KR100306635B1 - 분비생성물에의한직접적인세포선별 - Google Patents

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Abstract

세포를 그것의 표면에서 생성물에 특이적인 결합파트너에 커플링시키고 생성물이 분비 및 방출될때 특정 결합파트너에 의해 생성물이 포획되게 함으로써 효율적인 방식으로 세포가 분비 및 방출하는 생성물로 세포를 표지화시킬 수 있다. 그 다음엔 생성물-표지화된 세포를 원한다면 적합한 표지에 더욱 커플링시킬 수 있고, 생성물의 존재, 부재, 또는 양에 따라 분리할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
분비 생성물에 의한 직접적인 세포 선별
[도면의 간단한 설명]
제1도는 덱스트란에 바이오티닐 및 팔미토일 기를 도입하는 것에 대한 도해이다.
제2도는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르와 염기성 형태의 일차 아미노기의 반응에 대한 도해이다.
제3(a)도 및 제3(b)도는 각각 바이오티닐덱스트란 및 바이오티닐팔미토일덱스트란으로 처리한 세포와 스트렙트아비딘의 결합에 대한 형광 활성화된 세포 분류 분석(FACScan)의 트레이스(trace)의 사진복사이다.
제4도는 FACScan 결과의 트레이스의 사진복사이다: (a) 플루오르이소티오시아네이트(ST-FITC)로 표지화된 스트렙트아비딘으로 처리한 바이오티닐화되지 않은 세포(네가티브 대조구); (b) 바이오티닐팔미토일덱스트란으로 그리고나서 ST-FITC로 처리한 세포; (c) 바이오티닐-안티-αβ2마이크로글로불린(β2m)으로 인큐베이트시키고 ST-FITC로 처리한 세포.
제5도는 바이오티닐팔미토덱스트란과 포획(capture)항체의 컨쥬게이트를 갖는 세포와 IgM의 결합의 적정을 보여주는 그래프이다.
제6도는 포획 항체 아비딘-바이오틴 컨쥬게이트를 갖는 세포에 대한 IgM의 시간에 따른 포획의 FACScan 결과 트레이스의 사진복사이다. 패널(a), (b), (c) 및 (d)는 각각 10분, 30분, 1시간 및 2시간 경의 트레이스이다.
제7도는 포획에 대한 배지내의 메틸셀룰로스 농도의 효과를 보여주는 FACScan 트레이스의 사진복사이다. 제7(a)도 및 제7(b)도는 각기 2.5% 및 1% 메틸셀룰로스 배지에서 인큐베이트된 세포에 의한 항체 포획을 나타낸다.
제8도는 2.5% 메틸셀룰로스 함유 배지에서 분비된 항체의 포획에 기초하여 분리 전과 후 표지화된 세포의 FACScan 도해이다. 세포는 분리 전 제8(a)도에서 보여진다. 제8(b)도는 분리후 네가티브 분획을 보여준다. 제8(c)도는 분리후 포지티브 분획을 보여준다.
제9(a)도는 분비 단계(phase)동안 배양 배지에서 다른 첨가물질의 효과를 보여주는 FACScan 결과 트레이스의 사진복사이다. 제9(a)도, 제9(b)도 및 제9(c)도는 각각 세포를 배양배지, 40% 소혈청 알부민(BSA)이 있는 배양배지, 및 20% BSA + 20% 젤라틴이 있는 배양배지에서 인큐베이트했을 때 세포상의 안티-생성물 항체에 의한 생성물의 포획을 보여준다.
제10도 및 제11도는 포획 항체로 표지화시킨 후(10a, 11a), 분비단계 후(10b, 11b), 그리고 자기(magnetic)분리 후 (여기서, (10c, 11c)는 자기 분획이고, (10d 및 11d)는 비-자기 분획이다), 표지화된 세포의 FACScan 도해이다.
제12도는 FACS 분석을 위한 마우스 비장세포의 제13도 및 제14도에 대한 게이팅(gating)이다. 12a는 포워드 산란(forward scatter; FSC) 대 사이드 산란(side scatter; SSC) 도표이다. 12b는 요오드화프로피듐(PI) 대 형광 2를 나타낸다. 라인에 의해 둘러싸인 영역은 추가의 분석을 위해 게이팅된 세포(아세포, 살아있는)를 나타낸다.
제13도는 FITC 표지화된 세포의 FACS 분석을 편집해 놓은 것이다. 13a는 표지화되지 않은 세포의 스캔(scan)이다. 13b는 바이오티닐화 전 ST-FITC로 인큐베이트한 세포의 스캔이다. 13c는 바이오티닐화 후 ST-FITC로 표지화된 세포의 스캔이다. 13d는 래트 IgG에 특이적인 FITC에 커플링된 항체(GaRIgG-FITC)로 바이오티닐화된 세포를 염색한 후의 세포들의 스캔을 나타내는데, 이 세포들은 아비딘화 포획항체(래트)(포획-ab-아비딘)에는 노출되지 않은 것이다. 13e는 포획-ab 및 염소 안티-래트 IgG-FITC(GaRIgG-FITC)에 노출된 세포의 스캔이다.
제14도는 FACS 분석의 도트(dot) 플롯을 편집해 놓은 것이다. 각 경우에, 가로좌표는 인터페론γ(IFNγ)에 대한 표지 염색의 양을 나타내고 세로좌표는 어떤 정보도 나타내지 않는다. 디곡시게닌(digoxigenin)-컨쥬게이트된 래트 안티-마우스 IFNγ 항체를 검출하는 FITC 표지화된 안티디곡시게닌 항체(R46A2-DIG DIG-FITC)로 세포를 표지화시켰다. 14a는 IFNγ에 특이적인 포획 항체(포획 ab)로 제로 타임 인큐베이션에 얻어진 결과이다. 14b는 포획 ab와 5분 인큐베이트로 얻어진 결과이다. 14c는 포획 ab 없이 90분 인큐베이트로 얻어진 결과이다. 14d는 포획 ab와 40분 인큐베이트로 얻어진 결과이다. 14e는 포획 ab를 갖는 세포를 IFN-γ를 분비하는 세포로부터 얻어진 상징액(IFNγ sup)의 존재하에서 인큐베이트 할때 얻어진 결과이다. 14f는 포획 ab와 90분 배양으로 얻어진 결과이다.
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본발명은 세포 집단(populations)의 분석 및 세포분리의 분야에 속한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세포표면에 고정된(anchored) 생성물에 대해 특이적인 결합 파트너에 의한 이들 생성물의 포획을 통해서 세포를 그것의 분비된 생성물로 일차적 표지화시키는 것에 기초한 분석 및 분리 기술에 관한 것이다.
[배경기술]
세포가 생성하는 생성물에 기초하여 세포 집단을 분석하고 세포를 분리하기 위한 많은 시도가 행하여 졌다. 그러한 세포분석 및 분리방법은 원하는 생성물("생성물")을 분비할 수 있거나, 또는 생성물의 비교적 높은 분비자인, 세포들을 평가하는데 특히 유용하다. 이 방법들은 생성물에 대해서 미세적정 플레이트에서 클로닝하고 배양상징액을 분석하는것, 한천에서 클로닝하고 국소화된 세포 생성물의 확인 방법에 의해 분석하는 것을 포함한다; 확인 방법은 예컨대 플라크 분석 및 웨스턴 블로팅을 포함한다. 생성물 분비에 기초한 세포분석 및 선별을 위한 대부분의 방법은 세포의 물리적 분리후 생성물 분비를 허용하는 조건하에서 배양, 그리고 그 생성물을 생성하는 세포 또는 세포 클론을 검출하기 위하여 세포 위치를 스크리닝한다는 개념을 이용한다. 현탁액중의 세포에서는, 세포가 생성물을 분비한 후, 그것이 분비된 세포의 확인을 가능하게 하도록 마커를 남기지 않고 생성물이 세포로부터 확산된다. 따라서 이 시스템으로는 분비자 세포가 비-분비자 세포로부터 분리될 수 없다.
다른 경우들에서는, 분비자 및 비-분비자 세포가 생성물을 세포막과 회합시킬 수 있다. 이러한 유형의 시스템의 한 실례는 모노클로날 항체를 생성하는 B-세포 유래 세포주이다. 이러한 유형의 세포주는 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 및 항체 세포표면 마커의 존재에 의존하는 다른 방법에 의해 분리된다는 것이 발표되었다. 그러나, 천연적으로 세포표면과 회합되는 마커에 의해 세포를 분석 및 분리하는 방법은 정확하게 식별할 수 없고 및/또는 비-분비자 세포와 분비자 세포의 분리에서 사용될 수 없다. 또한, 이와 같은 시스템은 분비자 세포의 정량적인 차이(즉, 저수준 분비자와 고수준 분비자)를 식별하는데 유용하지 않다.
세포로부터의 생성물 확산과 연관된 문제점을 극복하는데 이용되는 방법은 세포로 부터 확산 속도를 억제하는 배지에 세포를 위치시키는 것이었다. 전형적인 방법은 겔-유사 배지(한천)에서 세포를 고정화한 다음, 블로팅 예를 들면, 웨스턴 블롯에 기초한 시스템을 이용하여 생성물 생성에 대해서 한천 플레이트를 스크리닝하는 것이다. 이 시스템은 다수의 세포를 분비, 비-분비의 성질, 또는 분비량에 대해 분석하려면 성가시고 비싸다.
Kohler 등은 항-트리니트로페닐(항-TNP) 특이성을 갖는 IgM을 분비하는 하이브리도마주(line)의 돌연변이체를, 합텐(hapten)을 세포표면에 커플링시키고 보체의 존재하에 세포를 배양함으로써 증폭시키는 시스템을 기술하였다. 이 방식에서는 야생형 Ig를 분비하는 세포는 사멸되지만, 감소된 용해활성을 갖거나 TNP에 결합하지 않는 IgM을 분비하는 세포는 우세하게 생존하였다. Kohler 및 Schulman, Eur. J. Immunol. 10: 467-476(1980).
다른 알려진 시스템은 생성물에 결합하는 비드를 함유하는 아가로스겔의 미세 비말(飛沫)의 배경하에서 세포가 생성물을 분비하게 하고, 세포의 캡슐화를 가능하게 한다. 그런 방법은 Nir 등, Applied and Environ. Microbiol. 56: 2870-2875(1990); 및 Nir 등, Applied and Environ. Microbiol. 56: 3861-3866(1990)에서 개시되었다. 이러한 방법은 다양한 이유로 만족스럽지 않다.
마이크로캡슐화의 과정에서는, 캡슐내의 세포수의 통계적 트래핑(trapping)이 일어나서, 캡슐화가 낮은 세포농도에서 일어날 때에는 많은 수의 빈 캡슐이 생기고, 또는 캡슐화가 높은 세포 농도에서 일어날때에는 캡슐당 다수의 세포가 생기게 된다. 이 기술에 의해서 단일 세포 또는 단일세포 집단을 분석 및 분리하기 위해서는 빈 캡슐의 수 때문에 그리고 마이크로캡슐의 크기(50-100㎛) 때문에 큰 체적을 비교적 적은 수의 세포를 가지고 다루어야 한다. 비말(droplet)의 큰 체적은 유동세포 계측법 분석 및 분리를 이용할 때 백그라운드 문제를 일으킨다. 또한, 세포분리를 위해 자기 비드 또는 패닝(panning)을 이용할때 캡슐은 분리를 가능하게 하지 않는다.
플루오로크롬과 같은 표지가 직접적인 검출을 의도하는 경우 표지를 세포 표면에 커플링시키는데 각종 방법이 이용되었다. 예컨대, 형광표지를 세포에 커플링시키기 위해 세포막 속에 삽입된 소수성 링커를 이용하는 것이 1990년 3월 8일 공개된 PCT WO 90/02334에서 기술되었다. HLA에 대한 항체가 또한 세포 표면에 표지를 결합시키는데 이용되어 왔다 그러한 결합은 상술한 캡슐화된 비말 보다 더 작은 크기를 초래하며 그러한 세포는 편리하게 유동세포 계측법 및 자기 분리를 포함하는 표준 분리방법에서 사용할 수 있다.
이제는 적당한 커플링 기작을 이용하여, 세포표면에 특이적인 결합 파트너를 고정시킴으로써 세포 생성물을 포획할 수 있고 생성물의 존재, 부재 또는 양에 기초하여 세포를 선별할 수 있다는 것이 발견되었다.
[발명의 개시]
본 발명은 세포에 의해 분비되는 생성물에 기초한 편리한 분석 및 세포분리 방법을 제공한다. 세포는 직접적으로 표지로서 사용될 수 있는 생성물에 대한 포획부(capture moiety)가 구비되어 있다. 생성물과 포획부의 결합은 "포획된 생성물”로 된다. 또 다르게는 세포가 포획부를 통해서 생성물에 결합되고 더욱이 특이적으로 생성물에 결합하고 그리고 형광단, 방사성 동위원소, 발색단 또는 자기 입자등의 전통적인 표지화 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지화되는 표지부(label moiety)를 통해서 표지화될 수 있다.
그리고나서 표지화된 세포는 이 표지에 기초한 표준 세포 분류 기술을 이용하여 분리하거나 검출할 수 있다. 그러한 기술에는 유동세포 계측법, 자기 분리, 고 경사도(gradient) 자기 분리, 원심분리 등이 포함된다.
따라서, 본발명의 한면은 세포에 의해 분비 및 방출되는 생성물에 따라 세포를 분리하는 방법을 포함하는데, 이 방법은 세포가 상기 생성물로 표지화되는 정도에 따라 세포분리를 행하는 단계, 여기서 생성물로의 표지화는 세포표면을 적어도 한 포획부에 커플링시킴으로써 이루어진다; 생성물이 분비, 방출되고 특이적으로 상기 포획부에 결합되는("포획되는" 또는 "트래핑되는") 조건하에서 세포를 배양하는 단계; 및 포획된 생성물을 표지부로 표지화시키는 단계(여기서 표지화된 세포는 분리과정의 일부로서 용해되지 않는다)로 이루어진다.
본발명의 다른 면은 세포에 의해 분비 및 방출되는 생성물을 포획할 수 있는 세포를 포함하는 물질의 조성물인데, 여기서 세포 표면은 포획부에 커플링된다. 본발명의 또다른 면은 상술한 방법에 의해 분리된 세포 및 그것의 자손(progeny)이다.
본발명의 또다른 면은 세포에 의해 분비 및 방출되는 생성물로 세포를 표지화하는 방법인데, 이 방법은 세포 표면은 포획부에 커플링시키는 단계, 및 생성물이 분비 및 방출되는 조건하에서 세포를 배양하는 단계로 이루어진다. 포획된 생성물은 별도로 표지부에 의해 표지화될 수 있다.
본발명의 부가적인 면은 세포집단에서 다른 세포에 비하여 다양해 양의 생성물을 분비하는 세포의 비율을 결정하기 위해 세포집단을 분석하는 방법인데, 이 방법은 상술한 방법에 의해 세포를 표지화하는 단계, 추가로 포획된 생성물을 표지화하지 않는 제2표지로 세포를 표지화하는 단계, 및 제2세포 표지에 비하여 생성물 표지의 양을 검출하는 단계로 이루어진다.
본발명의 다른 부가적인 면은 세포집단에서 분비활성의 분포를 결정하는 방법인데, 이 방법은 상술한 방법(즉, 상기 세포표면을 포획부에 커플링시키고, 생성물이 분비ㆍ방출되는 조건하에서 세포를 배양하고, 세포를 표지부에 노출시킴)에 의해 세포를 표지화하는 단계 및 세포에 결합된 표지부의 양에 의하여 세포당 생성물의 양을 결정하는 단계로 이루어진다.
본발명의 또다른 부가적인 면은 세포집단에서 분비 생성물 및 각 분비 생성물의 분비활성의 분포를 결정하는 방법인데, 이 방법은 집단내의 세포표면을 검출되어야 하는 각 분비 생성물에 대한 포획부로 커플링시켜서 상술한 방법에 의해 세포를 표지화하는 단계; 생성물이 분비ㆍ방출되는 조건하에서 세포를 배양하는 단계, 분비된 포획 생성물을 표지화하는 단계, 여기서 각 분비된 포획 생성물의 표지부는 식별가능하다; 및 세포당 생성물의 양 및 타입을 결정하는 단계로 이루어진다.
본발명의 또다른 면은 원하는 생성물을 분비하는 세포의 검출에 사용하기 위한 키트이다. 이 키트는 겔 같은 점도까지 점도의 정도가 변할 수 있는 생리적으로 허용가능한 배지, 상기 배지는 분비된 생성물의 제조를 위해 세포 배양에 사용된다; 적어도 하나의 고정부(anchor moiety) 및 적어도 하나의 포획부로 이루어진 생성물 포획 시스템; 적어도 하나의 표지부; 및 시약사용에 대한 지침을 포함할 수 있으며, 모두 적당한 용기내에 포장된다.
본발명의 다른 면은 원하는 생성물을 분비하는 세포의 검출 및/또는 분리에 사용하기 위한 키트이다. 이 키트는 세포 및 생성물 둘다에 대한 특이성을 갖는 이관능성 항체인 적어도 하나의 포획부와 적어도 하나의 표지부를 포함한다. 이 시약은 바람직하게는 동시의 포획 및 표지화를 위해서 단일 바이알(vial)내에 위치할 수 있다. 또한 시약사용에 관한 지침이 포함되어야 한다. 또한 점도 또는 겔 형성 능력이 변화하는 생리적으로 허용가능한 배지가 제공될 수도 있다. 그러나 액상은 샘플자체에 의해 제공될 수도 있는데, 이 샘플은 세포 배양배지, 혈액 및 오줌을 포함하지만 이것에 제한되지는 않는다.
[발명을 수행하는 방식]
본발명은 세포로부터 분비된 생성물의 포획 기작을 이용한다. 이 방법은 진핵성 및 원핵성 세포 또는 세포 집합체에 의해 분비된 생성물이 세포표면에서 포획되게 한다.
포획된 생성물은 존재하는 생성물의 존재, 부재 또는 양에 따라서 세포를 검출, 분석, 원한다면 분류할 수 있게 한다. 포획수단은 선별되어야 할 세포에 적합한 수단에 의하여 세포표면에 고정되는 포획부를 함유한다. 여기서 사용되는 용어 "세포" 또는 "세포들"은 세포 집합체를 포함하고; 세포 집합체는 지정된 분비 생성물을 생성하는 세포군이고, 당업계에서 공지되었고, 예컨대 랑게르한스섬을 포함한다. 여기서 사용되는 확인될 수 있는 생성물은 세포에 의해 분비되는 모든 생성물을 포함한다. 그러한 생성물은 시토카인으로서 IFNγ, IL1, IL2, IL4, IL10, IL12, TGFβ, GMCSF 및 SCF, 항체, 호르몬, 효소 및 단백질을 포함하지만, 이것들에 제한되지는 않는다.
포획부는 선택적으로 연결부(linking moiety)를 통해서 고정 수단("고정부")에 커플링될 수 있고, 또한 연결부를 포함할 수 있는데 이것은 이용할 수 있는 포획부의 수를 증가시키고 따라서 예를 들면, 변형된 덱스트란 분자, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈을 포함하여 분지된 폴리머 같은 생성물의 포획 가능성을 증가시킨다.
포유동물 또는 다른 동물세포 또는 세포 프로토플라스트 같은 세포벽 없는 세포에서, 세포표면에 대한 적당한 고정부는 지방산 같은 지방친화성 분자를 포함한다. 적당한 세포표면 분자의 실례는 세포표면과 연관된 분자를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다. 적합한 분자는 세포표면 마커로서 CD45(전(pan) 백혈구), 안티-β2 마이크로글로불린, CD3(T세포(활성화)), CD4, CD8 및 다른 CD 마커 또는 세포 접착분자를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다. 한편, MHC 항원 또는 당단백질 같은 세포 표면분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 기타 작용제를 사용할 수도 있다. 식물세포, 곰팡이, 효모 또는 세균 같이 세포벽을 갖는 세포에서 적당한 고정부는 예를들면, 항체 또는 렉틴을 포함하여 세포벽 성분에 결합하는 작용제를 포함한다.
특이적인 결합 파트너는 포획부 및 표지부를 포함한다. 포획부는 직접적으로 또는 간접적으로 세포 및 생성물에 부착하는 것들이다. 표지부는 생성물에 부착하는 것이며 직접적으로 또는 간접적으로 표지화될 수 있다. 특이적인 결합 파트너는 생성물과 그것의 결합 파트너 사이에 비교적 높은 친화성과 특이성이 있으며 생성물:파트너 복합체의 분리는 비교적 느려서 표지화 또는 세포 분리기술 공정 동안 생성물:파트너 복합체가 검출되도록 하는 어떤 부를 포함한다.
특이적인 결합 파트너는 생성물이 결합할 기질 또는 기질 유사체를 포함할 수 있지만 이것들에 제한되지는 않는다. 이 기질은 펩티드, 다당류, 스테로이드, 바이오틴, 디기톡신, 디기토닌, 분비 생성물에 결합할 수 있는 다른 분자들을 포함하지만 이것들에 제한되지는 않으며, 바람직한 구체예에서는 항체를 포함할 것이다. 포획부가 항체이면 그것은 "포획항체" 또는 "캐치항체"로서 언급될 것이다. 여기서 사용되는 용어 "항체"는 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 키메라 항체, 합텐 및 항체 단편, 이중-특이적인(bispecific) 항체 및 생성물 항원의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 등가물인 분자들을 포함하도록 의도된다.
또한 이중-관능성 항체로서 알려진 이중-특이적 항체는 제1항원에 대한 적어도 하나의 항원 인식부위 그리고 제2항원에 대한 적어도 하나의 항원 인식부위를 갖는다. 그러한 항체는 재조합 DNA 방법에 의하여 또는 당업계에서 공지된 방법에 의하여 화학적으로 제조할 수 있다. 화학적으로 합성된 이중-특이적인 항체는 2가(bivalent)의 특성을 유지하도록 환원되고 재형성된 항체 및 각 항원에 대한 적어도 두개의 항원 인식부위를 갖도록 화학적으로 커플링된 항체를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다. 이중-특이적인 항체는 두개의 다른 항원을 인식할 수 있는 모든 항체 또는 항체의 컨쥬게이트, 또는 항체의 폴리머 형태를 포함한다. 항체는 폴리머 또는 입자상에 고정화될 수 있다.
본발명의 실행에서, 포획부는 각종 방법에 의해 세포막(또는 세포벽)에 부착될 수 있다. 적합한 방법은 단백질 성분의 아미노기에의 직접적인 화학적 커플링; 단백질 성분의 티올(디술피드 브리지의 환원후 형성됨)에의 커플링; 항체(항체의 쌍을 포함) 또는 렉틴을 통한 간접적인 커플링; 소수성 고정부에 의한 지질 이중층에의 고정; 및 폴리 양이온에 의한 음전하를 띤 세포표면에의 결합을 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다.
본발명의 다른 구체예에는, 포획부가 둘 이상의 단계를 이용하여 도입되는데, 예를들면, 직접적으로 예컨대 바이오틴/아비딘 복합체에 의해 또는 간접적으로 적당한 연결부 또는 연결부들을 통해서 포획부와 고정부의 커플링을 허용하는 적어도 하나의 고정부로 세포를 표지화함으로써 도입된다.
세포표면과 항체의 직접적인 화학적 커플링 방법은 당업계에서 공지되었고, 예를들면, 글루타르알데히드 또는 말레이미드 활성화된 항체를 이용한 커플링을 포함한다. 다단계 과정을 이용한 화학적 커플링 방법은 예를들면, 바이오티닐화, TNP 또는 디곡시게닌의 예컨대 이 화합물의 숙신이미드 에스테르를 이용한 커플링을 포함한다. 바이오티닐화는 예컨대 D-바이오티닐-N-히드록시숙신이미드의 사용에 의하여 수행될 수 있다. 숙신이미드 기는 7 이상의 pH 값에서 아미노기와 효과적으로 반응하고, 약 pH 8.0과 약 pH 8.5 사이에서 우세하게 반응한다. 바이오티닐화는 또한 예컨대 세포를 디티오트레이톨(DTT)로 처리한 후 바이오틴 말레이미드를 첨가함으로써 수행될 수 있다.
세포에의 커플링은 또한 세포 표면항원("마커")에 대한 항체를 이용하여 수행할 수 있다. 표면항원에 대해서 일반적으로 만들어진 항체는 107세포당 항체 약 0.1 내지 1㎍의 범위 만큼 요구될 수 있지만, 이러한 요구량은 생성물과 항체의 친화성에 대한 반응으로 크게 변할 것이며 실험적으로 결정될 필요가 있을 것이다. 그러한 결정은 당업자의 기술내에서 용이하다. 따라서 항체의 적당량이 실험적으로 결정되어야 하며 이것은 당업자의 기술범위에 속한다. 이것은 세포 타입 특정 마커 발현에 대한 특정 세포에의 커플링을 허용한다. 예컨대 T 세포 또는 그것의 소집합(subset)등에 기초한 여러 부류의 세포는 특이적으로 표지화될 수 있다. 세포에 대한 항원 인식부위 또는 그위에 위치한 고정부, 및 생성물을 갖는 이중-특이적인 항체를 포획부로서 이용할 수 있다.
포획부, 특히 포획항체는 분비 생성물의 양에 기초하여 선별되어야 한다. 예컨대, 단지 몇몇 분자를 분비하는 세포에서는 대부분의 분비분자를 포획하기 위해서 고친화성 항체가 선택되어져야 한다. 또 다르게는, 배양시간 동안 세포가 많은 분자를 분비하는 경우에는, 캐치매트릭스의 너무 빠른 포화를 방지하기 위해서 보다 더 낮은 친화성의 항체가 바람직할 수 있다. 분비 단백질 수준에 대해 적당한 친화성의 결정은 실험적으로 결정되고 이것은 당업자의 기술범위내이다.
당 지방질의 성분으로서 표면에 다량의 N-아세틸뉴라민산을 갖는 세포는 생리적 pH 값에서 음전하를 띤다. 포획부의 커플링은 전하 상호작용을 통해 일어날 수 있다. 예를들면, 폴리 양이온(polycation)을 갖는 포획부는 음전하를 띤 세포에 결합한다. 폴리 양이온은 당업계에서 공지되었고 예를들면, 폴리리신 및 키토산을 포함한다. 키토산은 함께 β(1-4) 글루코시드 결합에 의해 연결된 D-글루코사민기로 구성되는 폴리머이다.
포획부를 세포에 커플링시키는 다른 방법은 세포표면 다당류에의 커플링을 통한 것이다. 다당류에 결합하는 물질은 당업계에서 공지되었고 예를들면, 콘카나발린 A를 포함하는 렉틴, 솔라눔 투베로숨, 알레우리아 아우란티아, 다투라 스트라모늄, 갈란투스 니발리스, 헬릭스 포마티아, 렌스 쿨리나리스 및 예를들면, Sigma Chemical Company와 Aldrich Chemical Company를 포함하는 다수의 회사에 의해 공급되는 다른 공지된 렉틴을 포함한다.
본발명의 일부 구체예에서는, 세포막의 소수성 고정부에 의해 포획부가 세포에 커플링된다. 막의 지질 이중층과 상호작용하는 적당한 소수성 고정부는 당업계에서 공지되었고, 지방산 및 비-이온성 세정제(예컨대, Tween-80을 포함)를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다. 고정부 삽입을 통한 세포와 포획부의 부착의 결점을 세포속에 고정부가 통합되는 비율이 낮다는 것이다. 따라서, 흔히 높은 농도의 고정부가 필요하다. 이러한 후자의 상황은 흔히 포획부가 비교적 제한되는 또는 비싼 물질 예를들면, 항체일때 비경제적이다.
막속에 포매(embed)되는 소수성 고정부의 낮은 수율은 이 물질이 비교적 제한된 양으로 이용가능할때에만 적당하다. 이러한 문제는 고정부와 포획부를 포함하는 브리지 시스템을 이용함으로써 극복될 수 있는데, 여기서 물질중 하나는 더 높은 이용가능성을 갖고 브리지 시스템의 두 부분은 서로에 대해 높은 정도의 특이성과 친화성을 갖는다. 예컨대, 한 구체예에서는, 아비딘 또는 스트렙트아비딘이 소수성 고정부를 통해 세포표면에 부착되지만, 포획부는 바이오티닐화된 안티-생성물 항체이다. 다른 구체예에서는, 세포표면을 디곡시게닌으로 표지화시킨 다음 디곡시게닌과 생성물에 대한 특이성을 갖는 이중-특이적인 항체로 표지화시킨다. 예를들면, 합텐과 안티합텐 항체, NTA와 폴리히스티딘 잔기, 또는 렉틴과 다당류를 포함하여 링크를 형성할 수 있는 다른 분자쌍을 가지고 이 방법을 이용할 수 있다. 바람직한 구체예는 고정부당 포획부의 수를 증가시킴으로써 시스템의 "증폭”을 가능하게 하는 것이다.
한 예시적인 구체예에서는, 분지된 덱스트란이 팔미트산에 결합되어 다양한 이용가능 결합부위를 제공하게 된다. 뒤이어, 덱스트란은 바이오틴에 커플링되고 생성물에 특이적인 아비딘-컨쥬게이트 항체로 처리된다.
고정부가 어떤 방식으로 세포표면에 커플링될때 고정부와 포획부 사이에서 링커부가 사용될 수 있는 것도 물론 본발명의 구체예내에 포함된다. 따라서 예를들면, 아비딘(또는 스트렙트아비딘) 바이오틴 링커부는 항체 고정부를 포획부와 연결할 수 있다. 이중-특이적인 항체 시스템도 또한 링커부로서 작용할 수 있다.
관심 있는 생성물을 분비할 수 있는 세포를 분석 그리고 원한다면 선별하기 위해서, 포획부를 포함하도록 상기와 같이 변형된 세포를 포획된 생성물을 포함하는 세포에 결합 그리고 그러한 세포의 검출을 가능하게 하는데 충분한 양으로 생성물의 생성 및 분비를 허용하는 조건하에서 배양한다. 이러한 조건은 당업자들에게 공지되었고 특히 적합한 온도, pH, 배양배지에서 염, 성장인자 및 기질의 농도, 뿐만아니라 기상에서 가스의 적합한 농도를 포함한다. 높은 그리고 낮은 생산자 세포를 구별하는 것이 바람직할때, 배양시간은 세포에 의한 생성물 분비가 여전히 직선 양상을 나타내는 그러한 시간이다. 적합한 조건은 실험적으로 결정될 수 있고 그러한 결정은 당업자의 기술범위내이다. 부가적으로, 세포에 의한 분비는 생물학적 변형제(modifier)를 이용하여 변형시킬 수 있어서, 상향조절, 유도 또는 감소시킬 수 있다. 적당한 생물학적 변형제는 분자 및 다른 세포를 포함하지만 그것에 제한되지는 않는다. 적당한 분자는 약제, 시토카인, 소분자, 호르몬, 인터류킨의 조합, 렉틴 및 다른 촉진제, 예를들면, PMA, LPS, 이중-특이적인 항체 그리고 세포기능 또는 단백질 발현을 변형시키는 다른 작용제를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다.
다른 세포는 종양 세포와 T 세포 사이 같이 직접적인 세포 대 세포 상호작용 그리고 생물학적 변형제를 분비하는 다른 세포의 근접에 의해 유도되는것 같은 간접적인 세포-세포 상호작용을 포함하지만, 이것들에 제한되지는 않는다. 적합한 세포는 혈구, 말초 골수세포(PBMC) 및 각종 세포주를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다. 생물학적 변형제는 어느 시간에도 첨가될 수 있지만 바람직하게는 배양배지에 첨가된다. 또 다르게는 배양단계 이전에 세포를 이러한 작용제나 세포로 미리 처리할 수 있다.
배양(incubation)조건은 또한 생산자 세포에 의해 분비된 생성물이 본질적으로 다른 세포에 의해 포획되지 않아서 생성물 생산 세포와 비-생산세포, 또는 낮은 생산자와 높은 생산자의 구별이 가능한 그러한 조건이다. 일반적으로 배양시간은 5분과 10시간 사이이고, 더 흔하게는 1시간과 5시간 사이이다. 배양배지는 선택적으로 생산자 세포로부터 분비 생성물의 확산을 느리게 하는 물질을 포함할 수 있다. 액체배지에서 생성물 확산을 억제하고 그리고 세포에 비독성인 물질은 당업계에서 공지되었고, 예컨대 알긴산, 저융점 아가로스 및 젤라틴을 포함하여 부분적으로 또는 완전히 겔이되는 각종 물질들을 포함한다. 배지의 점도 또는 투과성을 변화시킴으로써 어떤 크기의 분비 생성물의 생산 세포에 의한 국소적인 포획을 조절할 수 있다. 배지의 분자량 크기 배제를 사용하여 반응을 최적화할 수 있다. 배지의 최적 조성은 실험적으로 결정될 수 있고 이것은 세포농도, 분비수준, 생성물의 분자량, 포획 항체의 생성물에 대한 친화성에 의해 영향을 받는다. 그러한 결정은 당업자의 기술에 속한다.
바람직하게는, 세포 분류 기술에 의해 배지에서 세포나 세포군의 분리를 가능하게 하기 위해서 배양 후 겔을 가용화시킨다. 따라서, 예를들면, 겔은 β-메르캅토에탄올 또는 DTT 같은 슐피딜 환원제에 의해 분리될 수 있는 디술피드 결합에 의해 링크될 수 있거나 또는 겔이 예를들면, 칼슘이온을 포함하여, EDTA 같은 킬레이트화제의 첨가에 의해 가용화되는 이온성 교차-결합제를 함유할 수 있다.
바람직한 구체예에서는, 분비공정 동안, 세포를 젤라틴 배지에서 배양하며 겔속으로의 침투의 크기 제한은 우세하게 생성물이 겔속에 실질적으로 들어가지 못하게 한다.
비특이적 세포 교차-오염을 방지하기 위해 점성 또는 젤라틴성 배지를 사용하는 다른 방법 또는 추가의 방법은 분비 세포상의 세포표면 포획 시스템에 의해 포획되지 않는 생성물을 포획하기 위한 포획시스템을 제공하는 것이다. 예컨대, 이 기술은 많은 세포유형이 생성물을 생성하거나 또는 죽은 세포가 비특이적으로 원하지 않는 생성물을 다량 방출하거나 또는 세포 사이에 충분한 확산 장벽이 생성될 수 없는 경우에 이용할 수 있다. 이것은 상징액에서 항체 생성물에 컨쥬게이트된 세포 비드(가령 라텍스 비드)를 둘러싸는 배지에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 또 다르게는, 배지로부터 결합되지 않은 생성물을 제거할 수 있는 고정화된 항체 또는 다른 물질을 갖는 겔이 이용될 수 있다. 이러한 트래핑부는 비-잔류 생성물에 결합함으로써 비분비 세포에 그것이 결합하지 못하게 하거나 또는 이러한 원하지 않는 생성물을 잔류시킬 수 있다. 이러한 "정크(junk) 포획 시스템"은 겔 매트릭스 속에 고정화될 수 있거나 자기 또는 기타 유형의 입자에 부착될 수 있다. 정크 포획 시스템의 위치와 포획 특성은 충분한 생성물 분자가 특이적으로 분비세포에 결합하여 비-생산 세포상의 백그라운드를 최소화하도록 조정해야 한다.
분비단계의 끝무렵에 세포는 대개 냉각되어 더이상의 분비가 방지되고, 겔 매트릭스가 가용화된다. 이 순서는 물론 역전될 수 있다. 그후 포획 생성물을 포함하는 세포를 표지부로 표지화시킨다. 표지화는 당업자들에게 알려진 어떤 방법에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 안티-생성물 항체를 이용하여 생성물을 포함하는 세포를 직접적으로 또는 간접적으로 표지화시킬 수 있다. 사용되는 표지는 표지부의 생성물에의 부착에 기초하여 세포가 분석되거나 선별되는 시스템에서 사용하기에 적합한 것들이다.
다른 구체예에서는, 포획 생성물을 포함하지 않는 포획부를 검출할 수 있다. 이것은 예를들면, 네가티브 분리방법, 즉 생성물로 크게 포화되지 않는 세포의 검출을 이용함으로써 다량의 생성물을 분비하는 세포의 분리를 가능하게 한다. 세포표면 마커, 세포유형, DNA 함량 같은 세포변수, 세포상태 또는 포획부의 수 등을 인식하는 다른 물질로 세포를 표지화시킬 수 있는데, 상기의 것들을 포함하지만 그것들에 제한되지는 않는다.
실제 포획부의 계수는 가령 세포의 다른 컨쥬게이션 가능성 때문에 변하는 이 분자들의 양을 보충하는데 중요할 수 있다. 그것은 특히 고정부 및 포획부를 포함하여 생성물 포획 시스템에 결합할 감소 또는 증가된 가능성으로 세포를 배제하기 위해 드문세포의 분리에 중요할 수 있다.
표지의 존재에 기초한 세포집단 및 세포선별의 분석은 당업계에서 공지된 다수의 기술에 의해 수행될 수 있다. 가령 유동세포 계측법 또는 FACS에 의해 세포를 분석 또는 분류할 수 있다. 이 기술은 세포의 하나 이상의 변수에 따라 분석과 분류를 가능하게 한다. 대개 하나 또는 다수의 분비 파리미터를 세포유형, 세포표면 항원, DNA 함량등(이것들을 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다) 다른 세포의 측정가능 변수와 조합하여 동시에 분석할 수 있다. 이 데이타는 분석할 수 있고 어떤 식 또는 측정된 변수의 조합을 이용하여 세포를 선별할 수 있다. 세포 선별 및 세포분석 방법은 당업계에서 공지되었고, 가령 THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1 내지 4, (D.N. Weir, 편집자) 및 FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING(A. Radbruch, 편집자, Springer Verlag, 1992)에서 기술되었다. 또한 가령 레이저 스캐닝 현미경, 형광 현미경을 포함하는 현미경 기술을 이용하여 세포를 분석할 수 있다; 이 같은 기술은 영상분석 시스템과 조합하여 이용할 수도 있다. 세포 선별을 위한 다른 방법은 가령 친화성 기술을 이용한 패닝 및 분리를 포함하는데 여기에 플레이트, 비드 및 컬럼 같은 고체 지지체를 이용한 기술이 포함된다.
세포 분류를 위한 일부 방법은 자기 분리(magnetic separation)를 이용하며, 이 방법중 일부는 자기 비드(magnetic bead)를 이용한다. 가령 Dynal(노르웨이), Advanced Magnetics(미국 매사추세츠 캠브리지), Immuncon(미국 필라델피아), Immunotec(프랑스 마르세유), 및 Miltenyi Biotec GmbH(독일)을 포함하여 다수의 공급원으로 붙어 다른 자기 비드를 구할 수 있다.
바람직한 자기 표지화 방법은 5 내지 200㎚의 크기범위, 바람직하게는 10 내지 100㎚의 크기의 콜리이드 초상자성 입자를 포함한다. 이 자기 입자는 세포의 정량적인 자기 표지화를 가능하게하여 커플링된 자기 표지의 양이 결합된 생성물의 양에 비례하고, 자기 분리 방법은 생성물 분비의 상이한 양에 민감하다. 각종 특이성을 갖는 콜로이드 입자는 당업계에게 공지되었고, 가령 Miltenyi Biotec GmbH를 통해서 구할 수 있다. 또한 포획된 생성물의 정량적 표지화에는 면역특이적 형광 또는 자기 리포솜을 이용할 수 있다. 이 경우 리포솜은 그것의 표면의 항체와 컨쥬게이트된 형광염료 및/또는 자기 물질을 포함하며, 비생산, 저생산 및 고생산 세포 사이의 최적 분리를 가능하게 하기 위해 자기 분리를 이용한다.
자기 분리는 자기 흡인력에 제2의 힘을 조합하고, 이와 같은 두 반대된 힘의 다른 강도에 기초하여 분리를 일으킴으로써 고효율로 수행할 수 있다. 전형적인 반대된 힘은 예를들면, 자기 분리 챔버내의 분리 배지에서 혼합된 자기액에 의해 유도되는 힘, 중력, 세포에 대한 배지의 유속에 의해 유도되는 점착력이다. 어떤 자기 분리방법, 바람직하게는 정량적 분리를 가능하게 하는 자기 분리 방법이 사용될 수 있다. 또한 다른 분리방법이 조합될 수 있다. 가령 분리 질을 높이기 위해서 또는 다수의 변수에 의한 선별을 가능하게 하기 위해서 자기세포 분류를 FACS와 조합할 수 있다.
바람직한 기술은 고 경사도 자기분리(HGMS)를 포함하는데, 이 방법은 자기장에 배치된 챔버 또는 컬럼에서 자기물질을 선택적으로 잔류시키는 방법이다. 이 기술의 한 이용에서는 생성물을 자기입자에 부착시켜서 표지화한다. 부착은 일반적으로 표지부와 생성물의 회합(association)을 통해서 일어나는데, 이 표지부는 컨쥬게이션을 위한 작용기를 제공하는 자기 입자상의 코팅에 컨쥬게이트된다. 세포와 회합되고 자기 표지에 회합되는 생성물은 액체 속에 현탁되고 그 다음엔 챔버에 적용된다. 챔버를 지나서 공급되는 자기 경사도의 존재하에서, 자기적으로 표지화된 세포가 챔버내에 잔류된다; 챔버가 매트릭스를 포함하면 그것은 매트릭스와 회합된다. 자기 표지를 갖지 않거나 단지 소량의 자기 표지만을 갖는 세포는 챔버를 지나 통과한다.
그후 잔류된 세포는 자기장의 세기를 변화시켜서, 또는 자기장을 제거하여 또는 자기액을 도입하여 용출시킬 수 있다. 포획된 생성물에 대한 선택성은 자기입자에 직접적으로 혹은 간접적으로 컨쥬게이트된 표지부에 의해 공급되거나 또는 일차 항체를 인식하는 자기 입자와 일차 항체를 이용함으로써 공급된다. 자기장이 적용되는 챔버는 종종 매트릭스의 표면에 가깝게 챔버에서 국소적으로 높은 자기장 경사도를 유도하기 위해서 적당한 자기 민감성 물질의 매트릭스를 구비한다. 이것은 꽤 약하게 자화된 입자의 잔류를 허용한다. 다양한 HGMS 시스템을 기술하는 문헌이 당업계에서 공지되었고, 여기에는 예를들면, 미국특허 4,452,773, 미국특허 4,230,685, PCT 출원 WO 85/04330, 미국특허 4,770,183 및 PCT/EP89/01602가 포함된다. 시스템은 또한 미국출원 07/291,177 및 미국출원 07/291.176에서 기술되었고, 모두 여기서 참고문헌으로 통합되었다.
상기에서와 같이, 본발명에 의해 구체화된 방법은 하기의 단계를 포함한다.
a. 생성물을 분비하는 것으로 추정되는 세포의 표면에 고정부를 커플링시키는 단계; b. 분비된 생성물을 포획하는 포획부를 고정부에 커플링시키는 단계; c. 생성물이 포획부에 결합하는 조건하에서 생성물의 합성 및 분비를 가능하게하도록 세포를 커플링된 포획부와 배양하는 단계; d. 포획된 생성물을 표지부로 표지화하는 단계.
또한, 다른 구체예에서 이 방법은 포획된 생성물을 포함하는 세포를 표지화시키는 것을 포함한다. 다른 구체예는 또한 표지화된 세포를 검출하기 위해서 세포집단을 분석하고, 원한다면 표지화된 세포를 분류하는 것을 포함할 수 있다.
본발명의 방법은 다양한 세포유형을 분석 및/또는 분리하는데 이용할 수 있다. 예컨대, 고 수준의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 검출 및 선별하는데 이용될 수 있다.
이러한 유형의 하이브리도마 세포의 선별을 위한 예시적인 방법은 하기와 같다. 화학적 커플링에 의해 또는 지방친화성 고정부를 통한 세포에의 디곡시게닌의 커플링에 의해 디곡시게닌 고정부를 함유하도록 세포를 변형시킨다. 안티-디곡시게닌 항체 또는 항체 단편에 컨쥬게이트된 래트 안티-카파 또는 래트 안티-람다 모노클로날 항체를 통해서 포획부를 세포에 연결시킨다. 연결된 포획부를 갖는 세포를 모노클로날 항체의 분비를 가능하게 하기위해 배양시킨다. 분비 생성물 항체를 포획하는 세포를 래트 안티-마우스 IgG1 또는 IgG2a + b 모노클로날 항체와의 배양에 의해 표지부로 표지화시킨다. 생성물의 표면결합 형태를 인식하지 않는 안티-클래스 항체는 발현산물이 천연적으로 세포 표면과 회합될때 유용하다.
고 분비자 세포의 선별은 다수의 라운드로 수행된다. 각 분리공정은 세포 분리공정, 즉 다른 수준의 결합된 생성물을 구별하는 정량적 자기 분리 시스템, 또는 FACS의 이용을 포함한다. 가장 많은 표지화된 세포(결국 추가의 변수를 이용하여 세포 대 세포 기초하에 정상화시킴)를 분류하고 다시 배양하여 확대시킨다. 자기 분리와 FACS 분리는 조합될 수 있다.
FACS 분류는 바람직하게는 세포가 원래 표지화된 것이 아닌 다른 형광색소를 이용하여 일정량의 포획부에 대해 세포를 부가적으로 표지화시키고, 그후 높은 비율의 항체 양에 대한 생성물 양으로 세포를 선별함으로써 수행한다. 107내지 1010세포의 큰 세포 수를 이용한 여러 라운드의 분리는 매우 높은 수준의 생성 및 유전적 안정성을 보이는 희귀한 유전적 변이체의 분리를 가능하게 한다. 이상한 형태의 생성물을 생산하는 세포의 선별을 피하기 위해서, 다른 라운드의 분리 동안 다른 표지부가 이용될 수 있다.
유사한 방법을 이용하여, 일정한 특이성을 갖는 하이브리도마를 검출 및 선별할 수 있다. 큰 세포수에 대한 선별방법을 이용함으로써 더 큰 친화성 또는 특이성을 갖는 희귀한 유전적 변이체를 얻을 수 있다. 클래스 스위치 변이체는 다른 안티-클래스 항체를 이용하여 분리할 수 있다. 일반적으로, 이 방법은 원하는 특이성을 갖는 항체의 거의 모든 종류의 변이체의 분리에서 사용될 수 있다.
특정 융합 단백질, 시토카인, 성장 호르몬, 바이러스 단백질, 세균성 단백질등을 포함하는 특정 단백질을 생산하는 세포의 분리, 특정물질을 암호화하는 유전자의 식별과 분리도 또한 본발명의 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예컨대, 특정 단백질을 생산하는 세포를 선별하는 것이 바람직하면, 분리 형태의 관심있는 단백질을 암호화하는 발현 벡터의 도입에 의해 세포를 유전적으로 변형시킬 수 있다. 생성물에 특이적인 포획부 및 고정부를 포함하는 생성물 포획 시스템의 도입에 의해 세포를 변형시키고, 생성물 분비를 허용하는 조건하에서 세포를 생장시킨다. 포획 생성물을 포함하는 세포를 표지화시키고, 표지의 존재에 기초하여 하나 이상의 라운드의 분리를 행한다.
분비 생성물을 생성하는 인공적으로 도입된 유전자를 발현하는 세포의 분리는 환자세포를 신체로부터 제거하고 어떤 생성물(가령 시토카인)의 분비를 일으키는 유전자로 형질전환시키는 유전자 치료법에 특히 유용하다. 그 다음 환자에게 돌려보내기전에 형질전환된 세포를 비-형질전환 세포로부터 분리한다. 현재 사용되는 방법은 번거롭고 시간이 걸린다. 세포를 관심있는 단백질을 발현하는 유전자로 형질전환시키고 마커 단백질을 발현하는 유전자로 형질전환시킨다. 현재의 기술은 마커 단백질로서 β-갈락토시다제를 이용하여, 세포를 X-gal의 존재하에 배양하고 청색으로 변하는 세포를 골라내서 환자에게 돌려보내야 한다. 이것은 힘들고 종종 심하게 질환에 걸린 환자의 치료전에 심각한 시간의 지연을 야기한다. 여기서 기술된 방법으로는 형질전환된 세포를 형질전환 후 곧 분리할 수 있고 환자에게 즉시 돌려보낼 수 있다. 이 분리는 또한 마커 단백질 보다 관심있는 단백질의 분비에 기초하여, 세포가 형질전환되고 관심있는 단백질을 발현하는지를 확인할 수 있게 한다.
본발명의 방법은 또한 예컨대 백혈구, 골수세포, 정지된 종양세포, 또는 조직세포를 포함하는 혼합물 따위의 복합 세포 혼합물에서 정성적 및 정량적 분비 패턴을 동시에 분석하는데 이용될 수 있다. 이 경우 혼합물 내의 세포를 세포 특이적인 마커로 표지화하고, 또한 검출할 생성물에 대한 포획부로 표지화한다. 또한 특이적인 세포 마커에 대한 적어도 하나의 항원 인식부위 및 검출할 생성물에 대한 적어도 하나의 항원 인식부위를 포함하는 이중-특이적인 항체로 세포를 표지화할 수 있다.
분비단계 이후, 유동세포 계측법 및/또는 영상분석에서 사용되는 다변수 분석에 세포를 적용시키고,이 결과를 당업계에서 공지된 다-차원적 통계 방법으로 분석하고, 유동세포 계측법 및 영상분석 데이타의 분석에 사용한다. 분석이 생물학적 변형제와 특이적으로 반응하는 세포를 결정하는 것이면, 분석할 세포를 유동세포 계측법에 의한 분석 또는 영상분석 이전에 배양단계 이전 및/또는 배양 단계 동안 생물학적 변형제에 노출시킬 수 있다. 이러한 방법은 의학에서 각종 진단적 이용, 가령 각종 세포집단에서 인터류킨 생성의 수준 및 유형을 측정하고 종양 세포집단에서 성장인자 방출을 측정하는 데 잠재적으로 가치가 있다.
원하는 생성물의 분비자 세포의 검출에 사용되는 시약은 편리하게 키트의 형태로 포장할 수 있다. 이 키트는 예를들면, 선택적으로 젤라틴성 세포 배양배지의 제조에 사용하기 위한 하나 이상의 물질, 원하는 분비 생성물의 제조를 위해 세포배양에 사용할 배지, 고정부 및 포획부로 이루어진 생성물 포획 시스템; 표지부; 시약의 사용을 위한 지시사항을 포함할 것이다. 모든 시약은 적당한 용기내에 포장될 것이다.
이 키트는 또한 다음의 것들을 포함하도록 제제화할 수 있다. 이 경우 모든 시약은 바람직하게는 세포가 첨가되는 단일 바이알에 놓인다. 특정세포 표면구조에 이중-특이적인 적어도 하나의 항체 또는 고정부 및 생성물. 적어도 하나의 표지부 및 선택적으로 생물학적 변형제.
표지부는 형광색소가 부착된 안티-생성물 항체일 수 있는 데, 이것은 자기비드 컨쥬게이트, 콜로이드 비드 컨쥬게이트, FITC, 피코에리트린, PerCP, AMCA, 형광입자 또는 리포솜 컨쥬게이트 항체를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다. 또 다르게는 표지부가 어떤 적당한 표지일 수 있는데 이것은 여기서 개시된 것들을 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다.
선택적으로, 이 키트는 생리적으로 허용가능한 완충액을 포함할 수 있다. 그런 완충액은 당업계에서 공지되었고, BSA있는 PBS 및 BSA없는 PBS, 등장 식염수, 세포배양배지 및 특정 세포 유형에 필요한 어떤 특별한 배지를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다. 교차 표지화를 감소시키고 세포 주위의 국소적인 생성물 농도를 증가시키는 완충액을 이용할 수 있다. 완충액은 점도를 증가시키거나 투과성을 감소시키기 위한 작용제를 포함할 수 있다. 적합한 작용제가 여기서 기술되었다. 배지의 점도는 당업계에서 공지된 어떤 방법에 의하여 분석 전에 감소될 수 있는데, 이 방법은, 열, EDTA 및 효소를 용해시키는 생리적으로 허용가능한 완충액에 용해시키는 것을 포함하지만 이것에 제한되지는 않는다. 첨가한 배지의 부재하에 이미 배지내에서 현탁된 세포를 바이알에 직접적으로 첨가할 수 있다. 적합한 세포 현탁액은 세포주 및 생물학적 샘플을 포함하지만 이것에 제한되지는 않는다. 생물학적 샘플은 혈액, 오줌 및 혈장을 포함하지만 이것에 제한되지는 않는다.
세포 교차-오염을 감소시키기 위해 미결합 생성물을 포획시켜서 생산 세포로부터 생성물의 확산을 감소시키기 위한 추가의 구조체가 첨가될 수 있다. 이것은 겔 요소, 비드, 자기 비드, 폴리머에 고정화된 안티-생성물 항체를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다.
또한 생물학적 변형제가 특이적인 분비를 유도하도록 완충액이나 배지에 첨가될 수도 있다. 항체(자기 표지화된 또는 형광 표지화된)와 같은 추가의 표지부가 또한 존재하는데, 이것은 세포유형을 식별하기 위한 안티-세포 표면 항체, 죽은 세포를 표지화하기 위한 요오드화 프로피듐, 및 어떤 세포 유형을 표지화하기 위한 자기 비드를 포함하지만, 이것들에 제한되지는 않는다.
이 구체예에서, 모든 물질은 바이알 같은 단일 용기내에 위치할 수 있고 세포 샘플을 첨가할 수 있다. 생성물의 분비 및 그후 생성물의 포획 그리고 생성물과 표지부의 결합이 가능하도록 내용물을 배양한다. 그 다음엔 분비되고 결합된 생성물을 갖는 세포를 포획된 생성물의 존재, 부재 또는 포획된 생성물의 양에 기초하여 분리 및/또는 분석할 수 있다. 분리는 당업계에서 공지된 방법중 어느 것에 의해 행할 수 있는데, 이 방법은 단순 희석, 적혈구 용해 원심분리-세척 단계, 자기 분리, FACS 및 Ficoll 분리등을 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다. 세포분석은 다양한 방법에 의해 수행할 수 있는데, 이 방법은 FACS, 영상분석, 세포학적 표지화 및 면역분석을 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다.
하기의 실시예에서 보여지는 것처럼, 표시된 생성물을 분비하는 세포는 특정 결합 파트너의 존재하에 수분내에 확인 및 분류할 수 있다. 따라서 기술된 키트는 진단적 이용에 사용하는데 적합하다. 예컨대 적당한 진단적 이용은 면역 탈조절, 유전적 결함 및 종양 분류를 포함하지만 이것에 제한되지는 않는다.
하기에서 기술되는 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며, 본발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본 개시내용의 관점에서, 청구범위내에서 무수한 구체예가 당업자들에 명백할 것이다.
[실시예]
[실시예 1]
본 실시예의 목적은 외적으로 동일한 세포들의 혼합물로부터 주어진 생성물을 분비하는 생세포를 분리하는 것이었다. 시험 시스템으로서 B.1.8. 하이브리도마 세포주와 X63. Ag 8 6.5.3. 골수종 세포주를 이용했다. B.1.8 세포의 약 60%는 IgM을 분비한다; 골수종 세포주는 어떤 단백질도 분비하지 않는다. 분비세포는 Ag 8 6.5.3. 세포와 B.1.8.의 혼합물로부터 그리고 B.1.8.로부터 분리된 것이다. 이것을 달성하기 위해서, 세포표면에서 세포에 의해 분비된 생성물을 포획하고, 세포표면에서 생성물을 유지하고, 문제의 세포를 표지화하기 위한 방법이 개발되었다. 포획 항체는 두 단계로 부착되었다: 1) 세포의 바이오티닐화: 및 2) 아비딘-바이오틴 커플링 반응을 통한 포획 항체의 부착. 그리고 나서, 세포 혼합물로부터 표지화된 세포를 분리하였다.
[바이오티닐팔미토일 덱스트란으로의 세포표면의 바이오티닐화]
이것의 목적은 세포막 속에 포매되는(embed) 지방산기와 바이오틴기를 갖는 큰 고분자인 고정부의 합성이었다.
[소수성 바이오틴의 합성]
3x106g/mole의 분자량을 갖는 덱스트란을 담체 분자로서 사용하였다. 다당류에 지방산기와 바이오틴기를 커플링시킬 수 있도록 덱스트란에 먼저 반응성 일차 아미노기를 도입하였다.
바이오티닐 기와 팔미토일 기는 그후 바이오틴과 지방산 에스테르를 커플링시키는데 사용된 것과 같은 다소 변형된 방법에 의하여 단백질의 아미노기에 도입시켰다. 제1도는 덱스트란에 바이오티닐 및 팔미토일기를 도입하는 것의 도해를 보여준다.
[아미노덱스트란의 합성]
표준방법을 이용하여 카르보디이미다졸로의 활성화 및 디아미노헥산과의 반응에 의하여 아미노기를 덱스트란 분자에 도입하였다. 아미노덱스트란은 Sigma Corp. 및 Molecular Probes(Oregon)으로부터 얻었다. 분자당 165 ± 20 아미노기를 갖는 아미노텍스트란 3x106g/mole을 얻었다. 부반응으로 덱스트란의 중합이 일어난다. 비중합 생성물의 수율은 출발 덱스트란의 94%였다.
Dubois에 의해 기술된 방법을 이용하여 덱스트란 농도를 측정했다. 측정할 덱스트란 농도 100㎕를 갖는 시험관에 페놀80% 수용액 5㎕를 넣었다. 이 혼합물 속에 진한황산 1㎖을 빠르게 피페팅하였다. 10분 후, 제제를 10분 동안 30℃의 수조에 넣었다. 480㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 덱스트란 농도를 발견하였다.
[바이오티닐아미노덱스트란의 합성]
바이오티닐화 시약으로서 D-바이오티닐-N-히드록시숙신이미드를 이용하여 덱스트란에 바이오티닐기를 도입하였다. 숙신아미드 기는 7 이상의 pH 값에서 아미노기와 효과적으로 반응한다. 제2도는 염기성 형태의 일차 아미노기와 N-히드록시숙신이미드 에스테르의 반응의 도해이다. 대응하는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르는 덱스트란에서 팔미토일기와 바이오티닐기 둘다를 도입하는데 이용되었다. 이 도면에서, R′은 덱스트란을 나타내고, R은 바이오티닐기 또는 팔미토일기를 나타낸다.
[바이오티닐팔미토일덱스트란의 합성]
팔미트산기를 바이오틸화된 덱스트란에 커플링시켰다. 이 반응은 항체에 팔미토일기를 커플링시키는 다소 변형된 방법에 의해 수행되었다(Huang 등, J. Biol. Chem. 255:8015-8018(1980)). 커플링은 팔미트산의 NHS 에스테르에 대한 덱스트란 아미노기의 구핵성(nucleophilic)공격에 의하여 이전의 바이오티닐화와 유사하게 일어난다.
[바이오티닐팔미토일덱스트란으로의 세포의 바이오티닐화]
당지질, 바이오티닐팔미토일덱스트란이 세포에 결합하여 세포표면을 바이오티닐화 할 수 있는 능력을 인간 림프구에 대해 시험하고 팔미토일 기가 없는 바이오티닐아미노덱스트란의 결합과 비교하였다.
세포를 20℃에서 원심분리하고 37℃에서 10분간 PBS 중의 바이오티닐덱스트란 또는 바이오티닐팔미토일덱스트란 1㎎/㎖와 배양하였다(107세포에 대해 100㎕). 그리고나서 PBS 1% BSA(PBS/BSA) 1㎖을 가하고, 3분후 PBS 14㎖로 얼음상에서 세포를 세척하였다. 처리된 세포를 PBS 0.3% 아지드화나트륨(PBS/NaN3) 중에 취하였다.
바이오티닐덱스트란 또는 바이오티닐팔미토일덱스트란에 의한 세포의 바이오티닐화는 세포를 스트렙트아비딘-FITC(ST-FITC)로 표지화시킴으로써 모니터하였다. 보다 특이적으로, 처리된 세포를 세척하고 100㎕의 PBC/107세포중에 취하였다. PBS 중의 100㎍/㎖ ST-FITC 1㎕를 가하고 혼합물을 얼음에서 5분간 배양하였다. 그 다음 세포를 세척하고 107세포당 1㎖ PBS/BSA 중에 취하였다. 그리고 바이오티닐화의 척도로서 FACScan에서 형광의 강도를 측정하였다.
바이오티닐덱스트란 및 바이오티닐팔미토일덱스트란으로 처리된 세포와 스트렙트아비딘의 결합의 FACScan 결과는 각기 제3(a)도 및 제3(b)도에서 보여진다. 이 결과로부터 알수 있듯이, 바이오티닐덱스트란으로 배양한 세포는 ST-FITC에 결합하지 않았다. 반대로, 바이오티닐팔미토일덱스트란으로 배양한 세포는 다량의 ST-FITC에 결합하였다.
바이오티닐팔미토일덱스트란 표지화된 세포 및 β2마이크로글로불린(β2m)에 대한 바이오티닐 항체로 표지화된 세포에 의해 결합된 ST-FITC의 양 사이에서 비교가 행해졌다. 사용된 항체는 αβ2m이었는데, 이것은 β2m에 결합하는 항체이다. 제4도는 FACScan 결과의 트레이스를 보여준다: (a) ST-FITC로 처리된 바이오티닐화되지 않은 세포(네가티브 대조구); (b) 바이오티닐팔미토일덱스트란으로 그 다음엔 ST-FITC로 처리된 세포; (c) 바이오티닐-αβ2m으로 배양되고 ST-FITC로 처리된 세포. 제4도의 결과는 바이오티닐팔미토일덱스트란으로 표지화된 세포가 αβ2m-바이오틴 컨쥬게이트 보다 세포표면에 더 많은 스트렙트아비딘을 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
세포의 항체 표지화가 포화에 도달하는 동안, 바이오티닐팔미토일덱스트란에 의한 표지화는 표지화 시약의 농도에 따라 선형으로 증가한다. 그러나, 시약의 농도가 너무 높을때 표지화는 세포손상에 의해 제한된다. 세포의 바이오티닐화를 37℃에서 10분간 약 1㎎/㎖의 바이오티닐팔미토일덱스트란으로 행할 때에는 현미경하에서 어떤 세포표면의 변화도 관찰되지 않았다. 포워드 및 사이드 산란광으로의 FACScan에서 측정한 세포 표면의 광산란 성질을 미처리 세포와 비교했을 때 변하지 않았다. 처리된 세포는 생존력을 유지했고 다시 배양될 수 있었다.
[포획항체와 바이오티닐화된 세포의 커플링]
포획항체를 아비딘-바이오틴 브리지를 통해 바이오티닐팔미토일덱스트란으로 바이오티닐화된 세포에 커플링시켰다. 이것을 수행하기 위해서, 포획항체를 아비딘과 컨쥬게이트시켰고 컨쥬게이트를 바이오티닐화 세포와 반응시켰다.
두 항체, 마우스 IgM(람다)의 각종 에피토프에 대한 마우스 람다(LS136)에 대한 래트 안티-마우스 IgM(R33.24.12)및 마우스카파를 아비딘에 커플링시켰다.
아비딘은 몇몇 반응성 아미노기를 갖는 염기성 단백질이다. 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)를 이용하여 아비딘을 포획항체에 커플링시켰다. SMCC는 2가의 링커분자인데, 말레이미드기는 선택적으로 티올과 반응하고 숙신이미딜기는 선택적으로 일차아민과 반응한다. 포획항체는 DTT로 환원되었다. DTT는 순환 환원제인데 이것은 적당한 조건하에서 항원-결합 부위를 파괴하지 않고 IgG 분자의 1-4 디술피드 브리지를 티올로 환원시킨다. SMCC로 아비딘의 아미노기에 반응성 말레이미드기를 도입하였다. 아비딘의 말레이미드기를 환원된 항체의 SH기와 반응시켰다. 아비딘과 포획항체는 시클로헥산 브리지를 통해 이 방식으로 연결되었다.
보다 특이적으로, DTT 1몰 용액 1.5㎕를 5mM EDTA를 함유하는 PBS(PBS/EDTA) 200㎕중의 IgG 클래스의 항체 1㎎에 첨가했다. 실온에서 1시간 동안 반응후에, 환원된 항체를 세파덱스 PD10 컬럼상에 놓고, 1㎖의 PBS/EDTA로 용출시켰다. 항체분자당 도입된 티올기의 수를 측정하였다. 바람직한 범위는 항체분자당 약 2-6 티올기이다.
동시에, 1㎎ 아비딘을 100㎕의 탄산완충액 pH = 9.4에 녹이고 7.5㎕ DMSO 중의 125㎍ SMCC를 첨가했다. 실온에서 1시간 후, 세파덱스 PD10 컬럼으로 단백질을 정제하고 500㎕PBS/EDTA 중에 취하였다.
1㎖의 PBS/EDTA 중의 1㎎ 환원된 항체를 200㎍ PBS/EDTA 중의 활성화된 아비딘 400㎍과 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치시켰다. 1M N-에틸말레이미드 5㎕를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다.
[아비딘-표지화된 포획항체와 바이오티닐화 세포의 커플링]
골수종 및 하이브리도마 세포의 혼합물을 사용하였다. IgM을 분비하는 B.1.8. 하이브리도마 세포 및 비생산 X63. Ag 8 6.5.3. 골수종 세포를 수증기로 포화된 분위기에서 37℃에서 생장시켰다. 배양배지는 RPMI 및 5% 태아 소혈청(FCS), 100 IU/㎖ 페니실린, 및 0.1㎎/㎖의 스트렙토마이신을 포함했다.
세포 혼합물을 상술한 조건을 이용하여 바이오티닐팔미토일덱스트란으로 바이오티닐화시켰다.
바이오티닐된 세포에 항체-아비딘 컨쥬게이트를 커플링시키기 위해서, 바이오티닐화된 세포를 PBS/1% BSA로 세척한 후 아비딘-포획항체 컨쥬게이트와 배양하였다. PBS중의 포획항체-아비딘 컨쥬게이트 1㎎/㎖용액 1㎕를 100㎕ PBS/NaN3중의 107바이오티닐화 세포에 첨가하였다. 얼음에서 10분 후, 바이오틴기를 포획항체로 포화시키고, 세포에 포획항체를 로딩하였다.
세포표면에서 아비딘-항체 복합체의 존재를 검출하기 위해서, 형광 안티-항체를 사용했고, 형광표지를 FACScan으로 검출하였다. 형광 스트렙트아비딘으로의 바이오티닐화된 세포의 표지화와 대략 일치하는 세포의 표지화를 동일 연구로 수행하였다. 세포집단의 균일한 표지화가 관찰되었다; 모든 세포가 그것의 표면상에 대략 동일한 양의 포획항체를 가졌다.
[세포표면상의 포획항체의 기능성 시험]
포획항체를 구비한 약 107세포를 100㎕ PBS/BSA 중에서 얼음에서 (그것이 어떤 단백질도 분비하지 못하도록) 포획항체에 의해 포획되는 각종 농도의 마우스 IgM과 배양하였다. 5분간의 배양후, 세포를 세척하고 항체표지로서 R-PE 컨쥬게이트를 사용하여 세포표면에서 포획된 IgM를 검출하였다. 검출은 FACScan에서 행하였다. 제5도는 적정곡선을 나타낸다. 도면에서는, 세포의 형광(평균)을 세포가 배양된 IgM 농도에 대한 그래프로 나타냈다. 이 결과는 세포표면의 포획항체가 여전히 온전한 결합부위를 갖는다는 것을 보여준다. 배지내의 낮은 IgM 농도에 대한 포획 항체의 민감도도 또한 식별가능하다. 나타낸 적정곡선은 포획항체로서 R33.24.12를 이용하여 얻어졌다. 이후에 보여지는 포획실험에서는 포획항체 LS136을 이용하였다. 후자는 배지내의 낮은 IgM 농도에 대한 다소 더 높은 민감도를 보였다.
[분비된 IgM의 포획]
바이오티닐화된 B.1.8. 및 X63 세포의 혼합물을 포획항체와 컨쥬게이트시키고, 배지에서 다양한 길이의 시간동안 37℃에서 7.5% CO2분위기하에 유지하였다. 그것의 표면에서 포획된 IgM을 항체표지에 의해 검출하였다.
제6도는 결과적인 표지화를 FACScan 도해로서 나타낸다: 포획 시험 지속시간(6a) 10분; (6b) 30분; (6c) 1시간; (6d) 2시간. 30분 후에는 다른 양의 IgM을 포획하는 두 집단이 식별될 수 있다. 두 집단 사이의 차이는 오랜 배양 후에는 사라지는데, 그것은 분비세포에 의해 배지로 방출되는 IgM 때문이며 이것은 비분비 세포상의 포획항체에 의해 취해진다.
[확산 억제제를 이용한 분비된 IgM의 포획]
덜 강하게 표지화된 세포집단이 또한 그것의 표면에서 빠르게 IgM을 취하는 것은 상기의 실례로부터 볼수 있다. 이러한 백그라운드 표지화는 분비세포상의 포획항체에 의해 포획되지 않는 배양배지내의 분비 IgM으로부터 생긴다. 포획실험이 더 점성이 큰 배지에서 수행되면, 이 백그라운드 표지화는 감소될 수 있다. 2.5% 메틸셀룰로스를 갖는 배양배지를 사용했다; 이 배지는 겔 같은 점도를 보인다.
포획항체를 로딩한 세포를 2.5% 메틸셀룰로스 또는 1% 메틸셀룰로스를 갖는 배양배지에 혼합하였다. 세포를 세척하는 것은 불필요하고 부적절하였다; 세포에 결합되지 않은 포획항체-아비딘 컨쥬게이트는 방해하지 않는다. 107세포에 대해 배지 2㎖을 이용하였다. 용액속에 메틸셀룰로스를 적절하게 투입하기 위해서, 그것을 하루전날 배양배지와 혼합하였다. 배지를 37℃로 미리 가열하고, 세포를 가하고, 7.5% CO2와 함께 37℃에서 25 내지 45분간 배양하였다. 이러한 조건하에서, 하이브리도마 세포는 그것의 생성물을 분비했다. 배양후 고점도 배지를 냉각 PBS/BSA 45㎖로 희석하였다. 세포를 4℃에서 원심분리하고 100 내지 500㎕의 PBS/BSA 중에 취하였다. 메틸셀룰로스의 나머지는 세포 현탁액이 증가된 점도를 나타내게 했다: 이것에 의해 세포 또는 연이은 표지화 단계 어느 것도 해가 되지 않았다.
제7도는 배지내의 메틸셀룰로스 농도의 포획에 대한 효과를 나타낸다. 이 실험에서 세포는 2.5% 메틸셀룰로스에서 35분간 IgM을 생성하였고, 그리고나서 세포를 세척하고 R33.24.12. R-PE로 표지화시켰다. 제7(a)도 및 제7(b)도는 각각 2.5% 및 1% 메틸셀룰로스 배지에서 배양한 세포에 의한 항체의 포획을 나타낸다. 이 결과는 분비 및 비-분비세포가 2.5% 메틸셀룰로스 배지에서의 포획에 기초하여 성공적으로 구별된다는 것을 나타낸다.
[이중 표지화]
상술한 포획실험 후 표면에 IgM을 갖는 세포가 실제로 IgM을 분비하는 세포인지를 보여주기 위해서, 세포를 포획실험 후 표면에 R33.24.12.5 R-PE(FACScan에서 형광 2로서 육안으로 보임)으로 적색으로 표지화시키고, 고정시키고, 세포질에 R.33.24.12.-FITC(FACScan에서 형광 1로서 육안으로 보임)으로 녹색으로 표지화시켰다. 이러한 식으로 두번 표지화된 세포를 현미경하에서 그리고 FACScan에서 조사하였다.
포획실험 후 표면에 IgM을 갖는 세포가 분비세포라는 사실은 이러한 이중표지화에 의해 FACScan에서 형광 1 및 2의 이차원적 도해로서 나타내진다. 포획실험 후 B.1.8.세포는 포획된 IgM에 비하여 표면에서 적색으로 표지화되었고(FACScan에서 형광 2로서 육안으로 보임), 그후 고정되고 IgM에 비하여 세포질에서 녹색으로 표지화되었다(FACScan에서 형광 1로서 육안으로 보임). 또한 표면-표지화된 세포는 모두 세포질에서 표지화된다.
이 결과는 IgM을 생산하지 않는 세포 모두 표면-표지화되지 않은 세포집단에 속한다는 것을 나타낸다. 세포질-포지티브 세포를 두 분획으로 나누었다; 반대로, 세포의 한 분획은 표면에서 그리고 세포질에서 표지화되었다. 이것은 외견상 분비세포이다. 반대로, 한 세포 분획은 세포질에서는 표지화되었지만 세포표면에서는 그렇지 않았다. 이 집단은 Ficoll 경사도(고정 바로 전에 수행됨)에 의해 분리될 수 없기 때문에, 그것은 죽은 세포가 아니다. 이 집단의 일부 세포는 또한 분비세포 만큼 세포질에서의 강도로 표지화되지 않았다. 또한 두 다른 세포집단과 비교했을 때 이 분획의 보다 더 넓은 분산은 놀랍다. 이 세포는 IgM을 생산하지만 명백하게 이 단백질을 분비할 수 있는 능력을 상실했다. 이중-표지화된 세포는 현미경 하에서 대조구로서 관찰되었다. 이러한 연구는 FACScan 도해의 결과와 유사성을 보였다.
[MACS의 세포분리]
약 107B.1.8.과 X63 세포의 1:1 혼합물로의 분비된 IgM의 포획후에, 세포표면에서 포획된 IgM에 결합하는 자기 입자를 이용하여 자기세포 선별 시스템(MACS)으로 분리를 행하였다. MACS 시스템 및 자기입자는 Miltenyi Biotec GmbH(독일)에서 구입하였다.
IgM-분비 및 비-분비세포의 혼합물에 이 실험에서 개발한 분비 IgM을 포획하기 위한 매트릭스를 제공하고 2.% 메틸셀룰로스가 있는 배양배지 5㎖에서 25분간 7.5% CO2분위기 하에서 37℃로 유지하였다. 세포를 45㎖의 PBS/BSA에서 세척하였다. 펠렛을 겔 같은 점도의 메틸셀룰로스 나머지로 처리하였다. 그것을 PBS/BSA 500㎕중에서 취하고, 5㎕의 래트 안티-마우스 IgM 자기비드(Miltenyi Biotec GmbH)를 첨가하였다. 얼음에서 5분후, 10㎍/㎖의 R-PE-커플링된 R 33.24.12 항체를 가하고 혼합물을 5분 더 얼음에서 유지하였다.
이러한 식으로 미리 처리한 약 107 세포를 MACS(Miltenyi Biotec GmbH)에서 타입 A1 분리 컬럼상에 놓고 5℃에서 네가티브 분획을 10㎖의 PBS/BSA로 용출시켰다. 자기장에서 컬럼을 제거한 후, 포지티브 세포분획을 10㎖ PBS/BSA로 용출시켰다. IgM에 비하여 적색으로 표면이 표지화된 세포가 분리전과 후 제8도에서 보여진다. 분리전의 세포현탁액은 58.8% 비표지화된 세포와 41.2% 표지화된 세포를 포함하였다. 분리후 네가티브 분획은 89% 비표지화된 세포와 11%의 표지화된 세포를 포함했다. 포지티브 분획은 23% 비표지화된 세포와 77% 표지화된 세포를 포함하였다. 분리후 포지티브 세포의 농도를 하기식으로 계산했을 때: 농도 인자 = (% 포지티브 분획의 포지티브 세포 * % 원래세포혼합물의 네가티브 세포) / (% 원래 분획의 포지티브 세포 * % 포지티브 분획의 네가티브 세포) 4.8의 농도 인자가 얻어졌다.
분리후, 세포는 선택적으로 죽은 세포를 표지화시키는 염료인 요오드화 프로피듐으로 표지화시킬 수 없고, 다시 배양할 수 있었다. 분리한 후 일주일경에 현미경하에서 분리된 세포 분획의 생명력을 조사했다. 분리공정 동안 세포의 상실은 측정되지 않았다; MACS에서의 분리시 정상적으로 세포의 상당한 상실은 일어나지 않는다.
제8도는 분리전과 후 표지화된 세포의 FACScan 도해이다. 분비된 IgM을 포획한 후, 세포를 표면에서 IgM과 상대적으로 표지화시키고 IgM과 상대적으로 자기입자로 MACS에서 분리하였다. 분리전 세포가 제8(a)도에서 보여진다. 제8(b)도는 분리후 네가티브 분획을 보여준다. 제8(c)도는 분리후 포지티브 분획을 보여준다. 파선 우측의 세포를 표지화된 것으로 간주하고 파선 좌측의 세포를 비표지화된 것으로 간주하면, 세포분획은 하기의 양의 표지화된 세포 및 비표지화된 세포를 포함하였다:
% 네가티브 % 포지티브
분리전 세포 58.8 41.2
분리후 네가티브 분획 89 11
분리후 포지티브 분획 23 77
상술한 연구는 하기의 일반 기술을 포함하였다.
[세포의 항체 표지화]
세포를 PBS/BSA 중에 취하고 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 상징액을 흡인에 의해 제거하고 펠렛을 항체표지화 용액중에 재현탁시켰다. 107세포당 PBS/BSA 0.1% NaN3중의 항체 10-100㎎/㎖을 포함하는 표지화 용액 100㎕를 사용하였다. 커플링 반응물을 얼음에서 5분간 배양하였다. 그 다음 세포를 세척하였다.
[Ficoll 경사도 원심분리]
죽은 세포를 제거하는 Ficoll 경사도 원심분리를 이용하였다. 세포 현탁액에 주의 깊게 5㎖ Ficoll(스웨덴 웁살라 Pharmacia LKB)을 가하고 실온에서 2500rpm으로 원심분리했다. Ficoll 쿠션위에 남아 있는 살아 있는 세포는 흡인에 의해 제거되었다.
[세포질 표지화]
0.5% 사포닌 및 표지화 항체 10㎍/㎖ PBS/BSA 중의 고정된 세포에 첨가했다. 사포닌은 세포막에서 직경 약 10㎚의 가역적인 채널을 생성하여 항체가 세포속으로 침투할 수 있게 한다. 1시간의 반응시간 후, 세포를 PBS/BSA 0.5% 사포닌(1㎖/106세포)중에 취하였다. 30분후 세포를 세척하고 사포닌-제거 PBS/BSA 중에 취하였다.
[사용한 항체]
R-PE 및 플루오레세인(fluorescein)에 커플링된 모노클로날 래트 안티-마우스 항체 R33.24.12.는 Immunobiological Department of the Genetic Institute of Cologne의 스톡에서 얻어졌다. 최적 표지화 농도가 적정되었다. 이 항체의 R-PE 컨쥬게이트를 사용하여 분비세포 표면의 포획된 IgM을 표지화시키고, 플루오레세인 컨쥬게이트를 세포질 표지화에 사용했다. 마우스 람다에 대한 마우스 IgG 카파, LS136을 포획항체로 사용했다(포획되는 IgM은 람다 알로타입(allotype)에 속한다). LS136은 마찬가지로 Immunobiological Department의 내부 제조로부터 생긴 것이다.
[실시예 2]
본 실시예는 포획부에 아비딘을 통해 연결된 바이오틴 고정부를 포함하는 세포에 의한 분비될 생성물의 포획에 대한, 고점도 배지와 비교했을때 젤라틴 배지에서 분비단계의 수행의 효과를 나타낸다.
[NHS-LC-바이오틴을 이용한 세포의 화학적 바이오티닐화]
B.1.8. 및 X63 세포의 혼합물을 하기의 방법에 의해 화학적으로 바이오티닐화시켰다. 107내지 108세포를 포함하는 세포 현탁액을 원심분리하고, 상징액을 제거하고, 펠렛을 0.1 내지 1㎎/㎖ NHS-LC-바이오틴(미국 일리노이 록포드 피어스)을 포함하는 200㎕ PBS pH 8.5 용액에 재현탁시켰다. 실온에서 30분간의 배양후 세포를 50㎖ PBS/BSA로 두번 세척하였다. 바이오티닐화의 24시간 이내에 아비딘 컨쥬게이트로의 표지화가 행해졌다.
[바이오티닐화된 세포와 아비딘이 있는 포획항체의 결합]
NHS-LC-바이오틴과의 반응에 의해 바이오티닐화된 세포를 얼음에서 30분간 LS136의 아비딘 컨쥬게이트(30㎍/㎖의 농도)로 표지화시키고 세척하였다.
[젤라틴성 배지에서 그리고 고점도 배지에서 분비 및 생성물 포획]
바이오티닐화되고 아비딘 처리된 세포를 3가지의 다른 배지에서 7.5% CO2하에 37℃에서 1시간 배양하고, 세척하고 얼음에서 10분간 R 33.24.12의 플루오레세인 컨쥬게이트(10㎍/㎖)로 표지화시키고, 세척하고, 결합된 R 33.24.12.의 양의 측정을 위해 유동세표 계측법(FACScan)을 이용하여 분석하였다. R 33.24.12는 안티-생성물 항체의 플루오레세인 컨쥬게이트이다. 배양하는 동안 사용된 3가지의 다른 배지는 하기와 같다:
(1) 세포 배양배지, RPMI, 5% FCS; (2) RPMI, 5% FCS, 40% BSA를 보충(스위스 Fluka); (3) RPMI, 5% FCS, 젤라틴성 확산 억제제로서 20% BSA 및 20% 젤라틴을 보충(Sigma Chemical Co. 소가죽으로부터의 대략 225 블룸의 타입 B). 결과는 제9도, 제10도, 및 제11도에서 보여진다.
제9(a)도는 RPMI, 5% FCS(즉 확산 억제제가 없음)에서 배양된 세포의 표지화의 분포를 보여준다. 전체 세포집단은 더 많은 형광쪽으로 이동되었고, 따라서 별개의 세포집단의 분리가 이루어질 수 없었다. 제9(b)도는 40% BSA로 보충된 RPMI, 5% FCS에서 배양된 세포의 표지화의 분포를 보여준다. 이 BSA 배지는 고점도 확산 억제제이다. 제9(a)도와 비교했을 때, 이 배지에서의 배양은 더 적은 백그라운드 표지화를 나타냈다. 제9(c)도는 20% BSA 및 20% 젤라틴으로 보충된 RPMI, 5% FCS에서 배양된 세포의 표지화의 분포를 보여준다. 이 배지를 이용하면 두 세포집단, 분비자와 비-분비자를 식별할 수 있다. 제9(a)도 및 제9(b)도에서 나타낸 바와 같이, 다른 두 배지에서 배양된 세포와 비교했을 때 분비자 집단에서 형광의 양이 상당히 증가되었다.
본 실시예는 고 BSA 배지 같은 점성 배지는 비-생산자 세포에 의한 분비된 생성물의 포획을 감소시키지만 젤라틴 배지에서의 분비과정 동안의 배양은 포획 비-생산자 세포를 낮추는 것과 동시에 생산자 세포의 표지화를 상당히 증가시킨다는 것을 보여준다. 포획에 대한 이러한 증폭효과는 더 낮은 수준의 생성물을 생산하는 세포의 표지화를 가능하게 하고 및/또는 분비된 생성물의 포획을 위해 더 낮은 친화성 항체를 이용하는 것을 가능하게 한다. 젤라틴 배지는 포획반응의 속도를 억제하지 않으면서 분비세포 부근의 생성물의 농도를 증가시키는 것 같다. 생성물의 분자량 보다 더 낮은 차단값을 갖는 젤라틴 배지를 배지에서 사용할 때에는, 세포와 배지 사이의 틈에 분비된 분자가 농축하여 분비세포의 더 높은 국소 농도 그리고 더 효율적인 표지화를 일으킬 수 있다.
[MACS를 이용한 세포분리]
상술한 것처럼 B1.8 및 X63 세포의 혼합물을 화학적으로 바이오티닐화시키고 LS136-아비딘으로 표지화하였다. 대조구 샘플을 취해서 얼음에 보관했다. 남아 있는 세포는 23% 젤라틴, 18% BSA 및 5% FCS를 포함하는 6㎖ 젤라틴 RPMI 배지에서 1시간 동안 분비시켰다. 겔을 42℃ PBS 20㎖에서 빠르게 녹이고, 30㎖ 얼음 냉각시킨 PBS를 빠르게 첨가하고 냉각 원심분리기에서 세척하였다. 세포 및 대조구 샘플을 얼음에서 10분간 래트 안티-마우스 IgM 마이크로비드(Miltenyi Biotec GmbH, 염소 안티-마우스 플루오레세인(앨라바마, 버밍햄, SBA)으로 표지화됨)로 표지화시키고 한번 세척하였다. 그리고나서 MACS 자기 세포 분류기를 이용하여 A2 컬럼에서 세포를 분리하였다. 분리는 제조자의 지시사항에 따라서 수행하였다. 대조구 샘플, 비-분리 샘플, 자기 및 비-자기 분획을 유동세포 계측법(FACScan)에 의해 분석했다(미국 캘리포니아 산호세 베크톤 디킨슨).
제11(a)도는 대조구 샘플의 형광분포를 나타낸다. 도면에서 보여지는 것처럼, 세포상에서 거의 어떤 검출가능한 표면 표지화가 검출되지 않았다(점선 사이의 영역(포지티브 윈도우)에서 0.6%). 제11(b)도는 분비와 형광표지화 후, 자기분리전 형광분포를 나타낸다. 세포의 대략 14.2%가 포지티브 윈도우에 있고 이것은 추정되는 분비자이다. 제11(c)도는 자기분리후 비-자기 분획의 형광분포를 보여준다. 거의 모든 포지티브 세포가 자기 컬럼에서 유지되었다(세포의 2%가 포지티브 윈도우에 있다). 제11(d)도는 자기분획의 형광 분포를 보여준다. 포지티브 세포의 집단은 매우 농축되어 있다(80.3%가 포지티브 윈도우에 있다). 장치 제한 때문에 세포집단의 순도는 FACScan 분석에서 보여지는 것처럼 더 높은 것으로 기대될 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 증폭율(enrichment rate)은 24보다 더 큰 것으로 계산될 수 있다.
제10(a)도 내지 제10(d)도는 B1.8 대 X63 세포의 더 높은 비율을 사용한 것을 제외하고는 제11(a)도 내지 제11(d)도에서와 유사한 실험을 보여준다. 분비단계 동안의 배지는 25% 젤라틴과 2.5% FCS를 함유하는 RPMI였다. 포지티브 윈도우에서 세포의 백분율은 1.3%(대조구), 41.2%(분비후), 6.6%(비-자기 분획), 92.9%(자기 분획)였다. 본 실시예에서 포지티브 세포의 증폭율은 18.7보다 더 큰 것으로 계산될 수 있으며, 고갈율(depletion rate)은 9.9보다 더 큰 것으로 계산될 수 있다.
[실시예 3]
하기는 절대 분비량을 측정하고, 세포표면에서 포획부의 다른 양을 보정하는 방법을 기술한다.
분비단계 동안 세포를 배지로 공급된 낮은 농도의 표지를 붙인(tagged)생성물에 노출시킨다; 표지를 붙인 생성물은 세포의 생성물 결합부위에 결합하지만 포화되지는 않는다. 이 단계 동안의 배양은 분비생성물과 표지를 붙인 생성물이 세포에 결합하도록 한다. 그리고나서 생성물(표지를 붙인 것과 분비된 것)에 특이적인 표지부로 세포를 표지화시킨다. 한 변수를 이용한 표지(tag)의 측정 그리고 다른 변수로 전체 생성물의 측정, 세포에 의해 분비된 양이 표준화되고, 혼합물에서 세포의 포획항체의 다른 양이 보정된다.
[실시예 4]
[분비된 시토카인에 대한 생세포의 면역형광분석]
본 실시예는 분비된 시토카인에 대한 생세포의 면역형광분석 방법을 기술한다. 보다 특이적으로, 본 실시예는 인터페론γ(IFNγ)을 분비하는 마우스 비장세포의 식별 및 분리를 기술한다. 일반적으로, 이 실시예는 세포표면 단백질의 바이오티닐화에 의해 생세포 표면상에 인공적인 친화성 매트릭스를 생성하는 것과 아비딘-컨쥬게이트된 안티-시토카인 항체와 배양시키는 것을 포함한다. 세포를 고점도 배지에서 배양하여 분비세포와 비-분비세포 사이에서 분비 생성물의 확산을 방지하고 분비시킨다. 세포표면에서 캐치되는 분비된 시토카인을 디곡시게닌(DIG) 컨쥬게이트된 안티-시토카인 항체로 표지화시키고 형광색소를 붙인 안티-DIG 항체를 이용하여 염색하였다. 이러한 식으로 표지화된 세포를 표면 마커에 대해 더욱 특정화하고 기능분석을 위해 MACS 또는 FACS에 의해 선별할 수 있다. 이 방법을 시토카인의 세포내 검출과 조합하면 단일 세포수준에서 시토카인의 세포내 축적과 분비의 관계를 알수 있다.
[IFNγ-분비 뮤린 비장세포의 검출]
BALB/c 마우스 비장세포(SC)를 RPMI 1640 중의 2x106세포 /㎖로 약 40시간 동안 2㎕/㎖ Staphylococcus aureus 엔테로톡신 B (SEB; 시그마)로 자극시켰다. 세포를 300g에서 10분간 원심분리했다. 펠렛을 PBS, pH 8.4 중의 NHS-LC-바이오틴(1㎎/㎖; Pierce) 200㎕에 재현탁시키고 실온에서 15분간 배양하였다. 세포를 0.5% BSA가 있는 PBS(PBS/0.5% BSA)로 한번 세척하고, 다른 튜브에 놓고 PBS/0.5% BSA로 두번째 세척하였다.
세포를 0.02% NaN3가 있는 PBS/0.5% BSA(PBS/0.5% BSA/NaN3) 200㎕에 재현탁시키고 컨쥬게이트되지 않은 안티- 마우스 IFNγ R46A2(대조구)을 최종농도 10㎍/㎖에 도달할때까지 첨가하였다. 시험샘플에서는 아비딘-컨쥬게이트된 안티-마우스 IFNγ AN 18.17.24를 최종농도 25㎍/㎖에 도달하도록 첨가하였다. 세포를 4℃에서 5분간 배양하였다. 다음엔 세포를 37℃ 및 7.5% CO2속에서 106세포/㎖로, RPMI 1640(37℃) 중의 40% 젤라틴(75 블룸; Sigma)의 페트리접시 속에 10~60분동안 넣었다.
1.5배 체적의 PBS(37℃)를 첨가하고 세포를 2 체적의 PBS(12℃)가 있는 50㎖ 튜브속에 넣었다. 그리고나서, 이 세포를 300g에서 10분간 원심분리했다. 펠렛을 PBS/0.5% BSA/NaN3중의 100㎕ DIG-컨쥬게이트된 R46A2(10㎍/㎖)에 재현탁시키고, 4℃에서 10분간 배양하고, PBS/0.5% BSA/NaN3로 세척하였다. 다음엔 펠렛을 PBS/0.5% BSA/NaN3중의 200㎕ FITC 컨쥬게이트된 양(sheep) 안티-DIG 항체(2㎍/㎖)에 재현탁시키고, 4℃에서 10분간 배양하고, PBS/0.5% BSA/NaN3로 세척하였다. FACS 분석결과는 제13도 및 제14도에 주어져 있다. 선택적으로, 세포의 표면 표지화, 고정 및 세포내 표지화를 수행할 수 있고 PBS/0.5% BSA/NaN3에 재현탁시킬 수 있다.
[결과]
IFNγ의 분비는 41시간 동안 SEB로 생체외 자극된 마우스 비장세포에서 유동세포 계측법에 의해 분석했다. IFNγ는 단지 큰 활성화된 세포(아세포)에서만 생성되기 때문에, 광산란 성질 및 요오드화 프로피듐(PI) 표지화에 따라 살아있는 아세포의 게이팅이 행해졌다(제12도). 세포표면 단백질의 바이오티닐화는 ST-FITC로의 표지화, 포획항체로의 로딩에 의하여, FITC 컨쥬게이트된 염소 안티-래트 IgG로의 표지화에 의하여 조절되었다(제13도). 제13(a)도는 비표지화된 세포의 분포를 나타낸다. 제13(b)도는 바이오티닐화 전에 ST-FITC가 세포를 표지화할 수 있는 능력을 나타낸다. 세포가 ST-FITC에 의해 비특이적으로 표지화되지 않는 것을 주목해야 한다. 제13(c)도는 ST-FITC가 바이오티닐화된 세포를 표지화할 수 있는 능력을 나타낸다. 세포가 완전히 표지화된다는 것을 주목해야 한다. 제13(d)도는 FITC로 표지화된 염소 안티-래트 IgG(GaRIgG-FITC)를 갖는 캐치-항체로 표지화되지 않는 세포의 표지화를 나타낸다. 제13(d)도는 표지화 항체와 세포의 비특이적인 결합이 없다는 것을 보여준다. 제13(e)도는 GaRIgG-FITC를 갖는 아비딘화된 캐치-항체로 표지화된 세포의 표지화를 나타낸다. 제13(e)도는 캐치-항체가 세포에 완전히 결합하는 것을 보여준다.
네가티브 대조구로서, 캐치-항체 없는 세포를 고밀도 배지(HDM, RPMI중의 40% 젤라틴)에서 90분간 배양하고 IFNγ에 대해 표지화시켰다(제14도). 고 대조구로서 HDM에서 40분간 배양한 캐치-항체를 갖는 세포를 4℃에서 10분간 IFNγ 함유 상징액에서 배양한 다음 IFNγ에 대해 표지화시켰다(제14도). 캐치-항체로 표지화된 SEB-자극된 뮤린 SC중에서 HDM에서의 배양후 증가하는 수의 IFNγ 분비세포가 배양시간에 좌우되어 검출되었다(제14도). 추가의 표면 표지화는 이 IFNγ분비 SC를 CD4 + 및 CD8 + T세포로서 확인시켰다. SEB-자극된 T 세포 아세포는 다양한 양의 IFNγ를 분비하여 넓은 분포의 형광강도를 생성하였다(제14도).
제14도는 다양한 조건하에서 αDIG-FITC로 표지화된 세포의 수를 나타낸다. αDIG-FITC는 DIG R46A2-DIG에 커플링된 안티-IFNγ 항체에 결합한다. 제14(a)도는 제로타임에서 캐치-항체의 존재하에 표지화된 세포의 수를 나타낸다. 제14(b), (d) 및 (f)도는 5, 40 및 90분간 배양후 캐치-항체의 존재하에 표지화된 세포의 수를 나타낸다. 일부 세포는 이미 표지화되었고 90분 후에는 점점 더 많이 표지화되는 것을 주목해야 한다. 제14(c)도는 90분 배양후 캐치-항체의 부재하에 표지화된 세포의 수를 나타낸다. 제14(e)도는 배양하는 동안 첨가된 외인성 IFNγ 및 캐치-항체의 존재하에 αDIG-FITC로 표지화된 세포의 수를 나타낸다.
[산업상 이용가능성]
상술한 방법과 조성물은 다양한 수준의 하나 이상의 지정된 물질을 분비하는 세포의 검출 및/또는 분리에 유용하다. 세포는 지정된 생성물의 분비활성을 제외하고는 표현형이 동일할 수 있다. 따라서 이 방법은 상업적으로 가치 있는 물질을 분비하는 세포를 그러하지 않은 세포로부터 분리하는데 이용할 수 있는데, 예컨대 면역원성 폴리펩티드, 성장인자, 호르몬으로 작용할 수 있는 분자, 재조합기술에 의해 생성되는 것을 포함하여 각종 다른 생성물을 분비하는 세포를 분리하는데 이용할 수 있다. 또한, 이 기술은 이식 또는 체내이식과, 또는 체내이식을 위한 패키징에 이용할 세포군의 분리에서 유용할 수 있다. 이러한 세포군 유형의 실례는 랑게르한스섬이며, 여기서는 인슐린을 분비할 수 있는 세포군을 비-분비자인 세포로 부터 분리하는 것이 바람직할 것이다. 세포 혼합물에서 세포의 분비활성의 분포를 결정하는 방법은 비-분비 또는 저 분비 세포 변이체의 형태 또는 변형된 생성물을 생산하는 세포의 형태를 빠르게 식별하는 대규모 발현에서 또한 유용하다.

Claims (66)

  1. 세포에 의해 분비되고 방출되는, 시토카인, 항체, 호르몬, 효소 및 단백질을 포함하는 생활성제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 생성물에 따라 세포를 분리하는 방법으로, 세포의 분리는 상기 생성물로 세포가 표지화되는 정도에 따라 이루어지며, 상기 방법은 세포의 표면을 분비된 생성물에 특이적으로 결합하는 포획부에 커플링시키고 세포를 상기 생성물이 분비, 방출되고 특이적으로 상기 포획부에 결합되는 조건하에서 세포를 배양시키는 단계; 및 결합된 생성물의 기초하에 세포를 분리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분리 전에 상기 결합된 생성물을 표지화시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결합된 생성물을 표지부로 표지화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 표지부는 생성물에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표지부는 형광색소로 염색되고 그리고 상기 분리는 세포 분류(sorting)에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 표지부는 자화(磁化)될 수 있고 그리고 상기 분리는 표지부를 자화시킬 만큼 충분한 세기의 자기장에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 표지부는 약 5 내지 200㎚의 통상적인 직경을 갖는 콜로이드자기(磁氣)입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 포획부는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 이중-특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 커플링이 선택적으로 연결부를 통해서 포획부에 부착된 지질 고정을 통해서 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 커플링이 선택적으로 링커를 통해서 포획부에 부착된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 통해서 커플링이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 커플링이 선택적으로 링커를 통해서 세포 표면상의 성분과 포획부의 직접적인 화학적 커플링을 통해서 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 커플링이 항체와 세포의 특이적인 결합을 통해서 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 세포에 의해 분비되고 방출되는 생성물로 세포를 표지화하는 방법으로, 상기 방법은 세포 표면을 포획부에 커플링시키는 단계; 생성물이 분비 및 방출되고 생성물이 포획부에 의해 포획되는 조건하에서 세포를 배양시키는 단계; 및 상기 세포를 분비된 생성물에 특이적인 표지로 표지화하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 생성물을 표지부로 표지화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 표지부가 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 특이적인 결합 파트너는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 항체가 이중-특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 커플링이 선택적으로 연결부를 통해서 특이적인 결합 파트너에 부착된 지질 고정부를 통해서 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 커플링이 선택적으로 링커를 통해서 특이적인 결합 파트너에 부착된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 통해서 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 커플링이 항체와 세포의 특이적인 결합을 통해서 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 세포에 의해 분비되고 방출되는 생성물을 포획할 수 있는 세포를 포함하는 물질의 조성물로, 세포가 고정부를 포함하도록 변형되고, 그리고 특이적인 결합 파트너가 고정부를 통해 세포의 표면에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 추가로 생성물에 커플링된 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 포획부는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 항체가 이중-특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 선택적으로 연결부를 통해서 포획부에 연결된 지질고정부를 통해서 커플링이 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제22항에 있어서, 선택적으로 링커를 통해서 포획부에 연결된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 통해서 커플링이 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 항체와 세포의 특이적인 결합을 통해서 커플링이 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 세포집단에서 다른 세포와 상대적으로 일정량의 생성물을 분비하는 세포를 확인하거나 계수(計數)하기 위하여 세포집단을 분석하는 방법으로, 세포를 제14항에 따른 방법에 의해 표지화시키는 단계; 포획된 생성물을 표지화시키지 않는 적어도 하나의 추가 표지로 세포를 표지화시키는 단계; 및 추가 표지와 상대적인 양의 생성물 표지를 검출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 세포집단에서 분비활성의 분포를 결정하는 방법으로, 상기 방법은 세포를 제14항에 따른 방법에 의해 표지화시키는 단계; 및 세포당 생성물 표지의 양을 결정하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제14항에 있어서, 추가로 세포당 생성물 표지의 양과 타입을 결정하는 단계로서, 세포 집단에서 분비된 생성물 타입과 각각의 분비된 생성물 타입에 대한 분비 활성의 분포를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 원하는 생성물을 분비하는 세포의 검출에 사용하기 위한 키트로, 상기 세포의 검출은 세포가 생성물에 특이적인 적어도 하나의 표지부로 표지화된 정도에 따라 달성되고, 상기 키트는 적어도 하나의 고정부와 적어도 하나의 포획부로 이루어진 생성물 포획시스템 및 적어도 하나의 표지부를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  33. 원하는 생성물을 분비하는 세포의 검출에 사용하기 위한 키트로, 상기 세포의 검출은 세포가 생성물에 특이적인 적어도 하나의 표지부로 표지화된 정도에 따라 달성되고, 상기 키트는 적어도 하나의 세포타입에 대한 적어도 하나의 항원 인식부위 및 생성물에 특이적인 적어도 하나의 항원 인식부위를 갖는 적어도 하나의 이중-특이적인 항체, 및 적어도 하나의 표지부를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 이중-특이적인 항체 및 적어도 하나의 표지부가 단일 바이알 속에 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 이중-특이적인 항체가 세포 표면 분자를 통해서 세포에 결합하는 것을 특징으로 하는 키트.
  36. 제35항에 있어서, 세포 표면 분자는 천연적으로 존재하는 세포 표면 단백질인 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제35항에 있어서, 세포 표면 분자는 세포 표면 마커인 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제37항에 있어서, 세포 표면 분자는 CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD16, CD15, CD45, 클래스I MHC 분자 및 클래스II 분자, CD34, CD38, CD33, CD56 T 세포 리셉터, Fc 리셉터, β2-마이크로글로불린, 및 면역글로불린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제32항에 있어서, 배양조건은 고 점도 또는 겔 형성 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제39항에 있어서, 배지는 젤라틴, 아가로스, 알긴산, 및 그것의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  41. 제35항에 있어서, 표지부가 항체인것을 특징으로 하는 키트.
  42. 제41항에 있어서, 항체가 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  43. 제42항에 있어서, 검출가능한 표지는 형광단, 방사성 동위원소, 발색단, 및 자기 입자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  44. 제43항에 있어서, 표지부는 형광 활성화된 세포 분류에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 키트.
  45. 제35항에 있어서, 표지부는 제3의 항체에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 키트.
  46. 제45항에 있어서, 표지부는 디곡시게니에 커플링되고 제3의 항체는 디곡시게닌에 특이적인 것을 특징으로 하는 키트.
  47. 제45항에 있어서, 제3의 항체가 검출가능 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  48. 제33항에 있어서, 추가로 생물학적 변형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  49. 제33항에 있어서, 추가로 세포-세포 교차-오염을 감소시키는 포획 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  50. 생성물을 분비하는 세포를 확인하는 방법으로, 혼합된 세포집단을 적어도 하나의 첫번째의 이중-특이적인 항체와 결합시키는 단계 각각의 항체는 적어도 하나의 생성물과 세포표면 분자에 특이적인 결합부위를 갖는 단계, 적어도 하나의 생성물을 세포가 분비하는 데 충분한 조건하에서 그리고 충분한 시간동안 결합물을 배양하는 단계; 적어도 하나의 표지부를 첨가하는 단계; 및 적어도 하나의 표지부를 검출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 추가로 혼합된 세포집단으로부터 생성물을 분비하는 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 세포 표면분자는 천연적으로 존재하는 세포 표면 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 단백질은 세포 표면 마커인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 세포 표면 마커는 CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD16, CD15, CD45, 클래스I MHC 분자 및 클래스II MHC 분자, CD34, CD38, CD33, CD56, T 세포 리셉터, Fc 리셉터, β2-마이크로글로불린, 및 면역글로불린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제50항에 있어서, 배양 조건은 고 점도 또는 겔 형성 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제50항에 있어서, 표지부가 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 항체가 검출가능 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 표지는 형광단, 방사성 동위원소, 발색단, 및 자기 입자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 표지부는 형광 활성화된 세포 분류에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 표지부는 제3의 항체에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 표지부는 디곡시게닌에 커플링되고 그리고 제3의 항체는 디곡시게닌에 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제60항에 있어서, 제3의 항체는 검출가능 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 표지는 형광단, 방사성 동위원소, 발색단, 및 자기 입자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 표지부는 형광 활성화된 세포 분류에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제50항에 있어서, 표지부는 자화할 수 있는 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 표지부는 자화할 수 있는 부분에 커플링된 제3의 항체에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
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