志物、tdTomato标志物、mStrawberry标志物、J-red标志物、DsRed单体标志物、mOrange标志物、mKO标志物、mCitrine标志物、Venus标志物、YPet标志物、Emerald6标志物、CyPet标志物、mCFPm标志物、Cerulean标志物和T-Sapphire标志物。
在某些实施例中，外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS和第三RRS，至少一个选择标志物位于第一RRS和第三RRS之间。
“整合位点”包括宿主细胞基因组内的核酸序列，其中插入了外源核苷酸序列。在某些实施例中，整合位点在宿主细胞基因组上的两个相邻核苷酸之间。在某些实施例中，整合位点包括一段核苷酸序列。在某些实施例中，整合位点位于TI宿主细胞的基因组的特定基因座内。在某些实施例中，整合位点在TI宿主细胞的内源基因内。
外源核苷酸序列为不起源于宿主细胞但是可以通过传统的DNA递送方法，例如通过转染、电穿孔或转化方法被引入宿主细胞的核苷酸序列。在某些实施例中，TI宿主细胞包含在TI宿主细胞的基因组中一个或多个整合位点整合的至少一个外源核苷酸序列。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在TI宿主细胞基因组的特定基因座内的一个或多个整合位点。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含一个或多个重组识别序列(RRS)，其中RRS可以被重组酶识别。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少两个RRS。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS，其中第三RRS位于第一RRS和第二RRS之间。在某些实施例中，第一RRS和第二RRS相同，并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些实施例中，所有三个RRS为不同的。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含四个RRS、五个RRS、六个RRS、七个RRS或八个RRS。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含多个RRS。在某些实施例中，RRS总数的子集为相同的，或RRS总数的子集为不同的。在某些实施例中，RRS可以选自由以下项组成的组：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、
Figure BDA0003037162050000251
attP序列和
Figure BDA0003037162050000252
attB序列。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一个选择标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS和第三RRS和至少一个选择标志物。在某些实施例中，选择标志物位于第一RRS和第二RRS之间。在某些实施例中，两个RRS侧接至少一个选择标志物，即，第一RRS位于选择标志物的5'上游，而第二RRS位于选择标志物的3'下游。在某些实施例中，第一RRS邻近选择标志物的5'端，第二RRS邻近选择标志物的3'端。
在某些实施例中，选择标志物位于第一RRS和第二RRS之间，并且两个侧接RRS为不同的。在某些实施例中，第一侧接RRS为LoxP L3序列且第二侧接RRS为LoxP 2L序列。在某些实施例中，LoxP L3序列位于选择标志物的5'且LoxP 2L序列位于选择标志物的3'。在某些实施例中，第一侧接RRS为野生型FRT序列且第二侧接RRS为突变的FRT序列。在某些实施例中，第一侧接RRS为Bxb1 attP序列且第二侧接RRS为Bxb1 attB序列。在某些实施例中，第一侧接RRS为
Figure BDA0003037162050000253
attP序列且第二侧接RRS为
Figure BDA0003037162050000254
attB序列。在某些实施例中，两个RRS定位在同一取向上。在某些实施例中，两个RRS都处于正取向或反取向。在某些实施例中，两个RRS以相反的取向定位。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含侧接两个RRS的两个选择标志物，其中第一选择标志物不同于第二选择标志物。在某些实施例中，两个选择标志物均选自由谷氨酰胺合成酶选择标志物、胸苷激酶选择标志物、HYG选择标志物和嘌呤霉素抗性选择标志物组成的组。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含胸苷激酶选择标志物和HYG选择标志物。在某些实施例中，第一选择标志物选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因；第二选择标志物选自由以下项组成的组：GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。在某些实施例中，第一选择标志物为谷氨酰胺合成酶选择标志物且第二选择标志物为GFP标志物。在某些实施例中，侧接两个选择标志物的两个RRS是不同的。
在某些实施例中，选择标志物与启动子序列可操作地连接。在某些实施例中，选择标志物与SV40启动子可操作地连接。在某些实施例中，选择标志物与巨细胞病毒(CMV)启动子可操作地连接。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS。在某些实施例中，第三RRS位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，第一RRS和第二RRS相同，并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些实施例中，所有三个RRS为不同的。
II.c适用于实施本发明的示例性载体
除了上面概述的“单载体RMCE”之外，还可以执行新颖的“双载体RMCE”以同时进行靶向整合和随机化。
在根据本发明的方法中采用“双载体RMCE”策略。例如但不限于，整合的外源核苷酸序列可包含三个RRS，例如这样的布置：其中第三RRS(“RRS3”)在第一RRS(“RRS1”)和第二RRS(“RRS2”)之间，而第一载体包含两个RRS匹配在整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS，而第二载体包含两个RRS匹配在整合的外源核苷酸序列上的第三RRS和第二RRS。双载体RMCE策略的实例如图2所示。通过在每对RRS之间掺入适当数量的SOI，这样的双载体RMCE策略允许引入四个SOI。
双质粒RMCE策略涉及使用三个RRS位点同时执行两个独立的RMCE(图2)。因此，TI宿主中的登陆平台包括第三RRS位点(RRS3)，该位点与RRS1或RRS2位点没有交叉活性。待靶向的两个表达质粒需要相同的
侧接RRS位点用于有效靶向，一个(正)表达质粒侧接RRS1和RRS3，另一个(反)表达质粒侧接RRS3和RRS2。由于预计双质粒RMCE效率较低，因此需要严格的选择方案来丰富罕见的RMCE特定事件。双质粒RMCE中需要两个选择标志物。将一个选择标志物表达盒分成两部分。正质粒将包含启动子，随后为起始密码子和RRS3序列。反质粒将使RRS3序列与选择标志物编码区的N-端融合，减去ATG起始点。可能需要在RRS3位点和选择标志物序列之间插入其他核苷酸，以确保融合蛋白的框内翻译。仅当正确地靶向两个质粒时，才组装选择标志物的完整表达盒，从而使细胞对选择具有抗性。图2为示出双质粒RMCE策略的示意图。
单载体和双载体RMCE都可以将一个或多个供体DNA分子单向整合到宿主细胞基因组的预定位点中，并且可以将供体DNA上存在的DNA盒与宿主基因组上整合位点所在的DNA盒精确交换。DNA盒的特征在于两个异源特异性RRS，其侧接至少一个选择标志物(尽管在某些双载体RMCE实例中，如本文所述，可以使用“分裂选择标志物”)和/或至少一个外源SOI。RMCE涉及靶基因组基因座内两个异源RRS与供体DNA分子之间由重组酶催化的双重重组交换事件。RMCE设计用于将SOI或选择标志物的拷贝引入宿主细胞基因组的预定基因座。与仅涉及一个交换事件的重组不同，RMCE可以实施为使得不将原核载体序列引入宿主细胞基因组，从而减少和/或防止不期望的宿主免疫或防御机制触发。可以使用多个DNA盒重复执行RMCE程序。
在某些实施例中，通过两次RMCE实现靶向整合，其中两个不同的DNA盒均整合到宿主细胞基因组的预定位点中，每个盒均包含侧接两个异源RRS的至少一个外源SOI或至少一个选择标志物。在某些实施例中，通过多次RMCE实现靶向整合，其中来自多个载体的DNA盒均整合到宿主细胞基因组的预定位点中，每个载体均包含侧接两个异源RRS的至少一个外源SOI或至少一个选择标志物。在某些实施例中，选择标志物可以在第一载体上部分编码且在第二载体上部分编码，使得两个RMCE的整合允许表达选择标志物。图2给出了这样的一个系统的实例。
在某些实施例中，经由重组酶介导的重组的靶向整合导致选择标志物或一个或多个外源SOI被整合到宿主细胞基因组的一个或多个预定整合位点中，而不含来自原核载体的序列。
II.d根据本发明的方法的实施例
包含如上所述的外源核酸(“登陆位点”)的任何已知或未来的TI宿主都适合于实施本发明。
在下文中，用CHO细胞系概述了根据本发明的方法。仅出于举例说明本发明的目的而提出，但不应以任何方式将其解释为限制。本发明的真实范畴在权利要求书中阐述。
在一个优选实施例中，TI宿主细胞系为CHO细胞。
适用于根据本发明的方法的示例性TI宿主为CHO细胞系，其携带登陆盒，该登陆盒具有用于Cre重组酶介导的DNA重组的三个异源loxP位点、L3、LoxFas和L2(有关背景的信息，请参见Wong等人，2005)。这种配置允许同时整合两个质粒，一个具有L3和LoxFas位点的正质粒和一个具有LoxFas和L2位点的反质粒。选择性标志物基因的功能元件分布在两个质粒之间：启动子和起始密码子位于正质粒上，而编码区和poly A信号位于反质粒上。只有Cre介导的两个质粒整合才能可靠地诱导出对选择标志物3的抗性。外源核酸还包含双顺反子选择性标志物1-IRES-GFP抗性基因，其允许通过正选择来稳定登陆盒，以及在转染和Cre重组后选择不存在盒(负选择)。绿色荧光蛋白(GFP)用于监测盒式交换。
为了表达针对两种抗原A和B的CrossMAb，将编码交换的轻链(xLC)和交换的重链(xHCknob)的基因置于正质粒上。两条链共同形成针对抗原A的Fab片段。将编码非交换的轻链(LC)和非交换的重链(HChole)(其形成针对抗原B的Fab片段)的基因置于反质粒上。
为了产生重组CHO细胞文库(每个细胞表达单一类型CrossMAb)，将编码针对抗原A的抗体链的正质粒文库和编码针对抗原B的抗体链的反质粒文库混合并转染到TI宿主(图3)。在Cre重组酶的介导下，质粒A和质粒B在靶基因座处随机配对。随后，用选择标志物2(正选择)和选择标志物3(负选择)选择稳定经转染的细胞池。
通过诸如有限稀释、细胞分选或细胞印刷的方法，将获得的CHO细胞表达文库进行单细胞克隆。可以针对重组双特异性抗体的所需功能筛选所得的单细胞或其克隆后代。
为了分析整合质粒的身份，使用引物P_1和引物P_2(SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02)通过PCR同时扩增LC、xLC、HChole和xHCknob的抗体编码区。P_1结合在这些基因的5'非翻译区域，而P_2结合在3'非翻译区域。使用两种基因特异性引物通过Sanger测序分析所得的PCR产物混合物。引物P_3(SEQ ID NO:03)结合xHCknob基因的恒定部分，并允许对正质粒的VL区进行测序。引物P_4(SEQ ID NO:04)结合LC基因的恒定部分，并允许对反质粒的VL区进行测序。
在测序的39个克隆中，有37个包含一种类型的正质粒和一种类型的反质粒(请参见下表)。一个克隆(P2F10)包含两个反质粒。在克隆P2A09中未检测到正质粒。除了克隆P2C10中的反质粒(其包含两个所采用的反质粒B_1和反质粒B_2的杂合序列)外，所有序列均与参考序列之一完全匹配。考虑到所分析的克隆数量很少，所有经转染的质粒(图4)以及所有预期的正反质粒组合都以相似的频率发生(图5)。
Figure BDA0003037162050000291
Figure BDA0003037162050000301
Figure BDA0003037162050000311
*B_1和B_2的杂合体
必须明确指出，获得的克隆中不同表达质粒的表示/存在为相同的，这与表达的蛋白质(抗体链)的序列无关，这是绝对令人惊讶的。没有检测到任何半抗体的优选或偏向表达。考虑到用于筛选的文库的预期用途，这是重要的结果。例如，如果一个种类的发生比其能够发生的频率更高，会对筛选结果产生负面影响。
本公开提供了一种用于制备表达双特异性抗体文库的重组宿主细胞文库的方法，该方法包括：
a)提供TI宿主细胞，其包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS和第三RRS，第一RRS和第二RRS侧接至少一个第一选择标志物，第三RRS位于第一RRS和第二RRS之间，并且所有的RRS均不同；
b)向a)中所提供的细胞中引入第一载体的文库和第二载体的文库，第一载体各自包含两个RRS，两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS匹配并且侧接两个外源SOI和至少一个第二选择标志物；并且第二载体各自包含两个RRS，两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和第三RRS匹配并且侧接至少两个其他外源SOI；其中四个SOI之一编码双特异性抗体的第一轻链、第二轻链、第一重链和第二重链；
c)i)与b)的第一载体的文库和第二载体的文库同时引入一种或多种重组酶；或ii)其后依次引入一种或多种重组酶，其中一种或多种重组酶识别第一载体和第二载体的RRS；其中一种或多种重组酶识别RRS并且进行两次RMCE；
和
d)选择表达第二选择标志物并分泌双特异性抗体的TI细胞，
从而制备表达双特异性抗体文库的重组宿主细胞文库。
在一个实施例中，第一载体和第二载体中各自均包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI。
在一个实施例中，第一载体和第二载体中各自均包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码同源抗体重链的SOI。
在一个实施例中，第一载体或第二载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中一个载体包含编码抗体轻链的SOI位于编码抗体重链的SOI上游(5')；并且另一个载体包含编码抗体重链的SOI，其中编码抗体重链的SOI位于编码抗体轻链的SOI上游(5')。
在一个实施例中，第一载体和第二载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中编码抗体轻链的SOI位于编码抗体重链的SOI上游(5')。
在一个实施例中，第一载体和第二载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中编码抗体重链的SOI位于编码抗体轻链的SOI上游(5')。
在一个实施例中，第一载体或第二载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换。
在一个实施例中，第一载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换。
在一个实施例中，第一载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的抗体重链的SOI位于编码具有结构域交换的抗体轻链的SOI上游(5')。
在一个实施例中，第一载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的抗体重链的SOI位于编码具有结构域交换的抗体轻链的SOI上游(5')；并且第二载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中编码抗体轻链的SOI位于编码抗体重链的SOI上游(5')。
本公开提供了一种用于制备表达具有结构域交换的双特异性抗体的重组宿主细胞的方法，其包括：
a)提供TI宿主细胞，其包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS和第三RRS，第一RRS和第二RRS侧接至少一个第一选择标志物，第三RRS位于第一RRS和第二RRS之间，并且所有的RRS均不同；
b)向a)中所提供的细胞中引入第一载体和第二载体，第一载体各自包含两个RRS，两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS匹配并侧接两个外源SOI和至少一个第二选择标志物，第二载体各自包含两个RRS，两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和第三RRS匹配并侧接至少两个其他外源SOI；其中第一载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中抗体轻链和抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的抗体重链的SOI位于编码具有结构域交换的抗体轻链的SOI上游(5')；并且第二载体包含一个编码抗体轻链的SOI和一个编码抗体重链的SOI，其中编码抗体轻链的SOI位于编码抗体重链的SOI上游(5')。
c)i)与b)的第一载体和第二载体同时引入一种或多种重组酶；或ii)其后依次引入一种或多种重组酶，其中一种或多种重组酶识别第一载体和第二载体的RRS；
和
d)选择表达第二选择标志物并分泌双特异性抗体的TI细胞，
从而制备表达具有结构域交换的双特异性抗体的重组宿主细胞。
在一个实施例中，第一载体包含与密码子ATG可操作地连接的启动子序列，其中启动子序列上游侧接(两个)外源核苷酸序列(即位于其下游)，且ATG密码子下游侧接重组识别序列(即位于其上游)；并且第二载体包含缺少ATG转录起始密码子的选择标志物，选择标志物上游侧接重组识别序列并且下游侧接(两个)外源核苷酸序列。
本公开提供了一种用于制备表达双特异性抗体文库的重组宿主细胞文库的方法，该方法包括：
a)提供TI宿主细胞，其包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中外源核苷酸序列包含第一DNA盒，该第一DNA盒包含第一RRS、第二RRS和第三RRS，第一RRS和第二RRS侧接至少一个第一选择标志物，第三RRS位于第一RRS和第二RRS之间，并且所有的三个RRS均不同；
b)向a)中所提供的细胞中引入第一载体的文库和第二载体的文库，第一载体各自包含第二DNA盒，其中第二DNA盒包含两个(异源特异性)RRS，两个RRS与第一DNA盒的第一RRS和第三RRS匹配并且侧接两个外源SOI和至少一个第二选择标志物；并且第二载体各自包含第三DNA盒，其中第三DNA盒包含两个(异源特异性)RRS，两个RRS与第一DNA盒的第二RRS和第三RRS匹配并且侧接至少两个其他外源SOI；其中四个SOI之一编码双特异性抗体的第一轻链、第二轻链、第一重链和第二重链；
c)i)与b)的第一载体的文库和第二载体的文库同时引入一种或多种重组酶；或ii)其后依次引入一种或多种重组酶，其中一种或多种重组酶识别RRS并且进行两次RMCE；
和
d)选择表达第二选择标志物并分泌双特异性抗体的TI细胞，
从而制备表达双特异性抗体文库的重组宿主细胞文库。
在一个实施例中，第一载体包含与密码子ATG可操作地连接的启动子序列，其中启动子序列上游侧接(两个)外源核苷酸序列(即位于其下游)，且ATG密码子下游侧接重组识别序列(即位于其上游)；并且第二载体包含缺少ATG转录起始密码子的选择标志物，选择标志物上游侧接重组识别序列并且下游侧接(两个)外源核苷酸序列。
提供根据本发明的方法的重组宿主细胞也为本发明的一个方面。根据本发明的这种重组宿主细胞，其包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，
其中外源核苷酸序列包含以下元件
第一重组识别序列、第二重组识别序列和第三重组识别序列，
两个选择标志物，以及
第一表达盒至第四表达盒，
其中所述元件的5'至3'序列为
RRS1-1st EC-2nd EC-RRS3-SM-3rd EC-4th EC-RRS2-SM
且
RRS＝重组识别序列
EC＝表达盒
SM＝选择标志物。
RRS3和3rd EC之间的可选标志物为SM3。
在一个实施例中，表达盒各自在5'至3'方向上包含启动子、目的基因和polyA位点以及任选地终止子序列。
在本发明所有方面的一个实施例中
i)第一表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码具有结构域交换的抗体重链的核酸和polyA位点以及任选地终止子序列，
ii)第二表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码具有结构域交换的抗体轻链的核酸和polyA位点以及任选地终止子序列，
iii)第三表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码抗体轻链(无结构域交换)的核酸和polyA位点以及任选地终止子序列，以及
iv)第四表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码抗体重链(无结构域交换)的核酸和polyA位点以及任选地终止子序列。
在本发明所有方面的一个实施例中，启动子为具有内含子A的人CMV启动子，polyA位点为BGH polyA位点，终止子为hGT终止子。
在本发明所有方面的一个实施例中，结构域交换为CH1-CL交换，或VH-VL交换，或VH/CH1-VL/CL交换。
在一个实施例中，具有结构域交换的轻链和具有结构域交换的重链的可变结构域形成特异性结合第一抗原的结合位点，而无结构域交换的轻链和无结构域交换的重链的可变结构域形成特异性结合第二抗原的结合位点。在一个实施例中，第一抗原为抗原上的第一表位，且第二抗原为抗原上与第一表位不同的第二表位。在一个实施例中，第一抗原和第二抗原为不同的抗原(多肽)。
本公开的主题还涉及产生目的多肽的方法，其包括：
a)提供根据本发明或用本文所述方法制备的重组(宿主)细胞；
b)在适于表达SOI并从细胞或培养基中回收目的多肽的条件下，培养a)中的重组(宿主)细胞。
在一个实施例中，TI宿主细胞为CHO细胞。任何CHO细胞都可以用作宿主，因为它们都包含上面确定的七个基因座。
所得重组(宿主)细胞可用于重组生产双特异性抗体的方法中，由此促进目的双特异性抗体的表达。
在某些实施例中，本公开提供了制备表达第一对和第二对抗体轻链和抗体重链的TI宿主细胞的方法，其包括：
a)提供TI宿主细胞，其包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS和第三RRS，第一RRS和第二RRS侧接至少一个第一选择标志物，第三RRS位于第一RRS和第二RRS之间，并且所有的RRS均不同；
b)向a)中提供的细胞中引入第一载体，第一载体包含两个RRS，两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS匹配并且至少侧接编码第一对抗体轻链和抗体重链的外源SOI和至少一个第二选择标志物；
c)向a)中提供的细胞中或b)中获得的细胞中引入第二载体，第二载体包含两个RRS，两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和第三RRS匹配并且至少侧接编码第二对抗体轻链和抗体重链的外源SOI；
d)引入一种或多种重组酶，其中一种或多种重组酶识别b)或c)中获得的细胞中的RRS；
和
e)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达第一目的多肽和第二目的多肽的TI宿主细胞。
尽管以上为针对双特异性抗体的，但目的序列可以编码任何目的多肽，其包括但不限于本文列出的实例。SOI可以相同或不同，例如，SOI可以包含抗体两条链的编码序列。
在某些实施例中，与随机整合的SOI相比，可操作地连接的核苷酸序列增加了SOI的表达水平。在某些实施例中，整合的外源SOI表达为比随机整合的SOI高约20％、30％、40％、50％、100％、2倍、3倍、5倍或10倍。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含编码抗体重链序列或其片段的SOI和编码抗体轻链序列或其片段的SOI。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含编码第一抗体重链序列或其片段的SOI、编码第二抗体重链序列或其片段的SOI、以及编码抗体轻链序列或其片段的SOI。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含编码第一抗体重链序列或其片段的SOI、编码第二抗体重链序列或其片段的SOI、编码第一抗体轻链序列或其片段的SOI和编码第二抗体轻链序列或其片段的SOI。在某些实施例中，可以将编码重链序列和轻链序列的个体SOI整合到例如存在于单个整合位点的单个外源核酸序列中，或整合到存在于单个整合位点的多个外源核酸序列中。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS和四个外源SOI，并且第三RRS位于第一RRS和第二RRS之间。在某些实施例中，第一SOI和第二SOI位于第一RRS和第三RRS之间，并且第三SOI和第四SOI位于第三RRS和第二RRS之间。在某些实施例中，第一SOI和第二SOI为不同的。在某些实施例中，第一RRS和第二RRS相同，并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些实施例中，所有三个RRS为不同的。在某些实施例中，第一RRS为LoxP L3位点，第二RRS为LoxP 2L位点，并且第三RRS为LoxFas位点。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS、四个外源SOI和一个选择标志物。在某些实施例中，第一SOI和第二SOI以及选择标志物位于第一RRS和第三RRS之间，并且第三SOI和第四SOI位于第三RRS和第二RRS之间。
本公开的重组宿主细胞可以用于调节表达任何目的分子特别为双特异性抗体。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可以用于表达多肽，例如哺乳动物多肽。这种多肽的非限制性实例包括激素、受体、融合蛋白、调节因子、生长因子、补体系统因子、酶、凝血因子、抗凝血因子、激酶、细胞因子、CD蛋白、白介素、治疗性蛋白、诊断性蛋白和抗体。在某些实施例中，本公开内容的宿主细胞可用于表达分子伴侣、蛋白修饰酶、shRNA、gRNA或其他蛋白或肽，同时组成性地或调节性地表达治疗性目的蛋白或分子。
在某些实施例中，目的多肽为双特异性多肽、三特异性多肽或多特异性多肽，例如双特异性抗体，特别为在一个轻链-重链对中具有结构域交换的全长四链双特异性抗体。
与目前的细胞培养方法中使用的非TI细胞相比，本公开的重组宿主细胞可用于在较短的时间内生产大量的目的分子，例如双特异性抗体，特别为具有结构域交换的双特异性抗体。在某些实施例中，与目前的细胞培养方法中使用的非TI细胞相比，本公开的重组宿主细胞可用于提高目的分子的质量。
提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解的是，在不脱离本发明精神的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
附图说明
图1：CrossMab为由针对抗原A的两个功能性xLC-xHCknob对A1和A2和针对抗原B的两个功能性LC-HChole对B1和B2的亚单位随机关联而产生的；除了具有两个功能性Fab的四个CrossMab之外，由于轻链和重链的错配，还会产生12个部分或完全失去功能的CrossMab。
图2：双质粒RMCE策略的方案，其中涉及使用三个RRS位点同时执行两个独立的RMCE。
图3：在靶向整合CHO宿主细胞系中产生组合CrossMab文库。混合针对抗原A的n种不同正质粒和针对抗原B的m种不同反质粒的文库，并将其转染到TI CHO宿主细胞系中。所得稳定经转染细胞池表达n x m种不同的CrossMab，每个细胞仅表达一种类型。
图4A、图4B：4A：编码抗体1的xHCknob和xLC的正质粒F_1的图谱。
4B：编码抗体2的HChole和LC的反质粒B_1的图谱。
BGH Poly A：牛生长激素基因的3'UTR和多聚腺苷酸化信号，HGT：人生长激素基因的转录终止序列。
图5A、图5B：5A：在36个滴度呈阳性的单细胞克隆中，正质粒和反质粒的发生数量。不包括具有意外靶基因配置的克隆P2A09、P2C10和P2F10。
5B：在36个滴度呈阳性的单细胞克隆中，正质粒和反质粒组合的发生数量。不包括具有意外靶基因配置的克隆P2A09、P2C10和P2F10。
图6A、图6B和图6C：GFP(x轴)和抗体表达(y轴)的细胞测量。选择开始之后10天进行细胞计数。
图6A：亲代CHO细胞
图6B：TI宿主细胞
图6C：表达2x 2CrossMab文库的稳定库。
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实例1
通用技术
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:ALaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。
DNA序列测定
DNA测序在SequiServe GmbH(Vaterstetten,Germany)进行
DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件包)软件包和Invitrogen's Vector NTI11.5版用于序列创建、作图、分析、注释和图解。
实例2
产生和分析组合的2x2 CrossMAb表达文库
将两个正质粒F_1和F_2(编码特异性结合人抗原A的两个不同抗体的交换抗体链)和两个反质粒B_1和B_2(编码特异性结合人抗原B的两个不同抗体的未交换抗体链)同时转染到TI CHO宿主细胞系中(参见下表)。图4示出了正质粒F_1和反质粒B_1的图谱。正质粒F_1和F_2在VL和VH的氨基酸序列上彼此不同。反质粒B_1和B_2也是如此。
Figure BDA0003037162050000401
Figure BDA0003037162050000411
xHCknob：具有结构域交换和杵突变的重链
xLC：具有结构域交换的轻链
LC：无结构域交换的轻链
HChole：无结构域交换和臼突变的重链
在标准加湿条件(95％rH，37℃和5％CO2)下，将TI宿主在一次性125ml通气摇瓶中以150rpm的恒定搅拌速率繁殖。每3-4天，将细胞以3x105细胞/ml浓度的有效浓度接种到含有选择标志物1和选择标志物2的化学成分限定的培养基中。用Cedex HiRes细胞计数器(F.Hoffmann-La Roche Ltd,Basel,Switzerland)测量培养物的密度和活力。为了稳定转染，将等摩尔量的质粒F_1、F_2、B_1和B_2混合。将1μg Cre表达质粒添加到5μg质粒混合物中。转染前两天，将TI宿主细胞接种到密度为4x105细胞/ml的新鲜培养基中。根据制造商的方案，使用Nucleofector Kit V(Lonza,Switzerland)，使用Nucleofector设备进行转染。用30μg质粒转染3x107细胞。转染后，将细胞接种在无选择剂的30ml培养基中。接种后第5天，将细胞离心并转移至含有选择剂3和选择剂4的80mL培养基中，达到6×105细胞/ml有效浓度用于选择重组细胞。定期监测培养物的细胞密度和活力。当培养物的活力再次开始增加时，选择剂3和选择剂4的浓度降低到以前使用量的一半。开始选择之后10天，通过流式细胞术检测细胞内GFP和结合到细胞表面的细胞外CrossMab的表达来检查Cre介导的盒式交换是否成功(图6)。针对人抗体轻链和重链的APC抗体(藻蓝蛋白标记的F(ab')2片段山羊抗人IgG)用于FACS染色。用BD FACS Canto II流式细胞仪(BD,Heidelberg,Germany)进行流式细胞术。每个样品测量10,000个事件。在前向散射(FSC)与侧向散射(SSC)的图中，对活细胞进行了门控。活细胞门控由未经转染的TI宿主细胞定义，并通过使用FlowJo 7.6.5EN软件(TreeStar,Olten,Switzerland)应用于所有样品。在FITC通道中定量GFP的荧光(在488nm激发，在530nm检测)。在APC通道中测量CrossMab(在645nm激发，在660nm检测)。亲代CHO细胞，即用于产生TI宿主细胞的那些细胞，用作GFP和CrossMab表达的阴性对照。开始选择之后十四天，活力超过90％，并且认为选择已完成。
选择之后，通过有限稀释对稳定经转染的细胞池进行单细胞克隆。为此，将细胞用Cell Tracker GreenTM(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)染色，并以0.6细胞/孔的量接种在384孔板中。对于单细胞克隆和所有其他培养步骤，从培养基中省略选择剂4。通过明场和基于荧光的平板成像鉴定仅包含一个细胞的孔。仅进一步考虑包含一个细胞的孔。铺板后大约三周，从融合孔中挑出集落，并在96孔板中进一步培养。在96孔板中放置四天后，用抗人IgG夹心ELISA测量培养基中的抗体滴度。简而言之，用结合到MaxiSorp微量滴定板(NuncTM,Sigma-Aldrich)上的抗人Fc抗体从细胞培养液中捕获抗体，并用抗人Fc POD缀合物检测，该缀合物与不同于捕获抗体的表位结合。使用BM化学发光ELISA底物(POD)(Sigma-Aldrich)通过化学发光对二抗进行定量。91％的孔显示细胞生长，并且呈抗体阳性。裂解抗体阳性集落，并使用Allprep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)提取基因组DNA。
为了分析整合质粒的身份，使用引物P_1和P_2通过PCR同时扩增LC、xLC、HChole和xHCknob的抗体编码区。P_1结合在这些基因的5'非翻译区域，而P_2结合在3'非翻译区域。使用两种基因特异性引物通过Sanger测序分析所得的PCR产物混合物。P_3结合xHCknob基因的恒定部分，并允许对正质粒的VL区进行测序。P_4结合LC基因的恒定部分，并允许对反质粒的VL区进行测序。
在测序的39个克隆中，有37个包含一种类型的正质粒和一种类型的反质粒(请参见下表)。一个克隆(P2F10)包含两个反质粒。在克隆P2A09中未检测到正质粒。除了克隆P2C10中的反质粒(其包含反质粒B_1和反质粒B_2的杂合序列)外，所有序列均与参考序列之一完全匹配。考虑到所分析的克隆数量很少，所有经转染的质粒(图4)以及所有预期的正反质粒组合都以相似的频率发生(图5)。
Figure BDA0003037162050000431
*B_1和B_2的杂合体
必须明确指出，获得的克隆中不同表达质粒的表示/存在为相同的，这与表达的蛋白质(抗体链)的序列无关，这是绝对令人惊讶的。没有检测到任何半抗体的优选或偏向表达。考虑到用于筛选的文库的预期用途，这是重要的结果。例如，如果一个种类的发生比其能够发生的频率更高，会对筛选结果产生负面影响。
Figure IDA0003037162110000011
Figure IDA0003037162110000021

Claims (14)

1.一种用于制备表达双特异性抗体文库的重组宿主细胞文库的方法，其包括：
a)提供靶向整合宿主细胞，其包含整合在所述宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列包含第一重组识别序列、第二重组识别序列和第三重组识别序列，所述第一重组识别序列和第二重组识别序列侧接至少一个第一选择标志物，所述第三重组识别序列位于所述第一重组识别序列和第二重组识别序列之间，并且所述所有的所述重组识别序列均不同；
b)向a)中所提供的细胞中引入第一载体的文库和第二载体的文库，所述第一载体各自包含两个重组识别序列，所述两个重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的所述第一重组识别序列和所述第三重组识别序列匹配并且侧接两个外源核苷酸序列和至少一个第二选择标志物，所述第二载体各自包含两个重组识别序列，所述两个重组识别序列与所述整合的外源核苷酸序列上的所述第二重组识别序列和所述第三重组识别序列匹配并且侧接至少两个其他外源核苷酸序列；其中四个所述外源核苷酸序列之一编码双特异性抗体的第一轻链、一个第二轻链、一个第一重链和一个第二重链；
c)i)与b)的所述第一载体的文库和所述第二载体的文库同时引入一种或多种重组酶；或ii)其后依次引入一种或多种重组酶，其中所述一种或多种重组酶识别所述第一载体和所述第二载体的所述重组识别序列；其中所述一种或多种重组酶识别所述重组识别序列并且进行两次重组酶介导的盒式交换；
和
d)选择表达所述第二选择标志物并分泌所述双特异性抗体的重组宿主细胞，
从而制备表达双特异性抗体文库的重组宿主细胞文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一载体和所述第二载体中的每一个均包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述第一载体和所述第二载体中的每一个均包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码同源抗体重链的外源核苷酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一载体或所述第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中一个载体包含所述编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于所述编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')，并且另一个载体包含所述编码抗体重链的外源核苷酸序列，所述编码抗体重链的外源核苷酸序列位于所述编码抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一载体和所述第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中所述编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于所述编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一载体和所述第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中所述编码抗体重链的外源核苷酸序列位于所述编码抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一载体和所述第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中在一个载体中，所述编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于所述编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')，并且在另一个载体中，所述编码抗体重链的外源核苷酸序列位于所述编码抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一载体或所述第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中所述抗体轻链和所述抗体重链具有结构域交换。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中所述抗体轻链和所述抗体重链具有结构域交换。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中所述抗体轻链和所述抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的所述抗体重链的外源核苷酸序列位于编码具有结构域交换的所述抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中所述抗体轻链和所述抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的所述抗体重链的外源核苷酸序列位于编码具有结构域交换的所述抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')；并且所述第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中所述编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于所述编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')。
12.一种用于制备表达具有结构域交换的双特异性抗体的重组宿主细胞的方法，其包括：
a)提供靶向整合宿主细胞，其包含整合在所述宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列包含第一重组识别序列、第二重组识别序列和第三重组识别序列，所述第一重组识别序列和第二重组识别序列侧接至少一个第一选择标志物，所述第三重组识别序列位于所述第一重组识别序列和第二重组识别序列之间，并且所有的所述重组识别序列均不同；
b)向a)中所提供的细胞中引入第一载体和第二载体，所述第一载体各自包含两个重组识别序列，所述两个重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的所述第一重组识别序列和所述第三重组识别序列匹配并侧接两个外源核苷酸序列和至少一个第二选择标志物，所述第二载体各自包含两个重组识别序列，所述两个重组识别序列与所述整合的外源核苷酸序列上的所述第二重组识别序列和所述第三重组识别序列匹配并侧接至少两个其他外源核苷酸序列；其中所述第一载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中所述抗体轻链和所述抗体重链具有结构域交换，并且编码具有结构域交换的所述抗体重链的外源核苷酸序列位于编码具有结构域交换的所述抗体轻链的外源核苷酸序列上游(5')；并且所述第二载体包含一个编码抗体轻链的外源核苷酸序列和一个编码抗体重链的外源核苷酸序列，其中所述编码抗体轻链的外源核苷酸序列位于所述编码抗体重链的外源核苷酸序列上游(5')。
c)i)与b)的所述第一载体和所述第二载体同时引入一种或多种重组酶；或ii)其后依次引入一种或多种重组酶，其中所述一种或多种重组酶识别所述第一载体和所述第二载体的所述重组识别序列；
和
d)选择表达所述第二选择标志物并分泌双特异性抗体的重组宿主细胞，
从而制备表达具有结构域交换的双特异性抗体的重组宿主细胞。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一载体包含与密码子ATG可操作地连接的启动子序列，由此所述启动子序列上游侧接所述(两个)外源核苷酸序列(即位于其下游)，且所述ATG密码子下游侧接重组识别序列(即位于其上游)；并且所述第二载体包含缺少ATG转录起始密码子的选择标志物，所述选择标志物上游侧接重组识别序列并且下游侧接所述(两个)外源核苷酸序列。
14.一种生产双特异性抗体的方法，其包括：
a)提供通过根据权利要求1至13中任一项所述的方法制备的重组宿主细胞；
b)培养a)中的所述重组宿主细胞，并从所述细胞或所述培养基中回收所述双特异性抗体。
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