MX2007000644A

MX2007000644A - Anticuerpo policlonal recombinante anti-rhesus d y metodos de fabricacion.

Info

Publication number: MX2007000644A
Application number: MX2007000644A
Authority: MX
Inventors: Soeren Kofoed Rasmussen; Anne Bondgaard Tolstrup; Soeren Bregenholt Frederiksen; John Haurum
Original assignee: Symphogen As
Priority date: 2004-07-20
Filing date: 2005-07-18
Publication date: 2007-03-28
Also published as: AU2005263331B8; BRPI0513706A; JP4926054B2; KR20070038556A; EA200700249A1; EA014182B1; EP1967529A1; WO2006007850A1; AU2005263331A1; CA2574062A1; AU2005263331B2; NO20070927L; JP2008509658A; US20090017017A1; AU2005263331A8; IL179658A; EP1771483A1; NZ552265A; US20120322690A1; US8198415B2

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para la fabricacion de una composicion de anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD (anti-RhD rpAb). El metodo comprende obtener una coleccion de celulas transfectadas con una coleccion de vectores de expresion de anticuerpo anti-RhD, en donde cada celula en la coleccion es capaz de expresarse de un segmento de acido nucleico que comprende VH y VL, un miembro de la coleccion, que codifica un miembro distinto de la composicion de anticuerpo policlonal anti-RhD y que se localiza en el mismo sitio en el genoma de celulas individuales en la coleccion. Las celulas se cultivan bajo condiciones apropiadas para la expresion del anticuerpo policlonal recombinante, que se obtiene de las celulas o sobrenadante de cultivo. Los segmentos de acido nucleico que codifican el anti-RhD rpAb se introduce en las celulas por transfeccion con una coleccion de vectores para la integracion especifica al sitio. El metodo presente es apropiado para fabricar anti-RhD rpAb, por ello haciendo disponible un reemplazo superior de productos de inmunoglobulina terapeuticos y profilacticos derivados del plasma.

Description

ANTICUERPO PO ICLONAL RECOMBINANTE ANTI-RHESUS D Y MÉTODOS DE FABRICACIÓN Campo de la Invención La presente invención describe la producción de un anticuerpo policlonal recombinante anti-Rhesus D (anti-RhD rpAb) , así como el método general para generar un banco celular de trabajo policlonal para producción posterior de un anticuerpo policlonal deseado. La invención también se refiere a colecciones que codifican anti-RhD rpAb y a líneas de célula que producen anti-RhD rpAb. Además, la solicitud describe composiciones farmacológicas y de diagnóstico que comprenden anti-RhD rpAb y su uso en la profilaxis de enfermedad hemolítica de recién nacidos (HDN) , tratamiento de púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) y prevención de la sensibilización del antígeno Rhesus D después de transfusiones fallidas de sangre RhD(+) a individuos RhD(-) . Antecedentes de la Invención Los antígenos del grupo sanguíneo Rhesus se localizan en las proteínas de eritrocito de transmembrana abarcando los antígenos así llamados C, c, E, e y D. Aproximadamente el 16% de la población caucásica es Rhesus D negativo (RhD(-)) debido a un polimorfismo heredado. Además, existen múltiples variantes genéticas y serológicas de RhD (divididas en categoría II-VII) de las cuales RhDVI es el clínicamente más relevante. Ya que REF:178004 las células de glóbulos rojos positivas categoría VI (RBC) portan algunos de los diversos epítopos de la proteína D que las RBC de otras categorías, los individuos RhDVI(+) pueden formar aloanticuerpos contra RBC de otros individuos RhD positivo (RhD(+)) (Issitt, P. D. And Anstee, D.J., 1998. The Rh Blood Group System, Montgomery Scientific Publications, Durha , North Carolina, pp. 315-423). {Issitt & Anstee 1998 11809 /id}. La negatividad RhD en sí misma no se asocia con ninguna condición médica, pero tiene implicaciones médicas importantes cuando un sujeto del sexo femenino RhD(-) porta un feto RhD(+) o RhDVI(+) o un sujeto del sexo femenino RhDVI(+) que porta un feto RhD(+). La aloinmunización RhD fetomaternal puede entonces presentarse si los eritrocitos fetales entran en la circulación maternal, usualmente perinatalmente (durante la administración) , y por ello causan la inducción de una respuesta de anticuerpo anti-RhD maternal. En embarazos posteriores, las moléculas IgG específicas de RhD de la madre cruzan la placenta en la circulación fetal y median la lisis de eritrocitos fetales, por ello causando la enfermedad hemolítica de recién nacidos (HDN) . Se ha estimado que un promedio del 20% de mujeres RhD(-) dan a luz un bebé RhD(+) la segunda vez, y quienes no se protegen apropiadamente con profilaxis anti-D, generan una respuesta al anticuerpo anti-RhD. Cuando no se tratan, aproximadamente el 30% de los recién nacidos tiene anemia moderada, ictericia, y hepatomegalia, y 20% desarrollan anemia severa e hidropesía fetal, y recién nacidos severamente afectados están en riesgo de muerte neonatal o incapacidades permanentes . Las preparaciones de inmunoglobulina policlonales contra RhD se usan a nivel mundial para prevenir la aloinmunización de mujeres RhD(-) y RhDVI(+) embarazadas, por ello previniendo la enfermedad hemolítica del recién nacido. Las preparaciones de inmunoglobulina policlonales contra RhD (anti-D) se obtienen actualmente al agrupar plasma sanguíneo obtenido de donadores que se vuelven hiperinmunes, ya sea a través de aloinmunización RhD natural o a través de vacunación de sujetos del sexo masculino voluntarios de RhD negativo con eritrocitos RhD positivo. La eficacia de preparaciones de inmunoglobulina anti-RhD para profilaxis de HDN está bien establecida y tiene un uso de rutina durante varios años. Como un resultado esta enfermedad severa se vuelve una rareza. No obstante la causa fundamental de la enfermedad, esto es, aloinmunización de mujeres RhD(-) y RhDVI(+) embarazadas, todavía queda y se requiere de esta manera un suministro continuo de preparaciones de inmunoglobulina anti-D. Además de la profilaxis de HDN, la inmunoglobulina anti-D también proporciona utilidad en el tratamiento de púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) (George, J. N. , 2002. Blood Rev. 16, 37-38). ITP es un trastorno hematológico, donde los anticuerpos resultan en una liberación de plaquetas acelerada en el bazo y el hígado. Los síntomas son niveles de plaquetas reducidas que resultan en heridas y sangrado. En varios casos el bazo se remueve. Esto, sin embargo, no es posible en bebés debido a un efecto colateral severo, de esta manera se necesitan los tratamientos alternativos tipo inmunoglobulina anti-D. Además, la inmunoglobulina anti-D se usa después de transfusiones fallidas de sangre RhD(+) a receptores RhD(-) con objeto de prevenir la sensibilización al antígeno Rhesus D. Los métodos actuales para la producción de anti-D requieren, como ya se ha mencionado, inmunización repetida de un grupo incrementadamente renuente de donadores para la producción de antisuero de alta concentración. También hay factores de riesgo y problemas técnicos asociados, tales como el uso de RBC Rhesus positivo para la inmunización repetida porta el riesgo de transmisión de enfermedades virales tipo hepatitis B, SIDA y otras como virus aún desconocidos. Además, hay problemas con las variaciones lote a lote. Por lo tanto, se requiere un método alternativo para la producción de anticuerpos anti-RhD. Los métodos celulares para generar anticuerpos monoclonales anti-RhD se desarrollaron primero como una alternativa al suero hiperinmune. Estas técnicas abarcan transformación del Virus Epstein Barr de linfocitos que crean líneas de célula linfoblastoide B (Crawford et al. 1983. Lancet 1, 386-8) . Sin embargo, estas líneas de células son inestables y requieren clonación extensiva. La producción de anticuerpo humanos por la técnica del hibridoma también se restringen por la carencia de un patrón de fusión de célula de mieloma humano apropiado (Kozbor, D. and Roder, J. C, 1983. Immunol. Today. 4, 72) . Como substituto para estas técnicas, se desarrolló un método molecular que involucra la clonación por repertorio de V y VL y la construcción de colecciones de despliegue de fagos (Barbas, CF. et al. 1991. Proc Nati. Acad. Sci. U S A 88, 7978-7982). La técnica de despliegue de fagos también fue aplicable para el aislado de aglutinantes de antígeno Rhesus D. Un gran número de anticuerpo monoclonales (mAbs) con especificidad de enlace al antígeno Rhesus D se han aislado con esta técnica (WO 97/49809 y Siegel, D. L et al. 2002. Transfus. Clin. Biol. 9, 83-97). Ensayos clínicos recientes con un mAb anti-RhDVI recombinante han mostrado que es posible prevenir la inmunización RhD después de una prueba inmunogénica grande con RhD(+) RBC (Miescher, S., et al. 2004, Blood 103, 4028-4035). Sin embargo, el ensayo también muestra que el mAb fue menos eficiente con respecto a la liberación de RBC que una inmunoglobulina anti-D. La causa de esta relación de liberación reducida no se conoce. Es posible que un anticuerpo sencillo no sea eficiente como la diversidad de anticuerpos presente en el producto de inmunoglobulina anti-D, o que la presencia de más de un isotipo de inmunoglobulina esto es IgGl y IgG3 {Siegel, Czerwinski, et al. 2002 10320 /id} incrementa la liberación de RBC. Además de la cuestión de eficiencia, otra cuestióncon respecto a la profilaxis HDN es la situación donde un sujeto del sexo femenino RhDVI( +) lleva un feto RhD( + ) . En esta situación un mAb anti-RhDVI no será capaz de prevenir la aloinmunización del sujeto de sexo femenino. De esta manera, con objeto de proteger a sujetos del sexo femenino tanto RhD(-) como RhDVI(+), se necesita un producto con anticuerpo contra el antígeno categoría VI Rhesus D así como anticuerpos que no enlazan el antígeno categoría VI pero otros antígenos Rhesus D comunes . Otra cuestión posible con mAbs es que pueden ser inmunogénicos . No obstante que los mAbs son humanos, un tratamiento de primer tiempo puede resultar en una respuesta al anticuerpo del sujeto de sexo femenino tratado con el mAb. Teóricamente, esto puede pasar debido a que las regiones CDR del mAb, que nunca se han visto por el sistema inmune del individuo tratado antes, pueden reconocerse como externas si se presentan en una dosis suficientemente grande. Tal reacción volverá el mAb anti-RhD útil en el tratamiento profiláctico repetido. Es posible que algunos de estos problemas potenciales con mAbs pudieran vencerse al mezclar anticuerpos monoclonales. Sin embargo, esto significaría la producción y purificación separada de un número indefinido de anticuerpos, que pueden ser bastante costosos. Además, diferentes propiedades del lote de los anticuerpos monoclonales individuales de tal mezcla pueden afectar el producto final . Divulgación de la Contribución La presente invención proporciona un método para generar una línea celular de manufactura que puede expresar un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD (anti-RhD rpAb) como un lote sencillo. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos para la manufactura consistente de anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD (anti-RhD rpAb) . Se contempla que la presente invención abra la posibilidad para fabricación y producción a gran escala de una nueva clase de productos de anticuerpo anti-RhD terapéuticos. Un anti-RhD rpAb de la presente invención potencialmente tiene algunas ventajas sobre los anticuerpos anti-Rhesus D monoclonales. Antes que nada, cada epítopo Rhesus D potencial se cubrirá por más de un anticuerpo, de esta manera una composición anti-RhD rpAb puede usarse en el tratamiento profiláctico de sujetos de sexo femenino tanto RhD(-) como RhDVI que tienen un bebé RhD(+) . Por lo tanto, no será necesario mezclar mAb de lotes de producción y purificación diferentes con objeto de obtener el efecto profiláctico completo . Además, en el caso donde mAbs deberán probar ser inmunogénicos debido a la alta concentración de una molécula sencilla o algunas moléculas, un anti-RhD rpAb puede ser una buena alternativa. Ya que un anti-RhD rpAb de conformidad con la presente invención está compuesto de entre 5 y 56 moléculas de anticuerpo variantes, su concentración individual será más baja, y si uno de los anticuerpos deberá eliminarse debido a la inmunogenicidad, será copia de otros para cubrir el antígeno Rhesus D, de esta manera la profilaxis todavía será eficiente. La producción de un anticuerpo anti-RhD rpAb de la presente invención puede realizarse a partir de una línea de célula sencilla, como un lote sencillo. La generación de una línea de célula de fabricación policlonal para la producción anti-RhD rpAb se demuestra en la descripción detallada y por un ejemplo de trabajo. Definiciones Un "gen de resistencia al antibiótico" es un gen que codifica una proteína que puede vencer el efecto inhibidor o tóxico que un antibiótico tiene en una célula lo que asegura la sobrevivencia y proliferación continua de las células en presencia del antibiótico. El término "anticuerpo" describe un componente funcional del suero y frecuentemente se refiere ya sea a una colección de molécula (anticuerpos o inmunoglobulina) o como una molécula (la molécula de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina) . Una molécula de anticuerpo es capaz de enlazarse a, o reaccionar con una determinante antigénica específica (el antígeno o el epítopo antigénico) , que de nuevo puede llevar a la inducción de mecanismo efectos inmunológicos . Una molécula de anticuerpo individual se aprecia usualmente como monoespecífica, y una composición de moléculas de anticuerpo puede ser monoclonal, esto es, que consiste de moléculas de anticuerpo idénticas) o policlonales (esto es, que consiste de moléculas de anticuerpo diferentes que reaccionan con el mismo o diferente epítopo en el mismo antígeo o aún en antígenos diferentes, distintos) . Cada molécula de anticuerpo tiene una estructura única que permite enlazarse específicamente a su correspondiente antígeno, y todas las moléculas de anticuerpo naturales tienen la misma estructura básica general de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas . Los anticuerpos también se conocen colectivamente como inmunoglobulinas. Los términos anticuerpo o anticuerpos como se usan en la presente también se pretenden que incluyan anticuerpos quiméricos y de cadena sencilla, así como fragmentos de enlace de anticuerpos, tales como Fab, Fab' o moléculas F(ab)2, fragmentos Fv o fragmentos scFv o cualquier otro fragmento estable, así como moléculas de anticuerpo de longitud completa y formas muítiméricas tales como moléculas IgA diméricas o IgM prevalentes . El término "segmento de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-RhD" describe un segmento de ácido nucleico que comprende un par de elementos genéticos VH y VL. El segmento puede comprender además elementos genéticos de región constante de cadena ligera y/o cadena pesada, por ejemplo región constante de cadena ligera Kappa o Lambda y/o uno o más de los dominios de región constante CHl , CH2 , CH3 o CH4 seleccionados de uno de los isotipos IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgM, IgD e IgE. Los isotipos preferidos con IgGl e/o IgG3. El segmento de ácido nucleico también puede comprender uno o más casetes promotores, ya sea al facilitar la transcripción bidireccional o unidireccional de las secuencias que codifican VH y VL. Los elementos de traducción o transcripción adicionales, tales como secuencias líder funcionales dirigen el producto de gen a la trayectoria secretoria, secuencias de señal poli A, UCOE y/o un IRES puede también presentarse en el segmento . El término "anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD" o "anti-RhD rpAb" describe una composición de moléculas de anticuerpo diversas recombinantemente producidas, donde los miembros individuales son capaces de enlazarse a al menos un epítopo en el antígeno Rhesus D. Preferiblemente, la composición se produce a partir de una línea de célula de fabricación sencilla. La diversidad del anticuerpo policlonal se localiza en las regiones variables (regiones VH y V) , en particular en las regiones CDRl, CDR2 y CDR 3. El término "inclinación" se usa para que signifique el fenómeno durante la producción de anticuerpo policlonal recombinante, en donde la composición de una colección de expresión, línea de célula policlonal, o proteína policlonal alterada durante el tiempo debido a mutaciones genéticas aleatorias, diferencias en la cinética de proliferación entre células individuales, diferencias en los niveles de expresión entre diferentes secuencias de constructo de expresión, o diferencias en la eficiencia de clonación del ADN. Los términos "un miembro distinto del anti-RhD rpAb" significa una molécula de anticuerpo individual de la composición de anticuerpo policlonal recombinante, que comprende una o más extensiones dentro de las regiones variables, que se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácido en comparación con los otros miembros individuales de la proteína policlonal. Estas extensiones están localizadas en particular en las regiones CDRl, CDR2 y CDR 3. Como se usa en la presente, el término "genoma" no es para tomarse literalmente como el complemento normal de los cromosomas presentes en una célula, sino también los elementos extra-cromosomales que pueden introducirse en, y mantenerse en una célula. Tales elementos extra-cromosomales pueden incluir, pero no se limitan a, mini-cromosomas, YAC (siglas en inglés de cromosomas artificiales de levadura) , MAC (siglas en inglés de cromosomas artificiales de ratón) , o HAC (siglas en inglés de cromosomas artificiales humanos) . El término "promotores cabeza a cabeza" se refiere a un par promotor colocado en proximidad cercana de manera que la transcripción de dos elementos genéticos conducidos por los promotores se presentan en direcciones opuestas (transcripción bi-direccional) . La construcción de tal sistema se describe en detalle en el ejemplo 3 de la Patente E.U.A. No. 5,789,208, que se incorpora por ello para referencia. Un promotor cabeza a cabeza también puede construirse con un material compuesto de ácidos nucleicos irrelevantes entre los dos promotores. Tal fragmento de material puede contener fácilmente más de 500 nucleótidos . El término "mancha caliente" como en "línea de célula de mancha caliente" se refiere a una ubicación preestablecida del genoma que se selecciona o genera y caracteriza por la transcripción altamente eficiente de un segmento de ácido nucleico integrado de interés durante la integración del vector de expresión en tal sitio. El término "inmunoglobulina" comúnmente se usa como una designación colectiva de la mezcla de anticuerpos encontrada en la sangre o suero, pero también puede usarse para designar una mezcla de anticuerpos derivados de otras fuentes o se usa en el término "molécula de inmunoglobulina".

El término "sitio de entrada de ribosoma interno" o "IRES" describe una estructura diferente de la estructura de tapa 5' normal en un ARN. Ambas estructuras pueden reconocerse por una ribosoma para iniciar la exploración para un codon AUG para iniciar la traducción. Al usar una secuencia promotora y dos AUG de inicio, una primera y una segunda secuencia de polipéptido pueden traducirse del ARNm sencillo. De esta manera, se permite la co-traducción de una primera y una segunda secuencia de polinucleótido de un ARNm dicistrónico sencillo, la primera y segunda secuencias de polinucleótido pueden fusionarse transcripcionalmente por medio de una secuencia ligadora que incluye una secuencia IRES que permite la traducción de la secuencia de polinucleótido en cadena abajo de la secuencia IRES. En este caso, la molécula de ARN dicistrónica transcrita se traducirá de tanto el extremo 5' cerrado y de la secuencia IRES interna de la molécula de ARN dicistrónica para por ello producir el polipéptido tanto primero como segundo. Como se usa en la presente el término "colección" se refiere a una colección de secuencias de ácido nucleico variante. Por ejemplo, una colección de secuencias de ácido nucleico que codifican una población diversa de cadenas de pesadas variables de anticuerpo y/o cadenas ligeras variables. Donde un miembro de la secuencia de ácido nucleico variante está comprendida de dos elementos genéticos variantes, por ejemplo VH y V, frecuentemente se llaman un segmento de ácido nucleico. La colección de las secuencias/segmentos de ácido nucleico variante puede estar en la forma ya sea de un grupo de tales secuencias de ácido nucleico, o pueden ser una colección de secuencias de ácido nucleico separadas (por ejemplo, una secuencia única en cada pozo de una placa de 96 pozos) . Una colección de la presente invención típicamente tiene al menos 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 ó 106 miembros distintos. En "colección de vectores" las secuencias/segmentos de ácido nucleico variantes se insertan en el vector. Sin embargo, los términos colección y colección de vectores también puede usarse intercambiablemente . El término "una colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD" se refiere a una colección de secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-RhD variante insertado en un vector que porta elementos reguladores para la transcripción de los anticuerpos anti-RhD. Los elementos reguladores pueden ya sea localizarse en los segmentos de ácido nucleico insertados o en la estructura del vector. Preferiblemente los vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD también portan al menos una secuencia de reconocimiento de recombinasa, por ejemplo, un FRT y un sitio FRT' . El término "la mayoría de las células individuales" se refiere a un porcentaje de las células de tal manera que más del 80%, preferiblemente más del 85%, más preferiblemente 90%, 95%, o aún 99% o mayor. El término "transferencia de masa" o "transferencia en masa" se usa para describir la transferencia de segmentos de ácido nucleico de interés de una población de vectores a otra población de vectores y así subsecuentemente para cada uno de los segmentos de ácido nucleico simultáneamente sin valerse del aislado de los segmentos individuales de interés. Tales poblaciones de vectores pueden ser colecciones que contienen por ejemplo, regiones variables, promotores, elementos líderes o de aumento de interés. Estas secuencias pueden entonces moverse sin aislado previo de, por ejemplo, un vector fago a un vector de expresión mamífero. Especialmente para secuencias de anticuerpo, esta técnica asegura que el ligado entre la diversidad VH y VL no se pierde mientras se mueven las colecciones de, por ejemplo, un vector de selección (por ejemplo, un vector que exhibe un fago) a un vector de expresión mamífero. Por ello el apareamiento original de VH y VL se mantiene . Como se usa en la presente, el término "ligado operablemente" se refiere a un segmento ligado a otro segmento cuando se coloca en una relación funcional con el otro segmento. Por ejemplo, el ADN que codifica un polipéptido si se expresa como un líder que participa en la transferencia del polipéptido al retículo endoplásmico. También, el promotor o aumentador se liga operablemente a una secuencia de codificación si estimula la transcripción de la secuencia. El término "anticuerpo policlonal" describe una composición de moléculas de anticuerpo diferentes (diversas) que son capaces de enlazarse a o reaccionar con varias determinantes antigénicas específicas diferentes en los mismos o en antígenos diferentes. Usualmente, la variabilidad de un anticuerpo policlonal se localiza en las llamadas regiones variables del anticuerpo policlonal, en particular en las regiones CDR. Cuando se establece que el miembro de un anticuerpo policlonal se enlaza a un antígeno, significa en la presente un enlace que tiene una constante de enlace que está debajo de 1 mM, preferiblemente debajo de 100 nM, aún más preferiblemente debajo de 10 nM. El término "línea de célula de fabricación policlonal recombinante" se refiere a una mezcla/población de células que expresan la proteína que se transfectan con una colección de segmentos de ácido nucleico variante de interés de tal manera que las células individuales, que en conjunto constituyen la línea de célula de fabricación policlonal, cada una porta sólo una copia transcripcionalmente activa de un segmento de ácido nucleico distinto de interés, que codifica un miembro del anticuerpo policlonal recombinante de interés, y que cada copia se integra en el mismo sitio del genoma de cada célula. Las células constituyen la línea de célula de fabricación policlonal recombinante se seleccionan por su capacidad para mantener la copia integrada del segmento de ácido nucleico distinto de interés, por ejemplo por selección antibiótica. Las células que pueden constituir tal línea de célula de fabricación puede ser, por ejemplo, células de bacterias, de hongos, eucarióticas, tales como levadura, células de insectos o células de mamífero, especialmente líneas de células de mamífero inmortales tales como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, NSO), NIH 3T3, YB2/0 y células humanas inmortalizadas, tales como células HeLa, células HEK 293, o PER.C6. El término "anticuerpo recombinante" se usa para describir una molécula de anticuerpo o varias moléculas que se expresan de una célula o línea de célula transfectada con un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de la proteína que no se asocia naturalmente con la célula. Si las moléculas de anticuerpo son diversas o diferentes, el término "anticuerpo policlonal recombinante" aplica de conformidad con la definición de un anticuerpo policlonal. El término "recombinasa" se refiere a una enzima que cataliza la recombinación entre dos o más sitios de recombinación o secuencias de reconocimiento de recombinación. Las recombinasas útiles en la presente invención catalizan la recombinación en sitios de recombinación específicos que son secuencias de ácido nucleico específicas reconocidas por una recombinasa particular.

Los términos "sitio de reconocimiento de recombinasa" o "sitio de recombinación" describen una secuencia de ácido nucleico que sirve como sitio tanto para el reconocimiento como la recombinación por una enzima recombinasa específica de sitio. El sitio de reconocimiento de recombinasa comprende generalmente elementos de repetición invertidos cortos (11-13 bp en longitud) que flanquean una secuencia núcleo (6-8 bp en longitud) . Los sitios de reconocimiento de recombinasa también se llaman sitios objetivo de recombinasa, sitios de recombinación o sitios de integración e incluyen como ejemplos el sitio FLP, sitio loxP, sitios attP/attB, sitio six, sitio gix, sitio R y sitio Res. Los sitios de reconocimiento de recombinasa entre los cuales una recombinasa puede catalizar un evento de integración, extirpación o inversión se llaman sitios de reconocimiento de recombinasa alineados, por ejemplo son dos sitios FRT tipo silvestre considerados para alinearse, así como un sitio attB y un sitio attP constituyen un par alineado de sitios de reconocimiento de recombinasa, mientras que, un sitio FRT tipo silvestre y un sitio FRT mutante no constituyen necesariamente un par alineado de sitios de reconocimiento de recombinasa; esto depende de la mutación, estos términos también se usan intercambiablemente con el término sitio de integración. El término "análisis RFLP" se refiere a "análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción", un método por el cual el patrón en gel migratorio de los fragmentos de molécula de ácido nucleico se analiza después del desdoblamiento con las enzimas de restricción. El término "mezclado completo" ( "scrambling" ) describe situaciones donde dos o más miembros distintos de una proteína policlonal, donde cada miembro está comprendido de dos diferentes cadenas de polipéptido, por ejemplo cadenas VH y VL, se expresan de una célula individual. Esta situación puede resultar cuando la célula individual tiene integrado en su genoma, más de un par de elementos genéticos, donde cada par de elementos genéticos codifica un miembro distinto de la proteína policlonal. En tales situaciones, las combinaciones no pretendidas de las cadenas de polipéptido expresadas de los elementos genéticos pueden hacerse. "Mezclado completo de cadena VH-VL" es un ejemplo del mezclado completo definido arriba. El mezclado completo se presenta cuando combinaciones no pretendidas de polipéptidos VH y VL se producen de una célula donde dos diferentes segmentos de ácido nucleico que codifican VH y VL se integran en los sitios activos transcripcionales en la misma célula. Tal molécula de anticuerpo mezclada por completo posiblemente no mantiene la especificidad original, y de esta manera puede no tener ningún efecto terapéutico. El término "selección" se usa para describir un método donde las células adquieren una cierta característica que permite el aislado de células que no adquieren tal característica. Tales características pueden ser resistencia a un agente citotóxico o la producción de un nutriente esencial, enzima, o color. Los términos "gen marcador seleccionable", "gen marcador de selección", "gen de selección" y "gen marcador" se usan para describir un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen que confiere resistencia contra algún fármaco citotóxico tal como ciertos antibióticos, un gen capaz de producir un nutriente esencial que puede eliminarse del medio de crecimiento, un gen que codifica una enzima que produce metabolitos analizables o un gen que codifica un proteína de color que, por ejemplo, puede ordenarse por FACS) que se cointroduce en las células junto con los genes de interés. El término "transfección" se usa en la presente como un término amplio para introducir ADN externo en la célula. El término también es un medio para cubrir otros métodos equivalentes funcionales para introducir ADN externo en una célula, tal como por ejemplo, transformación, infección, transducción o fusión de una célula donadora y un célula aceptora . Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico en la cual la secuencia de ácido nucleico puede insertarse para transportarse entre diferentes ambientes genéticos y/o para la expresión en una célula hospedera. Un vector capaz de integrarse en el genoma de una célula hospedera en una ubicación específica, predeterminada, en el genoma se nombra en la presente "el vector para integración específica al sitio" . Si el vector porta elementos reguladores para la transcripción de la secuencia de ácido nucleico insertada en el vector (al menos un promotor apropiado) , el vector se llama en la presente "un vector de expresión" . El término "un vector que codifica el isotipo" se refiere a un vector que porta secuencias de ácido nucleico que codifican un isotipo de anticuerpo. En la presente especificación, "vector fagémido" y "vector de fago" se usan intercambiablemente. Los términos "plásmido" y "vector" se usan intercambiablemente. La invención se pretende que incluya tales otras formas de vectores, que sirvan en funciones equivalentes por ejemplo plásmidos, fagémidos y genomas de virus o cualesquiera de las moléculas de ácido nucleico capaces de dirigir la producción de una proteína deseada en un hospedero apropiado . El siguiente estilo de escritura "VH:LC" y "VH:VL" indica un par particular de una secuencia de cadena pesada variable con una cadena ligera o una secuencia de cadena ligera variable. Tales pares particulares de secuencias VH y V pueden ya sea secuencias de ácido nucleico o polipéptidos. En la presente invención, los pares VH y VL particulares confieren especificidad de enlace hacia el antígeno rhesus D.

Abreviaturas: Ab= anticuerpo. Anti-RhD rpAb= anticuerpo policlonal recombinante anti-Rhesus D. CASY= Sistema Contador + Analizador de Células. ELISA = Ensayo Inmunosorbente Ligado a la Enzima. FRT= Recombinasa Objetivo Flp. GFP= proteínas fluorescentes verdes. HDN= enfermedad hemolítica del recién nacido. ITP= púrpura trombocitopénico idiopático. LTR= repetición de terminal larga. mAb= anticuerpo monoclonal. pMCB= banco de célula maestra policlonal. PVDF = difluorido de polivinilideno. pWCB= banco de célula de trabajo policlonal. RBC= células de glóbulos rojos. RhD= Rhesus D. RhD(-)= Rhesus D negativo. RhD(+)= Rhesus D positivo. RhDVI= antígeno Rhesus D categoría VI. Anti-D= preparación de inmunoglobulina policlonal contra RhD de donadores hiperinmunes . SV40 poly A= secuencia de señal poli A de Virus 40 de simio. UCOE= elementos de abertura de cromatina ubicuos. 5'UTR= región no traducida 5' del ARNm. Breve Descripción de las Figuras Fig. ÍA: Diagrama de flujo que resume la generación de una línea de célula de fabricación policlonal recombinante y la producción de un anticuerpo policlonal recombinante . 1) Ilustra una estrategia de transfección por volumen; 2) ilustra una estrategia de transfección por semi-volumen y 3) ilustra una estrategia de transfección individual. A) Ilustra la colección de vectores de expresión del anticuerpo anti-RhD (líneas horizontales) , las puntas de flecha ilustran el agrupamiento de los vectores. En la estrategia 1, los vectores se agrupan en volumen, en la estrategia 2 se agrupan en fracciones más pequeñas (semi-volumen) , mientras que en la estrategia 2 se mantienen separados uno del otro (individual) . B) Ilustra la transfección, donde el número de tubos depende del agrupamiento de los vectores que constituyen la colección. C) Ilustra la selección de células cuyo sitio específicamente tiene integrado un segmento de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-RhD en el genoma de la célula hospedera, D) Ilustra la generación de una colección de reserva de anticuerpo anti-RhD, donde las células seleccionadas constituyen los segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-RhD integrado se almacenan en el congelador. Es opcional el banco de clones individuales o agrupar los clones. E) Ilustra el inicio de la fase de fabricación, donde los clones de la solución de reserva se descongelan (ya sea individualmente, de fracciones más pequeñas o del grupo) . F) Ilustra la etapa en la producción deonde la línea de célula policlonal se propaga para sembrar un bioreactor más grande (las etapas de sembrado intermediarias son una opción no obstante que no se ilustran) . En la estrategia 2 y 3, esta es la etapa donde la solución de reserva de clon celular policlonal no más grande se mantiene como clones individuales o fracciones de semi-volumen, pero se agrupan en una colección de células, formando una línea de células de fabricación policlonal recombinante (esta línea de células de fabricación policlonal también puede almacenarse como una solución de reserva congelada) . G) Ilustra la producción final obtenida de la fabricación del bioreactor. Siguiendo la fase de producción, la composición de proteína policlonal se cosecha para purificación y caracterización del producto. Fig. IB: Diagrama de flujo que resume la generación de un pWCB/pMCB y un sub-pWCB de células hospederas individualmente transfectadas y el sembrado de una línea de célula de fabricación policlonal . A) Ilustra una colección que comprende segmentos de ácido nucleico que codifican la revión variable, las puntas de flecha ilustran los miembros individuales de la colección. B) Ilustra la transfección, donde cada miembro individual de la colección se usa para transfectar una célula hospedera. La transfección requiere como mucho tubos separados que son miembros individuales de la colección. C) Ilustra la selección de células que tienen integrado un segmento de ácido nucleico que codifica la región variable en su genoma en una manera estable, D) Ilustra la selección de líneas de células individuales que tienen relaciones de proliferación similar y/o productividad, por ejemplo al clonar y analizar células sencillas agrupadas por FACS. Esta etapa es opcional en la generación de un pWCB/pMCB y también puede realizarse después de la etapa E. E) Ilustra la generación de una solución de reserva de colección congelada, constituida de n veces de líneas de células individuales cada una expresando un miembro de la colección que comprende segmentos de ácido nucleico que codifican la región variable usados para la transfección. Esto es opcional al banco de clones individuales en la solución de reserva de colección congelada antes de la generación de un pWCB/pMCB. F) Ilustra el mezclado de líneas de células individuales, donde las ampollas de la solución de reserva de colección individual se descongelan y se expanden en cultivos celulares separados, seguido por el mezclado de un número predefinido de células de cada cultivo en un cultivo celular sencillo. G) Ilustra la generación de un pWCB/pMCB al congelar alícuotas del cultivo celular mezclado en F, por ello generando una colección de viales. H) Ilustra la generación de un sub-pWCB al expandir un vial sencillo del pMCB y congelar alícuotas con aproximadamente el mismo número de células como en el vial del pMCB. I) Ilustra la generación de una línea de células de fabricación policlonal de una serie de sembrado (etapas de sembrado intermedias que no se ilustran) iniciadas ya sea desde el pWCB o el sub-pWCB. Fig. 2: vector de despliegue de fagos: Em351, un vector E. coli usado para generar una colección de despliegue de fagos anti-RhD Fab al insertar la región variable de cadena pesada y los fragmentos de cadena ligera amplificados de un donador en el vector en los sitios de restricción Ascl/Xhol y Nhel/Notl indicados, respectivamente. El vector comprende los siguientes elementos: pro Amp y Amp= promotor y gen de resistencia a la ampicilina. pUC Ori= origen de replicación. CHl Humano= secuencia que codifica el dominio 1 de cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina humana. Material = insertos de secuencia irrelevantes que se cortan durante la inserción de los fragmentos de cadena ligera y pesada. P tac y t lac Z = promotores bacteriales. PelB = líderes PelB bacteriales modificados para direccionar la expresión del Fab al espacio periplásmico del E. coli. Mycut= sitio de reconocimiento de proteinasa. Detención ámbar = codon de detención ámbar. gIII= gen III truncado de fago M13 (de 198 bp a la terminal C) . Fig. 3A-3C: Alineación de las secuencias de ácido nucleico que codifican la cadena pesada variable (VH) de los 56 clones RhD seleccionados . Los nombres de los clones individuales se indican a la derecha del alineado, y la posición de las regiones CDR se indican arriba del alineado. Fig. 4A-4E: Alineación de las secuencias de ácido nucleico que codifican la cadena ligera completa de los 56 clones RhD seleccionados. Los nombres de los clones individuales junto con una indicación de si esta es una cadena Kappa o Lambda se indican a la derecha del alineado, y la posición de las regiones CDR se indican arriba del alineado. Fig. 5: Alineación de las secuencias de aminoácidos que corresponden al VH de los 56 clones RhD seleccionados. Los nombres de los clones individuales se indican a la derecha del alineado, y la posición de las regiones CDR se indican arriba del alineado. Fig. 6A-6B: Alineación de las secuencias de aminoácidos que corresponden a VL de los 56 clones RhD seleccionados, en donde (A) corresponde a las cadenas Kappa y (B) a las cadenas Lambda. Los nombres de los clones individuales se indican a la derecha del alineado, y la posición de las regiones CDR se indican arriba del alineado. Fig. 7: Vector de expresión Neo: Representación esquemática del vector de expresión mamífero usado para facilitar la integración específica al sitio en el genoma de la célula hospedera de los segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-RhD. El vector comprende los siguientes elementos: pro amp y AMP= gen promotor y de resistencia a la ampicilina. Origen pUC = origen pUC de replicación. Sitios de enzima de restricción: Xhol, AscI, Nhel y Notl. Pl/P2= conjunto promotor que impulsa la expresión de la cadena ligera y la cadena pesada IgG, respectivamente. LH = secuencia líder de cadena pesada. VH = secuencia que codifica la cadena pesada variable de un anti-RhD Ab. Constante pesada IgGl humana = Secuencias que codifican la cadena pesada IgGl constante humana. RBG polyA = secuencia de señal polyA de ß-globina de conejo. BGH polyA = secuencia de señal polyA de hormona de crecimiento de bovino. LK = secuencia líder de cadena kappa. Cadena ligera = secuencia de codificación para la cadena ligera de un anti-RhD Ab. Sitio FRT= secuencia de reconocimiento de recombinasa Flp. Neomicina = gen de resistencia a la neomicina. SV40 polyA = secuencia de señal polyA de virus 40 de simio. Fig. 8: Cromatogramas de intercambio de cationes de la composición anti-RhD rpAb de alícuotas 3948 y 3949 después de 9 semanas de cultivo. El diagrama inferior corresponde a la alícuota 3949 y el superior a la alícuota 3948. El eje Y del diagrama superior se ha desplazado con objeto de separarlo del diagrama inferior. Los picos A - J comprenden anticuerpos diferentes en carga neta y anticuerpos individuales que aparecen con carga heterogénea. Fig. 9: Foto en gel que muestra el análisis Hinfl RFLP en producto RT-PCR derivado de alícuotas de línea celular policlonal 3948+ y 3949+ (FCW065) que producen anti-RhD rpAb después de 11 semanas de cultivo. Las bandas que pueden asignarse a clones específicos se identifican. Fig. 10: Patrones T-RFLP de cadenas ligeras de anticuerpo anti-Rhesus D a partir de un cultivo celular policlonal que expresa anti-RhD rpAb con ocho diferentes anticuerpos anti-Rhesus D. Los ocho diferentes clones anti-Rhesus D se asignan a los picos indicados por flechas . Fig. 11: Patrones T-RFLP de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo anti-Rhesus D a partir de un cultivo celular policlonal que expresa anti-RhD rpAb con veinticinco diferentes anticuerpo anti-Rhesus D en un punto de tiempo dado. Los veinticinco diferentes clones anti-Rhesus D se asignan a los picos indicados por las flechas. Fig. 12: Distribución del ADNc estimado por T-RFLP de ocho diferentes secuencias que codifican la cadena pesada anti-Rhesus D de un cultivo celular policlonal que se cultiva durante cinco semanas . Fig. 13: Muestra el contenido relativo (%) de un anti-RhD rpAb con ocho diferentes anticuerpos analizados usando cromatografía de intercambio de cationes. Los picos cromatográficos integrados se asignan a anticuerpos individuales de los tiempos de retención y patrones de pico obtenidos de anticuerpos sencillos analizados individualmente usando cromatografía de intercambio de cationes bajo condiciones idénticas. Fig. 14: Cromatograma de intercambio de cationes de un anti-RhD rpAb con veinticinco miembros individuales de la muestra obtenida después de 4 semanas de cultivo. Los picos AC1 hasta 25 comprenden anticuerpos que difieren en la carga neta y anticuerpos individuales que aparecen con carga heterogénea. Figs 15A-15C: (Fig. 15A) Muestra una comparación de la potencia de tres lotes, Sym04:21, Sym04:23, y Sym04:24, de anti-RhD pAb con 25 miembros individuales, producido por cultivo de lote de alimentación en escala de 5 L. El enlace de pAb a eritrocitos positivos RhD se mide por FACS y la intensidad de fluorescencia media (MFl) se muestra como una función de la concentración pAb en ng/ml. Además, la actividad funcional de un anti-RhD pAb con 25 miembros individuales se midió en Sym04:21 y Sym04:24 en un ensayo ADCC/fagocitosis combinado. (Fig. 15B) Muestra los resultados ADCC como un porcentaje de lisis específica de eritrocitos RhD positivos y RhD negativos como una función de la concentración pAb en ng/ml. (Fig. 15C) Muestra el porcentaje de fagocitosis de eritrocitos RhD positivos y RhD negativos como una función de la concentración pAb en ng/ml. Figs. 16A-16D: Perfiles de cromatografía de intercambio de cationes que exhiben las muestras tomadas en diferentes etapas durante el proceso en cadena abajo de una muestra anti-RhD rpAb que contiene 25 miembros individuales representados por el material colectado después de la elución de captura (Fig. 16A) , Sephadex G-25 (Fig. 16B) , DEAE-Sepharose (Fig. 16C) , y MEP Hypercel (Fig. 16D) . Descripción Detallada de la Invención £72 sistema de expresión de proteína policlonal recombinante La presente invención proporciona un sistema de expresión de anticuerpo policlonal recombinante para la fabricación consistente de anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD (anti-RhD rpAb) de una o algunas líneas celulares. Una de las ventajas mayores del método de fabricación de la presente invención es que todos los miembros que constituyen el anti-RhD rpAb pueden producirse en uno o algunos bioreactores o equivalentes del mismo. Adicionalmente, la composición anti-RhD rpAb puede purificarse del reactor como una preparación sencilla sin tener que separar los miembros individuales que constituyen el anti-RhD rpAb durante el proceso. En contraste, si se busca para imitar una composición anti-RhD rpAb al mezclar anticuerpos monoclonales anti-RhD rpAb purificados (anti-RhD mAbs) (como por ejemplo propuesto en WO 97/49809) deberá requerir la fabricación separada en un bioreactor, de cada anti-RhD mAb para incluirse en la composición y más similarmente los anticuerpos deberán ser purificados individualmente como pozo. Tal producción de una mezcla anti-RhD mAb deberá ser muy costosa, y el tiempo y espacio consumido comparado al método de la presente invención para producir un policlonal recombinante anti-RhD. De esta manera, el método como se describe en WO 97/49809 deberá resultar naturalmente en un límite practico al número de anti-RhD mAbs que deberá incluirse en tal mezcla, mientras tanto la tecnología como se describe en la presente generalmente puede producir un anticuerpo policlonal con como muchos miembros individuales como se desea. Además, los miembros individuales de un anti-RhD rpAb de la presente invención se producen bajo exactamente las mismas condiciones (en el mismo reactor de fabricación) , de esta manera las modificaciones posteriores a la traducción uniforme se aseguran comparada a una mezcla de anti-RhD mAbs donde las diferencias de producción ligera de lote a lote puede cambiar las propiedades del producto. Con objeto de obtener una línea de células de fabricación policlonal recombinante la cual es capaz de expresar anti-RhD rpAb sin pérdida significante de la diversidad que caracteriza la policlonalidad durante el periodo de producción, las células individuales dentro de la mezcla de células que componen la línea de células de fabricación policlonal se necesitará par ser tan uniforme como sea posible. Las técnicas de expresión de anticuerpo monoclonal convencional usando integración aleatoriamente son indeseables para la producción de un anticuerpo policlonal recombinante, ya que la naturaleza aleatoria de los procesos causará el número y posiciones de las secuencias de ácido nucleico integradas para variar de célula a célula. De esta manera, si el anticuerpo policlonal recombinante se produce por tales protocolos tradicionales, es probable que resulte en un cultivo celular heterogéneo con relaciones de expresión diversas de miembros individuales de la proteína policlonal, e inestabilidad genética debido a efectos posicionales del segmento de ácido nucleico integrado. Esto resultará más similarmente en una expresión sesgada de los miembros que constituyen la proteína policlonal . La introducción del segmento de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-RhD en un sitio genómico predefinido es por lo tanto deseado, esto puede en principio alcanzarse por recombinación homologa. Sin embargo, pertenece al dominio de eventos recombinantes ilegítimos, la recombinación homologa es muy ineficiente y también puede resultar en la introducción de varias cpias de segmentos de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-RhD variante en el genoma de una célula sencilla. Para circunvenir estos problemas el sistema de expresión de la presente invención usa integración especifica del sitio en el genoma de las células hospederas individuales. El sistema de la presente invención abarca una colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD la integración especifica del sitio que comprende los segmentos de ácido nucleico variante que codifica la anti-RhD rpAb. Los segmentos de ácido nucleico individual de la colección se insertan en células individuales en la misma ubicación cromosomal pre-establecida por la integración especifica del sitio a un sitio de reconocimiento de recombinación predefinido o por un procedimiento para cambiar el casette mediado por recombinasa, por ello generan una línea celular, en donde las células individuales expresan un miembro distinto del anti-RhD rpAb. Como se describe abajo, las integraciones múltiples podrían ocurrir en algunas de las células que constituyen la línea celular de fabricación policlonal recombinante. Esto, sin embargo, no se considera que plantee un problema de manera que una mayoría de las células individuales expresan un miembro distinto sencillo del anti-RhD rpAb. Preferiblemente esto se realiza al asegurar un integrante sencillo en el genoma de la mayoría de las células individuales o si hay más integrantes, asegurar que solamente uno se transcribe. Las recombinasas tales como Cre, Flp, beta-recombinasa, Gln, Pin, PinB, PinD, R/RS, Tn3 resolvasa, XerC/D integrasa/recombinasa, lambda integrasa, o fago FC31 integrasa puede usarse. Las recombinasas adecuadas para la integración en la ubicación cromosomal pueden proporcionarse ya sea (i) por la expresión del genoma propio a las células del genoma en el cual el segmento de ácido nucleico se introduce, (ii) al ser codificados operativamente por el vector insertado en las células, (iii) a través de la expresión de una segunda molécula de ácido nucleico, o (iv) como una proteína. En una modalidad preferida, el segmento de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-RhD contenido en un vector individual de la colección se integra en un lugar que media la transcripción de nivel alto y la expresión del segmento de ácido nucleico del anticuerpo anti-RhD, una llamada "mancha caliente". La línea celular hospedera usada es preferiblemente una línea de células de mamífero que comprende aquellos usados típicamente para la expresión de proteína biofarmacéutica, por ejemplo, células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, NSO), TB2/0, NIH 3T3 y células de humano inmortalizadas, tales como células HeLa, células HEK 293, o PER.C6. En la presente invención las células CHO se usaron. Sin embargo, una persona de experiencia ordinaria en la técnica deberá fácilmente ser capaz de substituir células CHI con otras células de mamífero como se describen, o aún utilizar otros tipos de células, incluyendo células de planta, células de levadura, células de insecto, hongos y bacterias. De esta manera, la elección del tipo de células no se pretende para limitar a la invención. En una modalidad preferida, una línea celular de mamífero que contiene una mancha caliente pre-caracterizada, que median los niveles de expresión altos del anti-RhD rpAb se usa para la fabricación. En una modalidad aún más preferida, la línea celular de mamífero contiene un sitio de reconocimiento de recombinasa sencilla ubicado en una mancha caliente pre-identificada. En una modalidad adicional de la presente invención, los segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-RhD se integran en una manera especifica en el sitio utilizando el mismo sitio de integración cromosomal en las células hospederas. Tal incorporación en un sitio especifico sencillo minimiza efectos posicionales de otra manera vistos con integración aleatoria o integración en sitios múltiples en un genoma. Además, el mezclado completo entre cadenas VH y VL no es probable que ocurra cuando se usa un sitio especifico para integración. En una línea celular hospedera que comprende un sistema de integración especifico en el sitio, las células hospederas transfectadas individuales se expresan del mismo anticuerpo general aparte de las diferencias observadas en la región variable del anticuerpo. Por lo tanto, un mayoría de células dentro de tal grupo de células deberán mostrar características similares con respecto a la productividad y estabilidad genética y por lo tanto esta tecnología ofrece la posibilidad de una producción controlada de un anti-RhD rpAb. Además de la variabilidad de las regiones VH y VL, en particular las regiones CDR, las regiones constantes también se pueden variar con respecto al isotipo. Esto implica que un par particular de VH y VL puede producirse con isotipos de cadena pesada constante variante, por ejemplo la IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2 , IgM, igD e IgE humano. De esta manera, un anti-RhD rpAb puede comprender moléculas de anticuerpo que se caracterizan por diferencias de secuencia entre las moléculas del anticuerpo individual en la región variable (región V) así como en la región constante. La composición anti-RhD rpAb puede estar compuesta de anticuerpos con cualquier isotipo de cadena pesada mencionada arriba o combinaciones de los mismos. Las composiciones anti-RhD rpAb preferidas contienen regiones constantes IgGl, regiones constantes IgG3 o regiones constantes IgGl e IgG3. En una modalidad preferida de la presente invención cada uno o alguno de los pares VH y VL se expresan con una cadena pesada constante IgGl, IgG3 , IgAl y/o IgA2 humano . Con objeto de proporcionar una colección de segmentos de ácido nucleico que codifican al anticuerpo anti-RhD un número de métodos conocidos en el arte pueden utilizarse. Una primera colección comprende segmentos que codifican VH y V puede ya sea generarse por técnicas de combinación (por ejemplo, EP 0 368 684) o técnicas que mantienen el apareamiento cognado (los pares de secuencias que codifica la región variable se deriva de la misma célula, descrita en WO 05/042774 que reivindica la prioridad de la solicitud de patente no publicada DK 200400782) . Además, las colecciones de los segmentos que codifican VH y VL pueden generarse al incorporar fragmentos de gen CDR aislado, en una estructura apropiada (por ejemplo, Soderlind, E. et al., 2000. Nat. Biotechnol. 18, 852-856), o por mutación de una o más secuencias que codifican VH y VL anti-RhD. Esta primera colección es separación por exclusión para segmentos de ácido nucleico que codifica VH y VL para la producción de anticuerpos o fragmentos con especificidad enlazada hacia RhD, por ello generan una colección de segmentos de ácido nucleico que codifica anti-RhD Ab. En particular con colecciones de combinación la separación por exclusión se procede por una etapa enriquecida por ejemplo un llamado etapa de bioinmunoplaqueteo. Las tecnologías de bioinmunoplaqueteo conocidas son despliegue de fagos (Kang, A.S. et al., 1991. Proc Nati Acad Sci USA 88, 4363-4366), despliegue de ribosomas (Schaffitzel, C. et al. 1999. J. Immunol . Methods 231, 119-135), despliegue de ADN (Culi, M.G. et al. 1992. Proc Nati Acad Sci USA 89, 1985-1986), despliegue de péptido ARN (Roberts, R.W. Szostak, J.W. 1997 Proc Nati Acad Sci USA 94, 12297-12302), despliegue covalente (WO 98/37186), despliegue de superficie bacterial (Fuchs, P. Et al. 1991. Biotechnology 9, 1369-1372), despliegue de superficie de levadura (Boder, E.T., Wittrup, K.D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553-557) y despliegue de virus eucariótico (Grabherr, R. , Ernst, W. , 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 185-192) . FACS y selección de perlas magnéticas también aplican para los propósitos de enriquecer (inmunoplaqueteo) usando antígeno etiquetado. La separación por exclusión para aglutinantes Rhesus D se llevan a cabo generalmente con ensayos de inmunodetección tales como aglutinación, FACS, ELISA, FLISA y/o ensayos de inmunotinción.

Después de la separación por exclusión, la sub-colección generada de segmentos de ácido nucleico que codifica VH y VL, generalmente necesita transferirse del vector de separación por exclusión hasta unos vectores de expresión adecuados para la integración especifica del sitio y la expresión en la célula hospedera deseada. Es importante que las secuencias que codifican los pares VH:VL individuales se mantengan durante la transferencia. Esto puede ya sea alcanzarse al tener los miembros individuales de la sub-colección separada y movimiento de las secuencias que codifican VH y VL uno por uno. Alternativamente, los vectores que constituyen la sub-colección se agrupan, y las secuencias que codifican los pares VH:VL se mueven como segmentos, manteniendo las secuencias que codifican VH y V juntos durante la transferencia. Este proceso también es la transferencia de masa terminada, y permite una transferencia fácil de todos los pares VH:V seleccionados de un vector a otro. En una modalidad adicional de la presente invención, una composición de anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD comprende un subconjunto definido de anticuerpos individuales, con base en la característica común que muestran enlace al menos un epitopo en el antígeno Rhesus D por ejemplo, epDl, epD2, epD3 , epD4, epD5, epD6/7, epD8, y/o epD , pero no o muy débilmente para antígenos Rhesus C, c, E, e. Preferiblemente, la composición anti-RhD rpAb está compuesta de al menos un anticuerpo que enlaza a epD3 , epD4 , y epD9 (antígeno VI categoría RhD enlazado al anticuerpo) y anticuerpos adicionales los cuales al menos en combinación enlazados a los epitopos restantes epDl, epD2, epD5, epD6/7 y epD8 , por ejemplo un anticuerpo contra RhD antígeno categoría II o III, o un anticuerpo enlazado al antígeno RhD categoría IV o V combinado con un anticuerpo contra el antígeno categoría VII. Típicamente, una composición anti-RhD rpAb tiene al menos 5, 10, 20, 50, 100 ó 500 miembros variantes distintos. El número preferido de miembros variantes está en el rango entre 5 y 100, aún más preferidos entre 5 y 50 y más preferidos entre 10 y 25. Una modalidad más de la presente invención es una línea de célula de fabricación policlonal recombinante, que comprende una colección de células transfectadas con una colección de segmentos de ácido nucleico que codifican anticuerpos policlonales anti-RhD, en donde cada célula en la colección es capaz de expresar un miembro de la colección, el cual codifica un miembro distinto de un rpAb anti-RhD o fragmento el cual se localiza en el mismo sitio en el genoma de células individuales en la colección, en donde el segmento de ácido nucleico no está asociado naturalmente con la célula en la colección. En una modalidad adicional los segmentos de ácido nucleico variantes que codifican el rpAb anti-RhD son todos derivados de secuencias que ocurren naturalmente, por ejemplo, aisladas de un donador, ya sea como pares VH:VL combinados o como pares afines, y no derivados por mutación. Las composiciones de células que contienen ácidos nucleicos variantes localizados en un sitio específico único en el genoma con cada célula que ha sido descrita en WO 02/44361. Este documento describe el uso de las células para identificar moléculas que tienen propiedades deseables, pero la referencia no da con la provisión de un sistema de producción o con la provisión de anticuerpo policlonal caracterizado por un enlazamiento específico a un antígeno. La célula hospedera Una célula hospedera apropiada comprende, en una región de su genoma, uno o más sitios de recombinación apropiados, esto es, secuencias de ácido nucleico reconocibles por una o más enzimas de recombinasa, de ahí también secuencias de reconocimiento de recombinasa denominadas . Para ser capaces de ser seleccionadas para integrantes, (esto es, células que tienen una copia integrada de un segmento de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-RhD en un sitio de integración) el sitio de recombinación se liga operablemente a un primer gen de selección (por ejemplo, un gen de resistencia antibiótica) situado en 3' (en la dirección 3') hacia el sitio de recombinación. Además, un promotor débil (por ejemplo, un promotor temprano SV40 truncado) y un codón de inicio de transcripción pueden estar situados en 5' (en la dirección 5') hacia el sitio de recombinación que constituye una parte integral de la región de codificación del marcador de resistencia. Así, el codón de inicio de transcripción inicia el comienzo de la transcripción del gen de selección en la célula hospedera antes de transfección con la colección de vectores de expresión anticuerpo anti-RhD que codifican el rpAb anti-RhD. Preferiblemente, la línea de célula hospedera tiene solamente un sitio de recombinación, y si tienen más de una secuencia de reconocimiento de recombinasa, estas deberían ser no homologas como se describe en la sección "El vector para integración especifica del sitio", y solamente permitir para una integración única en el genoma. Las células hospederas para integración específica del sitio como se describen anteriormente pueden ser generadas de cualquier célula la cual puede integrar ADN dentro de sus cromosomas o retener elementos cromosomales extras tales como minicromosomas, YAC (cromosomas artificiales de levadura) , MAC (cromosomas artificiales de ratón) , o HAS (cromosomas artificiales humanos) . Los MAC y HAC se describen en detalle en WO 97/40183, por este medio incorporada por referencia. Preferiblemente las células mamíferas tales como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, Sp2/0 ó células NSO), fibroblastos tales como NIH 3T3, y células humanas inmortalizadas, tales como células HeLa, células HEK 293, o PER.C6, se usan. Sin embargo, las células eucarióticas o procarióticas no mamíferas, tales como células de planta, células de insecto, células de levadura, hongos, E. coli, etc., también se pueden emplear. En una modalidad de la presente invención, la línea de células la cual está para ser usada como material de inicio es subclonada por realización de una dilución de limitación así llamada de la línea de células baja para un nivel de célula único, seguido por crecimiento de cada célula única a una población nueva de células antes de transfección con la colección de vectores de interés . Tal subclonación también se puede realizar posteriormente en el proceso de selección de la línea de célula correcta, si es necesario. Las células hospederas para integración específica de sitio se pueden obtener por transfección con un plásmido de integración aleatoriamente que comprende un promotor débil (por ejemplo, un promotor temprano SV40 truncado) , un codón de inicio de transcripción, un sitio de recombinación situado en 3' para el codón de inicio. Preferiblemente, el plásmido de integración también comprende un gen marcador acoplado a un primer gen de selección. Un ejemplo de tal plásmido de integración es el Pert/LacZeo2 de Invitrogen (Carisbad, CA) . El gen marcador se puede usar para evaluar la resistencia relativa de expresión en la localización genómica usada para inserción de una secuencia de ácido nucleico de interés. Un gen marcador, (por ejemplo, beta-galactosidasa (LacZ) , proteína fluorescente verde (GFP) o un marcador de superficie de célula) puede estar ligado al primer gen de selección en una fusión de gen o ligado transcripcionalmente por un IRES (sitio completo ribosomal interno) tal que la coexpresión del primer gen de selección y el gen marcador ocurren. El uso de un gen de selección que estabiliza una presión de sobrevivencia en las células (por ejemplo, resistencia al fármaco o disminución nutricional) combinado con un marcador que permite para evaluación de los niveles de expresión relativos de línea de célula a línea de célula es un método eficiente para asegurar producción alta de células las cuales mantienen el plásmido integrado dentro del genoma. Las células con la secuencia de recombinación insertada en un espacio con transcripción particularmente activa llevarán a expresión alta del gen marcador por ejemplo, GFP o LacZ. Los expresores altos se pueden seleccionar por ordenamiento de células activadas de fluorescencia (FACS) y clonadas. En este punto también será analizado si el integrante es un integrante único. Esto se puede realizar por PCR en tiempo real y manchado de Southern. La preparación de células que tienen un sitio FRT en una ubicación predeterminada en el genoma se describe en por ejemplo, US 5,677,177. Otro método para evaluación de niveles de expresión relativa de células transfectadas con un plásmido de integración es para realizar un paso de extirpación de integración adicional en las células generadas como se describió anteriormente. Este acumulado de células seleccionadas se transfectan nuevamente, con un plásmido que codifica una recombinasa que corresponde al sitio de recombinación del plásmido de integración y un segundo plásmido que contiene un segundo marcador de selección sin un codón de inicio, la región de codificación de la cual se precede por una secuencia de recombinación de la misma manera que corresponde al primer plásmido de integración. Este segundo plásmido también contienen la secuencia de codificación para una proteína marcadora fluorescente (por ejemplo, GFP (o proteínas fluorescentes equivalentes) guiada por un promotor apropiado. La recombinasa media la integración de este plásmido en el genoma de la célula hospedera donde una secuencia de recombinación similar previamente ha sido insertada por el plásmido de integración. Las células con la secuencia de recombinación insertada en un espacio con transcripción particularmente activa llevarán a expresión alta de la proteína fluorescente. Los expresores altos se seleccionan por ordenamiento de células activadas por fluorescencia (FACS) y clonados . Los clones con expresión consistentemente alta y que contienen una copia del plásmido insertado son transfectados con la recombinasa y seleccionados por el primer marcador de selección, las células de identificación donde la segunda secuencia del plásmido ha sido removida por la recombinasa, haciendo al primer marcador de selección trabajar nuevamente. Estas células todavía contienen la primera secuencia de recombinación insertada en un espacio caliente transcripcional y ahora se pueden usar para la expresión de genes de interés . Las líneas de células, las cuales logran expresión alta del gen marcador en integración de una copia única del plásmido, se usan para transfección con la colección de expresión de anticuerpo anti-RhD. El sitio de recombinación en la célula hospedera preferiblemente se localiza en un gen o región de expresión particularmente activa, esto es, en un espacio caliente así llamado. El vector para integración específica del sitio. Un vector apropiado comprende un sitio de recombinación apropiado ligado a un gen de selección apropiado diferente del gen de selección usado para construcción de la célula hospedera. Los genes de selección apropiados para uso en expresión de células mamíferas incluyen, pero no se limitan a, genes que hacen posible la selección nutricional, tal como gen de timidina cinasa (TK) , gen de sintetasa de glutamina (GS) , gen de sintasa de triptofano (trpB) o gen de histidinol deshidrogenasa (hisD) . Además, los marcadores de selección son agentes de resistencia antimetabolito que confieren resistencia al fármaco, tal como el gen de reductasa de dihidrofolato (dhfr) el cual se puede seleccionar con medio deficiente de hipoxantina y timidina y además seleccionado con metotrexato, el gen de fosforibosi1transferasa de xantina-guanina (gpt) , el cual se puede seleccionar con ácido micofenólico, el gen de fosfotransferasa de neomicina (neo) el cual se puede seleccionar con G418 en células eucarióticas y neomicina o canamicina en células procarióticas, el gen de fosfotransferasa de higromicina B (hyg, hph, hpt) el cual se puede seleccionar con higromicina, el gen de N-acetil-transferasa de puromicina (pac) el cual se puede seleccionar con puromicina o el gen de deaminasa de Blasticidin S (Bsd) el cual se puede seleccionar con blasticidina. Finalmente, los genes que codifican proteínas que hacen posible el ordenamiento por ejemplo, por citometría de flujo también se pueden usar como marcadores de selección, tales como proteína fluorescente verde (GFP) , el receptor de factor de crecimiento de nervio (NGFR) u otras proteínas de membrana, o beta-galactosidasa (LacZ) . En un aspecto de la presente invención, el gen seleccionable no está precedido por un promotor ni equipado con un codón de iniciación de traducción. El promotor y el codón ATG se proporcionan en el sitio de recombinación específico de sitio seleccionado. Si el vector es integrado en una ubicación diferente a la del sitio de recombinación seleccionado en el genoma de la célula hospedera, no puede ocurrir expresión de este segundo gen de selección debido a que carece de promotor y codón de iniciación. Si la integración ocurre en el sitio de recombinación seleccionado en el genoma de la célula hospedera, el segundo gen de selección se expresa y la expresión del primer gen de selección se pierde. La integración puede por ejemplo, ser llevada a cabo usando una secuencia de reconocimiento de sitio FRT/recombinasa Flp así llamada (5'-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3 ' (SEQ ID NO: 1) o variantes de esta) en el genoma y en el vector para integración especifica del sitio junto con la recombinasa Flp o mutantes de esta de Saccharomices cerevisiae. Sin embargo, otros sistemas de recombinasa igualmente bien pueden ser usados, incluyendo aquellos de Cre recombinasa y una variedad de sitios lox tales como loxP de bacteriófago Pl o variantes de mutantes de estos, por ejemplo, lox66, lox71, lox76, lox75, lox43, lox 44 y lox 511 (C. Gorman y C. Bullock, Curr. Opinión in Biotechnology 2000, 11:455-460) o por uso de interfase de fago FC31 o lambda integrasa, la cual lleva a cabo recombinación entre el sitio attP y el sitio attB (A. C. Groth y colaboradores, PNAS 2000, 97:5995-6000). Más sistemas de recombinasa que se pueden utilizar en la presente invención son, pero no se limitan a, el sistema ß-recombinasa-seis de plásmido bacterial pSMl9035 (Rojo y Alonso 1995) , el sistema Gin-gix de bacteriófago Mu (crisona y colaboradores, 1994), el sistema R-RS de Zygosaccharomyces rouxil (Onouchi y colaboradores, 1995), o Tn3 resolvasa la cual reconoce sitios de recombinación res (Stara y colaboradores, 1994) o el sistema XerC/D de E coli (Blakely y Sherratt 1994) . Una variante más del sistema de recombinación específico de sitio, denominado intercambio mediado de cásete de recombinasa (RMCE) , utiliza sitios de recombinación no homólogos. En un sistema tal, dos sitios de recombinación no idénticos se introducen dentro del genoma hospedero para la generación de sitios objetivos específicos. Los sitios de recombinación que corresponden a aquellos que flanquean el sitio objetivo también flanquean el constructo que contiene el gen de interés. Un sistema tal ha sido descrito en WO 99/25854, el cual de esta manera se incorpora por referencia en su totalidad. El uso de sitios de recombinación no homólogos fue mostrado para suprimir extirpación del gen de interés del cromosoma. Los sitios de recombinación no idénticos pueden estar compuestos de cualquiera de los sitios de recombinación descritos anteriormente mientras que las recombinasas que corresponden están provistas y los sitios no pueden recombinar uno con otro. Por ejemplo, sitios de recombinación no idénticos pueden consistir de un sitio FRT y un sitio FRT mutante que utiliza una recombinasa Flp para integración (Schlake y Bode 1994, Biochemistry 33, 12746-12751), un sitio loxP y un sitio loxP no compatible mutante que utiliza la recombinasa Cre (Langer y colaboradores, 2002, Nucleic Acids Res. 30, 3067-3077) o un sitio FRT y un sitio loxP que utiliza recombinasas Flp y Cre para la integración (Lauth y colaboradores, 2002, Nucleic Acids Res. 30, 21, ell5) . Además, un sistema que usa dos sitios FRT diferentes se ha descrito en Verhoeyen y colaboradores, Hum. Gene Ther. 2001 12, 933-44. En este planteamiento el plásmido de integración se transfiere a las células hospederas por infección retroviral. El plásmido consiste de una combinación de un gen reportero y un primer gen marcador de selección además de los elementos retrovirales requeridos para infección. El 3 'LTR retroviral contiene dos sitios FRT diferentes. Un gen marcador de selección segundo no funcional, el cual carece de un promotor y el codón de iniciación de traducción se localiza en 3' hacia estos sitios. Durante el proceso de infección retroviral la secuencia 3 'LTR se copia a la 5 'LTR. Esto resulta en el flanqueo del gen reportero y el primer gen marcador de selección por dos sitios FRT diferentes en cada lado. La secuencia entre los sitios FRT exteriores puede ser intercambiada contra un segmento de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-RhD bajo el control de un promotor fuerte. El cásete que contiene el segmento de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-RhD se flanquea por el mismo conjunto de sitios FRT. La reacción se cataliza por la recombinasa Flp. En el plásmido de intercambio transfectado un elemento IRES y un codón de iniciación de traducción se localizan además en la dirección 3' del segmento de ácido nucleico. Después de reemplazamiento del cásete integrado el gen marcador de selección no funcional localizado en la secuencia 3' LTR fuera de los sitios FRT se activa por el codón de iniciación de traducción proporcionado por el cásete que constituye el segmento de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-RhD. El estado de intercambio además puede ser enriquecido si un marcador de selección negativo (por ejemplo, timidina cinasa) está presente en el vector de integración. El vector de integración también puede ser transferido a las células hospederas por transfección estándar. En este caso el cásete de integración es flanqueado por un sitio FRT en la terminación 5' y un sitio FRT' diferente en la terminación 3'. El gen marcador de resistencia segundo deficiente de ATG está posicionado además en la dirección 3' del sitio FRT' 3 A El intercambio para un segmento de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-RhD procede como se describe para el sistema retroviral . Otro sistema que previene la extirpación del segmento de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-RhD después de su integración específica de sitio en el cromosoma es la integrasa FC31, también mencionada anteriormente. Este sistema ha sido descrito completamente en solicitudes de patente WO 01/07572 y WO 02/08409, de esta manera incorporadas por referencia en su totalidad. Preferiblemente el vector de integración es un vector que codifica isotipos, donde las regiones constantes (que incluyen preferiblemente intrones) están presentes en el vector anterior a la inserción del VH y VL que comprende segmento del vector de separación por exclusión. Las regiones constantes presentes en el vector pueden ya sea ser la región constante de cadena pesada completa (CHX a CH3 o hasta CH4) o la región constante que codifica la parte Fe del anticuerpo (CH2 a CH3 o hasta CH4) . La región constante Kappa o Lambda de cadena ligera también puede estar presente antes de transferir. La selección del número de regiones constantes presentes, si cualquiera, depende del sistema de separación por exclusión y transferencia usado.

Las regiones constantes de cadena pesada se pueden seleccionar de los isotipos IgGl, IgG2, lgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgM, igD e IgE. Los isotipos preferidos son IgGl y/o IgG3. Además, el vector para integración específica del sitio del segmento de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-RhD contiene promotores apropiados o secuencias equivalentes que dirigen niveles altos de expresión de cada una de las cadenas V y VL. Preferiblemente los promotores son de origen mamífero. Las secuencias que codifican VH y VL están colocadas como pares en el vector usado para integración (un par por molécula de vector) , asegurando de esta manera que ellos serán mantenidos juntos a través de todo el proceso de integración. Preferiblemente, los promotores están localizados dentro del segmento de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-RhD. Para expresión bidireccional se usa una configuración de promotor cabeza a cabeza en el vector de expresión (FIg. 7) . Para expresión unidireccional dos promotores, uno en frente del elemento genético V y uno en frente del elemento genético VL, o un promotor en frente de VH o VL combinado con una secuencia IRES entre los elementos genéticos pesados y ligeros, se pueden usar para lograr la expresión. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia líder funcional se puede incluir en el vector de expresión para dirigir el producto del gen al retículo endoplásmico o una ubicación específica dentro de la célula tal como un organelo.

Una secuencia de señal de poliadenilación fuerte puede estar situada 3' de la cadena pesada y secuencias que codifican cadena ligera. La señal de poliadenilación asegura terminación y poliadenilación de la transcripción de ARN naciente y se 5. correlaciona con estabilidad de mensaje. El vector de expresión para integración específica de sitio puede llevar elementos reguladores trascripcionales adicionales, tales como mejoradores o UCOE (elementos de abertura de cromatina de ubicuidad) para expresión incrementada 0 en el sitio de integración. Los mejoradores son secuencias de ácido nucleico que interactúan específicamente con proteínas celulares involucradas en la transcripción. Los UCOE abren cromatina o mantienen cromatina en un estado abierto y facilitan la expresión reproducible de un gen ligado 5 operablemente (descrito en más detalle en WO 00/05393, incorporado de esta manera por referencia en su totalidad) . Cuando uno o más de los elementos reguladores descritos en lo anterior están integrados dentro del cromosoma de una célula hospedera que se les denominan elementos reguladores 0 heterólogos. Establecimiento de un sistema de expresión para expresión de nivel alto de una proteína policlonal . Los métodos para introducción de una secuencia de ácido nucleico en una célula se conocen en la técnica. Estos métodos 5 comúnmente incluyen el uso de un vector de ADN para introducir la secuencia de interés dentro de la célula, el genoma o un elemento cromosomal extra. La transfección de células se puede lograr por un sinnúmero de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, que incluyen precipitación de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, fusión de liposoma, fusión de fantasma RBC, fusión de protoplasto, y similares. Para la transfección de una línea de célula hospedera, una colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD, en donde se usa cada vector individual comprende una copia única de un segmento de ácido nucleico, que codifica un miembro distinto del rpAb anti-RhD. Esta colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD codifica colectivamente el rpAb anti-RhD. Los vectores apropiados para integración específica de sitio fueron descritos en la sección previa. Los vectores individuales que constituyen la colección de segmentos de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-RhD pueden estar ya sea mezclados juntos en una composición única, o los vectores individuales que codifican un miembro individual del rpAb anti-RhD pueden mantenerse en composiciones separadas o en mezclas de aproximadamente 5 hasta 50 vectores individuales de la colección en una composición. La generación de una línea de célula de fabricación policlonal recombinante y la producción de un anticuerpo policlonal recombinante de una línea de célula tal se puede obtener por varias estrategias de transfección y fabricación diferentes. Estas estrategias están subrayadas en la Fig. Ia y se describen en más detalle a continuación. Una forma de generación de la línea de célula de fabricación policlonal recombinante, es para usar una colección de vectores mezclados juntos en una composición única para la transfección de la línea de célula hospedera. Este método se denomina transfección de volumen o transfección en volumen (todos los miembros individuales de la colección son transfectado en la línea de célula hospedera en un tubo) . Generalmente, el vector y la célula hospedera diseñados previamente descritos asegurarán que una línea de célula policlonal sea obtenida en selección apropiada. En una línea de célula tal, una mayoría de las células individuales han integrado una copia de un segmento de ácido nucleico, que codifica un miembro distinto del rpAb anti-RhD de la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD dentro del genoma. La copia única del segmento de ácido nucleico está integrada en un sitio específico único del genoma de cada célula en la colección de células, generando de esa manera una línea de célula policlonal comprendida de células individuales que expresan miembros individuales de rpAb anti-RhD. Preferiblemente una reserva congelada de la línea de célula policlonal se genera antes de iniciación de la fabricación de rpAb anti-RhD. Otra forma de generación de la línea de célula de fabricación policlonal recombinante es para dividir la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD en fracciones, que contienen aproximadamente 5 hasta 50 vectores individuales de la colección antes de transfección. Preferiblemente, una fracción de la colección constituye de 10 a 15 vectores individuales. Cada composición es transfectada luego en una alícuota de células hospederas. Este método se denomina transfección de semivolumen. El número de alícuotas transfectadas dependerá del tamaño de la colección y el número de vectores individuales en cada fracción. Si la colección por ejemplo, constituye 50 distintos miembros variantes, los cuales están divididos en fracciones que contienen 10 miembros variantes distintos en una composición, 5 alícuotas de células hospederas podrían necesitar ser transfectadas con una composición de colección que constituye una fracción distinta de la colección original . Las alícuotas de las células hospederas se seleccionan para integración específica de sitio. Preferiblemente, las alícuotas distintas se seleccionan separadamente. Sin embargo, también pueden ser acumuladas antes de selección. Para obtener la línea de célula policlonal deseada para fabricación, las alícuotas se pueden mezclar antes de generación de la reserva congelada, inmediatamente después de que ellas han sido recuperadas de la reserva o después de un tiempo de proliferación corto. Opcionalmente, las alícuotas de células se mantienen separadas en toda la producción, y la composición de anticuerpo policlonal se ensambla por combinación de los productos de cada alícuota mejor que las alícuotas de células antes de producción. Una tercera forma de generación de la línea de célula de fabricación policlonal recombinante, es un método de rendimiento alto en el cual las células hospederas son transfectadas separadamente usando los vectores individuales que constituyen la colección de los vectores de expresión anticuerpo anti-RhD. Este método se denomina transfección individual. Las células hospederas transfectadas individualmente preferiblemente se seleccionan de integración específica de sitio separadamente. Sin embargo, también pueden ser acumuladas antes de selección. Los clones de células individuales generados en selección se pueden analizar con respecto al tiempo de proliferación y al patrón de integración y preferiblemente, aquellos con grados de crecimiento similar y un integrante específico de sitio único se usan para generar una reserva de colección congelada. Los clones de célula individual se pueden mezclar para obtener la línea de célula policlonal deseada antes de generación de la reserva, inmediatamente después de que han sido recuperados de la reserva, o después de un tiempo de proliferación corto. Alternativamente, las células hospederas transfectadas individualmente se mezclan aún tempranamente, principalmente antes de que se realice la selección.

Una característica compartida en las estrategias de fabricación subrayadas en lo anterior es que todos los miembros individuales que constituyen el rpAb anti-RhD se pueden producir en uno, o un número limitado de bioreactores, con aproximadamente 5 a 10 como el máximo. La única diferencia es la etapa en la cual uno selecciona para generar la colección de células que constituyen la línea de célula de fabricación policlonal recombinante. La línea de célula hospedera a ser usada para expresión y producción de un rpAb anti-RhD tiene por lo menos una secuencia de ácido nucleico reconocible por una enzima de recombinasa. La preparación de una línea de células hospederas tal fue descrita en la sección "La célula hospedera" . El vector para integración específica de sitio preferiblemente se integra en un lugar de cromosoma genómico preferido que media la expresión de nivel alto, un espacio caliente así llamado. Si los niveles de expresión necesitan ser incrementados, la amplificación del gen se puede realizar usando selección para un gen DHFR o un gen de sintetasa de glutamina (GS) . Esto requiere el uso de vectores que comprenden un marcador de selección tal . La siguiente descripción es un ejemplo de cómo obtener una línea de célula de fabricación de anticuerpo policlonal recombinante, donde el mezcla completa de las cadenas es mínimo si es que existe. Los segmentos de ácido nucleico que contienen un cásete promotor universal para expresión constitutiva que tiene dos promotores colocados en dirección transcripcional opuesta, tal como una construcción cabeza a cabeza rodeada por la cadena pesada variable y el total de la cadena ligera kappa está construida, permitiendo transferencia del constructo completo dentro de un vector para integración específica de sitio del vector que comprende un sitio FRT y un gen de resistencia de neomicina y la región constante de cadena pesada. Se contempla que un cásete promotor para expresión inducible también se puede usar. Además, los promotores se pueden colocar cabeza a cola para transcripción unidireccional. Las células CHO-Flp-In (Invitrogen, Carisbad, CA) las cuales expresan establemente el gen de fusión lacZ-Zeocin, se usan para el experimento, produciendo las células resistentes al antibiótico Zeocin. Las células se mantienen en un medio apropiado que contiene Zeocin. Las células son cotransfectadas en volumen con un plásmido que expresa la recombinasa Flp y la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD para integración específica de sitio que codifica el rpA anti-RhD y un marcador de selección diferente (neomicina) . Después de transfección, las células se cultivan en la presencia de neomicina. Las células que exhiben resistencia a neomicina luego son adaptadas preferiblemente para crecimiento en suspensión además de condiciones libres de suero, esto se puede realizar en uno o dos pasos y con o sin presión de selección. Alternativamente, las células están adaptadas para crecer en suspensión bajo condiciones libres de suero antes de transfección de las células. Cuando la línea de célula policlonal se ha adaptado a las condiciones apropiadas que escalan pueden ser iniciadas usando sistemas de cultivo diferentes, tales como frascos de cultivo pequeños convencionales, fábricas de células multicapa Nunc, biorreactores de producción alta pequeños (MiniPerm, INTEGRA-CELLine, wavebags, BelloCell) y frascos giradores para fibra hueca y biorreactores . El tiempo de producción apropiado y la selección del tamaño de biorreactor final son dependientes de la producción deseada de proteína del lote y los niveles de expresión de la línea de células. Los tiempos pueden variar desde un par de días hasta tres meses. Las células son evaluadas para producción de anticuerpo usando ELISA. El rpAb anti-RhD expresado se aisla del sobrenadante. El rpAb anti-RhD se purifica y caracteriza. Ejemplos de procedimientos de purificación y caracterización se describen posteriormente. Diversidad Clonal/ Pol iclonalidad Una de las características de un anticuerpo policlonal es que está constituido de un número de moléculas de anticuerpo individuales donde cada molécula de anticuerpo es homologa a las otras moléculas del anticuerpo policlonal, pero también tiene una variabilidad que se caracteriza por diferencias en la secuencia de aminoácido entre los miembros individuales del anticuerpo policlonal. Estas diferencias están normalmente confinadas a la región variable en particular a las regiones CDR, CDRl, CDR2 y CDR3. Esta variabilidad de un anticuerpo policlonal también se puede describir como diversidad en el nivel funcional, por ejemplo, especificidad diferente y afinidad con respecto a determinantes antigénicas diferentes en los mismos o diferentes antígenos localizados en uno o más objetivos. En un anticuerpo policlonal recombinante la diversidad constituye un subconjunto de la diversidad observada en un producto de inmunoglobulina derivado del donador. Un subconjunto tal se selecciona cuidadosamente y se caracteriza con respecto a su capacidad para enlazar antígeno objetivo deseado, en este caso particular el antígeno Rhesus D. Uno de los asuntos con respecto a la producción de un anticuerpo policlonal recombinante puede ser si la diversidad clonal se mantiene en el producto final . La diversidad clonal se puede analizar por RFLP o secuenciamiento de productos (RT)-PCR de las células que expresan el rpAb anti-RhD. La diversidad también se puede analizar en nivel de proteína por pruebas funcionales (por ejemplo, ELISA) en el rpAb anti-RhD producido por la línea de célula, por anticuerpos anti-idiotípicos para miembros individuales o por métodos cromatográficos . La inclinación o inclinación clonal, si esta existe, se puede estimar por comparación de la diversidad clonal de la colección inicial, usada para transfección, con la diversidad encontrada en el acumulado de células (línea de célula policlonal) que expresa el rpAb anti-RhD. La diversidad clonal de un rpAb anti-RhD se puede evaluar como la distribución de miembros individuales de la composición policlonal. Esta distribución se puede evaluar como el número total de miembros individuales diferentes en la composición de anticuerpo policlonal final comparada con el número de secuencias de codificación diferentes introducidas originalmente dentro de la línea de célula durante transfección. En este caso diversidad suficiente se considera para ser adquirida cuando por lo menos 50% de las secuencias que codifican originalmente usadas en la transfección se pueden identificar como miembros individuales diferentes del rpAb anti-RhD final. Preferiblemente por lo menos 75% de las secuencias de codificación de anticuerpo anti-RhD usadas para transfección se pueden identificar como anticuerpos en la composición final. Aún más preferido, por lo menos 85% hasta 95%, y más preferido un 100% de las secuencias de codificación de anticuerpo anti-RhD usadas para transfección se pueden identificar como anticuerpos en la composición final. La distribución de miembros individuales de la composición rpAb anti-RhD también puede ser evaluada con respecto a la distribución mutua entre los miembros individuales. En este caso la diversidad clonal suficiente se considera para ser adquirida si el miembro no único de la composición constituye más de 75% del número total de miembros individuales en la composición de rpAb anti-RhD. Preferiblemente, los miembros individuales no exceden más de 50%, aún más preferido 25% y más preferido 10% del número total de miembros individuales en la composición policlonal final. La evaluación de la diversidad clonal basada en la distribución de los miembros individuales en la composición policlonal se puede realizar por análisis RFLP, análisis de secuencia o análisis de proteína tal como las aproximaciones descritas posteriormente para caracterización de una composición policlonal. La diversidad clonal se puede reducir como un resultado de la inclinación clonal la cual puede aumentar a) durante el proceso de clonación, b) como un resultado de variaciones en la proliferación celular, o c) a través de mezcla completa de integrantes múltiples. Si las tendencias aumentan, cada una de estas fuentes de una pérdida de diversidad clonal se remedia fácilmente por modificaciones menores a los métodos como se describen en la presente. Con el propósito de limitar la inclinación introducida por clonación de los dominios variables dentro de los vectores apropiados, la transferencia de genes de interés de un vector a otro se puede diseñar de una manera tal que la tendencia de clonación se limita. Las técnicas de transferencia de masa y una selección cuidadosa de la cepa de E. coli usada para amplificación puede reducir la tendencia de clonación. Otra posibilidad es realizar una transferencia individual de cada polinucleótido que codifica un miembro individual del anticuerpo policlonal, entre los vectores de separación por exclusión y los vectores para integración específica de sitio. Es posible que las variaciones en las velocidades de proliferación celular de las células individuales en la línea de células podrían, durante un período prolongado de tiempo, introducir una tendencia en la expresión rpAb anti-RhD, aumentando o reduciendo la presencia de algunos miembros del rpAb anti-RhD expresados por la línea de célula. Una razón para las variaciones en las velocidades de proliferación puede ser que la población de células que constituyen la línea de células de inicio usadas para la transfección inicial es heterogénea. Se sabe que las células individuales en una línea de células desarrollan de forma diferente durante un período prolongado de tiempo . Para asegurar un material de inicio más homogéneo, la subclonación de la línea de célula anterior para transfección con la colección de interés se puede realizar usando una dilución de limitación de la línea de células abajo del nivel de célula única y el crecimiento de cada célula única para una población nueva de células (llamada subclonación celular por dilución de limitación) . Una o más de estas poblaciones de células se seleccionan luego como material de inicio con base en su proliferación y propiedades de expresión. Además, la presión de selección usada para asegurar que solamente las células que han recibido integrantes específicos de sitio sobrevivirán, puede afectar las velocidades de proliferación de células individuales dentro de una línea de célula policlonal. Esto se puede deber al favorecimiento de las células que experimentan ciertos cambios genéticos con el propósito de adaptar la presión de selección. Así, la selección del marcador de selección también puede influenciar la tendencia inducida de velocidad de proliferación. Si esto ocurre, diferentes marcadores de selección deben ser evaluados. En casos donde la selección se basa en una sustancia que es tóxica a las células, la concentración óptima debe ser evaluada cuidadosamente, además si la selección es necesaria en todo el período de producción completo o solamente en la fase inicial.

Un planteamiento adicional para asegurar una población de célula bien definida es usar el ordenamiento de células activadas por fluorescencia (FACS) después de los procedimientos de transfección y selección. Los anticuerpos etiquetados de fluorescencia se pueden usar para enriquecer células altamente productivas derivadas de un acumulado de células transfectadas con constructor IgG (Brezinsky y colaboradores, J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155). Este método también se puede usar para sortear células que expresan niveles similares de inmunoglobulina, creando de esa manera una población de células homogéneas con respecto a la productividad. De la misma manera, mediante el uso de etiquetado con la tinta fluorescente las células de éster de succinimidil diacetato de 5, 6-carboxilfluoresceina que muestran velocidades de proliferación similares se pueden seleccionar por métodos FACS. Además, las diferencias en niveles de expresión de los miembros individuales del rpAb anti-RhD también pueden introducir una tendencia dentro del producto final por un período prolongado de tiempo. Si la línea de célula policlonal se genera por mezclado de clones transfectados separadamente después de selección (el 3er planteamiento en la Fig. Ia), el siguiente criterio de selección se puede establecer para los clones individuales en el nivel de cultivo de célula antes de mezclar: las velocidades de proliferación deben estar entre 24 y 32 horas, la productividad debe exceder 1.5 pg anticuerpo por célula por día, y el cultivo debe mostrar una población de célula homogénea evaluada por un método de teñido intracelular. Si se desea una población de células más homogénea para cada clon individual se puede obtener con el método de teñido de superficie descrito por Brezinsky antes de mezclar los clones individuales mediante activar en un área particular de la población en conexión con los análisis FACS. Aún si una proliferación inducida por la velocidad, o la inclinación inducida de productividad ocurre, la pérdida o sobre representación de miembros individuales puede no ser necesariamente crítica, dependiendo de la diversidad de requerimientos del producto rpAb anti-RhD final. En células con integrantes únicos específicos de sitio, las células solamente serán diferentes en la secuencia de las regiones variables de los anticuerpos a ser expresados . Por lo tanto, los efectos celulares diferentes impuestos por variación en el sitio de integración y los elementos reguladores del gen son eliminados y los segmentos integrados tienen efectos mínimos en la velocidad de proliferación celular. Ni el mezclado completo ni las integraciones múltiples son probables para provocar problemas en la velocidad de proliferación de la línea de célula de fabricación, puesto que estos son eventos de velocidad. Las integraciones aleatorias generalmente ocurren con una eficiencia de aproximadamente 10"5, considerando que ocurre integración específica de sitio con una eficiencia de aproximadamente 10A Si las integraciones múltiples deben plantear inesperadamente un problema, una alternativa es repetir la transfección con la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD, debido a que la posibilidad de que el evento ocurra es muy pequeña, como se describe anteriormente . Considerando estadísticas, la transfección de volumen de un número grande de células también constituye una manera para eludir una inclinación clonal no deseada. En este planteamiento, una línea de células hospederas se transfecta en volumen con la colección de vectores de expresión anticuerpo anti-RhD. Una colección tal constituye muchas copias de cada miembro distinto de la colección. Estas copias preferiblemente deben estar integradas en un número grande de células hospederas. Preferiblemente por lo menos 100, 1000, 10000 ó 1000000 células individuales son transfectadas con copias de miembros distintos de la colección de segmentos de ácido nucleico variantes. Así, si una colección de segmentos de ácido nucleico variantes distintos se compone de 1000 miembros distintos os cuales están integrados cada uno en 1000 células individuales, 106 clones que contienen un segmento de codificación de anticuerpo anti-RhD integrado específicamente de sitio debe aumentar para la transfección. De esta manera la curva gausiana de las velocidades de duplicación de células individuales debe influir la población general solamente en grados muy pequeños. Esto aumentará la probabilidad de mantener la constante de composición clonal, aún si un porcentaje bajo de las células de fabricación pudieran exhibir crecimiento y/o propiedades de expresión aberrantes. Alternativamente, se pueden usar los métodos de transfección de semivolumen o de transfección individual previamente descrita. Establecimiento de un banco de células de trabajo policlonales (pWCB) La sección "Establecimiento de un sistema de expresión para expresión de alto nivel de una proteína policlonal" describe tres formas alternas de establecer una línea de células de fabricación policlonal . La sección describe la generación de una reserva de colección congelada la cual se constituye de una colección de células, obtenidas por transfección de volumen o semivolumen, donde cada célula individual en la reserva de la colección es capaz de expresar un miembro individual de una colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD. Preferiblemente, los requerimientos de diversidad clonal ya descritos están cubiertos por la colección de células, de manera que esencialmente todos los miembros de la colección se pueden expresar a partir de una ampolleta de reserva de colección congelada, cuando se descongela y expande para establecer una línea de célula de fabricación policlonal. En la transfección de volumen y en la transfección de semivolumen las aproximaciones de la reserva de colección congelada, también se pueden considerar como banco de células de trabajo policlonales (pWCB) , por lo que un frasco único de reserva de colección congelada se puede descongelar y expandir dentro de una línea de célula de fabricación policlonal. Alternativamente, en el tercer planteamiento descrito previamente para la generación de una línea de célula de fabricación policlonal recombinante, la reserva de colección congelada se compone de líneas de célula separadas, las cuales han sido transfectadas individualmente con un miembro individual de una colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD. Los transfectantes se seleccionan para expresión estable del segmento de ácido nucleico derivado del vector integrado de su genoma. Preferiblemente, los segmentos de ácido nucleico están integrados específicamente del sitio dentro de uno o más sitios en el genoma de los transfectantes y aún más preferido en un sitio único del genoma. Las células transfectadas obtenidas por ejemplo, de colonias clónales en selección pueden ser ya sea aisladas y conservadas como clones únicos o acumuladas para generar un acumulado de clones que expresan el mismo anticuerpo anti-RhD. En la presente invención un clon único de células tanto como el acumulado de clones que expresan el mismo anticuerpo se denominan una línea de célula individual. Así, si la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD constituye 25 miembros individuales, la reserva de colección congelada, en este tercer planteamiento, podría estar compuesta de 25 líneas de célula individuales (no una mezcla de líneas de células) cada una que expresa un miembro individual de la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD. De ahí, un frasco de esta reserva de colección resultará en la generación de un anticuerpo anti-RhD monoclonal si se usa para fabricación. La presente invención ejemplifica una colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD. Sin embargo, la generación de una reserva de colección congelada es independiente de la especificidad del antígeno de la proteína policlonal producida de una colección comprendida de segmentos de ácido nucleico que codifica región variable y se puede usar con cualquier otra colección comprendida de segmentos de ácido nucleico que codifican anticuerpo VH y VL, o receptor de células T (TcR) a y ß-, o segmentos de ácido nucleico que codifican y y d . Una colección comprendida de segmentos de ácido nucleico que codifica región variable puede en adición a las regiones variables también codificar una o más regiones constantes. Así, una colección comprendida de segmentos de ácido nucleico que codifican anticuerpo VH y VL puede resultar en moléculas Fv, scFv, Fab o moléculas de anticuerpo de longitud completa, y una colección comprendida de segmentos que codifican región variable de TcR puede resultar en moléculas compuestas de fragmentos de dominio variable TcR, TcR solubles o TcR de longitud completa. En situaciones donde la reserva de colección congelada se compone de líneas de células individuales será apropiado generar un pWCB el cual se puede usar para el establecimiento de la línea de célula de fabricación policlonal mediante descongelamiento y expansión de los contenidos de una ampolleta única. Las líneas de células individuales usadas para generar un pWCB tal se obtienen ya sea a partir de i) un clon único ó ii) un acumulado de clones (un acumulado de clones únicos obtenidos después de selección) . Los clones se han obtenido de células hospederas transfectadas individualmente, y seleccionadas para expresión estable de un miembro individual de una colección que comprende segmentos de ácido nucleico que codifican región variable, tal como segmentos que codifican anticuerpo VH y VL, o TcR a y ß-, o segmentos que codifican y y d. La selección para expresión estable se realiza por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando genes marcadores de selección. En una modalidad preferida de la presente invención las líneas de células individuales se obtienen a partir de células clonadas o subclonadas, por ejemplo, mediante someter una línea de célula que se origina a partir de i) ó ii) (ver descripción previa) para limitar la dilución o análisis FACS de células únicas y selección, o mediante selección de clones de expresión alta por ejemplo, usando un robot similar al ClonePlx FL (ver a continuación) . Las líneas de células individuales usadas para generar el pWCB como se describe anteriormente se puede almacenar previamente en una reserva de colección congelada de líneas de células individuales, a partir de la cual una ampolleta de cada línea de célula individual se descongela y se expande antes de la generación de un pWCB. Preferiblemente, las líneas de células individuales expresan anticuerpos de longitud completa con propiedades que difieren de las propiedades de los anticuerpos producidos por los diferentes miembros del pWCB, por ejemplo, especificidad de antígeno diferente, afinidad diferente, regiones variables o CDR diferentes y/o regiones constantes diferentes. Cada línea de célula usada para generar el pWCB, produce un miembro diferente de una proteína policlonal. Preferiblemente, cada miembro distinto de la proteína policlonal enlaza un antígeno particular. Adicionalmente, se prefiere que cada miembro distinto se produzca a partir de un sitio específico único en el genoma de cada célula hospedera. Un pWCB se genera por mezclado de un número predefinido de células de cada línea de células individuales. Preferiblemente, las células se mezclan en números iguales (una relación 1:1), aunque otras relaciones también pueden ser deseadas (ver posteriormente) . La mezcla de células se congela en alícuotas, de manera que están distribuidas en un número de frascos con un número definido de células en cada frasco. Estos frascos se congelan y almacenan como el pWCB para propósitos de fabricación posteriores. Preferiblemente, el número de frascos que constituyen el pWCB excede de 10, 25, 50, 75, 100, 200, 500 ó 1000 frascos. Los frascos individuales en un pWCB pueden ser descongelados en diferentes momentos de generación de lotes diferentes de la línea de célula de fabricación policlonal los cuales son capaces de producir una proteína policlonal con esencialmente la misma composición de lote a lote (Ver Ejemplo 5) . En un planteamiento alternativo de la presente invención, la línea de células de fabricación policlonal se puede expandir a partir de un sub-pWCB, el cual se deriva de un pWCB. El sub-pWCB se genera por descongelamiento de un frasco único de un pWCB y expansión de las células para un número de generaciones suficiente para producir un número total de células las cuales pueden estar congeladas en una serie nueva de alícuotas (la sub-pWCB) , con aproximadamente el mismo número de células en cada alícuota de sub-pWCB como en el frasco de pWCB usado originalmente para generar el sub-pWCB. La ventaja de este planteamiento es que el pWCB ahora sirve como un banco de células madre como se sabe a partir de otros protocolos de producción de proteína recombinante. Así, en este planteamiento el pWCB también puede ser denominado un banco de células madre policlonales (pMCB) . Cuando el sub-pWCB ha sido agotado, es posible generar un nuevo sub-pWCB a partir de una alícuota del pWCB/PMCB. Este planteamiento por lo tanto requerirá de una cantidad significativamente menor de trabajo que el que podría ser requerido para expandir las líneas de células individuales a partir de la reserva de colección congelada y mezclado de un pWCB nuevo. Además, en el caso de que el sub-pWCB se agote, el cambio de producción de más lotes de la línea de células de fabricación policlonal, las cuales son capaces de producir una proteína policlonal con esencialmente la misma composición de lote a lote se incrementa. El principio de generación de un pWCB/pMCB y un sub-pWCB de células hospederas transfectadas individualmente se ilustra en la Fig. IB.

La ventaja de producción de pWCB o pMCB por mezclado de líneas de células individuales las cuales se han obtenido por transfección individual, comparadas con la generación directa de un pWCB de pMCB por transfección de volumen o transfección de semivolumen, es tal que es posible realizar análisis adicionales y selecciones de las líneas de células transfectadas individualmente antes de la generación del pWCB o pMCB. Esto puede asegurar una línea de célula de fabricación policlonal más estable la cual cumple con la diversidad de requerimientos ya descritos. En las siguiente pWCB se entiende como pWCB o pMCB. En una modalidad adicional de la presente invención, las líneas de células individuales las cuales han sido seleccionadas para expresión estable de un miembro individual de una colección de segmentos de ácido nucleico que codifican la región variable como se describe anteriormente, se caracterizan además con respecto a sus velocidades de proliferación y/o productividad antes de generación de un pWCB. En una modalidad preferida las líneas de células con velocidades de proliferación o productividad similares se seleccionan para la generación de un pWCB. Aún más preferida, las líneas de células con productividad similar además de velocidades de proliferación similares se seleccionan para la generación del pWCB. Preferiblemente, las líneas de células se adaptan a cultivo de suspensión libre de suero antes de la caracterización de las velocidades de proliferación y/o productividad. Alternativamente, las células parentales usadas para transfección se adaptan a cultivo de suspensión libre de suero antes de transfección. Las velocidades de proliferación se pueden evaluar por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2 de la invención actual. Las velocidades de proliferación para líneas de células mamíferas deben estar entre 18 y 100 horas, preferiblemente entre 22 y 40 horas y más preferido entre 24 y 32 horas. La productividad debe exceder 0.5 pg de proteína por célula por día (pg/ (cel*día) ) , preferiblemente debe exceder de 1, 1.5, 3, 5 ú 8 pg/ (cel*día) . Además la línea de célula debe mostrar una población de células homogénea con respecto a expresión cuando se evalúan por un método de teñido intracelular. Si se desea una población de células más homogénea para cada línea de células individuales se puede obtener por clonación, por ejemplo, por los métodos de ordenamiento FACS descritos a continuación. En más modalidades de la presente invención, las líneas de células individuales son FACS surtidos para identificar células con un nivel de expresión homogéneo, después de los procesos de transfección y selección. La posibilidad de sortear para clones de expresión alta individual o un sub-acumulado de células con niveles de expresión alta por activación de un área particular de la población en conexión con los análisis FACS es por lo tanto una modalidad adicional de la presente invención. La generación de células clonadas por análisis FACS y selección es particularmente útil cuando las líneas de células individuales se generan a partir de un acumulado de clones. Los anticuerpos etiquetados de fluorescencia se pueden usar para seleccionar células que expresan niveles altos de la proteína deseada por ejemplo, anticuerpo o TcR, creando de esa manera una población de células homogénea con respecto a la productividad. Esta técnica se basa en la observación de que las proteínas secretadas pueden ser detectadas en la superficie de la célula que las secreta, y la cantidad de proteína en la superficie aparentemente corresponde a los niveles de expresión de la célula individual . Las células de alta producción pueden por lo tanto ser células únicas seleccionadas en teñido con una anticuerpo etiquetado, seguido por análisis por FACS. La técnica se ha descrito por Brezinsky (Brezinsky y colaboradores, J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155). Una técnica de ordenamiento alternativa está basada en el acoplamiento de un ligando, con especificidad a la proteína expresada por las células, a la superficie de las células. Por ejemplo un anticuerpo anti-Fc o un anticuerpo anti-idiotipo se puede acoplar a la superficie de la población de células que secretan la proteína vía biotín. Los anticuerpos secretados por una célula individual son capturados luego por los anticuerpos anti-Fc en la superficie de esa célula. Después de esto, las células de alta producción pueden ser seleccionadas por FACS en teñido con un anticuerpo etiquetado. Esta técnica se ha descrito en EP 667896. Para obtener las líneas de células con unos niveles de expresión altos homogéneos, las células únicas que tienen un nivel de expresión alto se analizan con base en el perfil FACS obtenido por una de las técnicas descritas. Los clones de células individuales se expanden luego y analizan potencialmente con respecto a las velocidades de proliferación y productividad como se describe anteriormente. Alternativamente, un sub-acumulado de células que tienen el nivel de expresión más alto como se define por el perfil FACS se recoleta por ordenamiento. El sub-acumulado de células de la línea de células individuales puede ser analizado de esa manera con respecto a las velocidades de proliferación y productividad si se desea. En una modalidad alternativa de esta invención, un robot tal como el robot ClonePixFl (Genetix, UK) se usa para seleccionar clones que exhiben niveles de expresión altos y/o propiedades de crecimiento similares. Esto se hace como sigue: Las colonias obtenidas después de transfección y selección se crecen en un medio semisólido el cual se permite para detección de colonias de alta producción por captura del producto de proteína secretado en la proximidad inmediata de la colonia. El nivel de producción para cada colonia se determina por medio de etiquetado de inmunofluorescencia de la proteína expresada por las células seguidas por selección del software de imagen de los mejores clones con base en los criterios de selección predeterminados tales como nivel de expresión y propiedades de crecimiento. Además, el tamaño (que refleja la velocidad de proliferación de la célula) de cada colonia se puede evaluar por el robot que usa imagen de detección de luz. Las colonias con la producción deseada y/o propiedades de crecimiento se aislan luego por el robot y son transferidas a placas de 96 pozos para más propagación. Preferiblemente, las líneas de células individuales con productividad similar se seleccionan para la generación del pWCB. En una modalidad preferida las líneas de células individuales que constituyen el pWCB se generan a partir de células clonadas, por ejemplo, obtenidas por ordenamiento de células sencillo, dilución de limitación o selección de robot, con un nivel de expresión alto o a partir de un acumulado de células con nivel de expresión alto. En la presente invención, ambas líneas de células individuales obtenidas de una colonia sencilla de células aisladas después de transfección y selección además de líneas de células individuales obtenidas de un clon obtenido por ejemplo, por ordenamiento de FACS de células sencillas, se denominan líneas de células clonadas. En una modalidad preferida tales líneas de células clonadas se usan para generar el pWCB. En más modalidades de la presente invención, las líneas de células individuales se mezclan en diferentes relaciones en la generación de un pWCB. Las líneas de células individuales se pueden mezclar de acuerdo con criterios predeterminados con base en las propiedades de las líneas de células individuales y/o del miembro de proteína individual expresado por la línea de células, por ejemplo, la productividad específica o afinidad de enlace. Por ejemplo, las líneas de células individuales que expresen ciertos anticuerpos que enlazan anticuerpos o epítopos particularmente críticos se pueden suplir en exceso de las líneas de células de miembro que queda del pWCB, por ejemplo, en cantidades 2 veces, 3 veces, 5 veces ó 10 veces más grandes. Una línea de célula de miembro puede por ejemplo ser agregada en una relación de 2:1 sobre todos los otros miembros, por ejemplo, 4 x 106 células de miembro 1 y 2 x 106 células de cada una de las líneas de células de miembro que quedan. En una modalidad preferida de la presente invención, un pWCB para producción de un rpAb Anti-RhD se genera. Aún más preferido un pWCB tal se genera de manera que las líneas de células que producen anticuerpos con reactividad contra un antígeno VI de categoría de RhD constituye por lo menos 5%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20% ó 25% de la cantidad total de células incluidas en el pWCB. Este planteamiento de relaciones diferenciadas de las líneas de células individuales en el pWCB también se puede adoptar para eludir diferencias en velocidades de proliferación y productividad entre las líneas de células individuales, en particular si estas no han sido seleccionadas por semejanza en estos rasgos. De ahí que, si una o más de las líneas de células individuales tienen una velocidad de proliferación menor, esto es, tiempos de duplicación más largos, comparados con otros miembros del bando de células de trabajo policlonal las cuales están caracterizadas por una velocidad de proliferación más grande, pero esta velocidad de proliferación es más lenta no está asociada con una productividad alta particular, este miembro particular puede ser agregado al pWCB en una cantidad aumentada para compensar por su crecimiento lento. Por ejemplo podría una línea de células con una velocidad de proliferación de 50 horas ser agregada en una relación 2:1 si las líneas de células que quedan constituyendo el pWCB tienen velocidades de proliferación entre 22 y 30 horas. De la misma manera, la velocidad de las líneas de células con tiempos de duplicación cortos se pueden reducir para asegurar que estas no asumirán el mando durante la producción. Además, las relaciones de las líneas de células individuales en un pWCB se pueden ajustar con el análisis de los productos de proteína policlonal producidos de las líneas de células de fabricación policlonal del pWCB. Los ajustes por ejemplo, se pueden hacer con base en los perfiles IEX o herramientas de caracterización equivalentes. Si tal análisis muestra que uno o más miembros de proteína particular se producen en una cantidad incrementada comparada con los miembros que quedan, se puede generar un nuevo pWCB, en donde la relación de las líneas de células que producen estos miembros de proteína particular se reducen. Y viceversa, si un miembro particular se produce en una cantidad baja, un pWCB con una relación incrementada de la línea de células que produce este miembro puede ser generado. Purificación de un rpAb anti-RhD de sobrenadante de cultivo. El aislamiento de rpAb anti RhD de sobrenadantes de cultivo es posible usando varias técnicas cromatográficas que utilizan diferencias en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas, por ejemplo, diferencias en peso molecular, carga neta, hidrofobicidad, o afinidad hacia un ligando o proteína específicos. Las proteínas así pueden ser separadas de acuerdo al peso molecular usando cromatografía de filtración con gel o de acuerdo a la carga neta usando cromatografía de intercambio iónico (catión/anión) o alternativamente usando cromatofocalización. La cromatografía de afinidad combinada con pasos de purificación subsiguientes tales como cromatografía de intercambio iónico, interacciones hidrofóbicas y filtración con gel frecuentemente ha sido usada para la purificación de IgG (policlonal además de monoclonal) de fuentes diferentes, por ejemplo, fluido de ascitos, sobrenadantes de cultivo de células y suero. La purificación pro afinidad, donde la separación se basa en una interacción reversible entre los anticuerpos anti-RhD y un ligando específico acoplado a una matriz cromatográfica, es un método fácil y rápido, el cual ofrece alta selectividad, usualmente capacidad y concentración alta dentro de un volumen más pequeño. Los ligandos específicos en la forma de péptidos capaces de enlazar a anticuerpos anti-RhD se pueden obtener de acuerdo con el método descrito en EP 1 106 625 usando proyección de fago de péptido. La proteína A y proteína G, dos proteínas de superficie de célula bacterial, tienen alta afinidad para la región Fc, y, en una forma inmovilizada, han sido usados para muchas aplicaciones de rutina, incluyendo purificación de IgG policlonal y sus subclases de varias especies y absorción y purificación de complejos inmunes. Después de la cromatografía de afinidad, los pasos de cromatografía cadena abajo, por ejemplo cromatografía de intercambio iónico y/o de interacción hidrofóbica, se pueden realizar para remover proteínas de células hospederas, escapando Proteína A, y ADN. Con la cromatografía de afinidad de la proteína A e intercambio iónico se ha observado que valores de pH arriba de 5 pueden provocar precipitación del rpAb anti-RhD. Así las soluciones amortiguadoras deben ser ajustadas cuidadosamente con agentes de solución amortiguadora apropiados, por ejemplo, Tris o acetato.

La filtración con gel, como un paso de purificación final, se puede usar para remover moléculas contaminantes tales como dímeros u otros agregados, y transferir la muestra en solución amortiguadora de almacenamiento. Dependiendo de la fuente y condiciones de expresión puede ser necesario incluir un paso de purificación adicional para lograr el nivel requerido de pureza de anticuerpo. La cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de intercambio iónico se usan frecuentemente, en combinación con cromatografía de proteína y filtración con gel, para purificar anticuerpos para uso terapéutico. Con el propósito de purificar otras clases de anticuerpo, debe ser usado el medio de cromatografía de afinidad alternativa puesto que las proteínas A y G no enlazan IgA e IgM. Una purificación de inmunoafinidad se puede usar (anticuerpos monoclonales anti-IgA o anti-IgM acoplados a la fase sólida) o, alternativamente, se pueden emplear estrategias de purificación multipaso que incluyen intercambio iónico e interacción hidrofóbica. Caracterización Estructural de rpAb anti-RhD. La caracterización estructural de anticuerpos policlonales requiere alta resolución debido a la complejidad de la mezcla (diversidad clonal, heterogeneidad y glicosilación) . Los planteamientos tradicionales tales como filtración con gel, cromatografía de intercambio iónico o electroforesis pueden no tener suficiente resolución para diferenciar entre anticuerpos individuales en el rpAb anti-RhD. La electroforesis de gel de poliacrilamida de dos dimensiones (2D-PAGE) ha sido usada para perfilar mezclas de complejos de proteína seguido por espectrometría de masa (MS) o cromatografía líquida (LC)-MS (por ejemplo, proteomics) . La 2D-PAGE, la cual combina separación en la base de una carga y masa de proteína, ha probado utilidad para diferenciación entre inmunoglobulina policlonal, oligoclonal y monoclonal en muestras de suero. Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones. Las técnicas cromatográficas, en particular capilaridad y LC acoplada para MS de ionización de electroespray están aumentando siendo aplicadas para el análisis de mezclas de péptido de complejos. La LC-MS se ha usado para la caracterización de anticuerpos monoclonales y recientemente también para perfilar cadenas ligeras de anticuerpo policlonal. Los análisis de muestras muy complejas requieren más poder de resolución del sistema cromatográfico, lo cual se puede obtener por separación en dos dimensiones (o más) . Un planteamiento se basa en intercambio iónico en la primera dimensión y cromatografía de fase inversa (o interacción hidrofóbica) en la segunda dimensión acopladas opcionalmente a MS . Caracterización Funcional de rpAb anti-RhD. Un anticuerpo rpAb anti-RhD por ejemplo, puede ser caracterizado funcionalmente a través de estudios de comparabilidad con productos de inmunoglobulina anti-D o mAbs anti-RhD. Los estudios se pueden realizar in Vitro además de in vivo. Los métodos de caracterización funcional in Vitro de rpAb anti-RhD podrían por ejemplo, ser ensayos de fagocitosis (basados en 51Cr- o basados en FACS) , citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y ensayo de formación de rosetas. Brevemente descritos los ensayos se realizan como sigue: Ensayo ADCC (basado en 51Cr) : Las PBMC humanas se usan como células efectoras y RBC negativo y positivo de RhD (0 en el sistema ABO) se usan como objetivos. Primero el RBC (RhD(+) y RhD(-)) se etiquetan con 51Cr, se lavan y luego se sensibilizan con anticuerpos anti-RhD (por ejemplo, rpAb anti-RhD, mAb anti-D o anti-RhD) en varias diluciones. Las células efectoras (PMBC) se agregan al RBC sensibilizado (relación 20:1) y la incubación se realiza durante la noche. Las células se giran hacia abajo y los sobrenadantes de los pozos se transfieren a un Lumaplate (PerkinElmer) . Se incluyen los controles para liberación espontánea (RBC con 51Cr solamente) y para liberación total (la adición de Triton-X-100 a RBCetiquetado con 51Cr) . El Lumaplate se seca y se cuenta en un Topcounter (PerkinElmer) . Ensayo de Fagocitosis (basado en 51Cr) : La fagocitosis se puede medir en combinación en el ensayo ADC. Después de cosechar el sobrenadante en el ensayo ADCC, el sobrenadante que permanece se remueve y las células de glóbulos rojos son lisadas por adición de una solución amortiguadora hipotónica. Las células se lavan y el sobrenadante se remueve. Se agrega PBS-1% de Triton-X-100 a todos los pozos y las cantidades fijadas se transfieren a un Lumaplate, se secan y cuentan como anteriormente. Ensayo de fagocitosis (basado en FACS) : Este ensayo se basa en adherencia de las células fagocíticas. La línea de célula de monoblasto leucémico humano U937 se puede usar para este ensayo. Las células U937 se diferencian usando lOnM PMA. Dos días después el 60% del medio se remueve y se vuelve a colocar por medio sin PMA. La membrana de la célula de células de glóbulos rojos (RhD(+) y RhD(-)) se tiñen con PKH26 (PE) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (Sigma) . Los RBC se sintetizan con anticuerpos anti-RhD en varias diluciones y los anticuerpos en exceso se remueven por lavado. En el día tres, las células no adherentes célula U937 se remueven por lavado y los RBC sensibilizados (RhD(+) y RhD(-)) se agregan a los pozos. Las placas se incuban durante la noche en el incubador. Los RBC no fagocitados se lavan fuera por varios pasos . Se anexan pero los RBC no fagocitados son lisados por adición de solución amortiguadora hipotónica seguido por lavado adicional. Las células U937 se separan de los pozos por incubación con tripsina. Las células se analizan en el FACS.

Ensayo de Formación de rosetas . Un ensayo de formación de rosetas es simplemente un ensayo de enlazamiento de receptor Fc . Las células de glóbulos rojos sensibilizadas se incuban con células U937 diferenciadas preparadas como se describe anteriormente. Los RBC (RhD(-) y RhD(+)) son sensibilizados con anticuerpos anti-RhD en varias diluciones y los anticuerpos en exceso se remueven por lavado antes de ser mezclados con las células U937. La incubación se realiza por una hora y los RBC no enlazados se lavan. El porcentaje de células con dos o más RBC acopladas a la superficie se cuenta. Una caracterización funcional in vivo de anticuerpos anti-RhD se describe por Miescher (Miescher, S., y colaboradores, 2004, Blood 103, 4028-4035), involucra una inyección de células RhD(+) dentro de individuos RhD(-) seguida por administración de anticuerpo anti-RhD. Fue analizada la claridad de los RBC y la sensación del anticuerpo anti-RhD de los donadores. Composiciones Terapéuticas . En una modalidad de la invención, una composición farmacéutica que comprende Fab policlonal recombinante anti-RhD o rpAb anti-RhD u otro fragmento policlonal recombinante anti-RhD como ingrediente activo se proyecta para la profilaxis de la enfermedad hemolítica del recién nacido, tratamiento de púrpura trombocitoménica idiomática (ITP) o prevención de sensibilización al antígeno Rhesus D después de falta de transfusiones de sangre RhD(+) a individuos RHD(-) . La composición farmacéutica además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. El rpAb anti-RhD o fragmentos policlonales de este se pueden administrar dentro de un diluente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable en forma de unidad de dosificación. La práctica farmacéutica convencional se puede emplear para proporcionar formulaciones o composiciones apropiadas para administrar a madres o pacientes femeninos. En una modalidad preferida la administración es profiláctica. Cualquier ruta apropiada de administración se puede emplear, por ejemplo, la administración puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial , subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, en aerosol, supositorio, o administración oral. Por ejemplo, las formulaciones terapéuticas pueden ser en la forma de, soluciones líquidas o suspensiones; para administración oral, las formulaciones pueden ser en la forma de tabletas o cápsulas, goma de mascar o pasta, y para formulaciones intranasales, en la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo, por medio de disolución convencional, liofilización, mezclado, granulación o procesos de confección. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional (ver por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA and Enciclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NY) . Las soluciones del ingrediente activo, y también suspensiones, y esencialmente soluciones acuosas o suspensiones isotónicas, se usan preferiblemente, siendo posible, por ejemplo, en el caso de composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o junto con un portador, por ejemplo manitol, para las soluciones o suspensiones ser producido antes de usar. Las composiciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo, preservativos, estabilizadores, humectantes y/o agentes de emulsificación, solubilizadores, sales para regulación de la presión osmótica y/o soluciones amortiguadoras, y se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo, por medio de procesos de disolución convencional o liofilización. Las soluciones o suspensiones pueden comprender sustancias que incrementan la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidona o gelatina. Las composiciones de inyección se preparan de manera usual bajo condiciones estériles; lo mismo aplica también la introducción de las composiciones dentro de ampolletas o frascos y el sellado de los recipientes.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral se pueden obtener por combinación del ingrediente activo con portadores sólidos, si se desea granulación de una mezcla que resulta y procesamiento de la mezcla, si se desea o es necesario, después de la adición de excipientes apropiados, en tabletas, pildoras, o cápsulas, las cuales pueden estar recubiertas con goma laca, azúcar o ambas. También es posible estar incorporados en portadores plásticos que permiten a los ingredientes activos difundirse o ser liberados en cantidades medidas. Las composiciones farmacéuticas comprenden desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 95%, preferiblemente desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 90% de ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden estar, por ejemplo, en forma de unidad de dosis, tal como en la forma de ampolletas, frascos, supositorios, tabletas, pildoras, o cápsulas. Las formulaciones se pueden administrar a individuos humanos . en cantidades efectivas terapéutica o profilácticamente (por ejemplo, cantidades las cuales previenen, eliminan, o reducen una condición patológica) para proporcionar terapia para una enfermedad o condición. La dosis preferida de agente terapéutico a ser administrada es probablemente dependiente de variables como el tipo y extensión del trastorno, el estado de salud general del paciente particular, la formulación de los excipientes del compuesto, y su ruta de administración. Usos terapéuticos de las composiciones de acuerdo con la invención. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden usar para el tratamiento, mejoría o profilaxis de una enfermedad en un mamífero. Las condiciones que pueden ser tratadas o prevenidas con las composiciones farmacéuticas presentes incluyen prevención de enfermedad hemolítica del recién nacido, tratamiento de púrpura trombocitopénico idiopático (ITP) o prevención de sensibilización al antígeno Rhesus D después de falta de transfusiones de sangre RHD(+) a individuos RhD(-) . Un aspecto de la presente invención es un método para el tratamiento, mejora o profilaxis de enfermedad en un animal, en donde una cantidad efectiva de rpAb anti-RhD o fragmentos de esta se administran. Una modalidad más de la presente invención es el uso de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD o fragmento de anticuerpo policlonal para la preparación de una composición para la profilaxis de enfermedad hemolítica del recién nacido o tratamiento de púrpura trombocitopénico idiopático (ITP) . Uso diagnóstico y uso de detección ambiental . Otra modalidad de la invención se dirige a kits diagnósticos. Los kits de acuerdo con la presente invención comprenden un rpAb anti-RhD preparado de acuerdo con la invención cuya proteína puede ser etiquetada con una etiqueta detectable o no etiquetada para detección sin etiqueta. El kit se puede usar para identificar individuos con RhD(+) , o individuos con una categoría de Rhesus D particular. La identificación de los últimos se puede lograr mediante tener una composición de rpAb anti-RhD la cual solamente reacciona con esa categoría de Rhesus D particular. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos describen como anti-RhD rpAb se expresa y produce en una línea celular de alta producción, donde VH y VL comprenden segmentos o vectores de ácido nucleico que se han insertado por integración del sitio específico dentro de un sitio "de punto caliente" cromosomal pre-caracterizado . En los ejemplos, las células CHO se utilizaron como células hospederas. Las ventajas de las mismas incluyen la disponibilidad de medios de crecimiento apropiados, su capacidad para crecer eficientemente a una alta densidad en cultivo, y su capacidad para expresar proteínas de mamífero tal como anticuerpos en una forma biológicamente activa. En general, la transformación de E.coli y transfección de células de mamífero de conformidad con el sujeto de la invención se realizará de conformidad con los métodos convencionales . Los siguientes ejemplos ilustran la invención, pero no deben ser vistos como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Producción de un anticuerpo policlonal recombinante anti-Rhesus D Donadores Los donadores se alistaron en Aalborg Sigues Nord. Un total de ocho RhD(-) mujeres se inmunizaron con eritrocitos RhD(+) derivados a partir de RhD(+) individuales. Los donadores tenían una historia variada de las inmunizaciones con respecto al número de refuerzos y el origen de eritrocitos RhD(+) para la inmunización. La historia de la inmunización de los diferentes donadores se da en la tabla 1. Tabla 1 Las células mononucleares se cosecharon por leucoforesis 5-7 días después del último refuerzo. Las células se peletizaron y transfirieron inmediatamente a la solución de lisis celular a partir de un kit de preparación 7?RN comercialmente disponible (NucleoSpin RNA L, Machery-Nagel , cat. No. 740 962.20). Después de la lisis de las células, la suspensión se congela antes del procesamiento adicional . Generación de colección que exhibe Anti-Rhesus D Fab El material obtenido de cada donador se mantuvo separado a través del procedimiento de la generación de colección y el inmunoplaqueteo . Los lisados de la célula se descongelaron y ARN se preparó de conformidad con el kit de instrucciones (NucleoSpin ARN L) . La integridad del ARN se analizó por electroforesis de gel de agarosa, así verificando que los ARN ribosomales 18S/28S no se degraden. El ARN se sometió a síntesis cADN en una reacción preparada con oligo (dT) usando aproximadamente 10 µg total de ARN en una reacción usando ThermoScript (Invitrogen) , de conformidad con las instrucciones de manufactura. El cADN se usó como plantilla en reacciones PCR usando los siguientes cebadores : Cebadores delanteros VH (sitio Xhol en negrita): Cebadores inversos VH (sitio AscI en negrita): Cebador delantero C? (sitio Notl en negrita) : SEQ ID Secuencia de Cebador . - .i. « • 15 ACCGCCTCCA CCGGCGGCCG CTTATTAACA CTCTCCCCTG TTGAAGCTCT T Cebadores inversos V? (sitio Nhel en negrita) : Cebador delantero C? (sitio Notl en negrita) : Cebadores inversos V^ (NheI en negrita) El PCR se realizó con pares de cebador individual en cantidades para 36 reacciones VH, 6 reacciones Kappa y 22 reacciones Lambda. Todos los productos PCR VH, Kappa, y Lambda se reunieron separadamente y siguió la purificación usando columnas NucleoSpin (Machery-Nagel , cat. No. 740 590.250), los productos se digirieron antes de la clonación (VH: Ascl/Xhol, Kappa y Lambda: Nhel/Notl) seguido por una etapa de purificación de gel de las bandas de interés (perfectPrep Gel Cleanup kit, Eppendorf, cat. no. 0032 007.759). Las cadenas ligeras (Kappa y Lambda separadamente) se insertaron dentro de un Nhel/Notl tratado con vector de despliegue de fago Em351 (Fig. 2), al ligar y amplificar en E.coli XLl Blue (Estratageno) . El ADN plásmido que constituye la colección de cadena ligera se aisló a partir de células E.coli seleccionadas durante la noche en placas de agar con Carbenicilina (dos colecciones para cada donador, Kappa y Lambda, respectivamente) . Esta colección de ADN se sometió a digestión con Ascl/Xhol, y después de la purificación de gel, los productos de VH PCR (sometidos a digestión con las mismas enzimas y el gel purificado) se ligaron dentro de las dos colecciones de cadena ligera a partir de cada donador y se amplifican en células E.coli TGl (Estratageno) usando selección de carbenicilina en placas agar. Después del crecimiento durante la noche, se rasparon completamente las placas de bacteria, y las cepas de glicerol se prepararon por el almacenaje apropiado de la colección. Una preparación de ADN plásmido que contiene la colección (VH:LC) de cadena ligera -cadena pesada de variable combinatoria, se realizó también para asegurar la colección para el futuro. Las colecciones combinatorias que contienen en las células TGl (dos de cada donador) se pusieron listos para el despliegue de fago e inmunoplaqueteo . Los tamaños de las colecciones combinatorias (16 en total) fueron 106 o más grandes. Enriquecimiento para fagos que despliegan fragmentos Fab que enlazan al antígeno Rhesus D Los Fabs que despliegan fagos en su superficie se generaron como sigue: 50 mL 2 x YT/1% glucosa/100 µg/mL Carbenicilina se inoculó con células TGl que contienen la colección combinatoria VH:VL para obtener un OD6oo de aproximadamente 0.08. El cultivo se agitó durante IV. h, y fago auxiliar se agregó (VSCM13) . El cultivo se incubó a 37°C durante £ h sin agitación y durante V2 h con agitación. Las bacterias se peletizaron (3200 x g, 10 minutos, 4°C) , y se volvió a suspender en 50 mL 2 x YT/100 µg/mL Carbenicilina/70 µg/mL Kanamicina, y el cultivo se agitó durante la noche a 30°C. Los fagos se precipitaron del sobrenadante de cultivo al agregar 1/5 volumen de 20% PEG/1.5 M NaCl, incubando en hielo durante 30 minutos, y la centrifugación a 8000 x g durante 30 minutos a 4°C. Los fagos precipitados se volvieron a suspender en PBS y se usaron directamente para inmunoplaqueteo . El inmunoplaqueteo para antígeno Rhesus D enlazado a fragmentos Fab se realizó en un procedimiento de dos etapas. Células de glóbulos rojos 108 RhD(-) (RBC) se lavaron tres veces en PBS (centrifugación a 2000 x g, 45 sec) , y se volvieron a suspender en solución amortiguadora de inmunoplaqueteo 150 µl (2% de leche descremada en 0.85 x PBS). Cincuenta µl de fagos preparados frescamente se agregaron a las células RhD(-) (se volvieron a suspender en solución amortiguadora de inmunoplaqueteo) con objeto de realizar una etapa de selección negativa, e incubar durante 1 hora en un girador extremo sobre extremo a 4°C. Siguiendo la incubación una hora, las células se peletizaron por centrifugación (2000 x g, 45 sec) , y el sobrenadante que contiene fago se incubó con 2 x 107 RhD( +) RBC (se lavó tres veces en PBS) . La mezcla de fago: RhD(+) RBC se incubó durante una hora en un girador extremo sobre extremo a 4°C. Los fagos no enlazados se removieron al lavar cinco veces con 1 mL de solución amortiguadora de inmunoplaqueteo, y cinco veces con PBS. Los fagos enlazados se eluyeron al agregar 200 µl H20 (que lisan las células) . Cien µl del eluido se agregaron a células TGl de crecimiento exponencial, el resto se almacenó a -80°C. Las células TGl infectadas con fagos eluidos se colocaron en placas de agar Carb/glu y se incubaron durante la noche a 37°C. Al día siguiente, las colonias se rasparon completamente de las placas, y medio de cultivo en 10 mL, se inoculó, para la preparación de fagos para la segunda ronda de inmunoplaqueteo. La segunda ronda de inmunoplaqueteo se realizó como se describe por la primera ronda. Enriquecimiento para fagos que despliegan fragmentos Fab que enlazan al antígeno categoría VI Rhesus D En un conjunto separado de preparaciones de inmunoplaqueteo, las selecciones se realizaron con objeto de recuperar clones con reactividad en dirección al antígeno VI de categoría RhD. La selección negativa se realizó en sangre RhD(-) como se describe, y la selección positiva se realizó en eritrocitos RhD^ positivos. El procedimiento fue de otra manera como se describe arriba. Separación por exclusión para enlaces anti-RhD Fabs Después de cada ronda de inmunoplaqueteo sencillo las colonias se escogieron para análisis de sus características de enlace a células de glóbulos rojos en ensayos de aglutinación. Brevemente, las colonias sencillas se inocularon dentro de 2 x YT/100 µg/mL carbenicilina/glucosa 1% y se agitaron durante la noche a 37°C. Al siguiente día, las placas DeepWell se inocularon usando cultivo 900 µl 2 x YT/100 µg/mL carbenicilina/O .1% glucosa y 10 µl durante la noche. Las placas se agitaron durante dos horas a 37 °C, antes de que la inducción de Fab se realizó con adición de 300 µl 2 x YT/100 µg/mL carbenicilina/O, 25 mM IPTG por pozo. La placa se agitó durante la noche a 30°C. Al siguiente día, las bacterias se peletizaron por centrifugación (3200 x g, 4°C, 10 minutos), y se volvieron a suspender en 100 µl de 0,8 M NaCl, 0,2 x PBS, 8 mM EDTA, y se incubaron durante 15 minutos en hielo con objeto de realizar una extracción periplasmica de los fragmentos Fab. La placa se transfirió a -20°C y finalmente la suspensión se deshielo y la centrifugación se realizó durante 10 minutos a 4°C y 3200 x g. El extracto periplásmico se usó en ensayos ELISA para análisis de contenido Fab y en ensayos de aglutinación para evaluar el potencial de enlace de los fragmentos Fab individual. El ensayo de aglutinación se realizó como sigue: RhD(-) y RhD(+) RBC se mezclaron en una relación 1:1, y se lavaron 3 veces en PBS. Después del lavado final, la célula mezclada se volvió a suspender en 1% BSA en PBS a una densidad de 1% de células, 50 µl se agregó a cada pozo de una placa de 96. Los extractos periplásmicos se agregaron a los pozos. Como una inmunoglobulina Rhesogamma P de control positivo (Aventis) se usó de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. Las células se lavaron tres veces con PBS, antes de que el anticuerpo secundario se usó (conjugado de cabra anti-humano Fab/FITC, Sigma F5512) en una dilución 1:100. Las placas se dejaron para la aglutinación durante una hora a temperatura ambiente sin agitación. Los fragmentos positivos Fab en el ensayo de aglutinación se determinaron por inspección visual, y se registró al tomar una foto. La cuantificación de la actividad de enlace de los fragmentos Fab se realizó por análisis FACS de las muestras de aglutinación. Cuando se realiza la separación por exclusión para clones con reactividad hacia eritrocitos RhDVI+, tales células se usaron en conjunto con células RhD(-) en un procedimiento de otra manera idéntico al que se describió anteriormente. Selección de diversas secuencias que codifican Fab anti-RhD Un total de 1700 clones enlazados al antígeno RhD se identificaron. Todos los clones positivos se sometieron por secuenciación ADN. De estos 56 clones se seleccionaron basados en su conjunto único de secuencias CDR de cadena pesada. Para clones múltiples que usaron la- misma cadena pesada con diferentes cadenas ligeras, el clon que mostró la actividad de enlace más alta en el ensayo FACS se seleccionó. De tal modo, una sub-colección que comprende pares de secuencias que codifican (LC) cadena ligera (LC) y cadena pesada variable (VH) , representando una diversidad amplia con alta especificidad de antígeno RhD, se selecciona a partir de todos los clones positivos. La actividad de enlace de estos 56 clones se volvió a confirmar en ensayos de aglutinación, para asegurar que no se seleccionaran los clones positivos falsos. Los clones seleccionados se analizaron además con respecto a mutaciones debido a por ejemplo cebador cruzado inter-familia, ya que tales mutaciones pueden conducir a cambios estructurales totales del anticuerpo expresado posiblemente creando nuevos epítopos y de tal modo resulta en un aumento de inmunogenicidad del producto final. Los clones con tales mutaciones se repararon como . se describe en la siguiente sección relacionada a transferencia VH:LC del vector de fagemido al vector de expresión de mamífero. Las alineaciones de las secuencias de ácido nucleico corregidas para el VH y las cadenas ligeras (LC) se muestran en la Figura 3 a 6, respectivamente. Además las alineaciones de las cadenas de polipéptido VH y V se muestran en la figura 5 y 6, respectivamente. Las alineaciones de polipéptido se realizaron y nombraron de conformidad con el criterio estructural definido por Chothia (Chothia et al. 1992 J. Mol. Biol. 227, 776-798; Tomlinson et al. 1995 EMBO J. 14, 4628-4638 y Williams et al. 1996 J. Mol. Biol., 264, 220-232). Las figuras además indican la posición de las tres regiones CDR dentro de las regiones variables. Las posiciones de región CDR dentro de las secuencias de aminoácido se resumieron en la Tabla 2. La enumeración de las regiones CDR3 en las alineaciones de polipéptido (Fig. 5 y 6) no sigue a Chothia (transición marcada con un asterisco en las figuras) . Con objeto de permitir la identificación de la región CDR3 con respecto a la posición de aminoácido, una enumeración continua se ha asignado después del asterisco. La secuencia de la región CDR3 para cada clon individual se puede derivar de las figuras basadas en esta numeración.

Tabla 2 Los pares de la cadena pesada variable y cadena completa ligera que se han definido como Fabs y seleccionado por su capacidad a enlazar antígeno RhD, se pueden identificar por sus números de clon idéntico. Todos los pares VH:LC se enlistan por número de clones, el ácido nucleico (nuc.) SEQ ID y el aminoácido (a.a.) SEQ ID en la tabla 3.

Tabla 3 LD LD Transferencia de las secuencias que codifican cadena ligera y VH seleccionado a un vector de expresión de mamífero. Debido a las mutaciones resultantes de, por ejemplo, cebador cruzado inter-familia esto fue necesario para la reparación de un número grande de las secuencias seleccionadas . Esto se hizo en conexión con intercambio de sistema de expresión de despliegue de fagos a expresión de mamífero. Por esta razón la transferencia se realizó separadamente por cada clon individual . La transferencia y reparación se realizó como sigue: Primero la secuencia que codifica VH situada en el vector Em351 se volvió a amplificar por PCR usando la polimerasa de alta fidelidad, Fusión (Finnzymes) y un sistema apropiado de cebadores corregidos . El fragmento PCR VH se digirió con AscI y Xhol y se sometió a purificación de gel. El vector de expresión Neo (Fig. 7) se digirió con las enzimas correspondientes y gel purificado de tal modo la remoción de la secuencia de ácido nucleico situada entre la secuencia líder y las regiones constantes de cadena pesada. El fragmento VH corregido y el vector de expresión Neo se ligaron y amplificaron en células E.coli ToplO. El ADN plásmido del vector de expresión Neo que contiene VH se aisló a partir de las células E.coli seleccionadas durante la noche en Carbenicilina. Siguiendo la transferencia de la secuencia que codifica VH la secuencia LC correspondiente se volvió a amplificar por PCR usando la polimerasa de alta fidelidad, Fusión (Finnzymes) y un sistema apropiado de cebadores corregidos . El fragmento PCR LC se digirió con Nhel y Notl y se sometió a purificación de gel. El vector de expresión Neo que contiene VH se digirió con las enzimas correspondientes y gel purificado de tal modo la remoción de la secuencia de ácido nucleico situada entre la secuencia líder kappa y la secuencia de señal BGHpolyA. El fragmento LC y el vector de expresión Neo que contiene VH se ligaron y amplificaron en células E.coli ToplO. Los gliceroles de reserva se prepararon para cada clon individual, y una preparación de plásmido de alta calidad apropiada para la transfección de células de mamífero se preparó a partir del cultivo de bacterias también. Al realizar la transferencia por separado para cada clon los pares VH:LC que originalmente se seleccionan por despliegue de fago se regeneraron en el vector de expresión de mamífero. En los casos en donde la reparación no fue necesaria el segmento de ácido nucleico se transfirió sin realizar el PCR anterior a la digestión con las enzimas de restricción apropiadas. Los vectores de expresión de mamífero generados por la transferencia descrita son apropiados para expresar un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD de longitud completa. A través de los vectores se mantienen separados a este punto todavía considerados como una colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD. Transfección y selección de líneas celulares de mamífero La línea celular Flp-In CHO (Invitrogen) se usó como línea celular de partida por establecimiento de una línea celular de fabricación policlonal recombinante. Sin embargo, para obtener una línea celular más homogénea la línea celular Flp-In CHO parental se sub-clonó. Brevemente, la línea celular parental se sub-clonó por la dilución limitada y diversos clones se seleccionaron y expandieron. Basado en el comportamiento del crecimiento un clon, CHO-Flp-In (019), se seleccionó como la línea celular de producción. Todas las preparaciones de plásmido 56 se transfectaron individualmente dentro de línea celular CHO-Flp-In (019) como sigue: las células CHO-Flp-In (019) se cultivaron como células adherentes en F12 HAM con 10% de suero de becerro fetal (FCS) . Se transfirieron 2.5 x 106 células con plásmido representando un clon usando Fugene6 (Roche) . Las células se tripsinizaron 24 horas después de la transfección y la transferencia a matraces 3 x T175. La selección de presión, en este caso 450 µg/ml Neomicina, se agregó 48 horas después de la transfección. Aproximadamente dos semanas más tarde los clones aparecieron. Los clones se contaron y las células se tripsinizaron y posteriormente se cultivaron como grupos de clones que expresan uno de los 56 anticuerpos específicos anti-Rhesus-D.

Adaptación a cultivo de suspensión libre de suero Los cultivos celulares CHO-Flp-In (019) de anticuerpo anti-Rhesus-D adherente individual se tripsinizaron, centrifugaron y transfirieron para separar matraces agitadores con 8 x 105 células/ml en medio libre de suero apropiado (Excell302, JRH Biosciences) . El crecimiento y morfología celular se siguieron durante las varias semanas. Cuando las células muestra comportamiento de crecimiento bueno y estable y tienen un tiempo doble debajo de 32 horas 50 alícuotas de cada cultivo con 10 x 106 células/tubo se congelaron debajo (56 x 50 alícuotas) . Caracterización de las líneas celulares Todas las líneas celulares individuales se caracterizaron con respecto a la producción y proliferación de anticuerpo. Esto se realizó con los siguientes ensayos: Producción: La producción de anticuerpos recombinantes en los cultivos individuales se siguieron durante el tiempo por ELISA específico Kappa o Lambda. Las placas ELISA se recubrieron durante la noche con anticuerpos Kappa (Caltag) anti humano de cabra o Lambda (Caltag) anti humano de cabra en solución amortiguadora de carbonato, pH 9.6. Las placas se lavaron 6 veces con solución amortiguadora de lavado (1 x PBS y 0.05% Tween 20) y se bloquea durante 1 hora con solución amortiguadora de lavado 2% de leche. Las muestras se agregaron a los pozos y las placas se incubaron durante 1 hora. Las placas se lavaron 6x y los anticuerpos secundarios (IgG (H + L) HRPO humano anti cabra, Caltag) se agregaron durante 1 hora seguido por lavado 6x. ELISA se desarrollo con substrato TMB y la reacción se paró por adición de H2S0. Las placas se leyeron a 450 nm. Además, el teñido FACS intracelular, usando anticuerpos etiquetados fluorescentemente se usó para medir la producción de anticuerpos recombinantes en el sistema de cultivo celular. Las células 5 x 105 se lavaron en PBS FACS frío (lx PBS ad 2% FCS) y centrifugaron. Las células se fijaron en Cellfix (BD-Biosciences) durante 20 minutos y de aquí en adelante se lavaron en solución amortiguadora saponante (lx PBS y 0.2% saponina) . La suspensión se centrífugo y el anticuerpo etiquetado fluorescentemente (Fragmento de Cabra F(ab')2, anti humano IgG (H+L) -PE, Beckman Coultier) se agregó durante 20 minutos en hielo. Las células se lavaron dos veces en solución amortiguadora de saponina y se volvieron a suspender en solución amortiguadora FACS y se analizaron por FACS. Este teñido intracelular se usó para determinar el nivel de expresión general así como para determinar la homogeneidad de la población celular en relación a la expresión de los anticuerpos recombinantes . Proliferación : Las alícuotas de la suspensión celular se tomaron tres veces una semana y el número celular, tamaño celular, grado de agrupamiento y porcentaje de células muertas se determinaron por análisis CASY® (contador celular + sistema analizador de Schárfe System GMBH) . El doble tiempo para los cultivos celulares se calculó por el número celular derivado de mediciones CASY®. Establecimiento de una línea celular fabricada para producción de anticuerpo policlonal recombinante anti-Rhesus D Diez líneas celulares de cada una expresan un anticuerpo anti-Rhesus-D recombinante (RhDl57.119D11, RhD158.119B06, RhDl59.119B09, RhDl61.119E0 , RhDl63.119A02 , RhDl90.119F05 , RhDl91.119E08, RhDl92.119G06 , RhDl97.127A08 y RhD204.128A03 ) se seleccionaron para constituir la línea celular fabricada de policlonal recombinante. El Rhdl97 y RhD204 fueron clones Lambda mientras que todos los otros fueron clones kappa. Después de que los cultivos celulares que expresan los anticuerpos anti-Rhesus individuales se adaptaron completamente al cultivo de suspensión libre de suero en matraces agitadores, estos se mezclaron en igual número de células, de tal modo generando una línea celular CHO-Flp-In (019) policlonal. El cultivo celular mezclado se centrifugó y se congeló bajo alícuotas de 10 x 106 células/tubo. Dos tubos (3948 FCW065 y 3949 FCW065) se deshielaron y cultivaron individualmente durante 11 semanas en matraces agitadores 1000 ml que contienen medios 100 ml Excell302 con neomicma . Los sobrenadantes se cosecharon y filtraron anterior a la purificación del anti-RhD rpAb. Diversidad Clonal La diversidad clonal se probó tanto en los niveles de proteína así como en el nivel mRNA. La muestra de sobrenadante usada para analizar la composición del anticuerpo se tomó después de 9 semanas de cultivo, mientras que la muestra celular usada para analizar la composición mARN se tomó en la cosecha después de 11 semanas de cultivo. Composición de anticuerpo: El anti-RhD rpAb expresado de la línea celular CHO-Flp-In (019) policlonal es un anticuerpo IgGl isotipo. El anti-RhD rpAb se purificó a partir de ambas alícuotas (3948 y 3949) usando una columna con Proteína A inmovilizada. Los anticuerpos individuales interactúan con Proteína A inmovilizada. Los anticuerpos individuales interactúan con Proteína A inmovilizada a un pH 7.4, mientras que las proteínas contaminadas se lavaron a partir de la columna. Los anticuerpos enlazados se eluyeron posteriormente de la columna a un valor bajo de pH (pH 2.7). Las fracciones que contienen anticuerpos, determinadas a partir de las medidas de la absorbancia a 280 nm, se reunieron y dializaron contra acetato de sodio 5 mM pH 5. Las composiciones anti-RhD rpAb obtenidas a partir de alícuotas 3948 y 3949 (FCW065) después de 9 semanas de cultivo se analizaron usando cromatografía de intercambio de cationes. La Proteína A purificada anti-RhD rpAb se aplicó sobre una columna PolyCatA (4.6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5.0 a una relación de flujo de 60 ml h"1 funcionando a temperatura ambiente. Los componentes del anticuerpo se eluyeron posteriormente usando un gradiente lineal a partir de cloruro de sodio 150 - 350 mM en acetato de sodio 25 mM, pH 5.0 a una relación de flujo de 60 ml h"1. Los componentes del anticuerpo se detectaron espectrofotométricamente a 280 nm. El cromatograma (Fig. 8) se integró posteriormente y el área de los picos individuales A-J se usó posteriormente para componentes de anticuerpo cuantitativo (tabla 4) . El área total de los picos se colocó a 100%. Los cromatogramas de las dos alícuotas mostraron una distribución de pico idéntico, así como concentraciones similares de los componentes en cada pico. A partir de estos resultados se puede concluir que las alícuotas del mismo crecimiento de línea celular policlonal bajo condiciones idénticas producirán anti-RhD rpAb con una diversidad clonal similar . Los miembros individuales del anti-RhD rpAb se asignaron a uno o más picos particulares (resumidos en la tabla 4) . La asignación se basa en cromatogramas obtenidos por productos de anticuerpo a partir de cada clon individual. El cromatograma no individual se obtuvo por anticuerpos producidos a partir de RhDl58.119B06, así este clon no se asignó a cualquier pico. Sin embargo, se considera probablemente que el pico D constituye RhDl58.119B06, el clon se puede también representar en alguno de los otros picos debido a la heterogeneidad. En particular el producto de anticuerpo del clon RhDl97.127A08 tiene un grado alto de heterogeneidad. El clon RhD190.119F05 podría ser visible a 15.3 min. Sin embargo, esto no se detectó, indicando que este clon se ha perdido a partir de la línea celular de fabricación policlonal recombinante. La pérdida de clon RhDl90.119F05 corresponde a una reducción 10% de diversidad la cual se considera aceptable con respecto a la diversidad de la composición anti-RhD rpAb final. Tabla 4 Composición de mARN: La diversidad clonal dentro de la línea celular CHO-Flp-in (019) policlonal después de 11 semanas de cultivo se estimó por análisis RT-PCR-RFLP. Brevemente, una suspensión celular que corresponde a 200 células se sometieron a un procedimiento de congelado-descongelado y estos lisados se usaron como plantilla en un RT-PCR usando kit RT-PCR de Una ETAPA (Qiagen) con cebadores que amplifican la cadena ligera. Las secuencias del cebador fueron: Cebador delantero 5 ' -CGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTG (SEI ID 259) Cebador inverso 5 ' -AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGA (SEQ ID 260) Los productos RT-PCR se digirieron con Hinfl y se analizaron por electroforesis de gel de agarosa, visualizando el producto de restricción con teñido de bromuro de etidio (Fig. 9) . El tamaño esperado de los fragmentos de restricción obtenidos por digestión Hinfl de las cadenas ligeras amplificadas RT-PCR se muestran para cada clon individual en la tabla 5. Seis tamaños de fragmento único en el gel, que se podrían asignar a clones que producen anticuerpo Rhesus D específico, se indican en negritas. No todos los fragmentos únicos se podrían identificar en el gel, estos se indican en itálica. Esto sin embargo, no necesariamente significa que estos clones no se representan en el cultivo. Los fragmentos pueden ya sea no separarse suficientemente de los otros fragmentos a ser identificables, o su concentración es débil comparada a las bandas fuertes. Esto puede ser más pronunciado para fragmentos cortos, desde que enlazan un número más pequeño de moléculas de bromuro de etidio y por lo tanto son menos visibles . Tabla 5 Las dos alícuotas (3448 y 3949) de la misma línea celular policlonal, muestran un patrón de expresión en el gel, aunque la intensidad de los enlaces no son completamente idénticos, esto indica también que las alícuotas del mismo crecimiento de línea celular policlonal bajo condiciones idénticas producirán anti-RhD rpAb con una diversidad clonal similar. Resumen El presente experimento tiene éxito en generar una colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-Rhesus D que comprenden 56 segmentos de ácido nucleico que codifican anti-Rhesus D variante (Tabla 3) . Los plásmidos que contienen miembros individuales de la colección se usaron para transfectar la línea celular CHO-Flp-In (019) , generando 56 líneas celulares individuales capaces de expresar un anticuerpo anti-RhD específico. 10 de estas líneas celulares se mezclaron con objeto de generar una línea celular de fabricación anti-RhD rpAb, que después de 9 semanas de cultivo todavía manteniendo 90% de la diversidad inicial. Después de 11 semanas de cultivo mARN de seis diferentes clones podrían estar no ambiguamente identificados, otros diversos clones son similarmente representados en la banda en aproximadamente 500 pb. El hecho de que dos alícuotas de las líneas celulares CHO-Flp-In (019) policlonal muestren resultados similares con respecto a la diversidad clonal, ilustra que los resultados reproducibles se pueden obtener. EJEMPLO 2 Generación de un banco celular de trabajo para la producción más grande Veintisiete cultivos celulares se seleccionaron para constituir la línea celular policlonal (RhDl57.119D11, RhDl59.119B09, RhDl60.119C07 , RhDldl .119E09 , RhDl62.119G12 , RhDl63.119A02, RhDl89.181E07 , RhDl91.119E08 , RhDl92.119G06 , RhDl96.126Hll, RhDl97.127A08 , RhDl99.164E03 , RhD201.164H12 , RhD202.158E07, RhD203.179F07 , RhD207.127A11 , RhD240.125A09 , RhD241.119B05, RhD244.158B10 , RhD245.164E06 , RhD293.109A09 , RhD301.160A04, RhD305.181E06 , RhD306.223E11, RhD307.230E11 , RhD319.187All y RhD324.231F07) . Además al alto grado de diversidad entre los clones individuales, las selecciones del clon se basaron también en características de crecimiento y producción de los cultivos celulares individuales . Incluido en el criterio de selección en el nivel de cultivo celular fueron: I. Tiempo doble, tuvo que estar entre 24 y 32 horas II: Teñido intracelular; tuvo que mostrar una población celular homogénea III: Productividad; tuvo que exceder 1.5 pg por célula por día Los 27 cultivos celulares diferentes serán igualmente mezclados en vista de número celular y esta mezcla constituirá el banco celular de trabajo para una producción experimental de anti-RhD rpAb. EJEMPLO 3 El ejemplo actual ilustra la caracterización de un cultivo celular policlonal con ocho miembros durante el tiempo. La diversidad clonal del cultivo se determinó en el nivel genético usando análisis RFLP y en el nivel de proteína usando una técnica cromatográfica en una dimensión. La línea celular policlonal del ejemplo actual se constituyó de los siguientes ocho miembros: RhDl91.119E08, RhDl96.126Hll, RhD201.164H12 , RhD203.179F07 , RhD244.158B10, RhD306.223Ell, RhD319.187A11 y RhD324.231F07 En el ejemplo serán simplemente escritos como sigue RhDl91, RhD201, RhD203, RhD244, RhD306, RhD319 y RhD324. Análisis RFLP para estimar la diversidad de clon en cultivos celulares policlonales La distribución de los clones individuales en un cultivo celular policlonal que expresa ocho diferentes anticuerpos anti-Rhesus D se estimó por análisis RFLP (T-RFLP) terminal de productos RT-PCR derivados de la línea celular policlonal. En el procedimiento T-RFLP el cebador o cebadores delantero y/o inverso son etiquetados fluorescentemente y por lo tanto una proporción de los fragmentos de restricción generados a partir de los amplicones podrá contener la etiqueta. Los fragmentos etiquetados pueden ser posteriormente separados por electroforesis capilar y detectados por fluorescencia. Los análisis se pueden realizar ambos en la cadena ligera y la región variable de las secuencias que codifican cadena pesada, dependiendo de los cebadores aplicados . Brevemente, una suspensión celular correspondiente a 200 células se lavó una vez en PBS y se sometió a un procedimiento de congelado-descongelado generando lisados usados como plantillas en una amplificación RT-PCR usando un kit RT-PCR Una-Etapa (Qiagen) y cebadores apropiados. El RT-PCR se llevó a cabo en un ciclizador térmico estándar con las siguientes condiciones: Transcripción inversa 55°C durante 30 minutos Desnaturalizar 95°C durante 15 minutos Circuito de ciclo inicial (35 ciclos) Desnaturalizar 95°C durante 30 segundos Endurecer 60°C durante 30 segundos Prolongar 72°C durante 5 minutos Circuito de ciclo final Prolongar 72°C durante 15 minutos Finalizar 8°C por siempre Para el análisis de la cadena ligera los siguientes cebadores se usaron para la amplificación RT-PCR. El cebador inverso fue etiquetado 6-corboxifluoresceina (FAM) y las secuencias del cebador fueron como sigue: Cebador delantero VL: 5 ' -TCTCTTCCGCATCGCTGTCT Cebador inverso CL: 5 ' -FAM-AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC Veinte µl del producto RT-PCR se digirió con 1 U de Nhel, 1 U de PstI y 1 U de PstI y 1 U de Hinfl (todo del New England Biolabs) en NEBÍ durante 2 horas. Los fragmentos etiquetados se detectaron por electroforesis capilar fluorescente en un ABI3700 (Applied Biosystems) en Statens Serum Institute, Copenhagen, DK. Los fragmentos esperados para cada uno de los clones celulares que producen anticuerpos anti-RhD se muestran en la Tabla 6 y los fragmentos etiquetados FAM se indican en negritas . Tabla 6 El patrón T-RFLP se muestra en la Figura 10 y todos los ocho clones que producen anticuerpo anti-Rhesus D se han asignado a picos específicos. Bajo el supuesto de que no hubo competencia de plantilla/cebador durante el RT-PCR, el área de pico relativo podrá corresponder a la cantidad relativa de mARN transcrito de cada gen de cadena ligera de anticuerpo representados en la línea celular policlonal. Para el análisis de la región variable de cadena pesada dentro de la misma línea celular policlonal la amplificación RT-PCR se llevó a cabo con cebadores específicos VH. Las secuencias de cebador fueron como siguen: Cebador delantero VH: 5' -FAM CGTAGCTCTTTTAAGAGGTG Cebador inverso VH: 5 ' -HEX-ACCGATGGGCCCTTGGTGGA Veinte µl del producto RT-PCR se digirió con 1 U de Rsal y 1 U de Ndel (todo a partir de New England Biolabs) en NEB2 durante 2 horas . Los fragmentos etiquetados se detectaron por electroforesis capilar fluorescente en un ABI3700. El análisis se realizó por Statens Serum Institute, Copenhagen, DK. Los patrones esperados T-RFLP se muestran en la Tabla 7, donde los fragmentos etiquetados FAM se muestran en negritas y los fragmentos etiquetados HEX (éster de succinimidilo 6-carboxi-2 ' , 4, 4 ' , 5, 7, 7 ' -hexaclorofluorescina) son subrayados.

Tabla 7 La línea celular policlonal se cultivó durante 5 semanas y una vez a la semana las muestras se tomaron para los análisis T-RFLP. El análisis se realizó en la cadena pesada variable, pero podría realizarse en la cadena ligera así como si se desea. Después de la electroforesis capilar de los fragmentos de restricción, las áreas de pico relativo se integraron y usaron para estimar la diversidad clonal del cultivo celular policlonal. Las cantidades relativas durante el tiempo se muestran en la Figura 12. Basados en estos resultados, parece que RhDl96 aumenta mientras que RhD203 parece que reduce con el tiempo. Las cantidades de los otros clones son completamente estables durante el periodo de cultivo y todos los ocho cADN se podrían detectar después de cinco semanas de cultivo. Al realizar T-RFLP en ambas cadena ligera y cadena pesada así como en ambos mARN y ADN debe ser posible para obtener una huella digital precisa de la diversidad clonal dentro del cultivo celular policlonal, por ejemplo en células en él limite de envejecimiento celular in vitro o en cualquier punto de tiempo dado durante el cultivo. La técnica se puede por lo tanto usar para monitorear la estabilidad de la diversidad clonal en un cultivo celular durante el tiempo durante la producción de anticuerpo. La técnica se puede también aplicar para monitorear la consistencia lote a lote por ejemplo de diferentes ampollas congeladas bajo el mismo pWCB o en células cosechadas después de dos o más corridas de fabricación. Análisis cromatográfico de intercambio de cationes para estimar la diversidad clonal en un cultivo celular policlonal El anticuerpo policlonal producido del mismo cultivo celular policlonal como se usa en el análisis T-RFLP descrito anteriormente se analizó usando cromatografía de intercambio de cationes. La proteína A purificada recombinantemente que produce anticuerpo policlonal se aplicó sobre una columna PolyCatA (4.6 x 100 mm) en 25 mM de acetato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 5.0 a una relación de flujo de 60 ml h"1 operado a temperatura ambiente. Los componentes de anticuerpo se eluyeron posteriormente usando un gradiente lineal desde 150 - 350 mM de cloruro de sodio en 25 mM de acetato de sodio, pH 5.0 a una relación de flujo de 60 ml h-1. Los componentes de anticuerpo se detectaron espectrofotométricamente a 280 nm y el cromatograma se integró posteriormente y el área de los picos individuales se usó luego para cuantificar componentes de anticuerpo. Las cantidades relativas durante el tiempo se muestran en la Figura 13. Resumen Los resultados obtenidos en el nivel genético por el análisis RFLP y en el nivel de proteína por cromatografía de intercambio de cationes son comparables . Las Figuras 12 y 13 claramente ilustran que más de los clones individuales en la línea celular policlonal así como los anticuerpos individuales del anticuerpo policlonal expresado desde la línea celular siguiendo las mismas tendencias durante las 5 semanas de cultivo. Así, los análisis en el nivel de genética así como de proteína son buenos equivalentes para determinar la diversidad de la composición de una línea celular en el nivel genético y de proteína policlonal recombinante producida de la línea celular. EJEMPLO 4 El presente ejemplo ilustra la caracterización de un cultivo celular policlonal con veinticinco miembros durante el tiempo. La diversidad clonal del cultivo se determinó en el nivel genético usando análisis T-RFLP y en el nivel de proteína usando una técnica cromatográfica en una dimensión. La línea celular policlonal del presente ejemplo se constituyó de los venticinco miembros indicados en la Tabla 8. Además, las características de crecimiento de los clones individuales se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8 a Datos que representan el promedio de dos medidas ELISA b Reactivo RhDVI c Datos no disponibles En los siguientes, los nombres de clon son generalmente identificados solamente por sus primeros tres dígitos, por ejemplo, RhDl57.119D11 se escribe como RhDl57. Análisis T-RFLP de la parte variable de los genes de cadena pesada derivados de un cultivo celular policlonal que expresan veinticinco diferentes anticuerpos anti-Rhesus D durante un periodo de cultivo de 5 semanas. El cultivo celular policlonal examinado en el presente ejemplo se compuso de una mezcla de cultivos celulares que expresan veinticinco diferentes anticuerpos anti-Rhesus D (generados como se describe en el Ejemplo 1) . El cultivo celular policlonal se cultivó durante 5 semanas y una vez a la semana las muestras se tomaron para análisis T-RFLP. El RT-PCR se llevó a cabo con los cebadores específicos VH descritos en el Ejemplo 3 y la fragmentación de restricción se llevó a cabo similarmente. El T-RFLP de las veinticinco diferentes secuencias que codifican anti-Rhesus D, si todos los genotipos se presentan, resulta en setenta diferentes fragmentos etiquetados FAM. Algunos fragmentos representarán hasta tres genotipos diferentes mientras que otros representarán un genotipo sencillo. Los tamaños esperados de los fragmentos etiquetados FAM se muestran en la Tabla 9 junto con las cantidades relativas de los diferentes fragmentos etiquetados FAM durante el tiempo. Además, un ejemplo de un perfil T-RFLP se muestra en la Figura 11.

Tabla 9 Fue posible separar los fragmentos de restricción a un grado que permite información a ser obtenida por doce clones individuales de los veinticinco clones que constituyen la línea celular. Las fracciones restantes podrían potencialmente ser sometidas a ordenación con objeto de obtener más información en los clones restantes. Análisis cromatográfico de intercambio de cationes para estimar la diversidad clonal en un cultivo celular policlonal que expresa veinticinco diferentes anticuerpos anti-Rhesus D El anticuerpo policlonal producido a partir del mismo cultivo celular policlonal como se usa en el análisis T-RFLP descrito anteriormente, se analizó usando cromatografía de intercambio de cationes. La proteína A purificada recombinantemente que produce anticuerpo policlonal se aplicó sobre una columna PolyCatA (4.6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5.0 en una relación de flujo de 60 ml tf1 funcionando a temperatura ambiente. Los componentes de anticuerpo se eluyeron posteriormente usando un gradiente lineal desde cloruro de sodio 150 - 350 mM en acetato de sodio 25 mM, pH 5.0 a una relación de flujo de 60 ml h_1. Los componentes de anticuerpo se detectaron espectrofotométricamente a 280 nm y el cromatograma se integró posteriormente y el área de picos individuales se usó para cuantificar los diferentes componentes de anticuerpo. La Figura 14 muestra el cromatograma producido desde el mismo obtenido en la semana 4, el anticuerpo que contiene picos siendo numerado desde 1 hasta 25. Es coincidencia pura que el cromatograma contiene un número idéntico de picos como el número de anticuerpos individuales en el anticuerpo individual analizado. La Tabla 10 muestra el contenido relativo en porcentaje de los componentes de anticuerpo total (AC1 hasta 25), sai como la representación de los anticuerpos individuales en cada componente de anticuerpo (pico) . La asignación de anticuerpos individuales a los picos cromatográficos integrados se basó en los tiempos de retención y los patrones de pico obtenidos desde los anticuerpos monoclonales analizados usando cromatografía de intercambio de cationes bajo condiciones idénticas. Tabla 10 La cromatografía de intercambio de cationes separa los miembros del anticuerpo individual de un anticuerpo policlonal con base en las diferencias en carga neta entre los miembros individuales y además separa formas de anticuerpos individuales que aparecen de carga heterogénea. Varios anticuerpos son por lo tanto representados en un pico sencillo, por ejemplo, AC 1 que contiene RhD293 y RhD319 (ver Tabla 10) y algunos anticuerpos individuales se representan además en diversos picos cromatográficos, por ejemplo RhD319 en el cual está presenta tanto en ACl y 5 (ver Tabla 10) .

Los picos que contienen más de un anticuerpo individual puede someterse a técnicas de caracterización química de proteína adicional, tales como análisis cuantitativo con péptidos anti-idiotipo, mapeo de péptido proteolítico, secuencia de terminal N o una cromatografía de segunda dimensión. Resumen El ejemplo actual ilustra el uso combinado de análisis T-RFLP y cromatografía de intercambio de cationes para evaluar la distribución de las transcritos primarios y de componentes de anticuerpo, respectivamente, durante un periodo de cultivo. El análisis T-RFLP permite para identificación única de 12 clones individuales de los 25 clones expresados en la línea celular policlonal y en el ejemplo actual se ilustra que estos 12 clones pueden detectarse durante 4 semanas de cultivo con el análisis T-RFLP. Potencialmente, más clones pueden identificarse por análisis de secuencia de fragmentos representando más de un clon. La distribución de componentes del anticuerpo se analizan usando cromatografía de intercambio de cationes y en el ejemplo actual se aprecia que la distribución de los 25 componentes analizados es relativamente estable durante la cultivo. Aunque la identificación única de todos los anticuerpos individuales es difícil debido a la naturaleza heterogénea de carga inherente de los anticuerpos expresados se demostró en el ejemplo actual que el componente del anticuerpo 8 representa el anticuerpo RhDlßO muestra el nivel de anticuerpo más alto durante el periodo de cultivo de acuerdo con los valores T-RFLP altos obtenidos para el grupo 13 que representa los clones RhDlßO, 293, y 196. Adicionalmente, el componente RhD 207, que puede identificarse únicamente por T-RFLP así como por cromatografía de intercambio de catión, muestra niveles T-RFLP de 10-11% y niveles ligeramente inferiores de 5.5-10% obtenido al nivel de anticuerpo. Generalmente, las dos técnicas juntas demuestran una producción estable relativamente al mARN y nivel de anticuerpo durante la cultivo; sin embargo, las discrepancias potenciales entre las dos técnicas también pueden apreciarse, ilustrados por la perdida aparente de la transcripción de algunos clones a 5 semanas de cultivo que contrasta con los resultados obtenidos al nivel del anticuerpo. De esta manera, el ejemplo actual justifica el uso complementario de ambas técnicas para definir los intervalos de cultivo dentro de la producción estable del complejo de la proteína policlonal puede obtenerse. EJEMPLO 5 El ejemplo actual demuestra la generación de pWCB que contiene anti-RhD rpAb con 25 miembros individuales y proporciona la confirmación de una variación lote a lote mínimo de productos rpAb purificados de viales diferentes del pWCB.

Generación del pWCB Para generar un pWCB que contiene anti-RhD rpAb con 25 miembros individuales, un vial de cada una de las 25 líneas celulares de producción de anticuerpo anti-RhD monoclonal en banco (RhDl57, 159, 160, 162, 189, 191, 192, 196, 197, 199, 201, 202, 203, 207, 240, 241, 245, 293, 301, 305, 306, 317, 319, 321, 324) se descongelan en ExCell 302 medio que contiene 4 mM de glutamina y se expande durante 3 semanas en el mismo medio complementario con 500 µg/ml G418 y agente anti-agrupado diluido 1:250. Los números iguales de células (2 x 106) de cada cultivo luego se mezclan cuidadosamente juntos, y se congelan en nitrógeno líquido (5 x 107 células/vial) usando procedimientos de liberación estándar. Cul tivo en bioreactores Los viales del pWCB se descongelaron en matraces T75 (Nunc, Roskillde, Dinamarca) y se expanden en matraces de hilado (Techne, Cambridge, UK) . Bioreactores de 5 L(Appliko, Schiedam, Países Bajos) se inocularon con 0.6 x 106 células/ml en 1.5 L. Durante las corridas del reactor, las células se alimentan en una base diaria con medio ExCell 302 complementado con solución de alimentación concentrada, a glutamina y glucosa a un volumen final de 4.5 L. Las corridas del bioreactor se terminaron después de 16-17 días. Los tres lotes se terminan Symo4:21, Sym04:23 y Sym04:24. Los lotes se cultivaron a puntos diferentes en una vez.

Análisis de variación lote a lote Las muestra de anticuerpo policlonal recombinantes se purificaron por cromatografía de afinidad usando columnas HiTrap™rproteína A (GE Healthcare, UK) . Las muestras de anticuerpo policlonal recombinante purificado se analizaron usando cromatografía de intercambio de cationes empleando una columna PolyCAT A (4,6 x 100 mm, de PolyLC Inc., MA, US) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5.0 a una relación de flujo de 60 ml/h (temperatura ambiente) . Los picos de anticuerpo se eluyeron subsecuentemente usando gradiente lineal de 150 mM hasta 350 o NaCl 500 mMen acetato de sodio 25 mM, pH 5.0 a una relación de flujo de 60 ml/h. Los picos de anticuerpo se detectaron espectrofotométricamente a 280 nm. Los cromatogramas se integraron y el área de picos individuales usada por cuantificación. Como ya está mencionado algunos de los anticuerpos individuales exhiben heterogeneidad de carga y dos anticuerpos pueden contribuir al mismo pico en el cromatograma IEX. La tabla 11 muestra el contenido relativo en porcentaje de los componentes del anticuerpo total (AC) . En el ejemplo actual el área relativa se ha calculado para 35 AC, mientras que el Ejemplo 4 solamente calcula el área relativa para 25 AC . Esta diferencia es estrictamente debido a una asignación diferente de los picos en el cromatograma y no a diferencias actuales en el perfil como tal Tabla 11 La tabla 11 muestra que la capacidad de reproducción entre los productos de anticuerpo cosechados de los tres lotes es alto. La variación en el tamaño de los picos del anticuerpo individual fue dentro de 20% para más componentes anticuerpo, mientras que la variación para alguno de los picos más pequeños fue ligeramente grande. EJEMPLO 6 El ejemplo actual demuestra que los lotes diferentes de un anti-RhD rpAb con 25 miembros individuales (composición igual como en el Ejemplo 4) enlazan a eritrocitos RhD positivos con potencia similar y muestran actividad biológica comparable con respecto a los mecanismos efectores relevantes : citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y fagocitosis. Preparación de células de glóbulos rojos Las células de glóbulos rojos (RBC) se prepararon de sangre entera obtenida de donadores saludables después del informe consentido al Banco de Sangre, Hospital Aalborg, DK, al lavar la sangre tres veces en PBS (Gibco, Invitrogen, Reino Unido) que contiene 1% de albúmina de suero de bovino (BSA, Sigma-Aldrich, Alemania) . Los eritrocitos se resuspendieron y almacenar a 4°C como una solución de 10% en ID-Cellstab (DiaMed, Suiza) . Preparación de PBMC Las capas espumosas que contienen sangre de donadores saludables se obtuvieron del Banco de Sangre del Hospital Nacional, Copenhagen, Dinamarca y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se purifican en Ly phoprep (Axis-Shield, Noruega) . Ensayos de potencia El ensayo de potencia se adoptó de la Farmacopea Europea 4 (sección 2.7.13 método C) . La capacidad de enlace de un anti-RhD rpAb con 25 miembros individuales se midieron usando eritrocitos positivos RhD a 5 x 104 células/µl en PBS, 1% de BSA. Los lotes anti-RhD rpAb, Sym04:21, Sym04:23, y Sym04:24, se obtuvieron de corridas de bioreactor de lote de alimentación 5 L individuales. Las diluciones (1 . veces) de los lotes anti-RhD rpAb se hicieron en PBS, 1% de BSA en triplicado en placas de 96 pozos (Becton Dickinson Labware, NJ, USA) . Cinco µl de las diluciones anti-RhD rpAb se mezclaron con 50 µl de eritrocitos y se incuban a 37°C durante 40 min. Las células se lavaron dos veces (300 xg, 2 min) en PBS, 1% de BSA. 80 µl de IgG anti-humano de cabra conjugado con ficoeritrina, (Beckman Coulter, CA, USA) diluida 1:20 en PBS, 1% en BSA se agregó a cada muestra y se deja a 4°C durante 30 min. Las muestras se lavaron en PBS, 1% de BSA y en FacsFlow (Becton Dickinson, Bélgica) (300xg, 2 min) y se volvió a suspender en 200 µl de FACSFlow. Las muestras se corrieron en un FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, USA) y el análisis de datos llevado a cabo usando CellQuest Pro y Excel. Los tres lotes anti-RhD rpAb individuales exhiben esencialmente potencia de enlace idéntica para eritrocitos positivos RhD (Fig. 15A) . Ensayos de fagoci tosis y ADCC combinado Este ensayo se adaptó de Berkman et al. 2002. Autoimmunity 35, 415-419. Brevemente, las células de glóbulos rojos (RBC) RhD negativo (RhD-) y RhD positivo (RhD+) se etiquetaron con cromo radioactivo. Para Cr51 etiquetado, 1 x 108 RBC RhD+ y RhD-, respectivamente se centrifugaron (600 x g durante 10 min) y 100 µl de medio de Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) y 200 µl de cromato de sodio (0.2 µCl) (GE Healthcare, UK) se agregaron a cada tubo antes de la incubación durante 1.5 horas a 37°C. La suspensión se lavó dos veces en 50 ml de PBS y se resuspendió en 1 ml de DMEM completo (que contiene 2 mM de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 10% de suero de becerro fetal) (Invitrogen, CA, US) . Las células se ajustaron hasta 4 x 106 células/ml y 50 µl/pozo se agregaron a placas de cultivo celular de 96 pozos (Nunc) . Cincuenta µl de diluciones dos veces de anti-RhD rpAb de lote Sym04:21 o Sym04:24, luego se agregó a cada pozo, excepto en pozos de control. Los pozos de control se suministraron con DMEM completo y se usan para ya sea lisis espontánea/lisis de retención o máxima. Los PBMC se ajustaron hasta 2 x 107 células/ml, y 100 µl se agregaron a cada pozo y se incubaron a 37°C durante la noche. Cien µl 1% de triton-X-100 (Merck, Alemania) se agregó a los pozos de control de lisis máximo. Las placas se centrifugaron (600xg durante 2 min) y 50 µl del sobrenadante se transfirió a ADCC Lumaplates (Perkin Elmer, Bélgica) . Después de la transferencia de los sobrenadantes, las placas de cultivo celular se centrifugaron (300xg durante 2 min) y 50 µl del sobrenadante de los pozos de lisis máximo se transfirieron a otra LumaPlate (fagocitosis LumaPlate) . En las placas de cultivo celular, el sobrenadante se removió de los pozos restantes y la solución amortiguadora de lisis (NHC1 140 mM, Tris-HCl 17 mM) se agregó, seguido por 5 min de incubación a 37°C. El NHC1 lisa al RBC, pero deja la fracción PBMC y por ello el RBC fagocitozado intacto. Después de la lisis RBC, las placas se centrifugaron (4°C, 2 min, 300 g) , los peletizados se lavaron dos veces en PBS, y se resuspendió en 100 µl PBS. Cien µl de 1% de Triton-X-100 se agregó a los pozos para lisar el PBMC fagocítico, y 50 µl del lisado se transfirió a la fagocitosis LumaPlates . La Lumaplates se secaron durante la noche a 40°C y se encuentan en un TopCount NXT (Packard, CT, USA) . Todos los datos se importaron en Excel1 y se analizan como se describe por Berkman et al. 200. Autoimmunity 35, 415- 419. Brevemente, los datos computarizados se llevaron a cabo como sigue: ADCC: lisis inmune (%) = (prueba media Cr51 liberado - medio espontáneo Cr51 liberado) / (total Cr51 en eritrocitos objetivo - respaldo de la máquina) x 100 Fagocitosis: fagocitosis inmune (%) = (prueba media Cr51 retención - medio espontáneo Cr51 retención) / (total Cr51 en eritrocitos objetivos - respaldo de la maquina) x 100 Todos los datos se normalizaron a los valores asentados máximos combinados La actividad funcional de anti-RhD rpAb de las dos corridas de reactor consecutivas muestra actividad funcional casi idéntica en ambos ensayos in vitro (Fig. 15B y 15C) reflejando la consistencia alta entre los lotes. EJEMPLO 7 El ejemplo actual demuestra que la diversidad clonal de un anti-RhD rpAb con 25 miembros individuales (misma composición como en el ejemplo 4) se mantiene durante el proceso cadena abajo (DSP) . El análisis cromatográfico de intercambio de cationes se usa para estimar la diversidad clonal durante DSP del anticuerpo policlonal recombinante. Procesamiento cadena abajo Una muestra anti-RhD rpAb, que contiene 25 miembros individuales, de una corrida del bioreactor del desarrollo se purificó usando las siguientes etapas DSP: 1. - captura de los anticuerpos usando una columna MabSelect 2.- Inactivación de virus a pH 3 3. - Intercambio de solución amortiguadora usando una columna Sephadex G-25 4. - Cromatografía de intercambio de anión usando una columna DEAE-Sepharose 5.- Filtración de virus usando un filtro Planova 15N, y 6. - Cromatografía de inducción de carga hidrofóbica usando una columna MEP Hypercel 7.- Ultrafiltración/diafiltración usando un filtro Millipore biomax Análisis de diversidad clonal después de las etapas DSP individuales La cromatografía de intercambio de cationes se usó para analizar la diversidad clonal durante DSP de una composición de anticuerpo policlonal recombinante. Las muestras se toman después de las etapas 1, 3, 4 y 6 durante DSP de un anti-RhD rpAb se aplicó en una columna PolyCatA (4.6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5.0 a una relación de flujo de 60 ml h-l operado a temperatura ambiente. Los componentes de anticuerpo se eluyeron subsecuentemente usando un gradiente lineal desde 150-500 mM cloruro de sodio en acetato de sodio 25 mM, pH 5.0 a una relación de flujo de 60 ml h-l. Los componentes de anticuerpo se detectaron espectrofotométricamente a 280 nm y los cromatogramas se compararon (Fig. 16) para detectar la pérdida potencial de diversidad clonal durante DSP. En el ejemplo actual se demostró, usando cromatografía de intercambio de cationes que la diversidad clonal es esencial sin cambiar durante DSP de un anticuerpo policlonal recombinante. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Un método para generar una colección de células apropiadas como línea celular de fabricación para la expresión de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD, el método caracterizado porque comprende: a) proporcionar una colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD, en donde cada vector individual de la colección comprende 1) una copia sencilla de un segmento de ácido nucleico que codifica un miembro distinto del anticuerpo policlonal anti-RhD y 2) una o más secuencias de reconocimiento de recombinasa; b) introducir la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD en una línea de célula hospedera, en donde el genoma de cada célula individual de la línea de célula hospedera comprende secuencias de reconocimiento de recombinasa, que coinciden con esa del vector, en su genoma; c) asegurar la presencia en las células de una o más recombinasas de manera que los segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-RhD de la etapa (a) se integran específicamente en el sitio en las células de la línea de célula hospedera, donde las recombinasas están ya sea i) expresadas por las células en las cuales el segmento de ácido nucleico se introduce; ii) codificadas operativamente por los vectores de la etapa (a) ; iii) proporcionadas a través de la expresión de un segundo vector; o iv) proporcionadas a la célula como la proteína; y d) seleccionar células que comprenden una copia integrada del segmento de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-RhD de la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD se introduce en la línea de célula hospedera al transfectar las células hospederas separadamente con miembros individuales de la colección de vectores, y las células se agrupan para formar una colección de células apropiadas como una línea celular de fabricación policlonal recombinante posterior a la selección de la etapa (d) .
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD se introduce en la línea de célula hospedera por transfección de semi-volumen de alícuotas de las células hospederas con fracciones que comprenden 5 hasta 50 vectores individuales de la colección de vectores, y las células se agrupan para formar una colección de células apropiadas como una línea celular de fabricación policlonal recombinante posterior a la selección de la etapa (d) .
4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD se introducen en la línea de célula hospedera por transfección de volumen de una colección de las células hospederas con la colección de vectores.
5. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD codifica un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD donde al menos uno de los miembros individuales se enlaza específicamente a epD3 , epD4 y epD9 (antígeno VI categoría RhD) y miembros adicionales solos o en combinación de enlace a los epítopos de antígeno Rhesus D restantes epDl, epD2 , epD5, epD6/7 y epD8.
6. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la colección de vectores de expresión de anticuerpo anti-RhD comprende segmentos de ácido nucleico variantes cada uno comprende regiones CDRl, CDR2 y CDR3 seleccionadas de uno de los pares VH:LC que corresponden a los pares de secuencias de ácido nucleico identificables por los distintos nombres del clon en la tabla 3.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de los pares VH:LC se identifican por los nombres de clones RhDl57.119Dll, RhDl58.119B06 , RhDl59.119B09 , RhDldl .119E09 , RhDl63.119A02, RhDl90.119F05, RhDl91.119E08 , RhDl92.119G06 , RhDl97.127A08 y RhD204.128A03.
8. El método de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizado porque las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de los pares VH:LC se identifican por los nombres de clones RhDl57.119Dll, RhDl59.119B09 , RhDl60.119C07 , RhDl62.119G12 , RhDl89.18lE07, RhD191.119E08, RhDl92.119G06 , RhDl96.126H11 , RhDl97.127A08, RhDl99.164E03 , RhD201.164H12 , RhD202.158E07 , RhD203.179F07, RhD207.127A11, RhD240.125A09 , RhD241.119B05 , RhD245.164E06, RhD293.109A09 , RhD301.160A04 , RhD305.181E06 , RhD306.223Ell, RhD317.144A02 , RhD319.187A11, RhD321.187G08 y RhD324.23lF07.
9. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la copia sencilla de un segmento de ácido nucleico que codifica un miembro distinto del policlonal anti-RhD, se integra en una ubicación genómica predefinida sencilla de cada célula individual en la colección de células, la ubicación es capaz de mediar la expresión de alto nivel de cada miembro del anticuerpo policlonal recombinante.
10. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la colección de células se deriva de una línea celular de mamífero o tipo de célula.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la línea celular de mamífero se selecciona del grupo que consiste de células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK, YB2/0, NIH 3T3 , células de mieloma, fibroblastos, HeLa, HEK 293, PER.C6, y líneas celulares derivadas de las mismas .
12. Un método para generar un banco celular de trabajo policlonal, el método caracterizado porque comprende: a) proporcionar una colección de líneas celulares, obtenidas de células hospederas que se transfectan individualmente con un miembro individual de una colección que comprende segmentos de ácido nucleico que codifican la región variable, y donde cada línea de célula individual durante la transfección produce un miembro diferente de una proteína policlonal, b) mezclar un número predefinido de células expandidas de cada una de las líneas de células, y c) congelar alícuotas de la mezcla.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque una alícuota obtenida en la etapa c) se descongela y se expande durante un número de generaciones suficientes para producir un número total de células, que se congelan en una serie nueva de alícuotas (una sub-pWCB) , con aproximadamente el mismo número de células en cada alícuota de la sub-pWCB como en la alícuota descongelada.
14. El método de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque la colección que comprende segmentos de ácido nucleico que codifican la región variable es una colección que comprende segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo VH y V .
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la colección que comprende segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo VH y V codifica un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD.
16. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 hasta 15, caracterizado porque las líneas celulares individuales se seleccionan, antes del mezclado de las células, de tal manera que tienen relaciones de proliferación y/o productividad similares.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las líneas celulares individuales se seleccionan para productividad similar por análisis FACS.
18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las líneas celulares individuales se seleccionan para productividad similar y/o relación de proliferación por medio de un robot.
19. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 hasta 18, caracterizado porque las líneas celulares seleccionadas tienen una relación de proliferación entre 22 y 40 horas y/o una productividad que excede 1.5 pg/(célula*día) .
20. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 hasta 19, caracterizado porque las líneas celulares individuales son líneas celulares clonadas.
21. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 hasta 20, caracterizado porque cada línea de célula individual produce un anticuerpo de longitud completa con propiedades que difieren de las propiedades de los anticuerpos producidos por los otros miembros del banco celular de trabajo policlonal.
22. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 hasta 21, caracterizado porque las líneas celulares individuales se mezclan a relaciones iguales .
23. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 hasta 21, caracterizado porque las líneas celulares individuales se mezclan a relaciones diferentes.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la relación de una o más líneas celulares individuales que produce un anticuerpo que enlaza un antígeno particular se incrementa en comparación con los otros miembros del banco celular de trabajo policlonal.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la relación de una o más líneas celulares individuales que se distinguen por tener una relación de proliferación más lenta se incrementa en comparación a otros miembros del banco celular de trabajo policlonal que se distinguen por una relación de proliferación más rápida.
26. Un banco celular de trabajo policlonal, caracterizado porque comprende una mezcla de un número predefinido de células de una colección de líneas celulares individuales, donde cada línea celular individual es obtenida de células hospederas que se transfectan individualmente con un miembro individual de una colección que comprende segmentos de ácido nucleico que codifican la región variable, y donde cada línea celular individual produce un miembro diferente de una proteína policlonal, y donde el pWCB se ha congelado en alícuotas.
27. El banco celular de trabajo policlonal de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las líneas celulares individuales tienen relaciones de proliferación y/o productividad similares.
28. El banco celular de trabajo policlonal de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, caracterizado porque las líneas celulares individuales son células clonadas .
29. El banco celular de trabajo policlonal de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 26 hasta 28, caracterizado porque las líneas celulares individuales se mezclan a relaciones diferentes.
30. Un método para la manufactura de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD, el método caracterizado porque comprende: a) proporcionar un banco celular de trabajo policlonal de conformidad con la reivindicación 15 o las reivindicaciones 16 hasta 25 como dependiente de la reivindicación 14, o proporcionar una colección de células que comprenden una colección de segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-RhD, en donde cada célula individual en la colección contiene una copia sencilla de un segmento de ácido nucleico que codifica un miembro distinto del anticuerpo policlonal anti-RhD, la copia se integra al mismo sitio del genoma de cada célula individual; b) cultivar el banco celular de trabajo policlonal o la colección de células bajo condiciones que facilitan la expresión del anticuerpo policlonal recombinante; y c) recuperar el anticuerpo policlonal recombinante expresado del cultivo celular, células o sobrenadante.
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el anticuerpo policlonal recombinante recuperado se somete a purificación adicional.
32. El método de conformidad con las reivindicaciones 30 ó 31, caracterizado porque la colección de células en la etapa (a) se genera de conformidad con el método de cualesquiera de las reivindicaciones 1-11.
33. Una colección de vectores de expresión anti-RhD para integración específica al sitio, caracterizada porque comprende una población de segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-RhD variante, en donde cada uno de los vectores comprende 1) una copia de un segmento de ácido nucleico que codifica un miembro distinto del anticuerpo policlonal anti-RhD y 2) una o más secuencias de reconocimiento de recombinasa.
34. La colección de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque al menos uno de los miembros individuales de la población de segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-RhD variante codifica un anticuerpo anti-RhD que se enlaza específicamente a epD3 , epD4 y epD9 (antígeno RhD categoría VI) y miembros adicionales solos o en combinación enlazados a los epítopos de antígeno Rhesus D restantes epDl, epD2, epD5, epD6/7 y epD8.
35. La colección de conformidad con la reivindicación 33 ó 34, caracterizada porque la colección comprende segmentos de ácido nucleico variantes cada uno comprende regiones CDRl, CDR2 y CDR3 seleccionadas de uno de los pares VH:LC que corresponden a las secuencias de ácido nucleico identificables por los distintos nombres de clon en la tabla 3.
36. La colección de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de los pares VH:LC se identifican por los nombres de clones RhDl57.119Dll, RhDl58.119B06 , RhDl59.119B09 , RhDl61.119E09 , RhDl63.119A02, RhDl90.119F05 , RhDl91.119E08 , RhDl92.119G06 , RhDl97.127A08 y RhD204.128A03.
37. La colección de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de los pares VH:LC se identifican por los nombres de clones RhDl57.119Dll, RhDl59.119B09 , RhDl60.119C07 , RhDl62.119G12 , RhDl89.18lE07, RhDl91.119E08 , RhDl92.119G06 , RhDl96.126H11 , RhDl97.127A08, RhDl99.164E03 , RhD201.164H12 , RhD202.158E07 , RhD203.179F07, RhD207.127A11 , RhD240.125A09 , RhD241.119B05 , RhD245.164E06, RhD293.109A09 , RhD301.160A04 , RhD305.181E06 , RhD306.223Ell, RhD317.144A02 , RhD319.187A11 , RhD321.187G08 y RhD324.23lF07.
38. Una colección de segmentos de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-RhDs, caracterizada porque cada segmento comprende regiones CDRl, CDR2 y CDR3 seleccionadas de uno de los pares VH:LC que corresponden a los pares de las secuencias de ácido nucleico identificables por un nombre de clon distinto de la tabla 3.
39. La colección de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de los pares VH:LC se identifican por los nombres de clones RhDl57.119Dll, RhD158.119B06 , RhDl59.119B09 , RhDl61.119E09 , RhDl63.119A02, RhDl90.119F05, RhDl91.119E08 , RhDl92.119G06 , RhDl97.127A08 y RhD204.128A03.
40. La colección de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de los pares VH:LC se identifican por los nombres de clones RhDl57.119Dll, RhD159.119B09 , RhDl60.119C07 , RhDl62.119G12 , RhDl89.18lE07, RhDl91.119E08 , RhD192.119G06 , RhDl96.126H11 , RhDl97.127A08, RhDl99.164E03 , RhD201.164H12 , RhD202.158E07 , RhD203.179F07, RhD207.127A11, RhD240.125A09 , RhD2
41.119B05 , RhD245.164E06, RhD293.109A09 , RhD301.160A04 , RhD305.181E06 , RhD306.223Ell, RhD317.144A02 , RhD319.187A11 , RhD321.187G08 y RhD324.23lF07. 41. Una línea celular de fabricación policlonal recombinante, caracterizada porque comprende una colección de células transfectadas con una colección de segmento de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-RhDs, en donde cada célula en la colección es capaz de expresar un miembro de la colección, que codifica un miembro distinto de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD y que se localiza en el mismo sitio en el genoma de células individuales en la colección, en donde el segmento de ácido nucleico no se asocia naturalmente con la célula en la colección.
42. La línea celular de fabricación policlonal recombinante de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el segmento de ácido nucleico que codifica un miembro distinto del policlonal anti-RhD, se integra en una ubicación genómica predefinida sencilla de cada célula individual en la colección de células, la ubicación es capaz de mediar la expresión de alto nivel de cada miembro del anticuerpo policlonal recombinante.
43. La línea celular de fabricación policlonal recombinante de conformidad con la reivindicación 41 ó 42, caracterizada porque la colección de células se deriva de una línea celular de mamífero o tipo de célula.
44. La línea celular de fabricación policlonal recombinante de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la línea celular de mamífero se selecciona del grupo que consiste de células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK, YB2/0, NIH 3T3 , células de mieloma, fibroblastos, HeLa, HEK 293, PER.C6, y derivado de líneas celulares de las mismas.
45. La línea celular de fabricación policlonal recombinante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 41 hasta 44, caracterizada porque la colección es una colección de conformidad con una de las reivindicaciones 33 hasta 40.
46. Un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD, caracterizado porque consiste de regiones constantes IgGl y/o IgG3 obtenidas por el método de conformidad con las reivindicaciones 30 ó 32.
47. Un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD, caracterizado porque cada miembro individual comprende las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 seleccionadas de uno de los pares VH:LC que corresponden a los pares de secuencias de aminoácidos identificables por un nombre de clon distinto en la tabla 3.
48. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD de conformidad con la reivindicación 46 ó 47, caracterizado porque al menos uno de los miembros individuales se enlaza específicamente a epD3, epD4 y epD9 (antígeno RhD categoría VI) y miembros adicionales solos o en combinación enlazado a los epítopos de antígeno Rhesus D restantes epDl, epD2 , epD5, epD6/7 y epD8.
49. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD de conformidad con la reivindicación 47 ó 48, caracterizado porque las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de los pares VH:LC se identifican por los nombres de clones RhD157.119D11, RhDl58.119B06, RhDl59.119B09 , RhDldl .119E09 , RhD163.119A02 , RhDl90.119F05, RhDl91.119E08 , RhDl92.H9G06 , RhDl97.127A08 y RhD204.128A03.
50. El fragmento de anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD de conformidad con la reivindicación 47 ó 48, caracterizado porque las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de los pares VH:LC se identifican por los nombres de clones RhDl57.119DH, RhDl59.119B09 , RhDl60.119C07 , RhDl61.119E09 , RhDl62.119Gl2, RhDl63.119A02 , RhDl89.181E07 , RhDl91.119E08, RhDl92.119G06, RhDl96.126H11, RhDl97.127A08 , RhDl99.164E03 , RhD201.164Hl2, RhD202.158E07 , RhD203.179F07 , RhD207.127A11, RhD240.125A09, RhD241.119B05 , RhD244.158B10 , RhD245.164E06 , RhD293.109A09, RhD301.160A04 , RhD305.181E06 , RhD306.223E11, RhD307.230Ell, RhD319.187A11 y RhD324.231F07.
51. Un método para el tratamiento, alivio, o profilaxis en un animal, caracterizado porque se administra una cantidad efectiva del policlonal recombinante anti-RhD de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 46 hasta 50.
52. El uso de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 46 hasta 50 para la preparación de una composición para la profilaxis de enfermedad hemolítica del recién nacido, tratamiento de púrupura trombocitopénica idiopática (ITP) , o prevención de sensibilización al antígneo Rhesus D después de transfusión fallida de sangre RhD(+) a individuos RhD(-) .
53. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende como ingrediente activo un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD de conformidad con una de las reivindicaciones 46 hasta 50 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.