DE102005031755B4

DE102005031755B4 - Salmonella spp. bindende Peptide, dafür kodierende Nukleinsäuren deren Verwenduen und Verfahren und Kits zur Anreicherung, Immobilisierungen und zum Nachweis von Salmonella spp.

Info

Publication number: DE102005031755B4
Application number: DE200510031755
Authority: DE
Inventors: Juliane Steingroewer; Elke Dr. Boschke; Christian Bergemann
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2005-07-01
Filing date: 2005-07-01
Publication date: 2009-10-08
Anticipated expiration: 2025-07-02
Also published as: DE102005031755A1; DE102005031755B9

Abstract

Salmonella spp. bindendes Peptid ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis NO. 3, SEQ ID NO. 5 bis NO. 8, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 14 bis NO. 16, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 20 bis NO. 26, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 30 bis NO. 33.

Description

Die Erfindung betrifft Peptide, die affin an die Oberfläche bzw. die extrazellulären Strukturen von Salmonella spp., insbesondere Salmonella Typhimurium, binden, die Verwendung dieser Peptide zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Salmonella spp. sowie Verfahren und Kits zur Anreicherung und zum Nachweis von Salmonella spp. Die Erfindung betrifft weiterhin die Kopplung von therapeutisch wirksamen Substanzen an diese Peptide.
Salmonella spp. sind 0,7–1,5 × 2,0–5,0 μm lange, gramnegative, nicht Sporen bildende Stäbchenbakterien der Familie der Enterobacteriaceae.
Die Gattung Salmonella wird in zwei Spezies unterteilt, von denen nur Salmonella enterica klinische und epidemiologische Bedeutung besitzt. Salmonella enterica kann in sechs verschiedene Subspezies unterteilt werden, wobei 99,5% der isolierten Keime zu S. enterica ssp. enterica zugeordnet werden. Diese Untergattung weist etwa 1500 Serotypen auf, die sich nur hinsichtlich ihrer O-Antigene (Polysaccharide der äußeren Zellwand) sowie der H-Antigene (Proteine der Geißeln) unterscheiden. Der verwendete Modellkeim Salmonella enterica ssp. enterica ser. Typhimurium ist einer der 1500 Serotypen. Im weiteren Text wird die Schreibweise Salmonella Typhimurium verwendet.
Der Lebensraum von Salmonella spp. sind Warm- und Kaltblüter. Sie können jedoch auch in der Umwelt überleben.
Die hitzeresistenten Oberflächen- oder O-Antigene von Salmonella spp. sind Bestandteil des Protein-Lipopolysaccharid-Komplexes der Zellwand. Die Lipopolysaccharide bestehen aus einem Lipid-Teil (Lipoid A) und einer Polysaccharidseitenkette. Sie hat eine Serotypspezifische Zusammensetzung, in der sich die O-spezifischen Oligosaccharide n-mal wiederholen. Zur Identifizierung der O-Antigene wird ein Serum mit Antikörpern gegen die O-Antigene mit der zu untersuchenden Zellsuspension vermischt. Bindet das Antiserum kommt es zu einer Verklumpung (Agglutination) der Zellen, die mit bloßem Auge zu erkennen ist. Des Weiteren besitzen Salmonella spp. für jeden Serotyp spezifische Geißel (H)-Antigene. Diese werden ebenfalls durch Agglutination nachgewiesen. Die H-Antigene können jedoch in zwei Phasen auftreten, d. h. dass die Bakterienzelle zwei unterschiedlich aufgebaute Geißelproteine ausbilden kann.
Zum Nachweis von Salmonella spp. in Lebensmitteln kommen derzeit verschiedene z. T. in die Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG aufgenommene Untersuchungsmethoden zur Anwendung. Dabei handelt es sich um kulturelle, immunologische bzw. molekularbiologische Nachweisverfahren. Es ist möglich, diese Verfahren zu kombinieren.
Die konventionelle Detektion von Salmonella spp., auch in Lebensmitteln, wird in der Regel folgendermaßen durchgeführt:

– Voranreicherung
– Selektiv-Anreicherung
– Isolierung auf Selektivnährböden
– Biochemische und Serologische Identifizierung

Bis zum ersten Ergebnis nach Isolierung der Keime auf Selektivnährböden wird ein Untersuchungszeitraum von mindestens 3 bis 4 Tagen benötigt. Müssen verdächtige Kolonien biochemisch bzw. serologisch nachuntersucht werden, erhöht sich der Zeitbedarf auf 5 bis 6 Tage.
Neben den klassischen Tests kommen auch immunologische Nachweisverfahren, wie Immunfluoreszenztests oder ELISA zum Einsatz
Für den molekularbiologischen Nachweis von Salmonella spp. stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Er kann beispielsweise mittels Gensonden im Zuge der Fluoreszenz in situ Hybridisierung oder mit der Polymerase-Kettenreaktion erfolgen. Den genannten modernen Verfahren ist der Nachteil eigen, dass die Sensitivität nicht ausreichend hoch ist, d. h. die Keime müssen nach wie vor auf eine Zellzahl größer als das notwendige Detektionslimit angereichert werden.
Mit Hilfe von superparamagnetischen, mit entsprechenden Liganden, z. B. Antikörpern, beschichteten Partikeln ist ein Aufkonzentrieren der Keime möglich.
Für den Nachweis und die Charakterisierung von Mikroorganismen und deren Dauerformen (Sporen) werden als nachzuweisende Zielmoleküle neben den von den Zellen ausgeschiedenen Stoffwechselprodukten und anderen Zellbestandteilen oder Molekülen auch die Zellen selbst verwendet. Hierzu werden die Zellen nach dem Stand der Technik mit speziellen Immunoglobulinen (Antikörpern), aber auch anderen bindenden Molekülen (z. B. Lektinen) markiert. Diesen Molekülen ist gemeinsam, dass sie spezielle Zellstrukturen erkennen und daran binden. Dabei ist die Selektivität des Nachweisverfahrens sehr stark von den zur Markierung eingesetzten Molekülen abhängig, weshalb z. B. der Einsatz von Lektinen bei Systemen mit einer hohen Diversität der stofflichen Zusammensetzung ungeeignet ist.
Auch der Einsatz von Antikörpern für Nachweisverfahren hat einige Nachteile. Zunächst müssen spezifische Antikörper hergestellt werden. Dies geschieht zunächst durch Immunisierung von Tieren mit dem Zielantigen oder einem Bestandteil daraus. Hierbei ist jedoch nicht sichergestellt, dass die gewünschte Immunantwort auch erzielt wird. Falls eine Immunantwort stattgefunden hat und das Serum nach einiger Zeit einen genügend hohen Titer an spezifischen Antikörpern gegen das Zielantigen aufweist, werden B-Lymphozyten und Antikörper aus dem Blut des Tieres isoliert und mittels bekannter Methoden aufgereinigt. Diese Antikörper werden unabhängig von ihrem Reinheitsgrad als polyklonale Antikörper bezeichnet. Sie reagieren auf alle Antigene, zu denen das Tier bis zum Zeitpunk der Isolation Kontakt hatte und auf die eine Immunantwort erfolgt ist. Unerwünschte Kreuzreaktionen mit fremden, den Zielantigenen nicht unbedingt verwandten Antigenen werden daher häufig beobachtet und stellen einen wesentlichen Nachteil dar. Die Antikörper können zwar in weiteren Arbeitsschritten für ein bestimmtes Antigen angereichert werden, dies ist jedoch extrem zeitaufwändig und mit hohen Kosten verbunden. Ein weiterer Nachteil polyklonaler Antikörper liegt in der begrenzten Lebensdauer der B-Lymphozyten. Diese können nicht kultiviert werden und sterben nach einer gewissen Zeit ab. Zwischen verschiedenen Chargen polyklonaler Antikörper gibt es daher immer unerwünschte Qualitätsschwankungen.
Des Weiteren ist es möglich, durch entsprechende Fusionstechniken einzelne Antikörper produzierende B-Lymphozyten mit einer Tumor-Zellinie zu Hybridoma-Zellinien zu verschmelzen. Die entstehenden Hybridoma-Zellen können in vitro kultiviert werden. So lassen sich monoklonale Antikörper in Zellkulturen gewinnen. Die Hybridoma-Techniken sind jedoch langwierig und teuer: Die Entwicklung neuer monoklonaler Antikörper erfolgt in mehreren Teilschritten: Immunisierung, Fusion, Selektion, Screening und Charakterisierung. Eventuell folgen weitere Modifikationen, die die Eigenschaften der monoklonalen Antikörper verbessern. Zudem ist es nicht in allen Fällen ohne Probleme möglich, Antikörper gegen das Zielantigen zu gewinnen, besonders wenn es sich hierbei um ganze, intakte Zellen handelt. Teilweise kommt es auch zum Absterben der Hybridoma-Zellinie. Dies stellt einen weiteren Nachteil dar, da entsprechende Kopplungsprotokolle für Nachweisverfahren zeitaufwändig neu etabliert werden müssen.
Aufgabe der Erfindung ist es, einfache, sensitive, spezifische und möglichst schnell durchführbare Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, Markierung und/oder zum Nachweis von Salmonella spp. vorzugsweise von Salmonella Typhimurium, anzugeben, die nicht auf der Verwendung von Antikörpern basieren. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, die entsprechenden Nachweisreagenzien und Kits zur Durchführung dieser Verfahren anzugeben.
WO 2005/087792 A2 (nachveröffentlicht) offenbart mehrere Peptide, u. a. WSAAPTKPPYHT, die fähig sind an Glioma-Zellen zu binden.
WO 2005/00399616 A1 offenbart mehrere Peptide, u. a. LLADTTHHRPWT, de Angiogenese induzieren können.
WO 2003/102020 A2 offenbart mehrere Peptide, u. a. KSLSRHDHIHHH, die an Carbonanotubes binden können.
WO 2003/037172 A2 offenbart mehrere Peptide, u. a. QHANHQAWNNLR, STGKPYMMLTGV, IPLPPPSRPFFK, KLQTYNPHFRNP, die an Endothelzellen binden können.
WO 20003/026590 A2 offenbart mehrere Peptide, u. a. SHPWNAQRELSV, die Materialien binden können, die elementares Carbon enthalten, für die Verwendung in der an Halbleitertechnologie.
WO 2003/00045177 A2 offenbart mehrere Peptide, u. a. YITPYAHLRGGN, die an epitheliales Gewebe, insbesondere Peyers Patch oder M-Zell-Gewebe, binden können.
WO 2001/5700669 A2 offenbart mehrere Peptide, u. a. TQSPLNYRPALL und GHLIPLRQPSHQ, die an Herz und mehrere Tumoren, binden können.
Tang SS et al. (Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003, 10. (6), S. 1078–1084) offenbart Peptide, die an einen monoklonalen Antikörper binden, der spezifisch das V-iAntigen von Samonella Enterica erkennt.
Wu HY et al. (Peptides 2005, 26 (11) S. 2057–63) offenbart, dass das Peptid RQERSSLSKPVV an Pili des IVB-Typs von Samonella typhi bindet.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein oder mehrere Salmonella spp. bindende Peptide, gemäß Anspruch 1 und die Verwendung eines oder mehrere Salmonella spp. bindendes Peptid, das eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 36 enthält zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Salmonella spp.
Die erfindungsgemäßen Peptide enthalten folgende Aminosäuresequenzen: SEQ ID
Weitere erfindungsgemäß verwendete Peptide enthalten folgende Aminosäuresequenzen:
Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide, d. h. die Peptide mit den Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 36, binden überraschend affin und spezifisch an die Oberfläche bzw. extrazelluläre Strukturen von Salmonella spp. und sind daher geeignet, in Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren zur Anreicherung und/oder zum Nachweisen von Salmonella spp., insbesondere Salmonella Typhimurium, eingesetzt zu werden.
Die aufwändige Herstellung und Verwendung von Antikörpern in entsprechenden Nachweisverfahren kann so auf vorteilhafte Weise vermieden werden. Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich zudem mit herkömmlichen Syntheseverfahren leicht und in sehr hoher Reinheit herstellen. Daher kann eine gleich bleibende, chargenunabhängige Produktqualität erzielt werden, insbesondere im Hinblick auf die Reinheit und Stabilität. Die Handhabung der in Immobilisierungs- und/oder Nachweisverfahren einzusetzenden Reagenzien wird ebenfalls vereinfacht, so dass insgesamt die Immobilisierung und/oder der Nachweis von Salmonella spp. schneller, mit höherer Reproduzierbarkeit und mit geringerem Gesamtaufwand ermöglicht wird. Zudem ist es einfacher, Nachweis- und/oder Immobilisierungsverfahren zu miniaturisieren und zu automatisieren, in denen statt Antikörpern Fängerpeptide verwendet werden.
Besonders bevorzugt sind Peptide der Aninosäuresequenz SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2. Diese Peptide sind besonders spezifisch für Salmonella Typhimurium und weisen eine hohe Affinität für diesen Mikroorganismus auf. Sie sind daher in besonderer Weise geeignet, an Salmonella spp. und insbesondere an Salmonella Typhimurium in Proben zu binden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide besitzen eine Affinität für Salmonella spp., insbesondere zu Salmonella Typhimurium. Sie sind daher gut zur Verwendung als Sonden für Salmonella spp. einsetzbar. Dazu werden sie vorteilhafterweise mit einem leicht nachweisbaren Marker versehen. Geeignete Marker sind dem Fachmann aus zahlreichen Anwendungen, beispielsweise aus ELISA, bekannt.
Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein erfindungsgemäßes bzw. ein erfindungsgemäß verwendetes Peptid, das einen detektierbaren Marker enthält.
Durch die Kopplung an den detektierbaren Marker eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide vorteilhaft zur spezifischen Markierung und zum spezifischen Nachweis von Salmonella spp.
Bei dem detektierbaren Marker handelt es sich beispielsweise um partikuläre Marker (z. B. Goldpartikel), Fluorochrome, Isotope, Markerproteine, wie z. B. fluoreszierende Proteine (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP)), Amplifikatoren, z. B. Enzyme, die eine Reaktion katalysieren, welche ein Signal in Form eines sichtbaren Farbstoffpräzipitates, einer sichtbaren Farbstoffabspaltung oder Chemo- bzw. Biolumineszenz liefert.
Die verschiedenen detektierbaren Marker werden mittels bekannter Verfahren an das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid gekoppelt. Werden beispielsweise GFP oder enzymatisch aktive Amplifikatoren als detektierbare Marker eingesetzt, erfolgt die Kopplung des Peptides an den Marker geeigneterweise durch Fusion der für das Peptid kodierenden DNA-Sequenz mit der DNA-Sequenz von GFP bzw. des enzymatisch aktiven Amplifikators mittels üblicher gentechnischer Verfahren.
Es ist auch möglich, den Marker erst nach der Bindung an Salmonella spp. am Peptid anzubringen. Dies kann beispielsweise durch Vermittlung eines Linkers wie Biotin-Streptavidin bzw. Biotin-Avidin geschehen, indem das Peptid z. B. biotinyliert ist. Nach der Bindung des Peptids an Salmonella spp. werden Streptavidin und die biotinylierte katalytisch wirkende Einheit zugegeben. Streptavidin vermittelt dann die Bindung der katalytisch wirkenden Einheit an das Peptid.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein erfindungsgemäß eingesetztes Peptid an einen Träger gebunden.
Bei dem Träger handelt es sich bevorzugt um eine feste Phase, insbesondere können die in bekannten Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren verwendeten festen Träger eingesetzt werden, z. B. Mikrotiterplatten, Biochips oder Dip-Sticks.
Als feste Träger geeignet sind Metallkörper, beispielsweise Goldfolien und goldbeschichtete Träger wie im Biacore-System. Ferner können Kunststoffkörper bzw. kunststoffbeschichtete Körper als feste Träger verwendet werden, beispielsweise Polystyrol- oder Polymethylmethacrylat-Träger. Daneben können auch Glasträger, Gele oder andere, zur Herstellung von Biochips geeignete Träger, verwendet werden.
Indem das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid an einen festen Träger gebunden ist, wird es auf vorteilhaft einfache Weise möglich, Salmonella spp. aus Proben zu immobilisieren, zu gewinnen und/oder z. B. für die nachfolgende Detektion anzureichern.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid wird durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren an den festen Träger gebunden, beispielsweise durch Adsorption an den festen Träger. Ein mit einer Beschichtung versehener Träger bewirkt ebenfalls die Bindung des Peptids, z. B. bindet ein mit Streptavidin beschichteter Träger das Peptid nach dessen Biotinylierung. Andere mögliche Beschichtungen zum Binden eines Peptids sind solche, die Serumalbumin, Protein A und/oder Protein G umfassen. Das Peptid kann auch mit einem Nukleinsäure-Linker verbunden sein und in dieser Form an den Träger gebunden werden. Das Peptid kann weiterhin mit einem Oligonukleotid verbunden sein, das über ein an dem festen Träger gebundenes komplementäres Oligonukleotid die Bindung des Peptids an den Träger vermittelt.
Besonders vorteilhaft ist die Immobilisierung der erfindungsgemäß eingesetzten Peptide an eine bewegliche feste Phase als Träger, wie z. B. bei der Biomagnetischen Separation. Hierbei werden die Peptide mittels kovalenter Bindung beispielsweise über Amino- oder Carboxylgruppen an superparamagnetische Mikro- bzw. Nanopartikel (Beads) gekoppelt. Die Beads lassen sich durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes leicht mit den über die erfindungsgemäß eingesetzten Peptide immobilisierten Salmonella-Zellen aus Lösungen und Aerosolen abtrennen. Zudem besitzen die Beads eine hohe verfügbare Oberfläche, so dass ein hoher Anteil des Probenvolumens in Kontakt mit dem Träger tritt. Die verwendeten Materialien sind preiswert und die Handhabung ist einfach.
In einer weiteren Ausgestaltung ist das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid an ein pharmazeutisch wirksames Agens gebunden. Dieses kann auch eingeschlossen sein, z. B. in Mikrokapseln oder Hydrogele.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Nutzung dieser an pharmazeutisch wirksame Agentien gekoppelten Peptide für therapeutische Zwecke.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Salmonella spp. Die Durchführung dieser Verfahren erfolgt bevorzugt in festen und flüssigen Stoffsystemen zur Diagnostik und Analyse von Salmonella spp.
Ein Verfahren zur Anreicherung bzw. Immobilisierung von Salmonella spp. und insbesondere Salmonella Typhimurium aus einer Probe umfasst die folgenden Schritte:

a) Bindung mindestens eines Peptides ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 36 an einen Träger und
b) Kontaktieren des trägergebundenen Peptides mit der zu untersuchenden Probe, um ein Binden des Peptides an Salmonella spp. zu ermöglichen.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid bindet sowohl an den Träger als auch an die zu immobilisierenden Salmonella-Zellen. Dadurch stellt es auf vorteilhaft einfache Weise eine stabile und spezifische Verbindung zwischen dem Träger und den zu immobilisierenden Salmonella spp. her. Die immobilisierten Salmonella-Zellen können anschliessend einfach von der Probe abgetrennt werden, beispielsweise indem der Träger absedimentiert, abzentrifugiert oder durch Anlegen eines äusseren Magnetfeldes abgetrennt wird.
Wenn der Träger ein Gefäss zur Aufnahme der Probe selbst ist, beispielsweise in Form einer Mikrotiterplatten-Vertiefung, so können die gebundenen Salmonella-Zellen durch Waschen des Gefässes mit einer entsprechenden Waschlösung von der übrigen Probe abgetrennt und somit aufgereinigt und angereichert werden.
Dabei ist die Reihenfolge, in der die Schritte a) und b) durchgeführt werden, nicht festgelegt. Es hat sich gezeigt, dass die Bindung von Peptiden an einen zu immobilisierenden Mikroorganismus behindert sein kann, wenn das Peptid vor der Bindung an den Mikroorganismus bereits an den festen Träger gebunden ist. In einem solchen Fall ist es vorteilhaft, den Schritt b) vor oder gleichzeitig mit dem Schritt a) durchzuführen, indem beispielsweise das Peptid und die zu untersuchende Probe durch Mischen miteinander in Kontakt gebracht werden, und gleichzeitig oder anschließend der Träger mit der Mischung in Kontakt gebracht wird. Wenn jedoch der Schritt a) vor dem Schritt b) durchgeführt wird, beispielsweise indem ein erfindungsgemäß eingesetztes an einen Träger gebundenes Peptid wie zuvor beschrieben verwendet wird, so kann derselbe Träger mehrfach zum Immobilisieren von Mikroorganismen aus mehreren Proben oder zum Immobilisieren von Mikroorganismen aus einem Probenstrom verwendet werden. Ein solches Vorgehen kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn die zu untersuchenden Proben nur geringe Konzentrationen des nachzuweisenden Mikroorganismus besitzen, oder wenn die Proben zahlreiche Begleitsubstanzen enthalten, die unspezifisch an den festen Träger binden oder auf andere Weise die Bindung der Peptide an den nachzuweisenden Mikroorganismus stören.
Das erfindungsgemäße Anreicherungsverfahren erlaubt es, auch aus stark verdünnten Proben genügend hohe Zellzahlen von Salmonella Typhimurium zu isolieren, um einen sicheren und spezifischen Nachweis von Salmonella spp. zu ermöglichen.
Die Peptide werden mittels dem Fachmann bekannter Verfahren bevorzugt an eine feste Phase als Träger gebunden. Als feste Phase werden vorzugsweise superparamagnetische Mikro- oder Nanopartikel (Beads) verwendet. Nach Kontakt mit einer Probe immobilisieren die Peptide durch ihre spezifische Bindungsfähigkeit die in der Probe enthaltenen Salmonella-Zellen an die Trägerphase.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von Salmonella spp. insbesondere Salmonella Typhimurium, in einer Probe mit den Schritten

a) Kontaktierung der Probe mit mindestens einem Peptid ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 36, das einen detektierbaren Marker enthält, um ein Binden des Peptids an die nachzuweisenden Salmonella-Zellen zu ermöglichen
b) Nachweis des detektierbaren Markers des Peptides.

Das Nachweisverfahren ermöglicht einen spezifischen und sensitiven Nachweis von Salmonella spp. bzw. Salmonella Typhimurium auch in komplexen Proben.
Das Verfahren zum Nachweis des detektierbaren Markers richtet sich nach dem eingesetzten Marker.
Wie schon bei den zuvor beschriebenen Immobilisierungs- und Anreicherungsverfahren steht die Reihenfolge, in der die Schritte a) und b) durchgeführt werden, im Belieben des Fachmanns. Dieser kann anhand der Umstände des Einzelfalles leicht selbst entscheiden, welche Reihenfolge die besten Nachweisergebnisse liefert.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform des Nachweisverfahrens werden die in der Probe vorhandenen Salmonella-Zeilen vor dem Nachweisen des detektierbaren Markers mittels des erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreichungsverfahrens aus der Probe angereichert bzw. an einem Träger immobilisiert.
Dazu erfolgt zunächst die Immobilisierung von Salmonella-Zellen an den erfindungsgemäß eingesetzten trägergebundenen und nicht markierten Peptiden. Nach einem Waschschritt zur Entfernung der ungebundenen Probenbestandteile (Antigene, andere Zellen) wird ein weiteres erfindungsgemäß eingesetztes nicht an einen Träger gebundenes Peptid mit einem detektierbaren Marker zugegeben, das an die nun ebenfalls an die feste Phase immobilisierten Antigene der Zielzellen bindet und diese auf die oben beschriebene Art und Weise nachweist.
Auf diese Weise kann der nachzuweisende Mikroorganismus ohne großen Aufwand auch in stark verdünnten Proben oder in Proben mit den Nachweis stark störenden Begleitsubstanzen zuverlässig und mit hoher Sensitivität nachgewiesen werden.
Zweckmäßigerweise wird das Nachweisverfahren und/oder das Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahren in Form eines miniaturisierten Assays durchgeführt. Beispielsweise können verschiedene zu untersuchende Proben jeweils in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben und dort einem für die jeweilige Vertiefung spezifisch ausgestalteten Nachweisverfahren unterzogen werden. Auf diese Weise können große Probenmengen parallel verarbeitet werden.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung mindestens eines Peptids ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 36 zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Salmonella spp., insbesondere Salmonella Typhimurium.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Testkits zur spezifischen Markierung, zum Nachweis, zur Immobilisierung und zur Anreicherung von Zellen, die neben den üblichen Bestandteilen mindestens eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 enthalten.
Ein bevorzugtes Kit zum Anreichern von Salmonella spp., insbesondere Salmonella Typhimurium, enthält mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen Träger.
Mit einem solchen Kit wird dem Fachmann auf einfache Weise eine Reagenzienzusammenstellung an die Hand gegeben, um die Bindung eines erfindungsgemäßen Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 an einen festen Träger ohne großen Aufwand zu ermöglichen. Damit vereinfacht ein solcher Kit die Durchführung eines erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahrens. Partikelförmige feste Träger wie z. B. magnetische Beads sind wegen der genannten Vorteile besonders bevorzugt.
Ein bevorzugtes Kit zum Nachweis von Salmonella spp., insbesondere Salmonella Typhimurium, enthält mindestens ein mit einem detektierbaren Marker gekoppeltes erfindungsgemäßes Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
Bestandteil der Erfindung sind auch Nukleinsäuren mit mindestens einem für eines der erfindungsgemäßen Peptide gemäß einem der Anspruche 1 bis 5, codierenden Abschnitt. Vorteilhaft ermöglichen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren es, auf einfache Weise die erfindungsgemäßen Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 herzustellen, beispielsweise indem die für die Peptide codierenden Nukleinsäuren in geeignete Organismen (z. B. Escherichia coli) eingebracht und die Peptide so rekombinant gewonnen werden.
In besonders bevorzugten Nukleinsäuren ist der für das erfindungsgemäße Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 codierende Abschnitt mit einer für ein Markerprotein codierenden Nukleinsäure verbunden, so dass ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und dem Markerprotein, z. B. GFP und/oder einem enzymatisch aktiven Amplifikator gebildet wird.
Vorzugsweise enthalten die Nukleinsäuren mindestens eine der Sequenzen SEQ ID NO. 37 bis SEQ ID NO. 108, dabei bedeuten die Nukleotidsymbole nach dem fachüblichen Abkürzungsstandard:

n: a oder c oder g oder t
h: a oder c oder t
r: a oder g
y: c oder t
/: oder

Die Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 37 bzw. SEQ ID NO. 73 codieren dabei für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 1, die Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 38 bzw. SEQ ID NO. 74 für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 usw.
Ausführungsbeispiele
Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne diese einzuschränken. Dabei zeigen
1: Separationserfolg von Salmonella Typhimurium aus einer flüssigen Phase mittels Peptid beladener SiMAG-active Beads

A/pST1, A/pST2 mit Peptid pST1 bzw. PST2 gekoppelte Aminobeads

C/pST1, C/PST2 mit Peptid pST1 bzw. PST2 gekoppelte Carboxylbeads
Ausführungsbeispiel 1:
Erfindungsgemäß konnte ein Pool von Peptiden zur bioaffinen, spezifischen Bindung an Salmonella Typhimurium mittels Phagendisplay Technik ermittelt werden. Dazu wurde eine kommerziell erhältliche M13 Phagenbibliothek (Ph.D.-12, New England Biolabs) eingesetzt, die an der Oberfäche der Phagen zufällige Peptide mit einer Länge von 12 Aminosäuren präsentiert. Die Peptide werden zusammen mit einem kurzen Spacer (Gly-Gly-Gly-Ser) am N-terminalen Ende des Hüllproteins gpIII expressiert (Typ 3 Bibliothek). Die Bibliothek hat laut Herstellerangaben eine Diversität von 2,7·10⁹ verschiedenen Peptidsequenzen. In mehreren Panningrunden wurden die an Salmonella Typhimurium bindenden Phagen isoliert. Zur Erhöhung der Spezifität wurden außerdem entsprechende Subtraktionsrunden durchgeführt.
Die DNA der spezifisch bindenden Phagen wurde isoliert, mittels PCR vervielfältigt, aufgereinigt und anschließend von der Firma Seqlab GmbH sequenziert.
Ausführungsbeispiel 2:
Die ausgewählten Peptide pST1 und PST2 wurden synthetisiert (Seqlab GmbH) und an paramagnetischen Amino- bzw. Carboxylbeads (SiMAG-active, chemicell GmbH) immobilisiert.
Ausführungsbeispiel 3:
Für die Biomagnetische Separation der Salmonella Typhimurium Zellen wurde zunächst eine Übernachtkultur von Salmonella Typhimurium DSM 554 angelegt.
Die Zellkonzentration der Kultur wurde mittels Spectrophotometer (Genesys 10 UV, ThermoSpectronic) bei einer Wellenlänge von 577 nm bestimmt. Dabei entspricht der Wert der Optische Dichte OD₅₇₇ = 0,1 einer Zellkonzentration von ca. 10⁸ Zellen ml^–1. Ausgehend von der gemessenen Optischen Dichte der Kultur wurde die Zellkonzentration durch Verdünnung mit Phosphate-buffered saline (0,01 M; pH 7,4) auf einen Wert von 10³ Zellen ml^–1 eingestellt.
Aliquots von 1 ml der verdünnten Zellsuspension wurden in einem 2 ml Reaktionsgefäß mit je 55 μl der Peptid beladenen Magnetbeads 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Bead-Zellverbände im magnetischen Feld (MPC^®-S, Dynal) aus der flüssigen Phase abgeschieden. Der Überstand wurde entfernt. Das Bead-Zell-Pellet wurde 2-mal mit PBS-Tween (0,01 M; pH 7,4; 0,05% Tween 20) gewaschen und in 1 ml PBS resuspendiert. Zur Bestimmung des Anteils der separierten Zellen wurden je 100 μl des resuspendierten Bead-Zell-Pellets auf ENDO-Agar (Merck) Platten ausgestrichen. Gleichzeitig wurden 100 μl der verdünnten Übernachtkultur als Referenz zur Ermittlung des Anteils separierter Zellen ausgestrichen.
Die Ergebnisse der Biomagnetischen Separation mit den Peptiden pST1 und pST2 sind in 1 dargestellt.
In den Versuchen hat sich gezeigt, dass es mit Hilfe der isolierten Ligandenpeptide pST1 und pST2 möglich ist, Salmonella Typhimurium erfolgreich aus flüssiger Phase zu immobilisieren. Es wird weiterhin deutlich, dass aufgrund der höheren Separationserfolge eine Kopplung der Peptide pST1 und pST2 an Aminobeads der Kopplung an Carboxylbeads vorzuziehen ist.

Claims

Salmonella spp. bindendes Peptid ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis NO. 3, SEQ ID NO. 5 bis NO. 8, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 14 bis NO. 16, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 20 bis NO. 26, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 30 bis NO. 33.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen detektierbaren Marker enthält.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es an einen Träger gebunden ist.
Peptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass superparamagnetische Mikro- bzw. Nanopartikel (Beads) als Träger verwendet werden.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es an pharmazeutisch wirksames Agens gebunden ist.
Verfahren zur Immobilisierung bzw. Anreicherung von Salmonella spp. aus einer Probe mit den folgenden Schritten: a. Binden mindestens eines Peptides ausgewählt aus Sequenzen SEQ ID NO 1 bis 36 an einen Träger b. Kontaktieren des trägergebundenen Peptides mit der Probe.
Verfahren zum Nachweis von Salmonella spp. in einer Probe mit den folgenden Schritten: a. Kontaktieren mindestens eines markierten Peptides ausgewählt aus Sequenzen SEQ ID NO 1 bis 36 mit der Probe b. Nachweisen des detektierbaren Markers des Peptides.
Verwendung mindestens eines Peptids ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID NO 1 bis 36 zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Salmonella spp.
Kit zum Anreichern von Salmonella spp., mindestens enthaltend: a. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 b. einen Träger
Kit zum Nachweis von Salmonella spp., mindestens enthaltend ein Peptid nach Anspruch 2
Nukleinsäure mit einem für ein Peptid nach Anspruch 1 kodierenden Abschnitt.
Nukleinsäure nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus den Sequenzen SEQ ID NO. 37 bis NO. 39, SEQ ID NO. 41 bis NO. 44, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 50 bis NO. 52, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 56 bis NO. 62, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 66 bis NO. 69, SEQ ID NO. 73 bis NO. 75, SEQ ID NO. 77 bis NO. 80, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 86 bis NO. 88, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 92 bis NO. 98, SEQ ID NO. 100.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID NO. 37 bis NO. 108 zur Herstellung eines Peptides ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID NO 1 bis 36 zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Salmonella spp.