JP3731891B2 - 分泌生成物による細胞の直接選択 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞集団の分析および細胞分離の分野に関するさらに特定すれば、本発明は、細胞表面に繋がれた生成物に対する特異的結合パートナーによりこれらの生成物を捕捉するすることを介して、分泌生成物で細胞を一次標識することに基づく分析手法および分離手法に関する。
背景技術
細胞集団を分析するために、および細胞が産生する生成物に基づいて細胞を分離するために、多くの試みが成されてきた。細胞分析および細胞分離に対するこのようなアプローチは、これらの細胞を評価するのに特に有用である。そしてこれらの細胞、所望の生成物(「生成物」)を分泌し得るか、または比較的この生成物の高分泌型である。これらの方法には、マイクロタイタープレート中でのクローニング、および生成物についての培養上清の分析、寒天中でのクローニング、および位置決定された細胞の生成物の同定方法による分析が含まれる;この同定方法には、例えばプラークアッセイおよびウスエタンブロッティングが含まれる。ほとんどの生成物分泌に基づく細胞の分析方法および選択方法は、細胞の物理的単離の概念を用い、それは、生成物分泌が可能な条件下でインキュベートし、そして細胞の分布をスクリーニングして、この生成物を産生する細胞または細胞クローンを検出する。懸濁液中の細胞では、細胞がこの生成物を分泌した後、この生成物は分泌した細胞を同定し得るマーカーを遊離せず、細胞から拡散する。従って、分泌細胞は、非分泌細胞とこのシステムでは分離され得ない。
他の場合では、分泌細胞および非分泌細胞の両方とも、細胞膜とこの生成物とを会合し得る。このタイプのシステムの例は、モノクロナール抗体を産生するB細胞由来の細胞株である。これらのタイプの細胞株が、蛍光標示式細胞分取器(FACS)、および抗体細胞表面マーカーの存在に依る他の方法により分離されることが報告されている。しかし、細胞表面に天然に会合しているマーカーによって細胞を分析および分離する手順は、分泌細胞の非分泌細胞との分離を正確に同定し得ない、および/または分離するのに用い得ない。さらに、これらのようなシステムは、分泌細胞の量的差異(すなわち、高レベル分泌と低レベル分泌)を同定するのに有用ではない。
細胞からの生成物拡散に関連する問題を解決するのに用いられてきた方法は、細胞からの拡散速度を阻害する培地中に細胞を配置することであった。典型的な方法は、ゲル様培地(寒天)中に細胞を固定化し、次いでブロッティング(例えば、ウエスタンブロット)に依るシステムを用いて生成物の産生について寒天プレートをスクリーニングすることであった。これらのシステムは、多数の細胞を、分泌、非分泌、または分泌量の特性について分析すべき場合には、扱いにくく、そして高価である。
Kohlerらは、抗トリニトロフェニル(抗TNP)特異性を有するIgMを分泌するハイブリドーマ株の変異体が、ハプテンを細胞表面へカップリングすることおよび補体の存在下で細胞をインキュベートすることにより富化されるシステムを記載している。このように、野生型Igを分泌する細胞は自らを殺傷するが、低減した細胞溶解活性を有するIgMを分泌するか、またはTNPに優先的に結合しない細胞は生き残る。KohlerおよびSchulman, Eur.J.Immunol.10:467-476(1980)を参照のこと。
他の公知のシステムでは、細胞を、生成物に結合するビーズを含有するアガロースゲルの微小液滴、および細胞のカプセル化の環境で生成物を分泌させ得る。このような方法はNirら、Applied and Environ.Microbiol.56:2870-2875(1990);およびNirら、Applied and Environ.Microbiol.56:3861-3866(1990)による出版物に開示されている。これらの方法は種々の理由で不十分である。
マイクロカプセル化のプロセスでは、カプセル中の多くの細胞の統計学的な取り込みが起こる結果、低細胞濃度でカプセル化が起こる場合、多数の空のカプセルが生じ、あるいは高細胞濃度でカプセル化が起こる場合、カプセルあたりの細胞が多くなる。この手法により、単細胞または単細胞クラスターを分析および分離するために、大容量では、多くの空のカプセルのため、およびマイクロカプセルのサイズ(50-100μm)のため、比較的少数の細胞で作用するように扱わねばならない。大容量の液滴にした結果、フローサイトメトリー分析および分離を用いるとバックグラウンドの問題が生じる。さらに、このカプセルは細胞分離のために磁性ビーズまたはパンニングを用いて分離し得ない。
蛍光色素のような標識物が直接検出を意図する場合、細胞表面への標識物のカップリングのために、種々の方法が用いられている。例えば、細胞に蛍光色素標識をカップリングするために細胞膜に挿入する疎水性リンカーの使用が、1990年3月8日に公開されたPCT出願WO 90/02334に記載されている。HLAに対する抗体もまた、細胞表面に標識物を結合するために用いられた。このような結合の結果、上記のカプセル化液滴より小さい容積になり、そしてこのような細胞はフローサイトメトリーおよび磁性分離を包含する標準分離手順に便利に用いられ得る。
現在、適切なカップリングメカニズムを用いて細胞表面へ特異的な結合パートナーを繋ぐことにより、細胞生成物が捕捉され得、そして細胞が生成物の存在、非存在、または量に基づいて分類され得ることが見出されている。
発明の開示
本発明は、細胞により分泌される生成物に基づく簡便な分析方法および細胞分離方法を提供する。生成物に対する捕捉分子を有する細胞を提供し、次いでこの生成物は標識として直接用いられ得る。生成物の捕捉分子への結合の結果、「捕捉生成物」を生じる。あるいは、この細胞は捕捉分子を介して生成物に結合し、そして生成物に特異的に結合する標識分子を介してさらに標識され得、それらは、蛍光発色団、放射性同位元素、発色団、または磁性粒子のような慣例的な標識材料で直接的または間接的のいずれかで順に標識される。
標識された細胞は、次いでこれらの標識に基づく標識細胞分取手法を用いて分離または検出され得る。このような手法には、フローサイトメトリー、磁性分離、高勾配磁性分離、遠心分離などが包含される。
従って、1つの局面では、本発明は、細胞により分泌および放出される生成物に従って細胞を分離する方法を包含し、本方法は、上記生成物で標識される程度に従って細胞分離を効果的にすることを包含する。ここで、この生成物での標識は、少なくとも1つの捕捉分子と細胞表面とをカップリングすること;上記生成物が分泌され、放出され、そして上記の捕捉分子に特異的に結合される(「捕捉」または「捕獲」される)条件下で細胞を培養すること;および、捕捉された生成物を標識分子で標識することより達成され;ここで、標識細胞は分離手順の一部として溶解されない。
本発明の他の局面は、細胞により分泌および放出された生成物を捕捉し得る細胞を含有する物質の組成物であり、ここで、細胞表面は捕捉分子にカップリングされる。本発明のさらに他の局面は、上記方法により分離された細胞およびその子孫である。
本発明のさらに他の局面は、細胞により分泌および放出された生成物で細胞を標識する方法である。この方法は、細胞表面を捕捉分子にカップリングさせる工程、および上記生成物が分泌および放出される条件下で細胞を培養する工程を包含する。捕捉生成物は標識分子により別々に標識され得る。
本発明の他の局面は、細胞集団中の他の細胞に関連する種々の量の生成物を分泌する細胞の割合を検定するために細胞集団を分析する方法である。この方法は、上記方法により細胞を標識する工程、この細胞を捕捉生成物を標識しない第2の標識物でさらに標識する工程、および第2の細胞標識物に関する生成物の標識の量を検出する工程を包含する。
本発明の他のさらなる局面は、細胞集団中の分泌活性の分布を測定する方法である。この方法は、上記方法により細胞を標識する工程(すなわち、上記細胞表面を捕捉分子にカップリングする工程、上記生成物が分泌されそして放出される条件下で細胞を培養する工程、および標識分子に細胞を曝す工程)、および細胞に結合する標識分子の量により、細胞あたりの生成物の量を測定する工程を包含する。
本発明のさらに他の局面は、分泌される生成物の分布、および細胞集団中の各分泌生成物の分泌活性を測定する方法である。この方法は、細胞集団中の細胞表面にカップリングすることによる上記方法により、細胞を、検出されるべき各分泌生成物についての捕捉分子で標識する工程;上記生成物が分泌および放出される条件下で細胞を培養し、標識分子で分泌された捕捉生成物を標識する工程、ここで、各分泌された捕捉生成物についての標識分子は識別され得る;および、細胞あたりの生成物の量およびタイプを決定する工程、を包含する方法である。
本発明のさらに他の局面は、所望の生成物を分泌する細胞の検出に用いるキットである。このキットは、ゲル様の粘性度にまでの種々の程度の粘度であり得る生理学的に受容可能な培地、この培地は分泌生成物の産生のための細胞のインキュベーションに用いられる;少なくとも1つのアンカー分子および少なくとも1つの捕捉分子を含む生成物捕捉システム;および試薬の使用指示書を含み、全て適切な容器にパッケージングされる。
本発明の他の局面は、所望の生成物を分泌する細胞の検出および/または分離に用いるキットである。このキットは、細胞と生成物との両方に特異性を有する二価抗体である少なくとも1つの捕捉分子、および少なくとも1つの標識分子を含む。これらの試薬は、好ましくは、同時に捕捉および標識するために単一のバイアル中に配置され得る。試薬の使用指示書もまた含まれるべきである。種々の粘度またはゲル形成能を有する生理学的に受容可能な培地もまた提供され得る。しかし、液相は、サンプル自体により提供され得、これには細胞培養培地、血液、および尿が包含されるがそれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
図1は、ビオチニル基およびパルミトイル基のデキストランへの導入についてのスキームである。
図2は、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルの、塩基性形態の第一アミノ基との反応についてのスキームである。
図3aおよび図3bは、それぞれ、ビオチン化デキストランおよびビオチン化パルミトイルデキストランで処理した細胞へのストレプトアビジンの結合の蛍光標示式細胞分取分析(FACScan)の記録(trace)のフォトコピーである。
図4は、FACScan結果の記録のフォトコピーである:a)フルオロイソチオシアネートで標識したストレプトアビジン(ST-FITC)で処理した非ビオチン化細胞(ネガティブコントロール);b)ビオチン化パルミトイルデキストランで処理し、次いでST-FITCで処理した細胞;c)ビオチン化抗αβ2ミクログロブリン(β2m)とインキュベートし、そしてST-FITCで処理した細胞。
図5は、ビオチン化パルミトイルデキストランおよび捕捉抗体の複合体を有する細胞へのIgMの結合の滴定を示すグラフである。
図6は、捕捉抗体アビジン-ビオチン複合体を有する細胞上のIgMの、各時間での捕捉のFACScan結果の記録のフォトコピーである。パネル(a)、(b)、(c)、および(d)は、それぞれ、10分、30分、1時間、および2時間での記録である。
図7に、培地中のメチルセルロース濃度の捕捉に対する影響を示すFACScanの記録のフォトコピーである。図7aおよび7bは、それぞれ、2.5%および1%のメチルセルロース培地中でインキュベートした細胞による抗体の捕捉を示す。
図8は、2.5%メチルセルロース含有培地中の分泌抗体の捕捉に基づく分離前後の標識細胞のFACScan画像である。分離前の細胞を図8aに示す。図8bは、分離後のネガティブ画分を示す。図8cは、分離後のポジティブ画分を示す。
図9aは、分泌期の間の培養培地中への種々の添加物質の影響を示すFACScan結果の記録のフォトコピーである。図9a、9b、および9cは、それぞれ、培養培地、40%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む培養培地、および20%BSA+20%ゼラチンを含む培養培地中で細胞をインキュベートするときの、細胞上の抗生成物抗体による生成物の捕捉を示す。
図10および11は、捕捉抗体で標識後(10a、11a)、分泌期後(10b、11b)、ならびに磁性分離後の標識細胞のFACScan結果であって、ここで(10c、11c)は磁性画分そして(10d、11d)は非磁性画分である。
図12は、FACS分析のためのマウス脾臓細胞の図13および14についてのゲーティング(gating)を示す。12aは、側方散乱(SSC)に対する前方散乱(FSC)プロットである。12bは、蛍光2に対するプロピジウムヨージド(PI)を示す。線で囲んだ領域は、さらなる分析のためにゲートされた細胞を示す(芽細胞、生存)。
図13は、FITC標識細胞のFACS分析を編集したものである。13aは、非標識細胞のスキャンである。13bは、ビオチン化前にST-FITCとインキュベートした細胞のスキャンである。13cは、ビオチン化後にST-FITCで標識した細胞のスキャンである。13dは、ラットIgGに特異的なFITCにカップリングした抗体(GARIgG-FITC)で染色されているがアビジン化捕捉抗体(ラット)(捕捉抗体-アビジン)に曝されていないビオチン化後の細胞のスキャンを示すネガティブコントロールである。13eは、捕捉抗体およびヤギ抗ラットIgG-FITC(GaRIgG-FITC)に曝された細胞のスキャンである。
図14は、FACS分析のドットプロットを編集したものである。各場合において、横座標はインターフェロンγ(IFNγ)を染色する標識物の量を示し、縦座標は情報を示さない。細胞を、ジゴキシゲニン複合体化ラット抗マウスIFNγ抗体(R46A2-DIG αDIG-FITC)を検出するFITC標識抗ジゴキシゲニン抗体で標識した。14aは、IFNγに特異的な捕捉抗体(捕捉抗体)との0時間インキュベーションで得られた結果である。14bは、捕捉抗体との5分インキュベーションで得られた結果である。14cは、捕捉抗体なしで90分インキュベーションで得られた結果である。14dは、捕捉抗体との40分インキュベーションで得られた結果である。14eは、捕捉抗体を有する細胞を、IFN-γを分泌する細胞から得られる上清(IFNγsup)の存在下でインキュベートするときに得られた結果である。14fは、捕捉抗体との90分インキュベーションで得られた結果である。
発明を実施する態様
本発明は、細胞から分泌される生成物の捕捉のメカニズムを用いる。本方法は、真核生物および原核生物の細胞または細胞凝集物により分泌される生成物が細胞表面で捕捉されることを可能にする。捕捉生成物は、細胞を検出し、分析し、そして所望であれば、生成物の存在、非存在、または存在量にしたがって分類することを可能にする。捕捉手段は、分類すべき細胞に適切な手段によって細胞表面に繋がれている捕捉分子を包含する。本明細書で用いられるように、用語「細胞」は細胞凝集物を包含する;細胞凝集物は所定の分泌生成物を産生しそして当該技術分野で公知である細胞群であり、そして例えばランゲルハンス島を含む。本明細書で用いられるように、同定され得る生成物は細胞により分泌されるあらゆる生成物を含む。このような生成物には、IFNγ、IL1、IL2、IL4、IL10、IL12、TGFβ、TNF、GMCSF、およびSCFなどのサイトカイン、抗体、ホルモン、酵素、およびタンパク質が含まれるが、これに限定されない。
捕捉分子は、適宜連結分子(linking moiety)を介して繋げる手段(「アンカー分子(anchor moiety)」)にカップリングされ得、そしてまた利用し得る捕捉分子の数を増加し、そして、従って生成物の捕捉の可能性を増やす連結分子(例えば、改変デキストラン分子、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドンを含む分枝ポリマーなど)を含み得る。
哺乳類または他の動物の細胞または細胞のプロトプラストのような細胞壁のない細胞については、細胞表面に適切なアンカー分子は脂肪酸のような親油性分子を含む。適切な細胞表面分子の例は、細胞表面に会合するあらゆる分子を含むが、これらに限定されない。適切な分子には、CD45(全白血球)、抗β2ミクログロブリン、CD3(T細胞(活性化))、CD4、CD8、および他のCDマーカーまたは細胞接着分子のような細胞表面マーカーが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、MHC抗原または糖タンパク質のような細胞表面分子に特異的に結合する抗体または他の因子もまた使用し得た。植物細胞、菌類、酵母、または細菌などの細胞壁を有する細胞については、適切なアンカー分子には、例えば抗体またはレクチンを含む細胞壁成分への結合因子が含まれる。
特異的結合パートナーは捕捉分子または標識分子を含む。捕捉分子は細胞および生成物の両方に直接的または間接的のいずれかで結合するものである。標識分子は、生成物に結合するものであり、そして直接的または間接的に標識され得る。特異的結合パートナーは、生成物とその結合パートナーとの間で比較的高い親和性および特異性のあるあらゆる分子を含み、そしてこの分子において、生成物:パートナー複合体の解離が比較的遅いため、生成物:パートナー複合体が標識化または細胞分離手法の間検出される。
特異的結合パートナーは、生成物が結合する基質または基質アナログを含み得るが、これらに限定されない。これらの基質は、ペプチド、ポリサッカライド、ステロイド、ビオチン、ジギトキシン、ジギトニン、および分泌生成物を結合し得る他の分子を含むが、これらに限定されず、そして好ましい実施態様では抗体を含む。捕捉分子が抗体であるとき、「捕捉抗体」または「キャッチ抗体」と呼ばれ得る。本明細書中で用いられるように、用語「抗体」とは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、ハプテンおよび抗体フラグメント、二重特異性抗体および生成物抗原上のエピトープに特異的に結合する抗体同等物である分子を意味する。
二重特異性抗体はまた、二価抗体として公知であり、第1の抗原に対する少なくとも1つの抗原認識部位および第2の抗原に対する少なくとも1つの抗原認識部位を有する。このような抗体は組換えDNA法によりまたは当該技術分野で公知の方法で化学的に生成され得る。化学的に生成される二重特異性抗体は、二価の特性を保持するように還元および修正された抗体、および各抗原に対して少なくとも2つの抗原認識部位を有するように化学的にカップリングされた抗体を含むが、これらに限定されない。二重特異性抗体は、2つの異なる抗原を認識し得る全ての抗体または抗体の複合体、あるいは抗体のポリマー形態を含む。抗体はポリマーまたは粒子に固定化され得る。
本発明の実施において、捕捉分子は種々の方法により細胞膜(または細胞壁)に結合され得る。適切な方法には、タンパク質成分のアミノ基への直接的化学カップリング;タンパク質成分の(ジスルフィド架橋の還元後に形成される)チオールへのカップリング;抗体(抗体のペアを含む)またはレクチンを介する間接的カップリング;疎水性アンカー分子によって脂質二重層に繋げること;およびポリカチオンにより負荷電細胞表面に結合することが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の他の実施態様では、捕捉分子は、2つまたはそれより多い工程を用いて導入される。例えば、捕捉分子をアンカー分子に直接的に(例えばビオチン/アビジン複合体により)あるいは適切な1つまたは複数の連結分子を介して間接的にカップリングさせる少なくとも1つのアンカー分子で細胞を標識することによる。
抗体の細胞表面への直接的化学カップリングの方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、グルタルアルデヒドまたはマレイミド活性化抗体を用いるカップリングを含む。多工程手順を用いる化学カップリング方法は、例えば、ビオチン化、TNPまたはジゴキシゲニンの(例えばこれらの化合物のスクシンイミドエステルを用いる)カップリングを含む。ビオチン化は、例えば、D-ビオチン化-N-ヒドロキシスクシンイミドの使用により行われ得る。スクシンイミド基は、7を超えるpH値、好適には約pH8.0と約pH8.5との間、でアミノ基と効果的に反応する。ビオチン化はまた、例えば、細胞をジチオトレイトール(DTT)で処理した後ビオチンマレイミドの添加により行われ得る。
細胞へのカップリングはまた、細胞表面抗原(「マーカー」)に対する抗体を用いて行われ得る。一般に表面抗原に関する抗体は、107細胞あたり約0.1〜1μgの範囲の抗体が必要であり得る。しかし、この必要性は、生成物に対する抗体の親和性に応じて広く変化し、そして実験的に決定される必要がある。このような決定は当該技術分野では十分である。したがって、抗体の適切な量は実験的に決定されなければならず、そして当該技術分野の範囲内である。これは、細胞タイプ特異的マーカーの発現に特異的な細胞をカップリングさせる。例えば、T細胞またはそのサブセットなどに基づく細胞のクラスは特異的に標識され得る。二重特異性抗体は、細胞または細胞上に配置されたアンカー分子と生成物とに対する抗原認識部位を有し、捕捉抗体として用いられ得る。
捕捉分子、特に捕捉抗体は分泌生成物の量に基づいて選択されるべきである。例えば、ほんのわずかの分子を分泌する細胞については、ほとんどの分泌分子をキャッチするように、高親和性抗体を選択すべきである。あるいは、インキュベーション時間の間に細胞が多くの分子を分泌する場合、より低親和性の抗体がキャッチングマトリックスの速すぎる飽和を防止するために好ましくあり得る。分泌されたタンパク質のレベルに適切な親和性の決定は、実験的に決定され、そして当該技術分野の範囲内である。
リポポリサッカライドの成分として表面上に大量のN-アセチルノイラミン酸を有する細胞は、生理学的pH値で負の電荷を有する。捕捉分子のカップリングは電荷相互作用によるものであり得る。例えば、ポリカチオンを有する捕捉分子は、負荷電細胞に結合する。ポリカチオンは当該技術分野で公知であり、例えばポリリシンおよびキトサンが含まれる。キトサンはβ-(1-4)グリコシド結合により連結したD-グルコサミン基からなるポリマーである。
細胞に捕捉分子をカップリングする他の方法は、細胞表面ポリサッカライドへのカップリングによる。ポリサッカライドに結合する物質は当該技術分野で公知であり、例えば、コンカナバリンA、ジャガイモレクチン、aleuria aurantiaレクチン、ヨウシュチョウセンアサガオレクチン、galantus nivalisレクチン、helix pomatiaレクチン、レンズマメレクチン、および多くの会社(例えば、Sigma Chemical CompanyおよびAldrich Chemical Companyを含む)により供給される他の公知のレクチンを含むレクチンを包含する。
本発明のある実施態様では、捕捉分子は細胞膜への疎水性アンカー分子により細胞にカップリングされる。膜の脂質二重層と相互作用する適切な疎水性アンカー分子は当該技術分野で公知であり、脂肪酸および非イオン性界面活性剤(例えばTween-80を含む)を含むが、これらに限定されない。アンカー分子の挿入による細胞への捕捉分子の結合の欠点は、細胞へのアンカー分子の組み込み率が低いことである。このように、高濃度のアンカー分子がしばしば必要とされる。この後者の状況は、捕捉分子が効果的限定されるかまたは高価な物質(例えば抗体)である場合、しばしば不経済である。
膜に埋め込まれた疎水性アンカー分子の低収量は、これらの分子が比較的限られた量で入手し得る場合にのみ重要である。この問題は、アンカー分子および捕捉分子を含む架橋システムを用いることによって克服され得る。ここで、1つの分子はより入手可能性が高く、架橋システムの2つの部分が互いに高度の特異性および親和性を有する。例えば、1つの実施態様では、アビジンまたはストレプトアビジンは疎水性アンカー分子により細胞表面に結合され、一方捕捉分子はビオチン化抗生成物抗体である。他の実施態様では、細胞表面はジゴキシゲニンで標識され、次いでジゴキシゲニンと生成物との両方に特異性を有する二重特異性抗体で標識される。このアプローチは、連結を形成し得る分子の他のペアとともに用いられ得、例えば、これらの連結は、ハプテンと抗ハプテン抗体、NTAとポリヒスチジン残基、またはレクチンとポリサッカライドを含む。好ましい実施態様は、アンカー分子あたりの捕捉分子の数を増加させることによりシステムを「増幅」させるものである。
1つの例示的実施態様では、分枝状デキストランがパルミチン酸に結合し、こうして利用可能な多様な結合部位が提供される。次にデキストランはビオチンにカップリングされ、生成物に特異的なアビジン複合体化抗体で処理される。
アンカー分子が細胞表面にあらゆる様式でカップリングされる場合、リンカー分子がアンカー分子と捕捉分子との間に用いられ得ることはもちろん本発明の実施態様内であると考慮される。したがって、例えば、アビジン(またはストレプトアビジン)ビオチンリンカー分子は抗体アンカー分子と捕捉分子とを連結し得る。二重特異性抗体システムもまたリンカー分子として作用し得る。
目的の生成物を分泌する能力を有する細胞を分析し、そして所望であれば選択するために、捕捉細胞を含む上記のように改変された細胞は、捕捉生成物を含む細胞に結合させて検出するために十分な量で生成物を産生および分泌させる条件下で、インキュベートされる。これらの条件は当業者に公知であり、特に、適当な温度、pH、およびインキュベーション培地中の塩、成長因子、および基質の濃度、ならびに気相の適当な気体濃度を包含する。高産生細胞と低産生細胞との間を識別することが望ましい場合、インキュベーション時間は、細胞による生成物分泌が依然として直線期である時間となる。適当な条件は実験的に決定され得、そしてこのような決定は当該技術分野の範囲内である。さらに、細胞による分泌は改変され得る。すなわち、生物学的改変因子を用いて上方調節(upregulate)、誘導、または低減される。適切な生物学的改変因子は、分子および他の細胞を含むがこれらに限定されない。適切な分子には、薬物、サイトカイン、小分子、ホルモン、インターロイキンの組み合わせ、レクチン、および他の刺激因子(例えば、PMA、LPS、二重特異性抗体、および細胞機能またはタンパク質発現を改変する他の因子)を含むがこれらに限定されない。
他の細胞は、腫瘍とT細胞との間のような直接的な細胞-細胞相互作用、および生物学的改変因子を分泌する他の細胞の近接により誘導されるような間接的な細胞-細胞相互作用を含むが、これらに限定されない。適切な細胞には、血液細胞、末梢骨髄細胞(PBMC)、および種々の細胞株が含まれるが、これらに限定されない。生物学的改変因子はいつでも添加され得るが、好ましくはインキュベーション培地中に添加され得る。あるいは、細胞は、インキュベーション工程の前に、これらの因子または細胞で予め処理され得る。
インキュベーション条件はまた、産生細胞により分泌される生成物が本質的に他の細胞によって捕捉されないようなものであり、そして非産生細胞と生成物産生細胞とを、または高産生細胞と低産生細胞とを区別することが可能なものである。一般にインキュベーション時間は5分と10時間との間であり、そしてより通常には1時間と5時間との間である。インキュベーション培地は、産生細胞からの分泌生成物の拡散を遅延させる物質を必要に応じて含み得る。液体培地中で生成物の拡散を阻害し、細胞に対して毒性のない物質は、当該技術分野で公知であり、そして、例えば、部分的にまたは完全にゲルである種々の物質(例えば、アルギン酸塩、低融点アガロース、およびゼラチンを含む)を含む。培地の粘度または透過性を変えることによって、特定のサイズの分泌生成物の産生細胞による局在捕捉が調節され得る。培地の分子量サイズ排除は、反応を最適化するように調節され得る。培地の最適な組成物は、実験的に決定され、細胞濃度、生成物の分泌レベルおよび分子量、ならびに生成物に対する捕捉抗体の親和性により影響される。このような決定な当該技術分野の範囲内である。
好ましくは、ゲルはインキュベーション後に溶解されて、細胞分取法により培地から細胞または細胞群を単離させる。したがって、例えば、ゲルは、β-メルカプトエタノールまたはDTTのようなスルフヒドリル還元剤により解離され得るジスルフィド結合により連結され得、あるいは、ゲルは、EDTAのようなキレート剤の添加により溶解される、例えばカルシウムイオンを含む、イオン性架橋剤を含み得る。
好ましい実施態様では、分泌期の間、細胞はゼラチン状培地中でインキュベートされ、そして優先的にゲル中への浸透のサイズ限定は生成物が実質的にゲルに入ることを抑制する。
非特異的細胞の混在(cross-contamination)を抑制するために、粘性のまたはゼラチン状の培地を用いることに代わるまたは追加することは、分泌細胞上の細胞表面捕捉システムにより捕捉されない捕捉生成物のための捕捉システムを提供することである。例えば、この手法は、多くの細胞タイプが生成物を産生する場合または死細胞が特異性なしに大量の望ましくない生成物を放出する場合に、あるいは十分な拡散バリアが細胞間に作製され得ない場合に、用いられ得る。これは、上清からの抗体生成物に複合体化したビーズ(例えばラテックスビーズ)を細胞の周りの培地に添加することにより行われ得る。あるいは、固定化抗体を有するゲルまたは培地から非結合生成物を除去し得る他の分子が用いられ得る。これらの捕獲分子は、これらの望ましくない分子を保持し得るか、または保持されない生成物に結合することにより望ましくない分子が非分泌細胞に結合することを抑制し得る。この「ジャンク(junk)捕捉システム」は、ゲルマトリックス中に固定化されたものからなり得るか、あるいは磁性粒子または他のタイプの粒子に結合し得る。ジャンク捕捉システムの位置およびキャッチングの特徴は、十分な生成物分子が分泌細胞に特異的に結合するように調節されなければならず、こうして非産生細胞のバックグラウンドを最小にする。
分泌期の最後に、細胞は通常さらに分泌するのを抑制するために冷却され、そして(もしあれば)ゲルマトリックスは溶解される。この順序はもちろん逆にし得る。次いで、捕捉生成物を含む細胞は、標識分子で標識される。標識は当業者に公知の任意の方法により行われ得る。例えば、抗生成物抗体は、生成物を含む細胞を直接的にまたは間接的に標識するために用いられ得る。使用される標識は、標識分子の生成物への結合に基づいて細胞が分析されまたは分離されるシステムへの使用に適切なものである。
他の実施態様では、捕捉生成物を含まない捕捉分子が検出され得る。これにより、例えば、ネガティブ分離方法(すなわち、生成物で高度に飽和されていない細胞の検出)により大量の生成物を分泌する細胞の単離を可能にする。細胞は、細胞表面マーカー、細胞タイプ、DNA含量のような細胞パラメータ、細胞状態、または捕捉分子数を含むがこれらに限定されないものを認識する他の物質で標識され得る。
実際の捕捉分子の計測は、例えば、細胞の種々の複合体化可能性によって、これらの分子の変量を補正するために重要であり得る。アンカー分子および捕捉分子を含む生成物捕捉システムを結合する能力が低減または増強された細胞を排除することが、希少細胞の単離のために特に重要であり得る。
標識の存在に基づく細胞集団の分析および細胞分類は、当該技術分野で公知の多くの手法によって行われ得る。細胞は、例えば、フローサイトメトリーまたはFACSにより、分析または分類され得る。これらの手法により、細胞の1つまたはそれよい多いパラメータにしたがって、分析および分類することを可能にする。通常1つまたは複数の分泌パラメータが、細胞の他の測定可能なパラメータと組み合わせて同時に分析され得、これらには、細胞タイプ、細胞表面抗原、DNA含量などが含まれるがこれらに限定されない。データは分析され得、そして細胞は測定されたパラメータのあらゆる式または組み合わせを用いて分類され得る。細胞分類法および細胞分析法は当該技術分野で公知であり、例えば、THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY、第1〜4巻(D.N.Weir編)およびFLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING(A. Radbruch編、Springer Verlag、1992)に記載されている。細胞はまた、例えば、レーザー走査顕微鏡検査法、蛍光顕微鏡検査法を含む顕微鏡検査手法を用いて分析され得る;このような手法はまた画像分析システムと組み合わせて用いられ得る。細胞分類の他の方法は、例えば親和性手法を用いるパンニングおよび分離を含み、プレート、ビーズ、およびカラムなどの固体支持体を用いる手法を含む。
細胞分類のいくつかの方法は磁性分離を利用し、これらの方法のいくつかは磁性ビーズを利用する。種々の磁性ビーズが多くの供給源から入手可能であり、例えば、Dynal(Norway)、Advanced Magnetics(Cambridge, MA, U.S.A.)、Immuncon(Philadelphia, U.S.A.)、Immunotec(Marseille, France)、およびMiltenyi Biotec GmbH(Germany)が含まれる。
好ましい磁性標識方法は、5〜200nmのサイズ範囲、好ましくは10〜100nmのサイズ、のコロイド超常磁性粒子を含む。これらの磁性粒子は、細胞の定量的磁性標識を可能にし、したがってカップリングした磁性標識の量は結合した生成物の量に比例し、そして、この磁性分離法は、種々の量の生成物分泌に対して感度が高い。種々の特異性を有するコロイド粒子は当該技術分野で公知であり、例えばMiltenyi Biotec GmbHを介して入手可能である。免疫特異的な蛍光または磁性リパソームの使用はまた、捕捉生成物の定量的標識に用いられ得る。この場合、リポソームは、表面上の抗体と複合体化した磁性材料および/または蛍光染料を含み、磁性分離は、非産生細胞、低産生細胞、および高産生細胞の間の最適な分離を可能にするために用いられる。
磁性分離は、第2の力を磁性引力と合わせて高い効果をもって行われ得、2つの対立する力の種々の強度に基づく分離を引き起こし得る。代表的な対立する力は、例えば、磁性分離チャンバー中で分離培地に混合された磁性液体により誘起された力、重力、および細胞に関連する培地の流速により誘起される粘着力である。任意の磁性分離法(好ましい磁性分離法は定量的に分離し得る)が用いられ得る。種々の分離方法が組み合わされ得、例えば磁性細胞分離がFACSと組み合わされ得、分離の質を向上させ、あるいは複数のパラメータによる分類を可能にし得る。
好ましい手法は、高勾配磁性分離(HGMS)、磁場に置かれたチャンバーまたはカラムに磁性材料を選択的に保持する手順を含む。この手法の1つの適用では、生成物は磁性粒子に結合させることにより標識される。この結合は一般に生成物と標識分子との会合を介し、この標識分子は、複合体化のための官能基を提供する磁性粒子上のコーティングと複合体化する。次いで細胞と会合しそして磁性標識とカップリングする生成物は、チャンバーに置かれる液体中に懸濁される。チャンバーを横切るように供給された磁性勾配の存在下で、磁性標識された細胞はチャンバー内に置かれ;チャンバーがマトリックスを含む場合は、マトリックスと会合する。磁性標識のみを有さないまたは少量のみ有する細胞は、チャンバーを通過する。
次いで、保持された細胞は、磁場の強度を変えることにより、または磁場を取り除くことにより、あるいは磁流を導入することにより、溶出され得る。捕捉生成物の選択性は、磁性粒子に直接的または間接的のいずれかに複合体化した標識分子により、あるいは一次抗体と一次抗体を認識する磁性粒子とを用いることにより、供給される。磁場が横切って適用されているチャンバーはしばしば、適切な帯磁率の材料のマトリックスとともに提供されて、マトリックスの表面に近い量で、チャンバー内に局在した高磁場勾配を誘起する。これは、かなり弱い磁性化粒子の保持を可能にする。種々のHGMSシステムを記載している公開物は当該技術分野では公知であり、例えば、米国特許第4,452,773号、米国特許第4,230,685号、PCT出願WO 85/04330号、米国特許第4,770,183号、およびPCT/EP89/01602号を含み;システムもまた米国特許出願第07/291,177号および米国特許出願第07/291,176号に記載されており、これらは同一出願人によるものであり、そして本明細書中に参考として援用されている。
上記からわかるように、本発明により具体的に示されたプロセスは、以下の工程を包含する:
a.アンカー分子を、生成物を分泌すると考えられる細胞の表面にカップリングする工程;
b.アンカー分子に、分泌生成物を捕捉する捕捉分子をカップリングする工程;
c.細胞をカップリングした捕捉分子とともにインキュベートして、生成物が捕捉分子に結合する条件下で生成物の合成および分泌をさせる工程;および
d.捕捉生成物を標識分子で標識する工程。
さらに、他の実施態様では、このプロセスはもしあれば捕捉生成物を含む細胞を標識する工程を包含する。他の実施態様はまた、もしあれば標識細胞を検出するために細胞群を分析する工程、および所望であれば、もしあれば標識細胞を分類する工程を包含し得る。
本発明のプロセスは、種々の細胞タイプを分析および/または分離するために用いられ得る。例えば、高レベルの抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を検出および選択することに用いられ得る。
このタイプのハイブリドーマ細胞の選択のためのプロセス例は次のとおりである。細胞は、親油性のアンカー分子を介する細胞へのジゴキシゲニンのカップリングにより、または化学カップリングにより、ジゴキシゲニンアンカー分子を含むように改変される。捕捉分子は、抗ジゴキシゲニン抗体または抗体フラグメントに複合体化したラット抗κまたはラット抗λモノクローナル抗体を介して細胞に連結される。連結された捕捉分子を有する細胞は、モノクローナル抗体を分泌させるようにインキュベートされる。分泌生成物抗体を捕捉する細胞は、ラット抗マウスIgG1またはIgG2a+bモノクローナル抗体とのインキュベーションにより、標識分子で標識される。生成物の表面結合形態を認識しない抗クラス抗体は、発現生成物が天然に細胞表面と会合している場合、有利である。
高分泌細胞の選択は、多段階で行われる。各分離プロセスは、細胞分離プロセス、すなわち、種々のレベルの結合生成物を区別する定量的磁性分離システム、またはFACSの使用を包含する。最も高い標識を有する細胞(最終的にはさらなるパラメータを用いて、細胞対細胞ベースに基づいて標準化される)は、分類されそして再度培養で拡張させる。磁性分離およびFACS分離は組み合わされ得る。
FACS分離は、細胞が元来標識されているのとは異なる蛍光色素を用いて、捕捉分子の量についてさらに細胞を標識し、次いで、抗体量に対して高い割合の生成物量を有する細胞を選択することにより優先的に行われる。107〜1010細胞の高い細胞数を用いる多段階分離により、異常に高レベルの産生および遺伝的安定性を示す希少遺伝的変異体を単離させる。異常な形態の生成物を産生する細胞の選択を避けるために、種々の標識分子が、種々の分離段階の間、用いられ得る。
同様のアプローチを用いて、所定の特異性を有するハイブリドーマがまた、検出および選択され得る。多くの細胞数で選択プロセスを用いることにより、より高い親和性または特異性を有する希少遺伝的異体が得られ得る。クラススイッチ変異体は、種々の抗クラス抗体を用いて単離され得る。一般に、このアプローチは、所望の特異性を有する抗体のほとんど全ての種類の変異体の単離に用いられ得る。
特定の物質をコードする遺伝子の同定および単離、ならびに特定のタンパク質(特定の融合タンパク質、サイトカイン、成長ホルモン、ウイルス性タンパク質、細菌性タンパク質などを含む)を産生する細胞の単離はまた、本発明のプロセスを用いて行われ得る。例えば、特定のタンパク質を産生する細胞を選択することが望ましい場合、細胞は、分泌形態で目的のタンパク質をコードする発現ベクターの導入により、遺伝学的に改変され得る。細胞は、アンカー分子および生成物に特異的な捕捉分子を含む生成物捕捉システムの導入により改変され、そして細胞は生成物を分泌させる条件下で増殖する。捕捉生成物を含む細胞は標識され、そして標識の存在に基づいて1回またはそれより多い段階の分離がなされる。
このような分泌生成物を生じる人工的に導入された遺伝子を発現する細胞の分離は、患者の細胞が体から取り出されて、特定の生成物(例えばサイトカイン)の分泌を生じる遺伝子で形質転換される、遺伝子治療法に特に有用である。次いで、この形質転換細胞は患者に戻される前に非形質転換細胞から単離される。現在用いられている方法は、煩雑であり、そして時間がかかる。細胞は、目的のタンパク質を発現する遺伝子だけでなく、マーカータンパク質を発現する遺伝子でもまた形質転換される。現在の手法はマーカータンパク質としてβ-ガラクトシダーゼを利用し、したがって、細胞はX-galの存在下で培養されなければならず、そして青色になる細胞は精選されて患者に戻される。この困難性のみならず、その結果これらのしばしば重篤な疾病患者の処置の前にひどく時間延長することになる。本明細書に記載の方法を用いて、形質転換細胞は形質転換後すぐに分離されて、患者に直ちに戻され得る。この分離はまた、細胞が形質転換されて目的のタンパク質を発現していることをを確実にするために、マーカータンパク質よりも目的のタンパク質の分泌に基づくものであり得る。
本発明のプロセスはまた、例えば、白血球、骨髄細胞、浮遊腫瘍細胞、または組織細胞を含む混合物のような複合細胞混合物中で、定性的および定量的な分泌パターンを同時に分析するためにも用いられ得る。この場合、混合物中の細胞は、細胞特異的マーカーで標識され、そしてまた検出されるべき生成物に対する捕捉分子で標識された。細胞はまた、特異的細胞マーカーに対する少なくとも1つの抗原認識部位および検出されるべき生成物に対する少なくとも1つの抗原認識部位を含む、二重特異性抗体で標識され得た。
分泌期の後、細胞はフローサイトメトリーおよび/またはイメージ分析で用いられるような多パラメータ分析を受け、そして結果は当該技術分野で公知の多次元統計方法で解析し、そしてフローサイトメトリーおよびイメージ分析データの解析に用いた。分析により生物学的改変物と特異的に反応性である細胞を決定する場合、分析されるべき細胞は、フローサイトメトリーまたはイメージ分析による解析前のインキュベーション時間の前および/または間に、これらの生物学的改変物に曝され得る。これらのような方法は、例えば、種々の細胞集団中のインターロイキン生成物のレベルおよびタイプを測定するための、および腫瘍細胞集団中の増殖因子の放出を測定するための、医学における種々の診断応用に、潜在的に価値がある。
所望の生成物の分泌細胞の検出に用いる試薬は、便利なようにキットの形態でパッケージされ得ることが考慮される。
キットは、例えば、必要に応じてゼラチン状細胞培養培地の調製に使用するための1つまたはそれより多い材料、ここで培地は所望の分泌生成物の産生のための細胞インキュベーションに用いられる;アンカー分子および捕捉分子を含む生成物捕捉システム;標識分子;および試薬の使用指示書を含む。全ての試薬は適当な容器にパッケージされる。
キットはまた、次のものを含むように処方され得る。この場合、全ての試薬は、好ましくは細胞が添加される単一のバイアル中に置かれる。特定の細胞表面構造またはアンカー分子および生成物に対して二重特異性である少なくとも1つの抗体。少なくとも1つの標識分子および適宜に生物学的改変物。
標識分子は、蛍光染色した抗生成物抗体であり得、これは、磁性ビーズ複合体化抗体、コロイドビーズ複合体化抗体、FITC複合体抗体、フィコエリトリン複合体化抗体、PerCP複合体化抗体、AMCA複合体化抗体、蛍光粒子複合体化抗体、またはリポソーム複合体化抗体を含み得るが、これらに限定されない。あるいは、標識分子は本明細書に記載のものを含むあらゆる適切な標識であり得るが、これらに限定されない。
必要に応じて、キットは生理学的に受容可能な緩衝液を含み得る。このような緩衝液は当該技術分野で公知であり、BSAを含むおよび含まないPBS、等張生理食塩水、細胞培養培地、および特定の細胞タイプに必要な任意の特別な培地を含むが、これらに限定されない。交差標識を低減し、そして細胞の周りの局所的生成物濃度を上昇させる緩衝液が用いられ得る。緩衝液は、粘度を上昇させるまたは透過性を減少させる因子を含み得る。適切な因子は本明細書に記載されている。培地の粘度は、生理学的に受容可能な緩衝液、熱溶解、EDTA、および酵素での分解を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知のあらゆる方法により、分析前に低減され得る。添加培地の非存在下では、培地に既に懸濁されている細胞は直接バイアル中に添加され得る。適切な細胞懸濁液は、細胞株および生物学的サンプルを含むが、これらに限定されない。生物学的サンプルには、血液、尿、および血漿が含まれるがこれらに限定されない。
別の構造物が、細胞の混在を減らすために非結合生成物のキャッチングのために添加され得、それによって産生細胞から離れる生成物の拡散を低減し得る。これらには、ゲル成分、ビーズ、磁性ビーズ、ポリマーに固定化された抗生成物抗体が含まれるが、これらに限定されない。
生物学的改変物はまた、特定の分泌を誘起するために緩衝液または培地に添加され得る。抗体(磁性または蛍光標識されている)のような別の標識分子もまた存在し、これには、細胞タイプを同定するための抗細胞表面抗体、死細胞を標識するためのプロピジウムヨージド、および特定の細胞タイプを標識するための磁性ビーズが含まれるが、これらに限定されない。
この実施態様では、全ての材料はバイアルのような単一の容器中に置かれ得、そして細胞サンプルが加えられる。内容物をインキュベートして、生成物を分泌させ、続いて生成物を捕捉し、そして生成物に標識分子を結合させる。次いで、生成物を分泌および結合した細胞は、捕捉生成物の存在、非存在、または量に基づいて分離および/または分析され得る。分離は当該技術分野で公知のあらゆる方法により行われ得、単純希釈、赤血球溶解、遠心分離-洗浄工程、磁性分離、FACS、およびフィコール分離を含むが、これらに限定されない。細胞の分析には、FACS、イメージ分析、細胞学的標識、およびイムノアッセイが含まれるが、これらに限定されない、種々の方法により行われ得る。
以下に示すように、実施例において、所定の生成物を分泌する細胞は、特異的結合パートナーの存在下でインキュベーションの時間内に同されしそして分類され得る。したがって記載のキットは診断適用に使用するのに適切である。例えば、適切な診断適用には、免疫不調節(disregulation)、遺伝的欠損、および癌分類が含まれるがこれらに限定されない。
以下に記載の実施例は例示の目的のみで提供され、そして本発明の範囲を限定するものではない。本開示を考慮すると、請求の範囲内での多くの実施態様が当業者には明らかである。
実施例
実施例1
本実施例の目的は、外面的に同じ細胞の混合物から所定の生成物を分泌する生細胞を分離することである。B.1.8.ハイブリドーマ細胞株およびX63. Ag 8 6.5.3.ミエローマ細胞株を試験システムとして用いた。約60%のB.1.8.細胞はIgMを分泌し;ミエローマ株はタンパク質を分泌しない。分泌細胞をB.1.8.細胞から、およびB.1.8.細胞とAg 8 6.5.3.細胞との混合物から分離すべきであった。これを達成するために、細胞表面上において細胞により分泌された生成物を捕捉し、細胞表面上に生成物を保持し、このようにして問題の細胞を標識する手順を開発した。捕捉抗体を、2工程で結合した:1)細胞のビオチン化;および2)アビジン-ビオチンカップリング反応による捕捉抗体の結合。次いで、標識細胞を細胞混合物から分離した。
ビオチン化パルミトイルデキストランでの
細胞表面のビオチン化
目的は、ビオチニル基と細胞膜に埋め込まれている脂肪酸基とを有する巨大高分子であるアンカー分子の合成であった。
疎水性ビオチンの合成
3×106g/molの分子量を有するデキストランをキャリア分子として用いた。ビオチニル基と脂肪酸基との両方をポリサッカライドにカップリングし得るために、まず、反応性の第一アミノ基をデキストランに導入した。
次いで、ビオチニル基およびパルミトイル基を、ビオチンおよび脂肪酸エステルをカップリングするのに用いたようないくらか改変した方法により、タンパク質のアミノ基に導入すべきであった。図1は、ビオチニル基およびパルミトイル基のデキストラン上への導入についてのスキームを示す。
アミノデキストランの合成
アミノ基を、カルボジイミダゾールでの活性化および標準的方法を用いるジアミノヘキサンとの反応により、デキストラン分子中に導入した。アミノデキストランをSigma Corp.からおよびMolecular Probes(Oregon)から得た。3×106g/molの分子あたり165±20個のアミノ基を有するアミノデキストランを得た。デキストランの重合化が副反応として起こる。非重合化生成物の収率は、開始デキストランの94%に達した。
Duboisにより記載された方法を用いてデキストラン濃度を測定した。80%フェノール水溶液5μlを、100μlの測定すべきデキストラン溶液とともに試験管中に入れた。1mlの濃硫酸をこの混合物中に迅速に滴下した。10分後、この処方物をさらに10分間30℃で水浴中に置いた。デキストラン濃度は480nmでの吸光を測定することにより決定した。
ビオチン化アミノデキストランの合成
ビオチニル基のデキストランへの導入を、ビオチン化試薬としてD-ビオチン化-N-ヒドロキシスクシンイミドを用いて行った。スクシンイミド基はpH7より高いpH値でアミノ基と効果的に反応する。図2は、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルと、塩基形態での第一アミノ基との反応についてのスキームである。対応するN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを用いて、デキストランにビオチニル基とパルミトイル基との両方を導入した。この図において、R'はデキストランを示し、そしてRはビオチニル基またはパルミトイル基のいずれかを表す。
ビオチン化パルミトイルデキストランの合成
パルミチン酸基をビオチン化デキストランとカップリングした。この反応を、パルミトイル基を抗体とカップリングするためのわずかに改変した手順により行った(Huangら、J.Biol. Chem. 255:8015-8018(1980))。カップリングは、パルミチン酸のNHSエステルにおけるデキストランのアミノ基の求核付加による上記のビオチン化と同様に起こる。
細胞のビオチン化パルミトイルデキストランでのビオチン化
リポポリサッカライド、ビオチン化パルミトイルデキストランの、細胞に結合してそれにより細胞表面をビオチン化する能力を、ヒトリンパ球で試験し、そしてパルミトイル基のないビオチン化アミノデキストランの結合と比較した。
細胞を、20℃で遠心分離し、そしてPBS中1mg/mlのビオチン化デキストランまたはビオチン化パルミトイルデキストランのいずれかとともに(107細胞について100μl)37℃で10分間インキュベートした。次いで、1mlのPBS1% BSA(PBS/BSA)を加え、そして3分後に細胞を氷上で14mlのPBSで洗浄した。処理細胞をPBS 0.03%アジ化ナトリウム(PBS/NaN3)中に取り出した。
ビオチン化デキストランまたはビオチン化パルミトイルデキストランによる細胞のビオチン化を、細胞のストレプトアビジン-FITC(ST-FITC)での標識によりモニターした。より詳細には、処理細胞を洗浄し、そして107細胞あたり100μlのPBS中に取り出した。PBS中100μg/mlのST-FITCを1μl加えて、この混合物を氷上で5分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、107細胞あたり1mlのPBS/BSA中に取り出し、そして蛍光強度をビオチン化の尺度としてFACScanで測定した。
ビオチン化デキストランおよびビオチン化パルミトイルデキストランで処理した細胞へのストレプトアビジンの結合のFACScanの結果を、それぞれ図3aおよび図3bに示す。結果からわかるように、ビオチン化デキストランとインキュベートした細胞はST-FITCを結合しなかった。これに対して、ビオチン化パルミトイルデキストランとインキュベートした細胞は大量のST-FITCを結合した。
β2ミクログロブリン(B2m)に対するビオチン化抗体で標識した細胞により結合したST-FITCの量とビオチン化パルミトイルデキストラン標識細胞により結合したST-FITCの量との間で比較を行った。用いた抗体はαβ2mであり、これはβ2mに結合する抗体である。図4はFACScan結果の記録を示す:a)ST-FITCで処理した非ビオチン化細胞(ネガティブコントローラ);b)ビオチン化パルミトイルデキストランで処理し、次いでST-FITCで処理した細胞;c)ビオチン化αβ2mでインキュベートし、そしてST-FITCで処理した細胞。図4の結果は、ビオチン化パルミトイルデキストランで標識した細胞は、αβ2m-ビオチン複合体よりもより多いストレプトアビジンを細胞表面に結合し得ることを示す。
細胞の抗体標識は飽和に達するが、ビオチン化パルミトイルデキストランによる標識は標識試薬の濃度とともに直線的に増加する。しかし、試薬の濃度が高すぎると、細胞への障害により標識は制限される。細胞のビオチン化が37℃で10分間約1mg/mlのビオチン化パルミトイルデキストランで行われたとき、顕微鏡下では細胞表面の変化は観察されなかった;前方および側面の分散光でのFACScanで測定される、細胞表面の光散乱特性は、未処理細胞と比較して変化はなかった。処理細胞は生存力を維持し、そして再度培養し得た。
ビオチン化細胞への捕捉抗体のカップリング
捕捉抗体を、アビジン-ビオチン架橋を介してビオチン化パルミトイルデキストランでビオチン化した細胞とカップリングした。これを行うために、捕捉抗体をアビジンと複合体化し、そしてこの複合体をビオチン化細胞と反応させた。
2つの抗体、ラット抗マウスIgM(R33.24.12)、およびマウスIgM(λ)上の種々のエピトープに対するマウスλ(LS136)に対するマウスκをアビジンにカップリングした。
アビジンは、数個の反応性アミノ基を有する塩基性タンパク質である。スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)を用いてアビジンを捕捉抗体にカップリングした。SMCCは二価のリンカー分子であり、そのマレイミド基は選択的にチオールと反応し、そしてそのスクシンイミジル基は選択的に第一級アミンと反応する。捕捉抗体をDTTで還元した。DTTは緩和な還元剤であり、適切な条件下で抗原結合部位を破壊せずにIgG分子の1〜4のジスルフィド架橋をチオールに還元する。反応性マレイミド基をアビジンのアミノ基にSMCCで導入した。アビジンのマレイミド基を還元抗体のSH基と反応させた。アビジンおよび捕捉抗体をシクロヘキサン架橋を通してこのように結合した。
より詳細には、1.5μlのDDTの1モル濃度溶液を、5mM EDTAを含むPBS(PBS/EDTA)の200μl中のIgGクラスの抗体1mgに添加した。室温で1時間反応後、還元抗体をSephadex PD10カラム上に置き、1mlのPBS/EDTAで溶出した。抗体分子あたりに導入されたチオール基の数を測定した。所望の範囲は、抗体分子あたり約2〜6個のチオール基である。
同時に、1mgのアビジンを100μlの炭酸緩衝液pH=9.4に溶解し、そして7.5μlのDMSO中の125μgのSMCCを添加した。室温で1時間後、タンパク質をSephadex PD10カラムで精製し、そして500μlのPBS/EDTA中に取り出した。
1mlのPBS/EDTA中の1mgの還元抗体を、200μgのPBS/EDTA中の400μgの活性化アビジンと合わせて、4℃で一晩放置した。反応を5μlの1M N-エチルマレイミドを添加することにより停止した。
アビジン標識捕捉抗体のビオチン化細胞へのカップリング
ミエローマ細胞とハイブリドーマ細胞との混合物を用いた。IgMを分泌するB.1.8.ハイブリドーマ細胞および非産生X63.Ag 8 6.5.3.ミエローマ細胞を水蒸気で飽和した大気中で37℃で増殖した。培養培地は、RPMIおよび5%ウシ胎児血清(FCS)、100IU/mlのペニシリン、および0.1mg/mlのストレプトマイシンを含んだ。
細胞混合物を上記の条件を用いてビオチン化パルミトイルデキストランでビオチン化した。
抗体-アビジン複合体をビオチン化細胞にカップリングするために、PBS/1%BSA中で洗浄後、ビオチン化細胞を、アビジン-捕捉抗体複合体とともにインキュベートした。PBS中の1mg/mlの捕捉抗体-アビジン複合体溶液の1μlを、100μlのPBS/NaN3中の107個のビオチン化細胞に添加した。氷上で10分後、ビオチニル基を捕捉抗体で飽和し、そして細胞を捕捉抗体に載せた。
細胞表面上のアビジン-抗体複合体の存在を検出するために、蛍光抗-抗体を用いて、FACScanにより蛍光標識を検出した。ビオチン化細胞の標識にほぼ対応する細胞の、蛍光ストレプトアビジンでの標識を、同様の研究で行った。細胞集団の均一な標識が観察された;全ての細胞は、その表面上にほとんど同じ量の捕捉抗体を有した。
細胞表面上の捕捉抗体の機能性試験
捕捉抗体を提供する約107細胞を、100μlのPBS/BSA中(タンパク質を分泌しないように)氷上で、捕捉抗体により捕捉される種々の濃度のマウスIgMとともにインキュベートした。5分のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、そして捕捉IgMをR-PE複合体を抗体標識として用いて細胞表面上で検出した。検出はFACScanで行った。図5に滴定曲線を示す。図において、細胞の蛍光(平均)が、細胞がともにインキュベートされたIgM濃度に対してプロットされている。これらの結果は、細胞表面上の捕捉抗体が依然として完全な結合部位を有することを示す。培地中の低IgM濃度に対する捕捉抗体の感受性もまた認識し得る。示した滴定曲線を捕捉抗体としてR33.24.12を用いて得た。捕捉抗体LS136を後に示す捕捉実験に用いた。後者は培地中の低IgM濃度への感受性が幾分高いことを示した。
分泌IgMの捕捉
ビオチン化B.1.8.細胞およびX63細胞の混合物を捕捉抗体と複合体化し、培地中で種々の長さの時間37℃で7.5% CO2環境下に保持した。次いで、その表面上に捕捉されたIgMを抗体標識により検出した。
図6は、得られた標識をFACScanの図として示す:捕捉試験の持続時間(6a)10分;(6b)30分;(6c)1時間;および(6d)2時間。2つの集団は、30分後に区別され得、異なる量のIgMを捕捉している。分泌細胞により培地へ放出されるIgMが非分泌細胞上の捕捉抗体に取り込まれるため、2つの集団間の差は、長いインキュベーションの後消失する。
拡散阻害剤を用いる分泌されたIgMの捕捉
あまり強くなく標識された細胞集団もまたその表面上に迅速にIgMを取り込むことが、上記の例示から明らかであり得る。このバックグラウンドの標識は培養培地中の分泌されたIgMから生じ、これは分泌細胞上の捕捉抗体により捕捉されていない。捕捉実験がより粘性な培地中で行われる場合、このバックグラウンド標識は低減され得る。2.5%メチルセルロースを含む培養培地を用いた;この培地はゲル様粘性度を示す。
捕捉抗体を載せた細胞を2.5%メチルセルロースまたは1%メチルセルロースを含む培養培地に混合した。細胞の洗浄は不必要および余計であった;細胞に結合していない捕捉抗体-アビジン複合体は妨害しない。107細胞に対して2mlの培地を用いた。溶液中に適切にメチルセルロースを入れるために、1日前に培養培地を混合した。培地を37℃まで余熱し、細胞を添加して、7.5%CO2で37℃で25〜45分間インキュベートした。これらの条件下で、ハイブリドーマ細胞は生成物を分泌した。インキュベーション時間の後、高粘度培地を45mlの冷PBS/BSAで希釈した。細胞を4℃で遠心分離して、100〜500μlのPBS/BSA中に取り出した。メチルセルロースの残渣は細胞懸濁液の粘度を上昇させた;細胞もそれに続く標識工程も、これにより害されなかった。
図7は、培地中のメチルセルロース濃度の捕捉に対する影響を示す。この実験の細胞は2.5%メチルセルロース中で35分間でIgMを産生し、次いで洗浄され、R33.24.12. R-PEで標識された。図7aおよび7bは、それぞれ2.5%および1%のメチルセルロース培地中でインキュベートした細胞による抗体の捕捉を示す。この結果は、分泌細胞および非分泌細胞を、2.5%メチルセルロース培地中での捕捉に基づいてうまく区別したことを示す。
二重標識
上記の捕捉実験後にその細胞表面上にIgMを有する細胞が、実際にIgMを分泌する細胞であることを示すために、細胞を、R33.24.12. R-PEを用いて捕捉実験後に表面に赤く標識し(蛍光2としてFACScanで可視化)、固定し、そしてR33.24.12.-FITCを用いて細胞質にグリーンで標識した(蛍光1としてFACScanで可視化)。このように2回標識した細胞を顕微鏡下でおよびFACScanで検査した。
捕捉実験後に細胞表面上にIgMを有する細胞が分泌細胞である事実を、FACScanの蛍光1および2の二次元表示としてこの二重標識により示した。捕捉実験後のB.1.8.細胞を、捕捉したIgMに対する表面に赤く標識し(蛍光2.としてFACScanで可視化)、次いで固定し、そしてIgMに対する細胞質にグリーンで標識した(蛍光1.としてFACScanで可視化)。全ての表面標識細胞もまた細胞質に標識される。
この結果は、IgMを産生しない全ての細胞もまた、表面標識されていない細胞集団に属することを示した。細胞質-ポジティブ細胞を2つの画分に分けた;一方では、細胞画分は表面上および細胞質中の両方で標識された。これらは明らかに分泌細胞であった。他方では、細胞画分は細胞質中で標識されたが細胞表面上では標識されなかった。この集団はフィコール勾配(固定化の直前に行った)により分離し得なかったので、これらは死細胞ではなかった。この細胞集団のいくつかの細胞はまた、分泌細胞ほどは強くは細胞質中で標識されなかった。2つの他の細胞集団と比較して、この画分がより広く分散することもまた著しかった。これらの細胞はIgMを産生したが、このタンパク質を分泌する能力を明らかに失っていた。二重標識細胞をコントロールとして顕微鏡下で観察した。この実験はFACScan表示の結果に一致することを示した。
MACSの細胞分離
約107のB.1.8.細胞およびX63細胞の1:1混合物での分泌IgMの捕捉後、細胞表面上の捕捉したIgMに結合する磁性粒子を用いて、磁性細胞分取システム(MACS)で分離を行った。MACSシステムおよび磁性粒子をMiltenyi Biotec GmbH(Germany)から得た。
IgM分泌細胞および非分泌細胞の混合物を本研究で開発した分泌されたIgMを捕捉するためのマトリックスとともに提供し、そして2.5%メチルセルロースを含む5mlの培養培地中で25分間、7.5%CO2環境中で37℃に保存した。細胞を45mlのPBS/BSAで洗浄した。ペレットをゲル様粘性度のメチルセルロースの残渣で処理した。これを500μlのPBS/BSA中に取り出し、5μlのラット抗マウスIgM磁性ビーズ(Miltenyi Biotec GmbH)を添加した。氷上で5分後、10μg/mlのR-PE-カップリングしたR33.24.12抗体を添加して、この混合物をさらに5分長く氷上に保存した。
このようにして予め処理した約107個の細胞をMACSのタイプA1分離カラム(Miltenyi Biotec GmbH)に置き、そしてネガティブ画分を5℃で10mlのPBS/BSAで溶出した。磁場からカラムを取り出した後、ポジティブ細胞画分を10mlのPBS/BSAで溶出した。
IgMに関連する細胞表面標識された赤い部分を、分離の前後について図8に示す。分離前の細胞懸濁液は、58.8%の非標識細胞および41.2%の標識細胞を含んでいた。分離後、ネガティブ画分は、89%の非標識細胞と11%の標識細胞とを含んでいた。ポジティブ画分は、23%の非標識細胞と77%の標識細胞とを含んでいた。分離後のポジティブ細胞の濃度を、次式:
濃度係数=(ポジティブ画分中のポジティブ細胞%*出発細胞混合物中のネガティブ細胞%)/(出発画分中のポジティブ細胞%*ポジティブ画分中のネガティブ細胞%)を用いて計算すると、4.8の濃度因子が得られる。
分離後、細胞は、プロピジウムヨージド(死細胞を選択的に標識する染料)で標識され得ず、再度培養され得た。分離した細胞画分の生存力を、分離後1週目に顕微鏡下で調べた。分離工程中の細胞損失は測定しなかった;通常、関連する細胞損失は、MACSでの分離では起こらない。
図8は、分離前後の標識細胞のFACScan表示である。分泌されたIgMを捕捉した後、細胞をその表面でIgMに対して標識し、そしてIgMに対して磁性粒子を用いるMACSで分離した。分離前の細胞を図8aに示す。図8bは、分離後のネガティブ画分を示す。図8cは、分離後のポジティブ画分を示す。中央の破線の右側の細胞は標識され、中央の破線の左側の細胞は標識されていないと考えると、これらの細胞画分は、以下の量の標識細胞と非標識細胞を含んでいた:
上記の研究は、以下の一般的手法を含んでいた。
細胞の抗体標識
細胞をPBS/BSA中に取り、そして遠心分離によりペレットにした。上清を吸引により除去し、そしてペレットを抗体標識溶液に再懸濁した。107個の細胞あたり、PBS/BSA 0.1% NaN3中に10〜100μg/mlの抗体を含有する100μlの標識溶液を使用した。カップリング反応を、氷上で5分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄した。
フィコール密度勾配遠心分離
フィコール密度勾配遠心分離を用いて、死細胞を除去した。細胞懸濁液を5mlのフィコール(Pharmacia LKB, Uppsala, Sweden)で注意深く下層(underlayerd)にし、次いで室温にて2500rpmで遠心分離した。生細胞はフィコールクッション(Ficoll cushion)上に残存し、これを吸引により採取した。
細胞質の標識
0.5%のサポニンと10μg/mlの標識抗体をPBS/BSA中の固定した細胞に加えた。サポニンは、細胞膜に直径約10nmの可逆性チヤンネルを生成し、その結果、抗体は細胞内に貫入し得る。1時間反応後、細胞をPBS/BSA 0.5%サポニン(1ml/106細胞)中に取った。30分後、細胞を洗浄し、そしてサポニンを含有しないPBS/BSA中に取った。
用いた抗体
R33.24.12.(R-PEとフルオレセインとの両方にカップリングした、ラット抗マウスモノクローナル抗体)を、Cologne遺伝研究所の免疫生物学部門の在庫から入手した。最適な標識濃度を滴定した。この抗体のR-PE複合体を用いて、分泌細胞の表面上の捕捉されたIgMを標識し、フルオロセイン複合体を用いて、細胞質標識を行った。捕捉抗体として、LS136(マウスλに対するマウスIgGκ)を用いる(捕捉されるIgMはλアロタイプである)。LS136は、同様に免疫生物学部門の内部生成物に由来する。
実施例2
この実施例は、高粘度培地と比較して、ゼラチン状培地で分泌期を行うことが、アビジンを介して捕捉分子に連結したビオチンアンカー分子を含む細胞による分泌生成物の捕捉に与える効果を示す。
NHS-LC-ビオチンを用いる、細胞の化学的ビオチン化
B.1.8.細胞とX63細胞との混合物を、以下の手順により化学的にビオチン化した。107〜108個の細胞を含む細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、そしてペレットを0.1〜1mg/mlのNHS-LC-ビオチン(Pierce, Rockford, Illinois, U.S.A.)を含有する200μlのPBS(pH8.5)溶液に再懸濁した。室温で30分間インキュベートした後、50mlのPBS/BSAで2回、広範囲に細胞を洗浄した。アビジン複合体での標識をビオチン化から24時間以内に行った。
抗体を捕捉するビオチン化細胞とアビジンとの連結
NHS-LC-ビオチンとの反応によりビオチン化された細胞を、LS136(濃度30μg/ml)のアビジン複合体で、氷上で30分間標識し、そして洗浄した。
ゼラチン状培地および高粘度培地での分泌および生成物の捕捉
ビオチン化−アビジン処理細胞を3種の異なる培地中で、7.5%のCO2環境下、37℃で1時間インキュベートし、洗浄し、氷上で10分間、R 33.24.12(10μg/ml)のフルオレセイン複合体で標識し、洗浄し、そして結合したR 33.24.12の量の測定をフローサイトメトリー(FACScan)を用いて分析した。R 33.24.12は、抗生成物抗体のフルオレセイン複合体である。インキュベーションの間に用いた3種の異なる培地は、以下の通りであった:(1)細胞培養培地、RPMI、5%FCS;(2)40%BSA(Fluka、Switzerland)を加えたRPMI、5%FCS;および(3)20%BSAおよび20%ゼラチン(ウシ皮膚由来のタイプB、約225ブルーム、Sigma Chemical Co.)をゼラチンの拡散阻害剤として加えたRPMI、5%FCS。結果を図9、10、および11に示す。
図9aは、RPMI、5%FCS(即ち、拡散阻害剤なし)中でインキュベートした細胞の標識分布を示す。全細胞集団は、蛍光の濃い方向にシフトしており、従って、異なる細胞集団の分離は解決され得ない。図9bは、40%BSAを加えたRPMI、5%FCS中でインキュベートした細胞の標識分布を示す。このBSA培地は、高粘度拡散阻害剤である。図9aと比較すると、図9bは、この培地におけるインキュベーションにより、バックグラウンド標識が低下したことを示す。図9cは、20%BSAおよび20%ゼラチンを加えたRPMI、5%FCS中でインキュベートした細胞の標識分布を示す。この培地を用いると、2種の細胞集団、分泌細胞および非分泌細胞が同定され得る。図9aおよび9bに示された他の2種の培地中でインキュベートした細胞と比較すると、分泌細胞集団の蛍光量は、顕著に増加している。
この実施例により、高濃度BSA培地のような粘性培地は、非産生細胞による分泌生成物の捕捉を減少させるが、ゼラチン状培地での分泌の間のインキュベーションにより産生細胞の標識は著しく増加し、それに付随して捕捉非産生細胞の捕捉は減少する。この捕捉増幅効果により、より低レベルの生成物を産生する細胞を標識することが可能となり、および/または分泌生成物の捕捉に対して、より低い親和性の抗体を使用することが可能になる。ゼラチン状培地は、分泌細胞の近傍で生成物の濃度を上昇させるが、捕捉反応の速度を阻害しないようである。生成物の分子量より低いカットオフ限界を有するゼラチン状培地が培地中で使用されると、分泌された分子は細胞と培地との間の間隙(gap)に集中し、局部的に高濃度となり、そしてより効率的に分泌細胞を標識し得る。
MACSを用いる細胞の分離
B1.8細胞とX63細胞との混合物を、上記のように化学的にビオチン化し、LS136−アビジンで標識した。コントロールサンプルを取り、氷上で保存した。残りの細胞を、23%ゼラチン、18%BSA、および5%FCSを含む6mlのゼラチン状RPMI培地中で1時間分泌させた。このゲルを20mlの42℃PBSにすばやく溶解し、次いで30mlの氷冷したPBSを迅速に加え、そして冷却遠心分離で洗浄した。細胞およびコントロールサンプルを氷上で10分間、ヤギ抗マウスフルオレセイン(SBA、Birmingham, Alabama)で標識されているラット抗マウスIgMマイクロビーズ(Miltenyi Biotec GmbH)で標識し、そして1回洗浄した。次いで、MACS磁性細胞分取器を用いて、A2カラムで細胞を分離した。製造者の指示に従って分離を行った。コントロールサンプル、非分離サンプル、ならびに磁性および非磁性画分をフローサイトメトリー(FACScan)(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)により分析した。
図11aは、コントロールサンプルの蛍光分布を示す。図で見られるように、細胞上に検出可能な表面標識はほとんど検出されなかった(点線の間の領域(ポジティブ枠)の0.6%)。図11bは、磁性分離前の分泌およびフルオレセイン標識後の蛍光分布を示す。細胞の約14.2%がポジティブ枠内にあり、推定分泌細胞である。図11cは、磁性分離後の非磁性画分の蛍光分布を示す。ほとんど全てのポジティブ細胞が磁性カラムに保持されている(ポジティブ枠の細胞の2%)。図11dは、磁性画分の蛍光分布を示す。ポジティブ細胞の集団は非常に富化されている(ポジティブ枠の80.3%)。細胞集団の純度は、計器の限界のため、FACScan分析で示されたよりも高いと予測され得ることに注目すべきである。富化率は、24を超えると計算され得る。
図10a〜10dは、x63細胞に対するB1.8細胞の比率を高くして用いたこと以外は、図11a〜11dと同様の実験を示す。分泌期の間の培地は、25%ゼラチンと2.5%FCSとを含有するRPMIであった。ポジティブ枠の細胞のパーセントは、1.3%(コントロール)、41.2%(分泌後)、6.6%(非磁性画分)、および92.9%(磁性画分)であった。この実施例のポジティブ細胞の富化率は、18.7を超え、そして減少(depletion)率は9.9を超えると計算され得る。
実施例3
以下に、分泌の絶対量を測定し、そして細胞表面上の捕捉分子の種々の量を補正する方法について説明する。
分泌期の間、培地を加えた低濃度の付加(tagged)生成物に細胞を曝し;付加生成物は、細胞上の生成物結合部位に結合するが、飽和しない。この期間のインキュベーションにより、分泌生成物および付加生成物の両方が細胞に結合する。次いで、細胞を生成物(付加生成物および分泌生成物の両方)に対して特異的な標識分子で標識する。1つのパラメータを用いた付加物の測定、および別のパラメータにおける全生成物の測定により、細胞により分泌された量を規格化し、そして混合物中の細胞上の捕捉抗体の種々の量を補正した。
実施例4
分泌されたサイトカインについての生細胞の免疫蛍光分析
この実施例では、分泌されたサイトカインについて生細胞を分析するための免疫蛍光法について説明する。より詳細には、この実施例では、インターフェロンγ(IFNγ)を分泌するマウス脾臓細胞の同定および分離を説明する。一般的には、この実施例には、細胞表面タンパク質のビオチン化およびアビジン複合体化抗サイトカイン抗体とのインキュベーションによる、生細胞表面での人工のアフィニティーマトリックスの作製を包含する。細胞を高粘度の培地でインキュベートし、分泌細胞と非分泌細胞との間の分泌生成物の拡散を防止し、そして細胞に分泌させる。細胞表面上にキャッチングした分泌サイトカインをジゴキシゲニン(DIG)複合体化抗サイトカイン抗体で標識し、そして蛍光色素化した抗DIG抗体を用いて染色した。次いで、このようにして標識した細胞は、さらに表面マーカーで特徴付けされ、機能性アッセイのためにMACSまたはFACSにより分離され得る。この方法を細胞内サイトカイン検出と組み合わせることにより、単一細胞レベルでのサイトカインの細胞内蓄積および分泌を相互関連させる。
IFNγ分泌ネズミ脾臓細胞の検出
BALB/cマウス脾臓細胞(SC)を2μg/mlのStaphylococcus aureusエンテロトキシンB(SEB;Sigma)で約40時間、RPMI 1640中、2×106細胞/mlで刺激した。次いで、細胞を10分間300gで遠心分離した。PBS、pH8.4中のNHS-LC-ビオチン(1mg/ml;Pierce)200μlにペレットを再懸濁し、次いで室温で15分間インキュベートした。0.5% BSAを含有するPBS(PBS/0.5% BSA)で1回洗浄し、別のチューブにいれ、そしてPBS/0.5% BSAで2回目の洗浄を行った。
細胞を0.02% NaN3を含有するPBS/0.5% BSA(PBS/0.5% BSA/NaN3)200μlに再懸濁し、そして最終濃度が10μg/mlとなるまで、非複合体抗マウスIFNγ R46A2(コントロール)を加えた。試験サンプルでは、アビジン複合体化抗マウスIFNγ AN18.17.24を加えて最終濃度を25μg/mlとした。この細胞を4℃で5分間インキュベートした。次に、細胞を37℃および7.5%CO2中で10〜60分間、106細胞/mlでRPMI 1640(37℃)中の40%ゼラチン(75ブルーム;Sigma)のペトリ皿中にいれた。
1.5倍容量のPBS(37℃)を加え、そして細胞を2容量のPBS(12℃)を入れた50mlチューブに入れた。次いで、これらの細胞を10分間300gで遠心分離した。ペレットを、PBS/0.5% BSA/NaN3中のDIG複合体化R46A2(10μg/ml)100μl中に再懸濁し、4℃で10分間インキュベートし、次いで、PBS/0.5% BSA/NaN3で洗浄した。次に、PBS/0.5% BSA/NaN3中のFITC複合体化ヒツジ抗DIG抗体(2μg/ml)200μl中にペレットを再懸濁し、4℃で10分間インキュベートし、そしてPBS/0.5% BSA/NaN3で洗浄した。FACS分析について、図13および図14に示す。必要に応じて、細胞の表面標識、固定、および細胞内標識を行い得、そしてPBS/0.5% BSA/NaN3中に再懸濁し得る。
結果
IFNγの分泌を、SEBで41時間、インビトロで刺激したマウス脾臓細胞について、フローサイトメトリーにより分析した。IFNγは巨大活性化細胞(芽細胞)からのみ産生されるので、光散乱特性およびプロピジウムヨージド(PI)標識に従って、生芽細胞上のゲーティングを行った(図12)。ST-FITCで標識することにより、キャッチング抗体で充填し、FITC複合体化ヤギ抗ラットIgGで標識することにより、細胞表面タンパク質のビオチン化を制御した(図13)。図13aは、非標識細胞の分布を示す。図13bは、ST-FITCがビオチン化の前に細胞を標識する能力を示す。細胞がST-FITCにより非特異的に標識されないことに注意されたい。図13cは、ST-FITCがビオチン化細胞を標識する能力を示す。図13dは、FITCで標識されたヤギ抗ラットIgGを有する、キャッチ抗体(GaRIgG-FITC)で標識されなかった細胞の標識を示す。図13dは、細胞に対する標識抗体の非特異的結合がないことを示す。図13eは、アビジン化されたキャッチ抗体で標識した細胞のGaRIgG-FITCでの標識を示す。図13eは、キャッチ抗体が細胞に完全に結合することを示す。
ネガティブコントロールとして、キャッチ抗体を有さない細胞を、90分間高密度培地(HDM、RPMI中40%ゼラチン)中でインキュベートし、IFNγで標識した(図14)。高濃度コントロールとして、40分間HDM中でインキュベートしたキャッチ抗体を有する細胞を、IFNγを含有する上清中で4℃中で10分間さらにインキュベートし、次いでIFNγに対して標識した(図14)。キャッチ抗体で標識したSEB刺激ネズミSCのうち、HDM中でインキュベートした後、インキュベーション時間に依存して、IFNγ分泌細胞の数の増加が検出された(図14)。さらなる表面標識により、これらのIFNγ分泌SCは、CD4+およびCD8+ T細胞であると同定された。SEB刺激T細胞芽細胞は、種々の量のIFNγを分泌し、その結果蛍光強度の分布が広くなる(図14)。
図14は、種々の条件下でαDIG-FITCで標識した細胞の数を示す。αDIG-FITCは、DIG R46A2-DIGにカップリングした抗IFNγ抗体に結合する。図14aは、ゼロ時における、キャッチ抗体の存在下で標識した細胞の数を示す。図14b、d、およびfは、5分、40分、および90分のインキュベーション後における、キャッチ抗体の存在下で標識した細胞の数を示す。細胞の中には既に標識されているものがあり、そして90分後にはさらに多くの細胞が増加的に標識されることに注意されたい。図14cは、90分インキュベーション後における、キャッチ抗体の非存在下で標識した細胞の数を示す。図14eは、キャッチ抗体およびインキュベーションの間に添加された外来IFNγの存在下でαDIG-FITCで標識した細胞の数を示す。
産業上の利用性
上記の方法および組成物は、種々のレベルの1種またはそれ以上の所定の物質を分泌する細胞の検出および/または分離に有用である。細胞は、所定の生成物の分泌活性以外は、表現型が同一であり得る。従って、この方法は、商業価値のある物質を分泌する細胞(例えば、免疫原性のポリペプチド、成長因子、ホルモンとして作用し得る分子、および組換え法により産生される生成物を包含する種々の他の生成物を分泌する細胞)を、これらを分泌しない細胞から分離する際に有用であり得る。さらに、これらの手法は移植または内移植手順、あるいは内移植のためのパッケージングに用いられる細胞群の単離に有用であり得る。このタイプの細胞群の例示としては、ランゲルハンス島がある。この場合、非分泌細胞である細胞から、インスリンを分泌し得る細胞群を分離することが望ましい。細胞混合物中の細胞の分泌活性の分布を測定する方法はまた、非分泌細胞または低分泌細胞変異体の出現、あるいは改変生成物を産生する細胞の出現がすばやく同定される点で、大規模な発酵において有用である。
Claims (68)
- 以下の工程を包含する、細胞により分泌および放出される生成物に従って細胞をポジティブに分離する方法であって、ここで、該細胞の分離が、該細胞が該生成物で標識される程度に従って行われる、方法:
捕捉分子を該細胞の表面にカップリングして、該生成物が細胞から分泌され、該分泌された生成物が該捕捉分子に特異的に結合する条件下で該細胞を培養する工程;および
該捕捉分子に結合した該分泌された生成物に基づいて該細胞を分離する工程であって、該標識された細胞が、該分離手順の一部として溶解されない、工程。 - 分離前に前記生成物を標識する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記生成物が標識分子で標識される、請求項2に記載の方法。
- 前記標識分子が、前記生成物に特異的な抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記標識分子が蛍光色素化され、そして前記分離が細胞分離により行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記標識分子が磁化され得、そして前記分離が該標識分子を磁化するのに十分な強度の磁場で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記標識分子が、約5〜200nmの代表的直径を有するコロイド磁性粒子を包含する、請求項6に記載の方法。
- 前記捕捉分子が、抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体またはこれらの抗原結合フラグメントが二重特異性である、請求項8に記載の方法。
- 前記カップリングが、前記捕捉分子に結合した脂質アンカーを介するか、または連結分子を介して該捕捉分子に結合した脂質アンカーを介する、請求項1に記載の方法。
- 前記カップリングが、前記捕捉分子に結合した抗体またはこれらの抗原結合フラグメントを介するか、あるいはリンカーを介して該捕捉分子に結合した抗体またはこれらの抗原結合フラグメントを介する、請求項1に記載の方法。
- 前記カップリングが、前記細胞表面上の成分への前記捕捉分子の直接的な化学的カップリングを介するか、またはリンカーを介した該細胞表面上の成分への該捕捉分子の直接的な化学的カップリングを介する、請求項1に記載の方法。
- 前記カップリングが、前記抗体の前記細胞への特異的結合を介する、請求項9に記載の方法。
- 以下の工程を包含する、細胞により分泌される生成物で細胞を標識する方法:
捕捉分子を該細胞の表面にカップリングする工程;
該生成物が細胞から分泌され、そして該分泌された生成物が、該細胞の表面にカップリングした該捕捉分子に捕捉され、そして該細胞が該方法の間に溶解されない条件下で、該細胞を培養する工程。 - 前記生成物が、標識分子で標識される、請求項14に記載の方法。
- 前記標識分子が抗体である、請求項15に記載の方法。
- 特異的結合パートナーが、抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである、請求項14に記載の方法。
- 前記抗体が二重特異性である、請求項17に記載の方法。
- 前記カップリングが、前記捕捉分子に結合した脂質アンカーを介する、請求項14に記載の方法。
- 前記カップリングが、前記捕捉分子に結合した抗体またはこれらの抗原結合フラグメントを介する、請求項14に記載の方法。
- 前記カップリングが、前記抗体の前記細胞への特異的結合を介する、請求項18に記載の方法。
- 細胞により分泌される生成物を捕捉し得る該細胞を含有する組成物であって、捕捉分子が該細胞の表面がカップリングし、そして該分泌された生成物が、該生成物が放出された細胞の表面にカップリングした該捕捉分子に結合し得る、組成物。
- 前記生成物にさらにカップリングしている、請求項22に記載の組成物。
- 前記捕捉分子が、抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである、請求項22に記載の組成物。
- 前記抗体が二重特異的である、請求項24に記載の組成物。
- 前記カップリングが、前記捕捉分子に結合した脂質アンカーを介するか、または連結分子を介して前記捕捉分子に結合し得る脂質アンカーを介する、請求項22に記載の組成物。
- 前記カップリングが、前記捕捉分子に結合した抗体またはこれらの抗原結合フラグメントを介するか、あるいはリンカーを介して前記捕捉分子に結合し得る抗体またはこれらの抗原結合フラグメントを介する、請求項22に記載の組成物。
- 前記カップリングが、前記抗体の前記細胞への特異的結合を介する、請求項25に記載の組成物。
- 請求項1に記載の方法により分離される、生存可能な細胞であって、該細胞は、該細胞の表面に結合した捕捉分子を含み、そして該捕捉分子が該細胞によって分泌される生成物に結合する、細胞。
- 以下の工程を包含する、細胞の集団を分析して、集団内の他の細胞に対して、ある量の生成物を分泌する細胞を同定または計測する方法:
請求項14に記載の方法により、該細胞を標識する工程;
前記捕捉生成物を標識しない少なくとも1種の別の標識で、該細胞を標識する工程;および
該別の標識に関する生成物標識量を検出する工程。 - 以下の工程を包含する、細胞集団の分泌活性の分布を測定する方法:
請求項14に記載の方法により、細胞を標識する工程;および
細胞あたりの生成物標識量を測定する工程。 - 以下の工程をさらに包含する、請求項14に記載の方法:
細胞あたりの生成物標識の量およびタイプを測定する工程であって、細胞集団における分泌生成物のタイプおよび各分泌生成物タイプについての分泌活性の分布を測定する工程。 - 所望の生成物を分泌する細胞の検出に用いるキットであって、以下:
少なくとも1種のアンカー分子および少なくとも1種の捕捉分子を含む生成物捕捉システムであって、該少なくとも1種のアンカー分子が、該細胞の該表面に該少なくとも1種の捕捉分子を固定する、システム、ならびに;
少なくとも1種の標識分子であって、前記生成物を結合する、標識分子、
を含む、キット。 - 所望の生成物を分泌する細胞の検出に用いるキットであって、以下;
少なくとも1種の細胞タイプに対する少なくとも1種の抗原認識部位と、該細胞の生成物に対して特異的な少なくとも1種の抗原認識部位とを有する少なくとも1種の二重特異的抗体、および;
少なくとも1種の標識分子であって、該生成物を結合する、分子、
を含む、キット。 - 前記少なくとも1種の二重特異的抗体および前記少なくとも1種の標識分子が1つのバイアル中にある、請求項34に記載のキット。
- 前記少なくとも1種の二重特異的抗体が細胞表面分子を介して前記細胞に結合している、請求項34に記載のキット。
- 前記細胞表面分子が天然由来の細胞表面タンパク質である、請求項36に記載のキット。
- 前記細胞表面分子が細胞表面マーカーである、請求項36に記載のキット。
- 前記細胞表面分子が、CD4、CD8、CD19、CD20、CD14、CD16、CD15、CD45、クラスIMHC分子およびクラスII MHC分子、CD34、CD38、CD33、CD56、T細胞レセプター、Fcレセプター、β2-ミクログロブリン、および免疫グロブリンからなる群より選択される、請求項38に記載のキット。
- 高粘度培地またはゲル形成培地をさらに含む、請求項33に記載のキット。
- 前記培地が、ゼラチン、アガロース、アルギネート、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項40に記載のキット。
- 前記標識分子が抗体である、請求項36に記載のキット。
- 前記抗体が検出可能な標準を含む、請求項42に記載のキット。
- 前記検出可能な標識が、発蛍光団、放射性同位元素、発色団、および磁性粒子からなる群より選択される、請求項43に記載のキット。
- 前記標識分子が、蛍光標示式細胞分離により検出される、請求項44に記載のキット。
- 前記標識分子が、第3の抗体により検出される、請求項36に記載のキット。
- 前記標識分子が、ジゴキシゲニンにカップリングし、そして前記第3の抗体がジゴキシゲニンに対して特異的である、請求項46に記載のキット。
- 前記第3の抗体が、検出可能な標識を含む、請求項46に記載のキット。
- 生物学的改変剤をさらに含有する、請求項34に記載のキット。
- 以下の工程を含む、生成物を分泌する細胞を同定する方法:
混合された細胞集団を、各抗体が細胞表面分子に対して特異的な結合部位と少なくとも1種の生成物に対して特異的な結合部位とを有する、少なくとも1種の第1の二重特異性抗体と合わせる工程;
細胞に少なくとも1種の生成物を分泌させるのに十分な条件下および時間で該組合わせをインキュベートする工程であって、ここで、該生成物は、該生成物に結合する二重特異性抗体に結合される、工程;
少なくとも1種の、該生成物に結合する標識分子を添加する工程;および
該少なくとも1種の標識分子の結合を検出し、それによって該生成物を分泌すつ細胞を同定する工程。 - 前記混合された細胞集団から前記生成物を分泌する前記細胞を分離する工程をさらに包含する、請求項50に記載の方法。
- 前記細胞表面分子が、天然由来の細胞表面タンパク質である、請求項51に記載の方法。
- 前記タンパク質が、細胞表面マーカーである、請求項52に記載の方法。
- 前記細胞表面マーカーが、CD4、CD8、CD19、CD20、CD14、CD16、CD15、CD45、クラスIMHC分子およびクラスII MHC分子、CD34、CD38、CD33、CD56、T細胞レセプター、Fcレセプター、β2-ミクログロブリン、および免疫グロブリンからなる群より選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記インキュベーションの条件が、高粘度培地またはゲル形成培地を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記標識分子が抗体である、請求項50に記載の方法。
- 前記抗体が検出可能な標識を包含する、請求項56に記載の方法。
- 前記標識が、発蛍光団、放射性同位元素、発色団、および磁性粒子からなる群より選択される、請求項57に記載の方法。
- 前記標識分子が、蛍光標示式細胞分離により検出される、請求項58に記載の方法。
- 前記標識分子が、第3の抗体により検出される、請求項59に記載の方法。
- 前記標識分子が、ジゴキシゲニンとカップリングし、そして前記第3の抗体がジゴキシゲニンに対して特異的である、請求項60に記載の方法。
- 前記第3の抗体が、検出可能な標識を包含する、請求項60に記載の方法。
- 前記標識が、発蛍光団、放射性同位元素、発色団、および磁性粒子からなる群より選択される、請求項62に記載の方法。
- 前記標識分子が、蛍光標示式細胞分離により検出される、請求項63に記載の方法。
- 前記標識分子が磁化可能な分子を包含する、請求項50に記載の方法。
- 前記標識分子が、磁化可能な分子にカップリングした第3の抗体により検出される、請求項に65記載の方法。
- 前記カップリングが、連結分子を介して前記捕捉分子に結合した脂質アンカーを介する、請求項14に記載の方法。
- 前記カップリングが、連結分子を介して前記捕捉分子に結合した抗体またはこれらの抗原結合フラグメントを介する、請求項14に記載の方法。
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