TWI826663B - 以重組內孢子或細菌作為感測元件以偵測化合物、抗體或蛋白質之方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供偵測樣品中分析物的存在之方法及系統。特定言之，本發明提供諸如診斷套組之系統，以偵測樣品中分析物的存在；該系統包含(a)表現一或多個重組蛋白於其表面之重組細菌或孢子，其中該重組蛋白特異性結合至該分析物，該結合係直接或透過特異性結合該重組蛋白及該分析物之結合劑；及(b)可被偵測之訊號產生物質。

Description

以重組內孢子或細菌作為感測元件以偵測化合物、抗體或蛋白質之方法

本發明係關於以表現重組蛋白於孢子或細菌表面之重組孢子或細菌檢測樣品中分析物的存在之新穎方法，及利用此重組孢子或細菌之偵測系統。

將蛋白質及肽呈現於微生物表面逐漸成為克服生物製程、惡劣條件之工業製程、疫苗開發及環境保護中問題的基本工具(Kim及Schumann, 2009)。表面呈現需要經由基因工程技術在活細胞細胞膜表面上表現靶蛋白。為了成功呈現，靶蛋白需與錨定蛋白(anchor protein)融合(Van Bloois等人, 2011)以便呈現易位-不相容(translocated-incompatible)及多聚蛋白(Kim及Schumann, 2009)。第一個表面呈現系統在1985年由George P. Smith等人開發，其中使用絲狀噬菌體M13在噬菌體表面上表現抗體。該系統提供用於抗原生產之新技術(Smith, G. P., 1985)。此後表面呈現技術已應用於諸如細菌、酵母及孢子之其他生物體。

已對革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)之表面呈現系統進行廣泛研究。在彼等細菌中，已經廣泛研究大腸桿菌(E. coli )且發現其在細胞表面上呈現異源蛋白(Francisco 1992, Georgiou 1996)。George Georgiou教授小組構建含有以下之融合蛋白：(i)成熟脂蛋白(大腸桿菌之外膜蛋白)之訊號序列及前九個N端胺基酸；(ii) OmpA(大腸桿菌之另一外膜蛋白)之胺基酸46-159及(iii)完整β-內醯胺酶。已證實此融合蛋白在大腸桿菌外部表現並展現β-內醯胺酶活性(Francisco 1992, Georgiou 1996)。大腸桿菌之表面呈現具有多種不同應用，諸如全細胞生物催化劑、生物吸附劑、肽篩選、疫苗生產及抗體生產(Nguyen 2014)。

與其他生物體之系統相比，孢子之表面呈現就高穩定性、容易純化及回收以及表現大分子之能力而言具有優勢。鑑於異源性錨定蛋白無法跨越任何膜之事實，因係於胞內生產，胞子較非孢子生產者有利。此外，由於具堅硬孢子外套，呈現於孢子上之蛋白質及酵素對工業程序過程中之惡劣條件(諸如高溫、化學物質及輻射)具有抗性；該等蛋白質及酵素亦可在室溫下長時間儲存(Kim及Schumann, 2009)。

枯草桿菌(Bacillus subtilis )為好氧的革蘭氏陽性細菌(Gram-positive bacterium)。其廣泛存在於土壤、湖泊、海洋、動物及植物。雖然已在人類腸道中發現枯草桿菌，其不具病原性。在實驗室中最常使用之枯草桿菌菌株為菌株168、PY79、W23及NCIB3610，其中菌株168之基因組業經完全定序。枯草桿菌之尺寸為約0.7至0.8×3 μm；其無莢膜、表面上遍佈鞭毛且為可移動者。

在極端條件下，枯草桿菌可進入孢子形成(sporulation)且在惡劣環境條件下長時間存活。首先，該等細胞分裂以產生較小前孢子(prespores)及較大母細胞，該等較小前孢子及較大母細胞藉由兩者之間的膜分隔開。在下一階段中，該母細胞吞噬該前孢子，且該前孢子表面產生肽聚糖皮質及孢子外套。隨後該前孢子在成熟後自該母細胞釋放(Mohab A. Al-Hinai等人, 2015)。孢子具有複雜多層結構，其主要由四層組成：含有重要遺傳物質(DNA)之最內核(innermost core)，其由內膜(inner membrane)包圍；具有肽聚糖作為主要組分之肽聚糖皮質；由包括基底層(basement layer)、內部外套(inner coat)、外部外套(outer coat)及外殼(crust)之若干蛋白質層構成之孢子外套；及外膜(exosporium)(Setlow, P., 2014；Henriques等人, 2004)。

枯草桿菌孢子含有至少70種不同孢子外套蛋白，該等蛋白包括CotA、CotB、CotC、CotD、CotE、CotF、CotG、CotH、CotJA、CotJC、CotM、CotS、CotSA、CotT、CotX、CotY、CotZ、SpoIVA、SpoVID、YabG及YrbA (McKenney等人, 2013；Takamatsu及Watabe, 2002)，但最佳錨定蛋白為外部外套蛋白。

多種因素影響枯草桿菌孢子表面呈現系統之效率，包括錨定蛋白、靶蛋白、連接子、表現載體及其他實驗參數。近年來，已報導許多錨定蛋白用於枯草桿菌孢子表面呈現，包括CotB、CotC、CotG、CotZ、CotX、CotY、CotA、OxdD、CotE、CotZ、CgeA及其他外套蛋白。在此等蛋白中，已經深度研究CotB、CotC及CotG。CotB為用於孢子表面呈現技術之第一種孢子外套蛋白，且作為錨定蛋白之不同長度之CotB已成功地將外源蛋白定位於孢子表面上(Isticato R.等人, 2001)。連接肽可形成穩定螺旋結構以解決在錨定蛋白與靶蛋白之間具有剛性結構之問題。大量研究已顯示在建構重組載體時包括可撓性連接肽可有效調控融合酵素之功能。可藉由涉及蛋白質之N端、C端及夾層結構以融合外源及錨定蛋白。透過在孢子形成過程中錨定之方向決定融合方法，該方法將靶蛋白定位於表現錨定蛋白之孢子表面上。枯草桿菌可藉由重組及非重組融合方法進行枯草桿菌孢子表面呈現(Isticato R, Ricca E., 2014)。重組方法主要基於利用整合質體或附加型質體(episomal plasmid)將編碼外來及錨定蛋白之基因融合。隨著誘導孢子形成過程，可將外來蛋白成功地呈現於孢子表面而不影響孢子之結構及功能。

酵素結合免疫吸附分析法 (ELISA)在1971年由Engvall及Perlmann開發(Engvall及Perlmann 1972)，且該分析法此後已經廣泛用於偵測蛋白質、抗體及化合物。該分析法利用針對分析物之抗體來偵測樣品中之抗體，且使酵素(諸如辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP))與抗體之一結合，該酵素與其受質反應而產生可偵測訊號以定量待測試之分析物(Lequin 2005)。ELISA為生物技術中重要之快速篩選診斷工具。

最常見類型之ELISA為三明治ELISA，其中使用來自不同物種之兩種抗體以結合至分析物之不同部分(Schmidt, 2012)。該方法具有極佳特異性及高可靠性。在此方法中，作為捕捉抗體之來自物種A之抗體經附著至固體表面。之後，添加樣品以使現有抗原結合至該捕捉抗體，隨後添加作為偵測抗體之來自物種B之抗體，該偵測抗體亦結合至該抗原。隨後添加特異性結合至來自物種B之抗體的二級抗體；該二級抗體係與酵素連結。最後，添加該酵素之受質，且其反應產生可偵測訊號。最常用之訊號為顏色變化。其他訊號包括螢光訊號或電化學訊號。

另一常用之ELISA為競爭型ELISA，其適用於化合物(半抗原)(Chittamma 2013)。由於化合物太小而無法與兩種不同抗體結合，三明治ELISA不適用於化合物。競爭型ELISA可以不同方式進行。於一種方法中，首先將化合物附著至孔之底部，其中該化合物之結構與測試化合物之結構類似或相同。將測試化合物與抗體在另一試管中混合。在一段時間之後，將混合物添加至以上孔中。此時，該測試化合物與在孔之底部的化合物競爭結合該抗體。隨後洗滌孔以移除未與孔之底部之化合物結合的抗體。測試化合物含量越高，保留於孔中之抗體含量越少。隨後添加與酵素連結之二級抗體，且該酵素與其酵素之反應產生可偵測訊號。測試化合物含量越高，該訊號越弱。

側層流分析法(LFA)為以紙為基礎的平台，其用於偵測及定量複雜混合物中之分析物，其中將樣品置放於測試裝置上且結果通常在5至30分鐘內呈現。LFA之低開發成本及易於生產已使其應用擴展至需要快速測試之多個領域。基於LFA之測試廣泛用於醫院、醫師辦公室及臨床實驗室，以用於特異性抗原及抗體之定性及定量偵測。使用LFA可測試多種生物樣品，包括尿液、唾液、汗液、血清、血漿、全血及其他體液。採用基於LFA之測試之其他產業包括獸醫學、品質控制、食品生產中之產品安全性及環境健康及安全。此等利用領域使用快速測試以篩選尤其動物疾病、病原體、化學物質、毒素及水污染物。

LFA背後之原理很簡單：含有相關分析物之液體樣品(或其萃取物)在無外部力(毛細作用)輔助之情況下移動通過聚合物試紙之各區域，在該等區域上附著有可與該分析物相互作用之分子。典型側層流測試試紙由重疊之膜組成，該等重疊之膜經安裝在背板上以提供更佳穩定性及操作。將樣品施用於吸附樣品墊上試紙之一端，該吸附樣品墊浸漬有使樣品適合於與偵測系統相互作用之緩衝鹽及界面活性劑。該樣品墊確保存在於樣品中之分析物將能夠結合至結合物之捕捉試劑及膜上。經處理樣品經由結合釋放墊移動，該結合釋放墊含有對目標分析物具有特異性且與著色或螢光粒子(最常為膠態金及乳膠微球體)結合之抗體。該樣品以及結合至目標分析物之結合抗體沿試紙移動至偵測區域。此為具有成行固定之特異性生物組分(大部分為抗體或抗原)之多孔膜(通常由硝化纖維素構成)。其作用為與結合至結合抗體之分析物反應。樣品分析物之辨識導致測試線出現合適反應，而對照線上之反應指示液體正確流經該試紙。可藉由眼睛或使用專用讀取器來評定由出現不同強度之線表示的讀數。液體藉由試紙材料之毛細力而流過裝置，且於試紙末端附著吸收墊以維持此移動現象。吸收墊之作用為芯吸過量試劑且防止液體回流。

流式細胞分析技術(FCM)為用於量測液相中懸浮細胞或粒子之分析技術。其可快速偵測及分析單一粒子之各種物理特性，諸如粒度、密度、內部結構及相對螢光強度。可藉由光電系統記錄細胞之散射光訊號及螢光訊號來獲得細胞之特徵。懸浮液中直徑為0.2至150 µm之粒子或細胞適合用於流式細胞分析技術(Rowley, T, 2012)。流式細胞分析技術廣泛用於各種研究領域，諸如分子生物學、病理學、免疫學、植物學及海洋生物學。

流式細胞分選可選擇、富集、分配或劃分目標細胞、病毒、物體或粒子之群體。選擇標準包括個別細胞之可量測特性，該等特性可在藉助或不藉助與細胞聯結或可經引起而與細胞聯結之化學試劑或複合物或物體的情況下自細胞外部偵測。例如，細胞特性可藉由偵測及/或量化細胞與一或多種標記物(諸如發螢光或經修飾以顯現螢光之分子、複合物或物體)之聯結來量測或估計。此類螢光分子、複合物及/或物體可基於細胞之定性或定量特性而與細胞差異性聯結，該等特性包括其關於以下之組成：蛋白質、脂質、磷蛋白、糖蛋白、磷脂、糖脂、核酸(包括核酸之數量、序列或組織)、碳水化合物、鹽/離子及細胞中、細胞上或與細胞相聯結之任何其他分子。另外，此類螢光分子、複合物及/或物體可基於細胞之物理或生理學特徵而與細胞差異聯結，該等特徵之實例包括但不限於膜滲透率、膜組成、膜流動性、化學或薄膜電位、生存力、化學梯度、移動性、氧化電位或狀態之降低及其他參數或特性。

基於全細胞之生物感測器便宜且易於操作，且可作為快速篩選之替代方案(Bereza-Malcolm等人, 2015；Mehta等人, 2016)。在該方法中，將合成基因併入細胞中，其中靶向特定化合物且產生易偵測訊號(Liu等人, 2014；Tian等人, 2017)。例如，化學活化之螢光素酶基因表現(calux)可用於偵測特定化學物質(Sany等人, 2016)。該細胞含有螢光素酶基因及其調控DNA。在待測試之化學物質結合至其相應受體蛋白之後，該複合物連結至調控DNA並誘導螢光素酶表現。已將Calux用於偵測戴奧辛(dioxin)(Sany等人, 2016；Xu等人, 2018)、雙酚A(Dusserre等人, 2018)、雜環芳胺(Steinberg等人, 2017)及其他化合物。針對戴奧辛，偵測耗時約24小時(不包括樣品製備時間)，且偵測極限為1 pM (Sany等人, 2016)。

抗生物素蛋白(avidin)為源自禽類與兩棲類之蛋白質，其對生物素(biotin)(在多種真核生物過程中扮演角色之輔因子)展現相當之親和力。抗生物素蛋白及其他生物素結合蛋白(包括鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)及中性抗生物素蛋白(neutravidin))可結合至多四個生物素分子。抗生物素蛋白-生物素複合物為已知蛋白質與配位體間最強的非共價交互作用(Kd=10^-15 M)。生物素與抗生物素蛋白之間的鍵形成極快速，且一旦形成，則不受pH、溫度、有機溶劑或其他變性劑之極值的影響。生物素及抗生素蛋白之此等特徵—由鏈黴抗生物素蛋白及中性抗生物素蛋白共有之特徵—適用於純化或偵測結合至該交互作用之任一組分之蛋白質。

半抗原為小分子量化合物，其僅在附接於載體蛋白時才可引起免疫反應。於體內，半抗原容易結合至諸如白蛋白之血清蛋白。白蛋白與半抗原之合併分子量需超過3000 MW才能刺激免疫系統。該免疫反應係同時針對半抗原與載體蛋白。通常已知之半抗原包括生物素、巴拉松-甲基(parathion-methyl)、戴奧辛、雷托巴胺(ractopamine)、三聚氰胺及各種有毒藥物。

諸如氣相(或液相)層析質譜法(GC-MS)及高效液相層析法(HPLC)之分析技術為最常見之偵測化合物、抗體及/或蛋白質之方法。儘管此等方法靈敏且準確，其用途受限於程序複雜、設備成本高及人員訓練密集。目前，用於化合物、抗體及/或蛋白質之快速篩選方法包括酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)及側層流分析法(LFA)。兩種方法相對便宜且快速。然而，仍需要進一步改良以上方法之偵測極限。

本發明係使用重組孢子或細菌係作為ELISA、LFA、流式細胞分析技術及其他方法之感測元件。此偵測方法具數種優勢，諸如操作較容易、價格較低及偵測極限較低/靈敏度較高。

因此，本發明提供偵測樣品中分析物的存在之方法及系統。特定言之，本發明提供諸如診斷套組之系統，以偵測樣品中分析物的存在；該系統包含(a)表現一或多個重組蛋白於其表面之重組細菌或孢子，其中該重組蛋白特異性結合至該分析物，該結合係直接結合或透過特異性結合該重組蛋白及該分析物之結合劑結合；及(b)可被偵測之訊號產生物質。

在一態樣中，該分析物係化合物、抗體或蛋白質。

在一實施例中，由重組細菌表現或表現於重組孢子表面之一或多個重組蛋白包含選自以下之蛋白質：鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、增強型綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein; eGFP)、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、過氧化氫酶、蟲漆酶(laccase)、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、β-內醯胺酶、與分析物或結合劑特異性或非特異性結合的蛋白質、抗體、抗原、蛋白A、蛋白G、蛋白L及蛋白A/G，較佳為eGFP及/或鏈黴抗生物素蛋白。

在另一實施例中，重組蛋白係融合蛋白，其中該融合蛋白較佳包含重組孢子之外套蛋白及外源蛋白或重組細菌之膜蛋白(或人工膜蛋白)及外源蛋白，其中該外源蛋白較佳為鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白L及/或蛋白A/G。

在又一實施例中，該重組孢子係由芽孢桿菌種(Bacillus species)，較佳枯草桿菌(Bacills subtilis )，更佳選自品系168、PY79、W23及NCIB3610之枯草桿菌品系所產生。在一較佳實施例中，由重組孢子表現之融合蛋白包含選自CotA、CotB、CotC、CotE、CotG、CotW、CotX、CotY及CotZ之外套蛋白。

在一態樣中，重組細菌係源自大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcal aureus )、木糖葡萄球菌(Staphylococcal xylosus )、肉葡萄球菌(Staphylococcal carnosus )、淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae )、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica )、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis )或格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii )，較佳為大腸桿菌。

在另一態樣中，結合劑係抗分析物之抗體，較佳為結合了生物素或其他蛋白質結合分子之抗體。

在又一態樣中，訊號產生物質包含染劑(dye)、螢光染劑、螢光蛋白、膠態金奈米粒子、有顏色的奈米粒子或可將未提供訊號之受質轉化為提供訊號之受質之酵素。在一實施例中，訊號產生物質係偵測重組蛋白或結合劑與分析物結合之偵測劑。於另一實施例中，偵測劑係特異性結合分析物之抗體或抗原。

在又一態樣中，該系統進一步包含與分析物競爭結合重組蛋白或結合劑之競爭劑。在一實施例中，該結合劑包含訊號產生物質。

在另一態樣中，該系統進一步包含(a)具正區域及負區域之紙膜，其中抗體、抗原或競爭劑經固定於該正區域及/或該負區域以偵測樣品中分析物存在與否；或(b)ELISA盤，其具有固定於其上之可結合至分析物、抗體、抗原或競爭劑之蛋白質，以偵測樣品中分析物存在與否。較佳地，該紙膜係側層流分析法所慣用之硝化纖維素紙膜。

在一較佳態樣中，重組蛋白與分析物之結合係藉由流式細胞分析技術、側層流分析法或ELISA偵測。

本發明進一步提供以上述系統偵測樣品中分析物之方法。

定義

除非另外定義，本文中所使用之技術及科學術語與本發明所屬技術中具有通常知識者一般理解之含義相同。

熟習此項技術者將瞭解與本文所述類似或等效之多種方法及材料可用於實施本發明。實際上，本發明絕不限於所述方法及材料。為了本發明，以下術語定義如下。

如本文中所使用之術語「分析物」係指待偵測存在或不存在於樣品中之物質，該物質可為化合物、抗體或蛋白質。

術語「細菌(bacterium或bacteria)」係指所有革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌，包括但不限於大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、淋病雙球菌、腸道沙門氏菌、乳酸乳球菌及格氏鏈球菌。

術語「重組」係指體外合成或以其他方式操作之聚核苷酸(「重組聚核苷酸」)，且係指使用重組聚核苷酸以於細胞或其他生物系統產生由彼等聚核苷酸編碼之基因產物的方法。例如，可將經選殖聚核苷酸插入至適合之表現載體(諸如細菌質體)，並以該質體轉型適合之宿主細胞。包含該重組聚核苷酸之宿主細胞稱為「重組宿主細胞」或「重組細菌」。該基因隨後在重組宿主細胞中表現以產生例如「重組蛋白/多肽」。

術語「孢子」包括常用於監測滅菌過程之任何孢子及內孢子。例如，可使用來自枯草桿菌、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans )、產氣莢膜芽孢梭菌(Clostridium perfringens )、產芽孢梭菌(Clostridium sporogenes )或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus )之孢子。來自枯草桿菌菌株168、PY79、W23及NCIB3610之孢子尤其適用。孢子可未純化或經純化。例如，可藉由對水性懸浮液進行差速離心將枯草桿菌孢子分離成重孢子及輕孢子。在2, 000×g下離心12至15分鐘之後，重孢子集結成粒(pellet)，而輕孢子保持於懸浮液中。可藉由在2,000×g下離心來自第一次離心之上清液30分鐘來集結輕孢子。可藉由透過WhatmanGF/D玻璃纖維過濾器過濾重孢子之稀懸浮液以移除小塊瓊脂、變性核蛋白及在第一次離心中與孢子一起沈降之其他殘渣來進一步純化重孢子。

如本文中所使用之術語「外源」意謂源自宿主菌株外部，且術語「外源蛋白」包括蛋白質、肽及多肽。

由本發明之重組細菌或孢子表現之「重組蛋白」包含選自但不限於以下之蛋白質：鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、過氧化氫酶、蟲漆酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、β-內醯胺酶、特異性或非特異性結合至分析物或結合劑之蛋白質、抗體、抗原(較佳對分析物具有特異性)、蛋白A、蛋白G、蛋白L及蛋白A/G。

術語「外套蛋白」在本文中以最廣泛意義使用且包括存在於孢子外套之外層且暴露於孢子表面上之任何天然蛋白質，及此類天然蛋白質之功能片段及功能胺基酸序列變異體。該術語包括芽孢桿菌屬之任何孢子形成之種及亞種之天然外套蛋白序列，及此類天然外套蛋白序列之功能片段及功能胺基酸序列變異體。在此情形下，術語「天然」用以指天然序列多肽，且不指其來源或製備模式。因此，天然外套蛋白可從其天然來源分離，但亦可藉由其他手段(例如合成及/或重組方法)製備。功能胺基酸序列變異體包括嵌合變異體，該等嵌合變異體包含兩個或更多個天然外部暴露之孢子外套蛋白序列或其片段之融合體。較佳之外套蛋白包括CotA、CotB、CotC、CotE、CotG、CotW、CotX、CotY及CotZ。

術語「孢子外套蛋白B」及「CotB蛋白」可互換使用，且係指外部暴露之孢子外套蛋白，其特徵為C端之高度疏水性區域，且經分類為CotB，諸如基於序列同源性之CotB1或CotB2蛋白。較佳地，本文中之CotB蛋白彼此間及與外部外套層之枯草桿菌孢子外套之42.9-kDa組分的胺基端三分之二間具顯著胺基酸序列一致性。本文中之代表性CotB蛋白序列係如SEQ ID NO:1所示，其特定地包括於本文中之孢子外套蛋白B(CotB)之定義。

術語「變異體」及「胺基酸序列變異體」可互換使用，且包括天然序列之取代、缺失及/或插入變異體。在一較佳實施例中，蛋白質變異體與天然序列具有至少約80%胺基酸序列一致性、或至少約85%胺基酸序列一致性、或至少約90%胺基酸序列一致性、或至少約92%胺基酸序列一致性、或至少約95%胺基酸序列一致性、或至少約95%胺基酸序列一致性、或至少約98%胺基酸序列一致性。

「功能」片段或變異體保有在孢子(諸如芽孢桿菌孢子)表面上增殖且穩定地呈現之能力。

術語「表面上之蛋白質表現」在本文中以最廣泛意義使用，且包括將蛋白質(諸如孢子外套蛋白或重組蛋白)完全及部分暴露。

術語「融合」在本文中用於指在一個多肽鏈中不同來源之胺基酸序列的組合，其藉由其編碼核苷酸序列之框內(in-frame)組合。除融合至多肽鏈末端之一外，術語「融合」明確涵蓋內部融合體，亦即在多肽鏈內插入不同來源之序列。

術語「化合物(compound)」係指化學化合物(chemical compound)，諸如生物素、戴奧辛、地高辛(digoxin)及其他蛋白質結合或抗體結合化學物質。

術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以意指胺基酸殘基之聚合物。該等術語應用於其中一或多個胺基酸殘基為對應於天然存在胺基酸之人工化學類似物的胺基酸聚合物，以及天然存在之胺基酸聚合物。在本文中胺基酸可由其習知之三字母符號或命名委員會(Nomenclature Commission)所建議之名詞表示。同樣地，核苷酸可由其通常接受之單字母代碼(亦即，由IUPAC-IUB所建議之一個字母符號)表示。

「聚核苷酸」及「核酸」係指由經由磷酸二酯鍵連接之核苷酸單元(核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、相關天然存在之結構變異體及其合成非天然存在之類似物)構成的聚合物、相關天然存在之結構變異體及其合成非天然存在之類似物。因此，該術語包括核苷酸聚合物，其中核苷酸及在其之間的連結包括非天然存在之合成類似物。應瞭解，在上下文需要時，當核苷酸序列由DNA序列(亦即A、T、G、C)表示時，此亦包括「U」替代「T」之RNA序列(亦即A、U、G、C)。"

如本文中所使用，「抗體」係指包含一或多個多肽之蛋白質，該多肽實質或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因之片段編碼。術語抗體用以意謂全抗體及其結合片段。已知免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因，以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，其又分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。典型免疫球蛋白(例如抗體)結構單元包含四聚體。各四聚體由兩個相同的多肽鏈對構成，各對具有一個「輕」鏈(約25 KDa)及一個「重」鏈(約50至70 KDa)。各鏈之N端定義主要負責抗原辨識之約100至110或更多個胺基酸之可變區。術語可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)分別係指此等輕鏈及重鏈之可變區。在本申請案中，術語「抗體」特定地涵蓋但不限於單株抗體、多株抗體及抗體片段。

「抗原」一般係指能夠在宿主中引發抗體形成的物質或能夠產生與該物質反應之特定淋巴球群體的物質。抗原可包含對宿主而言為外來的大分子(例如多肽、蛋白質及多醣)。

術語「結合劑」係指特異性結合至由重組細菌表現或在重組孢子表面上表現之重組蛋白及待偵測分析物的試劑，從而使得重組蛋白與該分析物經間接連接或連結。例如，該結合劑可為針對分析物之抗體。較佳地，該抗體與生物素、地高辛或其他蛋白質結合分子結合。在一個實施例中，上述蛋白質結合分子透過特定蛋白質-蛋白質交互作用結合至由重組孢子或細菌表現之其結合搭配物(binding partner)。替代地，抗體可透過其恆定區與由重組孢子或細菌表現之重組蛋白結合。

術語「生物素化」係指將生物素附接至蛋白質及其他大分子之過程 (Barat及Wu，2007)。

當針對抗體與蛋白質或肽之交互作用使用時，術語「特異性結合(specific binding)」及「特異性結合(specifically binds)」意謂該交互作用取決於蛋白質上特定結構(亦即，例如抗原決定子或抗原決定基)之存在；換言之，抗體辨識且結合特定蛋白質結構而非整體蛋白質。例如，若抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則在含經標記「A」及抗體之反應中存在含有抗原決定基A(或游離、未經標記A)之蛋白質將減少結合至該抗體之經標記A的量。

術語「偵測劑」係指用於偵測在由重組細菌表現或在重組孢子表面上表現之重組蛋白或結合劑與待偵測分析物之間的直接或間接結合的試劑。較佳地，該偵測劑為特異性結合至分析物之抗體或抗原。更佳地，該偵測劑包括對待偵測分析物具特異性之初級抗體及對該初級抗體具特異性之二級抗體。在一個實施例中，偵測劑包含訊號產生物質。此類偵測可以此項技術中習知之技術進行，該等偵測技術包括但不限於流式細胞分析技術、側層流分析法及ELISA。

術語「訊號產生物質」係指提供可藉由眼睛或偵測器(諸如螢光顯微鏡)偵測之訊號的物質。此類訊號產生物質包括但不限於染劑、螢光染劑、螢光蛋白、膠態金奈米粒子、有顏色之奈米粒子或可將未提供訊號之受質轉化為提供訊號之受質的酵素。該訊號產生物質可為用於偵測重組蛋白或結合劑與分析物之結合的偵測劑。

術語「競爭劑」係指與分析物競爭結合至重組蛋白或結合劑的試劑。例如，該競爭劑可與分析物(諸如化合物)相同，但其經螢光物質標記以便變成訊號產生物質或其與載體蛋白連接。

術語「載體蛋白」係指在反應性側鏈中含有足夠胺基酸殘基以與目標化合物結合之免疫原性蛋白或肽。載體蛋白可選自但不限於以下：牛血清白蛋白(BSA)、血清球蛋白、白蛋白、卵白蛋白及諸多其他。亦可使用合成多肽，諸如聚-L-麩胺酸。

術語「標記物」或「經…標記」在本文中用以指可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學手段偵測之任何組合。此類標記物包括用於以經標記鏈黴抗生物素蛋白結合物染色之生物素、磁珠(例如，戴諾磁珠 (Dynabeads))、螢光染劑(例如，螢光素、德克薩斯紅 (Texas Red)、若丹明 (rhodamine)、綠色螢光蛋白及其類似物)、放射性標記物(例如，³ H、¹²⁵ I 、³⁵ S、¹⁴ C或³² P)、酵素(例如，辣根過氧化酶 (HRP)、鹼性磷酸酶及在ELISA常用之其他者)及量熱(calorimetric)標記物，諸如膠態金奈米粒子或經著色玻璃或塑膠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠粒。教示此類標記物之使用的專利包括但不限於美國專利第3,817,837號、第3,850,752號、第3,939,350號、第3,996,345號、第4,277,437號、第4,275,149號及第4,366,241號(全部以引用之方式併入本文中)。本發明中所涵蓋之標記物可藉由許多方法偵測。例如，可使用照相軟片或閃爍計數器偵測放射性標記物，可使用光偵測器偵測所發射光以偵測螢光標記物。通常藉由為酵素提供受質及偵測藉由該酵素作用於該受質產生之反應產物以偵測酵素標記物，及單純藉由視覺觀察經著色標記物以偵測量熱標記物。

術語「流式細胞分析技術」係指藉由光學或電子偵測器透過偵測溶液中標記於單一細胞或小粒子中或單一細胞或小粒子上之螢光訊號來定量及/或分選目標物質的技術。

術語「側層流分析法」係指使用膠體金作為顯色劑，基於抗原與抗體間的特異性及免疫親和力進行偵測的分析法。在此類分析法之一實例中，首先將針對目標物質之抗體固定於硝化纖維素紙膜之測試線，並將針對上述針對目標物質之抗體的二級抗體固定於紙膜上之對照線；隨後將膠態金粒子及針對該目標物質之另一抗體結合並固定於結合釋放墊上。當樣品含有目標物質時，結合釋放墊上之膠體金-針對該目標物質之抗體結合物將結合該目標物質，且一旦該複合物到達測試線，測試線中針對該目標物質之抗體將結合上述複合物且導致呈色。固定於對照線之二級抗體可結合針對該目標物質結合物之膠態金抗體並作為正對照。在本發明中，抗體、抗原或競爭劑可固定於正區域及/或負區域以偵測樣品中分析物存在與否。例如，選自以下之一或多種物質可經固定於紙膜上之正或負區域：針對分析物之抗體、載體蛋白、孢子、細菌、孢子或細菌上之重組蛋白或結合劑、競爭劑及由分析物辨識之抗原。

術語「ELISA」係指使用以固定於培養盤之針對目標物質之抗體的分析法。當樣品含有目標物質時，該目標物質透過抗體與目標物質間的特異性結合至ELISA培養盤上之抗體。隨後將與酵素結合之針對該目標物質的另一抗體添加至培養盤。當該抗體結合至目標物質時，結合於其上之酵素將催化其受質，且該化學反應導致呈色，隨後量測其吸光度以計算樣品中該目標物質之濃度。在本發明中，能夠結合至分析物之蛋白質、抗體、抗原或競爭劑可固定於ELISA培養盤上以偵測樣品中分析物存在與否。例如，上述抗體為針對載體蛋白或分析物(諸如蛋白質)之抗體；上述可結合至分析物之蛋白質為透過其恆定區結合至目標抗體之蛋白質；且上述抗原為目標抗體所辨識之抗原。

本發明提供偵測樣品中分析物的存在之系統，其包含(a)表現一或多個重組蛋白於其表面之重組細菌或孢子，其中至少一個該重組蛋白特異性結合至該分析物，該結合係直接結合或透過特異性結合該重組蛋白及該分析物之結合劑結合；及(b)偵測該重組蛋白或結合劑與該分析物之結合之偵測劑。在一較佳實施例中，如下述，以孢子為例，該分析物係樣品中之化合物、抗體或蛋白質。藉由流式細胞分析技術偵測

本發明之偵測系統可用於透過流式細胞分析技術偵測樣品中分析物之存在。舉例而言，當該分析物係生物素或生物素化之化合物時，對其之偵測係透過表現鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白於表面之重組孢子及與該重組孢子之競爭結合進行；該競爭係介於樣品中生物素或生物素化之化合物的生物素部分及加入反應中之螢光素標記之生物素。

在另一實施例中，由該重組孢子表現之重組蛋白包含特異性結合至目標化合物之外源蛋白。結合螢光物質之目標化合物(f-目標物)係作為訊號產生競爭劑，以與樣品中之目標化合物競爭結合該重組蛋白。或者，抗目標化合物之抗體視情況結合生物素或其他蛋白結合分子以作為結合劑。在此情況下，該重組蛋白包含鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述抗目標化合物之抗體之恆定區的蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。該抗目標化合物之抗體亦可以融合蛋白之形式呈現於孢子表面。

當分析物為抗體時，由該重組孢子表現之重組蛋白包含該目標抗體所辨識之抗原。該訊號產生偵測劑為可結合至結合螢光物質之目標抗體的恆定區之抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G。在一實施例中，由該重組孢子表現之重組蛋白包含可結合該目標抗體之恆定區之抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G。該訊號產生偵測劑係結合螢光物質且可為該目標抗體所辨識之抗原。或者，可結合至該目標抗體之恆定區、視情況結合生物素或其他蛋白結合分子之抗體可用作結合劑。在此情況下，該重組蛋白包含鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至抗該目標抗體之抗體的恆定區之蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。

當分析物為蛋白質時，抗目標蛋白之抗體視情況結合生物素或其他蛋白結合分子以作為結合劑。由該重組孢子表現之重組蛋白包含鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述抗目標蛋白之抗體之恆定區的抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。或者，該抗目標蛋白之抗體係以融合蛋白之形式呈現於孢子表面。另一抗目標蛋白之抗體結合螢光物質或與對抗其之抗體(其經螢光標記)連接以作為訊號產生偵測劑。藉由側層流分析法偵測

本發明之偵測系統可用於透過側層流分析法、利用以染劑、螢光染劑、螢光蛋白、膠態金奈米粒子、有顏色的奈米粒子或可將未提供訊號之受質轉換為提供訊號之受質之酵素標記之偵測劑偵測樣品中分析物之存在。

在一實施例中，該偵測劑經金奈米粒子標記。在一實施例中，金奈米粒子與抗孢子抗體結合以形成AuNP-Ab複合物。

當分析物為化合物時，由該重組孢子表現之重組蛋白包含特異性結合至該目標化合物之目標物結合蛋白。該AuNP-Ab複合物(作為訊號產生物質)及該孢子經混和以形成AuNP-Ab-孢子複合物。該目標化合物及載體蛋白經連接以形成載體-目標物，其係作為競爭劑。將抗載體抗體固定於紙膜之負區域，並將抗孢子抗體或抗該重組蛋白之抗體固定於紙膜之正區域(該抗體及與AuNP結合之抗體係結合至孢子上之不同抗原決定基)，其中該負區域離紙膜上樣品加入位置較近，且該正區域離紙膜上吸水墊較近。隨後混合該樣品、上述AuNP-Ab-孢子複合物及該載體-目標物使樣品中含有的目標化合物與該競爭劑可競爭結合該AuNP-Ab-孢子複合物。或者，將上述競爭劑固定於紙膜的負區域，以取代抗載體抗體。在另一實施例中，視情況結合生物素或其他蛋白結合分子之抗目標化合物之抗體係用作結合劑。在此情形下，由重組孢子表現之重組蛋白包含鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述抗目標化合物之抗體之恆定區之蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。該抗目標化合物之抗體亦可以融合蛋白之形式呈現於孢子表面。

在一實施例中，螢光蛋白係呈現於孢子表面。在一較佳實施例中，該螢光蛋白係透過習知重組技術呈現於孢子表面。在一實施例中，該螢光蛋白係增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)或黃色螢光蛋白(YFP)。在一較佳實施例中，該螢光蛋白係eGFP。在另一實施例中，孢子上之螢光訊號係藉由螢光偵測器(諸如螢光顯微鏡)偵測，在無任何AuNP或其他標記物之情形下。

在一實施例中，由重組孢子表現之重組蛋白含有eGFP(作為訊號產生物質)及特異性結合至目標化合物之目標物結合蛋白。該目標化合物及載體蛋白經連接而形成載體-目標物，其係作為競爭劑。將抗載體抗體固定於紙膜之負區域，並將抗孢子抗體或抗該目標物結合蛋白之抗體固定於紙膜之正區域，其中該負區域離紙膜上樣品加入位置較近，且該正區域離紙膜上吸水墊較近。隨後混合該樣品、上述孢子及該載體-目標物，使樣品中含有的目標化合物與該競爭劑可競爭結合孢子上之該目標物結合蛋白。於螢光顯微鏡下觀察正區域或負區域之GFP訊號存在與否。或者，將上述競爭劑固定於紙膜的負區域，以取代抗載體抗體。在另一實施例中，抗目標化合物之抗體視情況結合生物素或其他蛋白結合分子以作為結合劑。在此情形下，由重組孢子表現之重組蛋白包含eGFP(作為訊號產生物質)及鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述抗目標化合物之抗體之恆定區之蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。該抗目標化合物之抗體亦可以融合蛋白之形式呈現於孢子表面。

當分析物為抗體時，由該重組孢子表現之重組蛋白包含該目標抗體所辨識之抗原。上述AuNP-Ab複合物(作為訊號產生物質)及該孢子經混和以形成AuNP-Ab-孢子複合物。將抗該目標抗體之恆定區的抗體固定於紙膜之正區域，並將抗孢子抗體(該抗體及與AuNP結合之抗體係結合至孢子上之不同抗原決定基)或抗該重組蛋白之抗體固定於紙膜之負區域，其中該正區域離紙膜上樣品加入位置較近，且該負區域離紙膜上吸水墊較近。隨後混合該樣品及上述AuNP-Ab-孢子複合物以產生反應。

在一實施例中，由重組孢子表現之重組蛋白包含抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他可結合至目標抗體恆定區之抗體結合蛋白。上述AuNP-Ab複合物(作為訊號產生物質)及孢子經混和以形成AuNP-Ab-孢子複合物。將目標抗體所辨識之抗原固定於紙膜之正區域，並將抗孢子抗體(該抗體及與AuNP結合之抗體係結合至孢子上之不同抗原決定基)或抗該重組蛋白之抗體固定於紙膜之負區域，其中該正區域離紙膜上樣品加入位置較近，且該負區域離紙膜上吸水墊較近。隨後混和該樣品及上述AuNP-Ab-孢子複合物以產生反應。在另一實施例中，可使用可結合至目標抗體恆定區、視情況與生物素或其他蛋白結合分子結合之抗體以作為結合劑。在此情形下，該重組蛋白為鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述結合劑之恆定區之蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。

在一實施例中，螢光蛋白係呈現於孢子表面。在一較佳實施例中，該螢光蛋白係透過習知重組技術呈現於孢子表面。在一實施例中，該螢光蛋白係增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)或黃色螢光蛋白(YFP)。在一較佳實施例中，該螢光蛋白係eGFP。在另一實施例中，孢子上之螢光訊號係藉由螢光偵測器(諸如螢光顯微鏡)偵測，在無任何AuNP或其他標記物之情形下。

在一實施例中，由重組孢子表現之重組蛋白含有eGFP(作為訊號產生物質)及目標抗體所辨識之抗原。將抗目標抗體恆定區之抗體固定於紙膜之正區域，並將抗孢子抗體或抗該重組蛋白之抗體固定於紙膜之負區域，其中該正區域離紙膜上樣品加入位置較近，且該負區域離紙膜上吸水墊較近。隨後混合該樣品及上述孢子以產生反應。在另一實施例中，由重組孢子表現之重組蛋白含有eGFP(作為訊號產生物質)及可結合至目標抗體恆定區之抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。將抗目標抗體所辨識之抗原固定於紙膜之正區域，並將抗孢子抗體或抗該重組蛋白之抗體固定於紙膜之負區域，其中該正區域離紙膜上樣品加入位置較近，且該負區域離紙膜上吸水墊較近。隨後混合該樣品及孢子以產生反應。在另一實施例中，使用可結合至目標抗體恆定區、視情況與生物素或其他蛋白結合分子結合之抗體以作為結合劑。在此情形下，該重組蛋白含有eGFP(作為訊號產生物質)及鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述結合劑之恆定區之蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。

當分析物為蛋白質時，視情況將抗目標蛋白之抗體與生物素或其他蛋白結合分子結合以作為結合劑。由重組孢子表現之重組蛋白包含鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述結合劑之恆定區之蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。上述結合劑與孢子結合以形成孢子-Ab複合物。或者，該抗目標蛋白之抗體係以融合蛋白之形式呈現於孢子表面。上述AuNP-Ab複合物(作為偵測劑)與孢子-Ab複合物反應以形成AuNP-Ab-孢子-Ab複合物。將另一抗目標蛋白之抗體固定於紙膜上之正區域，並將抗該孢子-Ab複合物中恆定區之抗體固定於紙膜上之負區域，其中該正區域離紙膜上樣品加入位置較近，且該負區域離紙膜上吸水墊較近。隨後混和該樣品及上述AuNP-Ab-孢子-Ab複合物以產生反應。在一較佳實施例中，螢光蛋白係透過習知重組技術呈現於孢子表面。在一實施例中，該螢光蛋白係增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)或黃色螢光蛋白(YFP)。在一較佳實施例中，該螢光蛋白係eGFP。在另一實施例中，孢子上之螢光訊號係藉由螢光偵測器(諸如螢光顯微鏡)偵測，在無任何AuNP或其他標記物之情形下。

在一實施例中，抗目標蛋白之抗體視情況與生物素或其他蛋白結合分子結合以作為結合劑。由重組孢子之重組蛋白含有eGFP(作為訊號產生物質)及鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至結合劑之恆定區之抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。上述結合劑與孢子結合以形成孢子-Ab複合物。或者，該抗目標蛋白之抗體係以融合蛋白之形式呈現於孢子表面。將另一抗目標蛋白之抗體固定於紙膜上之正區域，並將抗該孢子-Ab複合物之恆定區之抗體固定於紙膜上之負區域，其中該正區域離紙膜上樣品加入位置較近，且該負區域離紙膜上吸水墊較近。隨後混和該樣品及上述孢子-Ab複合物以產生反應。藉由 ELISA 偵測

可透過此項技術中常用之ELSIA以本發明偵測系統偵測樣品中分析物之存在。在一實施例中，該分析物為化合物，且該目標化合物與載體蛋白連接以形成載體-目標物，其係作為競爭劑。由重組孢子表現之重組蛋白包含特異性結合至目標化合物之目標結合蛋白。將抗載體蛋白之抗體固定於ELISA盤。隨後混和該樣品、競爭劑及孢子並加至ELISA盤使樣品中目標化合物與競爭劑競爭結合至孢子上之目標結合蛋白。將選自以下之訊號產生物質加入盤中用以偵測：與酵素結合之抗孢子抗體，該酵素將未提供訊號之受質轉化為提供訊號之受質；抗孢子抗體及與酵素結合之抗前述抗體恆定區之抗體，該酵素將未提供訊號之受質轉化為提供訊號之受質；以及抗孢子抗體及與酵素結合之可結合至前述抗體恆定區之蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白，該酵素將未提供訊號之受質轉化為提供訊號之受質。或者，該可將未提供訊號之受質轉化為提供訊號之受質的酵素亦可作為呈現於孢子表面之重組蛋白。隨後將上述酵素之受質加入盤中以產生反應。在另一實施例中，將載體-目標物(即，偵測劑)固定於ELISA盤上以與目標化合物競爭結合孢子上之目標結合蛋白。

在又一實施例中，抗目標化合物之抗體視情況與生物素或其他蛋白結合分子結合以作為結合劑。在此情形下，由重組孢子表現之重組蛋白係鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述結合劑之恆定區之蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。或者，該抗目標化合物之抗體亦可以融合蛋白之形式呈現於孢子表面。

當分析物係抗體時，由重組孢子表現之重組蛋白包含目標抗體所辨識之抗原。將可結合至目標抗體恆定區之抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G或其他抗體結合蛋白固定於ELISA盤。隨後混和該樣品及上述孢子並加至ELISA盤。亦將前述用於藉由ELISA偵測化合物之訊號產生物質及相關酵素受質加入盤中以產生反應。在一實施例中，將目標抗體所辨識之抗原固定於ELISA盤。由重組孢子表現之重組蛋白係可結合至目標抗體恆定區之抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。隨後混和該樣品及上述孢子並加至ELISA盤。亦將前述用於藉由ELISA偵測化合物之訊號產生物質及相關酵素受質加入盤中以產生反應。在另一實施例中，使用可結合至目標抗體恆定區、視情況與生物素或其他蛋白結合分子結合之抗體以作為結合劑。在此情形下，由重組孢子表現之重組蛋白包含鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述抗目標蛋白之抗體之恆定區的蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。

當分析物為蛋白質時，使用視情況與生物素或其他蛋白結合分子結合之抗目標蛋白之抗體以作為結合劑。由重組孢子表現之重組蛋白包含鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白、特異性結合至上述蛋白結合分子之蛋白質、或可結合至上述抗目標蛋白之抗體之恆定區的蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或其他抗體結合蛋白。上述抗目標蛋白之抗體隨後結合至孢子以形成孢子-Ab複合物。或者，該抗目標蛋白之抗體係以融合蛋白之形式呈現於孢子表面。將另一抗目標蛋白之抗體固定於ELISA盤，並將該樣品及上述孢子-Ab複合物加至盤中。亦將前述用於藉由ELISA偵測化合物之訊號產生物質及相關酵素受質加入盤中以產生反應。

藉由以下非限制性實例闡述本發明之進一步細節。實例 1 ：融合蛋白之表面呈現 1-1 質體建構

用於本發明之重組質體係透過此項技術中已知之習知重組技術製得。pSH-SA

透過使用具有基因型fhuA2 lacΔU169 phoA glnV44Φ80' lacZΔM15 gyrA96 recA1 relA1 endA1thi-1 hsdR17 (Taylor等人, 1993)之大腸桿菌DH5α(獲自國立台北科技大學黃志宏博士)將CotB (Kunst等人, 1997)及鏈黴抗生物素蛋白(SA)基因選殖至穿梭載體pMK4 (BCRC 41416，購自台灣食品工業發展研究所)中，該穿梭載體具有複製起點(ori)及限制酶HindIII、PstI、BamHI、EcoRI、NdeI及SpeI之切點及包括安比西林抗性基因(Ampicillin resistance gene，AmpR (bla))及氯黴素乙醯轉移酶(Chloramphenicol acetyltransferase，CmR (cat))之選擇標記以形成重組質體pSH-SA。含有啟動子及無cotB終止密碼子、cgtcgtcgtcgtcgtcgatcg DNA序列及cotB終止子的結構基因的cotB DNA片段由Protech(台灣台北)合成。該合成DNA亦含有限位酶切點，其包括在cotB啟動子端之PstI、SalI及XhoI及在另一端之NheI及EcoRI。將此DNA片段插入pMK4之PstI與EcoRI位點之間(Sullivan等人, 1984)。所得質體稱為pWL-cotB。含有cgatcgcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgt DNA序列及鏈黴抗生物素蛋白之胺基酸13至140之基因(即生物素-結合位點)(Argarana等人, 1986)的另一DNA片段亦由Protech (台灣台北)合成。此DNA片段亦含有cotB基因之終止子及包括在cotB終止子端之BamHI及EcoRI及在另一端之NheI之限制酶切點。將該DNA片段插入pWL-cotB之NheI與EcoRI位點之間。將該新質體命名為pSH-SA。pSH-SA之質體圖譜係如圖1所示。pSH-SA-eGFP

將cotC (Negri等人, 2013)及eGFP (Ning等人, 2011)基因選殖至pSH-SA中。cot C-eGFP DNA片段由Protech (台灣台北)合成。其含有啟動子及無cot C終止密碼子的結構基因，該結構基因具有eGFP之終止密碼子及cot C終止子(SEQ ID NO:2)。此DNA片段亦含有包括在cot C啟動子端之PstI及在cot C終止子端之XhoI的限制酶切點。將該DNA片段插入pSH-SA之PstI與XhoI位點之間。將該新質體命名為pSH-SA-eGFP。 pH-SA-eGFP

首先合成具有如SEQ ID NO:3所示之核苷酸序列的3147 bp的DNA片段P_araBAD -Lpp-OmpA(46-159)-SA-P_lacUV5 -eGFP(HindIII-ompC 終止子-araC-P_araBAD -Lpp-OmpA(46-159)-(L8)-SA-P_lacUV5 -eGFP-T7 終止子-HindIII)且將其選殖至pMK4(介於HindIII與HindIII)以獲得名為pLH-SA-eGFP的質體。pLH-SA-eGFP之質體圖譜係如圖2所示。

使用pLH-SA-eGFP作為PCR模板，以引子del-F (CAATGAAAAAAGGGCCCGCA；SEQ ID NO:4)及del-R (TCTTCCGCTTCCTCGCTCA；SEQ ID NO:5)進行PCR以移除核苷酸1與238之間的序列從而獲得命名為pH-SA-eGFP之質體。pH-SA-eGFP之質體圖譜係如圖3所示。1-2 勝任細胞 (Competent Cells) 之 製備 枯草桿菌

選擇具有基因型trpC2之枯草桿菌168 (BCRC 17890；購自台灣食品工業發展研究所) (Zeigler等人, 2008)用於本發明。在轉型質體前，將在37℃下培養隔夜之枯草桿菌168之細菌培養物添加至含有LBS培養基(LB培養液(含有2.5 g酵母萃取物(BIONOVAS；目錄第8013-01-2號)、5 g胰化蛋白(PROADISA；目錄第1612.00號)、5 g NaCl (AMRESCO；目錄第241-1KG號)及500 mL逆滲透(RO)水)與0.5 M山梨糖醇(ACROS；目錄第132735000號))之燒瓶。將細菌培養物之起始濃度稀釋約100倍 (OD₆₀₀ ≒0.05)(藉由購自TiHalinko Technology CO.,Ltd.,Taiwan之分光光度計量測)，隨後在37℃水浴下將其繼代培養。當OD₆₀₀ 值為約0.85(不超過1)時，將細菌培養物置於冰上10分鐘。隨後將該細菌培養物置於50 mL錐形管中，在4℃下以5000 ×g離心10分鐘，隨後移除上清液。然後，添加體積與初始培養物體積相同之MSG緩衝液(包含0.5 M甘露醇(ACROS；目錄第125345000號)、0.5 M山梨糖醇(ACROS；目錄第132735000號)及10% v/v甘油(J. T. Baker；目錄第2136-01號))以使沈澱物再懸浮，隨後在4℃下以5000×g離心10分鐘且移除上清液。重複以上步驟三次，且添加體積為原始培養物體積之1/80之MSG緩衝液以使細胞再懸浮，隨後將其分裝於微量離心管(每一管為約60μl)以儲存於-80℃。大腸桿菌

以DH5α作為勝任細胞。將細菌在37℃下培養隔夜且添加至含有液體培養基之錐形瓶中；將細菌培養物之初始濃度稀釋至1/100且置於37℃水浴中約2小時。當OD₆₀₀ 達到0.4(不超過0.8)時，將培養物置於冰上10分鐘。隨後將細菌培養物置於50 mL錐形管中，在4℃下以1000×g離心15分鐘，隨後移除上清液。然後，添加冰滅菌水以溫和地再懸浮沈澱物，隨後在4℃下以1000 ×g離心20分鐘且移除上清液。添加體積與初始培養物體積相同之冰冷10% v/v甘油以再懸浮沈澱物，隨後在4℃下以1000×g離心20分鐘；小心移除上清液以避免移除細胞。將所有沈澱物再懸浮於適合量(繼代培養物之體積)之10%甘油中並分裝於微量離心管(每一管為約40 μl)以儲存於-80℃。1-3 轉型 枯草桿菌

經由電穿孔將以上建構之質體遞送至枯草桿菌168中，基於抗生素基因進行選擇。該方法包含以下步驟：溶解最初儲存在-80℃之勝任細胞且添加適合量之質體(約1至2 μl)，隨後輕拍離心管以進行混合，並將混合物置於冰上1分鐘；將混合物置於在-20℃下預冷卻之電穿孔槽 (BTX電穿孔槽；Level Biotechnology Inc.,Taiwan)中，用拭鏡紙(kimwipes)擦乾電穿孔槽之外部，隨後將其置於電穿孔儀(CellJect Duo,Termo Hybrid及BTX ECM 399, Level Biotechnology Inc.)之電穿孔槽 (1 mm 間隙)中，且啟動脈衝已進行電擊(電壓：2000伏特；電容：15 μF；並聯電阻：335R)；完成該電擊後立刻取出電穿孔槽，將1 ml LB培養基添加至該電穿孔槽待混合，隨後自電穿孔槽取出細菌培養物，將其置於微量離心管且在37℃下培養該細菌培養物3小時；以12000×g離心該細菌培養物3分鐘，移除上清液使得殘餘體積為約100 μl，充分混合該細菌培養物且將培養物均勻地塗佈於包含用於選擇之抗生素的LB培養盤(具有與LB培養液之相同組分但添加了瓊脂糖)上，隨後培養16小時；並選擇生長之菌落且將其培養16至18小時以進行孢子形成。.大腸桿菌

經由電穿孔將以上建構之質體遞送至大腸桿菌，基於抗生素基因進行選擇。該方法包含以下步驟：溶解最初儲存在-80℃下之勝任細胞，且添加適合量之質體(約1至2 μl)，隨後輕拍離心管以進行混和，並將該混合物置於冰上1分鐘；將混合物置於在-20℃下預冷卻之電穿孔槽中，以拭鏡紙擦乾電穿孔槽之外部，隨後將其置於電穿孔儀之電穿孔槽(1 mm間隙)並啟動脈衝活化以進行電擊(電壓：2000伏特；電容：15 μF；並聯電阻：335R)；於完成電擊後立刻取出電穿孔槽，將1 ml 37℃LB培養基添加至該電穿孔槽待混合，隨後自電穿孔槽取出該細菌培養物，將其置於微量離心管，且在37℃下培養該細菌培養物1小時；以12000×g離心該細菌培養物3分鐘，移除上清液使殘餘體積為約100 μl，充分混合細菌培養物且將該培養物均勻地塗佈於包含用於選擇之抗生素的固體LB培養基上，隨後培養16小時。1-4 孢子形成

將枯草桿菌 (B.s. 168、B.s. 168/pSH-SA或B.s. 168/pSH-SA-eGFP)之菌落接種於添加5 ml LB培養基(含有濃度為3 mg/ml之10 μl氯黴素)之試管且培養16至18小時。將125 μl經培養之細菌培養液置於添加25 ml 2×SG培養基之燒瓶且置於37℃水浴中培養(200 rpm之搖晃速度)48小時。隨後將經培養之細菌培養液置於50 ml錐形管，且在4℃下以10, 000 ×g離心20分鐘。之後，以PBS洗滌沈澱孢子兩次以移除殘餘養分且儲存於4℃供後續使用。

在轉型之後，將經轉型之枯草桿菌菌落接種於5 mL LB培養液(包含選擇抗生素標記)中培養16至18小時，隨後進行包括以下步驟之孢子形成方法(基於「Molecular Biological Methods for Bacillus」(由Colin R. Harwood & Simon M. Cutting編輯；Chichester；John Wiley & Sons, 1990)設計)：在燒瓶中以2×SG培養基(包含16 g Difco Nutrient培養液(BD；目錄第234000 500G號)、2 g KCl (SIGMA；目錄第7447-40-7號)、0.5 g MgSO₄ -7H₂ O (SIGMA；目錄第M1880-500G號)及1L RO水，在以高溫對以上混合物進行滅菌且將其冷卻後添加以下物質：1 mL 1 M Ca(NO)₂ (SIGMA；目錄第C2786-500G號)、1 mL 0.1 M MnCl₂ -H₂ O(SIGMA；目錄第M1787-10X1ML號)、1 mL之1 mM FeSO₄ (SIGMA；目錄第38047-1EA號)及2 mL葡萄糖50% (w/v)，過濾滅菌)將細菌培養物稀釋200倍(125 μl，25 ml)，且將其置於37℃水浴(200 rpm之搖晃速度)中培養；以CCD(40X) (Olympus)光學顯微鏡每天觀測該細菌培養物的孢子形成(3天之後超過90%之細菌形式孢子)；將該細菌培養物置於50 mL錐形管中，且在4℃下以10,000 ×g離心20分鐘；以冰水洗滌該等孢子以移除殘餘養分且使殘餘細胞溶解；並將該等孢子儲存於4℃且每週更換水，或將該等孢子儲存於-20℃以長期儲存。1-5 大腸桿菌之生長

將經轉型之MG1655/pH-SA-eGFP菌落接種於5 ml LB培養基(含有濃度為3 mg/ml之10 μl氯黴素)且培養16至18小時；量測經培養細菌培養液之OD₆₀₀ 。將適合量細菌培養物添加至25 ml LB培養基(含有濃度為3 mg/ml之50 μl氯黴素)，隨後將OD₆₀₀ 調整至0.05，且培養於37℃水浴(200 rpm之搖晃速度)。當OD₆₀₀ 為0.1時，添加濃度為0.1 M之2.5 μl阿拉伯糖使最終濃度為10 µM；當OD₆₀₀ 為1時，添加濃度為100 mM之25 μl IPTG使最終濃度為100 μM，隨後培養於37℃水浴(200 rpm之搖晃速度)16至18小時。隨後以1000 ×g離心該細菌培養物15分鐘，以PBS洗滌兩次且儲存於4℃。上述PBS含有8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂ HPO₄ 、0.24 g KH₂ PO₄ 及1000 mL H₂ O，其中以1 M HCl將pH調節至7.4。實例 2 ：以孢子及金奈米粒子 (AuNP) 藉由 LFA 偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體 2-1 孢子之預處理

將250μl之0.05% SDS加至1000 μl OD₆₀₀ 為1之孢子(B.s. 168/pH-SA-eGFP)並混和30分鐘。將該混和物離心兩次(以12000 ×g進行3分鐘)，加入1000 μl之1% BSA (w/v, BSA/PBS)並混合2小時。隨後將該等孢子離心，並加入100 μl PBS使OD₆₀₀ 經調整為約10。2-2 AuNP 修飾

將100 μl濃度為26 mM之碳酸鉀溶液加至600 μl之AuNP溶液(0.355 nM)(最終體積：AuNP溶液為0.3 nM;碳酸鉀溶液為3.714 mM)。加入1 μl濃度為2 mg/ml之抗孢子抗體(Mybiosource/mbs612878)，並將該混和物置於4℃ 16小時，之後加入200 μl之5% BSA並等待30分鐘。隨後於4℃以4000 ×g離心該混和物40分鐘。其後，移除上清液，並以600 μl之PBS使沉澱物再懸浮；將該溶液儲存於4℃供使用。2-3 紙帶製作

將2 mg/ml之抗小鼠IgG二級抗體(SIGMA/M8890)及1 mg/ml之抗eGFP抗體(abcam/ab184601)分別噴至紙膜(Millipore/HF1200)上的正結果線(positive line)及負結果線(negative line)(紙膜上每1 cm噴上2 μl)，之後於室溫乾燥兩小時。隨後將紙膜浸泡於1% PVA(聚乙烯醇)溶液30分鐘，之後於室溫乾燥兩小時。此後，將紙膜浸泡於5%蔗糖溶液30秒。於乾燥後，將紙膜裁切為寬度為0.5 cm之紙帶，並存放於4℃。2-4 偵測

將100 μl之經預處理孢子與100 μl之經修飾AuNP混和30分鐘。隨後將該孢子與1 μl不同濃度之來自小鼠之抗鏈黴抗生物素蛋白抗體(abcam/ab10020)充分混和。此後，立刻將紙帶置於上述溶液混和物，並於乾燥約10分鐘後拍照記錄結果。2-5 結果

已發現當抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之量為10^-15 mol時，正結果線顯示訊號，且抗體量越高，訊號越強。另方面，於負結果線，抗體量越高，訊號越弱(參圖4)。實例 3 ：以孢子及金奈米粒子 (AuNP) 藉由 LFA 偵測 β- 半乳糖苷酶 3-1 孢子之預處理

將250 μl之0.05% SDS加至1000 μl OD₆₀₀ 為1之孢子(B.s. 168/pSH-SA-eGFP)並混和30分鐘。將該混和物離心兩次(以12000 ×g進行3分鐘)，加入1000 μl之1% BSA (w/v, BSA/PBS)並混合2小時。隨後將該等孢子離心，並加入100 μl PBS使OD₆₀₀ 經調整為約10。之後，加入100 μl濃度為10^-7 M之生物素化抗β-gal抗體(abcam/ab6645)並混和兩小時，接著將該等孢子離心並加入100 μl PBS使OD₆₀₀ 經調整為約10。3-2 AuNP 修飾

將100 μl濃度為26 mM之碳酸鉀溶液加至600 μl之AuNP溶液(0.355 nM)(最終體積：AuNP溶液為0.3 nM;碳酸鉀溶液為3.714 mM)。加入1 μl濃度為2 mg/ml之抗孢子抗體(Mybiosource/mbs612878)，並將該混和物置於4℃ 16小時，之後加入200 μl之5% BSA並等待30分鐘。隨後於4℃以4000 ×g離心該混和物40分鐘。其後，移除上清液，並以600 μl之PBS使沉澱物再懸浮；將該溶液儲存於4℃供使用。3-3 紙帶製作

將1 mg/ml之抗β-半乳糖苷酶抗體(Novusbio/NBP2-25705)及2 mg/ml之山羊抗兔子IgG抗體(abcam/ab6702)分別噴至紙膜(Millipore/HF1200)上的正結果線及負結果線 (紙膜上每1 cm噴上2 μl)，之後於室溫乾燥兩小時。隨後將紙膜浸泡於1% PVA30分鐘，之後於室溫乾燥兩小時。此後，將紙膜浸泡於5%蔗糖溶液30秒。於乾燥後，將紙膜裁切為寬度為0.5 cm之紙帶，並存放於4℃。3-4 偵測

將100 μl之經預處理孢子與100 μl之經修飾AuNP混和30分鐘。隨後將該孢子與1 μl不同濃度之β-半乳糖苷酶充分混和。此後，立刻將紙帶置於上述溶液混和物，並於乾燥約10分鐘後拍照記錄結果。3-5 結果

已發現當β-半乳糖苷酶之量為10^-15 mol時，正結果線顯示訊號，且β-半乳糖苷酶量越高，訊號越強。另方面，於負結果線，β-半乳糖苷酶量越高，訊號越弱(參圖5)。實例 4 ：以孢子及金奈米粒子 (AuNP) 藉由 LFA 偵測生物素 4-1 孢子之預處理

將250 μl之0.05% SDS加至1000 μl OD₆₀₀ 為1之孢子(B.s. 168/pH-SA-eGFP)並混和30分鐘。將該混和物離心兩次(以12000 ×g進行3分鐘)，加入1000 μl之1% BSA並混合2小時。隨後將該等孢子離心，並加入100 μl PBS使OD₆₀₀ 經調整為約10。4-2 AuNP 修飾

將100 μl濃度為26 mM之碳酸鉀溶液加至600 μl之AuNP溶液(0.355 nM)(最終體積：AuNP溶液為0.3 nM;碳酸鉀溶液為3.714 mM)。加入1 μl濃度為2 mg/ml之抗孢子抗體(Mybiosource/mbs612878)，並將該混和物置於4℃ 16小時，之後加入200 μl之5% BSA並等待30分鐘。隨後於4℃以4000 ×g離心該混和物40分鐘。其後，移除上清液，並以600 μl之PBS使沉澱物再懸浮；將該溶液儲存於4℃供使用。4-3 紙帶製作

將1 mg/ml之抗eGFP抗體(abcam/ab184601)及2 mg/ml之抗BSA抗體(SIGMA/B2901)分別噴至紙膜(Millipore/HF1200)上的正結果線及負結果線 (紙膜上每1 cm噴上2 μl)，之後於室溫乾燥兩小時。隨後將紙膜浸泡於1% PVA30分鐘，之後於室溫乾燥兩小時。此後，將紙膜浸泡於5%蔗糖溶液30秒。於乾燥後，將紙膜裁切為寬度為0.5 cm之紙帶，並存放於4℃。4-4 偵測

將100 μl之經預處理孢子與1 μl不同濃度之生物素混和兩小時，之後加入100 μl之10^-7 M生物素-BSA並混和30分鐘。隨後將該混和物離心以移除上清液，並以100 μl PBS使沉澱物再懸浮。此後，將紙帶置於上述溶液混和物。乾燥後，加入表面經抗孢子抗體修飾之AuNP。於乾燥約10分鐘後拍照記錄結果。4-5 結果

已發現當生物素之量為10^-15 mol時，正結果線顯示微弱訊號，且生物素量越高，訊號越強。另方面，於負結果線，生物素量越高，訊號越弱(參圖6)。實例 5 ：以孢子及螢光 (eGFP) 藉由 LFA 偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體 5-1 孢子之預處理

將250 μl之0.05% SDS加至1000 μl OD₆₀₀ 為1(約5×10⁷ 孢子/mL)之孢子(B.s. 168/pSH-SA-eGFP)並混和30分鐘。將該混和物離心兩次(以12000 ×g進行3分鐘)，加入1000 μl之1% BSA(w/v, BSA/PBS)並混合2小時。隨後將該等孢子離心，並加入100 μl PBS使OD₆₀₀ 經調整為約10。5-2 紙帶製作

將2 mg/ml之抗小鼠IgG二級抗體(SIGMA/M8890)及1 mg/ml之抗eGFP抗體(abcam/ab184601)分別噴至紙膜(Millipore/HF1200)上的正結果線及負結果線(紙膜上每1 cm噴上2 μl)，之後於室溫乾燥兩小時。隨後將紙膜浸泡於1% PVA30分鐘，之後於室溫乾燥兩小時。此後，將紙膜浸泡於5%蔗糖溶液30秒。於乾燥後，將紙膜裁切為寬度為0.5 cm之紙帶，並存放於4℃。5-3 偵測

將100 μl之經預處理孢子與1 μl不同濃度之抗鏈黴抗生物素蛋白抗體均勻混和。之後立刻將紙帶置於上述溶液混和物，乾燥約10分鐘，並以倒立式螢光顯微鏡(Leica Dmi8)觀察；以軟體MetaMorph將倍率設定為2.5X，調整對比，並照相記錄。5-4 結果

已發現當抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之量為10^-17 mol時，正結果線顯示訊號，且抗體量越高，訊號越強。另方面，於負結果線，抗體量越高，訊號越弱(參圖7)。實例 6 ：以 E. coli 及金奈米粒子 (AuNP) 藉由 LFA 偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體 6-1 AuNP 修飾

將100 μl濃度為26 mM之碳酸鉀溶液加至600 μl之AuNP溶液(0.355 nM)(最終體積：AuNP溶液為0.3 nM;碳酸鉀溶液為3.714 mM)。加入1 μl濃度為5 mg/ml之抗E. coli 抗體(abcam/ab137967)(來自兔子)，並將該混和物置於4℃ 16小時，之後加入200 μl之5% BSA並等待30分鐘。隨後於4℃以4000 ×g離心該混和物40分鐘。其後，移除上清液，並以600 μl之PBS使沉澱物再懸浮；將該溶液儲存於4℃供使用。6-2 紙膜製作

將1 μl之2 mg/ml抗小鼠IgG二級抗體(SIGMA/M8890)及1 μl之2 mg/ml抗鏈黴抗生物素蛋白抗體(abcam/ab10020)分別滴至紙膜(Millipore/HF1200)上的正結果點及負結果點，之後於室溫乾燥兩小時。隨後將紙膜浸泡於1% PVA 30分鐘，之後於室溫乾燥兩小時。此後，將紙膜浸泡於5%蔗糖溶液30秒。於乾燥後，將紙膜存放於4℃。6-3 偵測

將100 μl之經培養E. coli (MG1655/pH-SA-eGFP)與100 μl之經修飾AuNP混和30分鐘。隨後將該等細胞與1 μl不同濃度之來自小鼠之測試抗體(abcam/ab10020)充分混和。此後，立刻將紙膜置於上述溶液混和物，並於乾燥約10分鐘後拍照記錄結果。6-4 結果

已發現當抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之量為10^-15 mol時，正結果線顯示訊號，且抗體量越高，訊號越強。另方面，於負結果線，抗體量越高，訊號越弱(參圖8)。實例 7 ：以 E. coli 及螢光 (eGFP) 藉由 LFA 偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體 7-1 紙膜製作

將1 μl之2 mg/ml抗小鼠IgG二級抗體(SIGMA/M8890)及2 mg/ml抗鏈黴抗生物素蛋白抗體(abcam/ab10020)分別滴至紙膜(Millipore/HF1200)上的正結果點及負結果點，之後於室溫乾燥兩小時。隨後將紙膜浸泡於1% PVA 30分鐘，之後於室溫乾燥兩小時。此後，將紙膜浸泡於5%蔗糖溶液30秒。於乾燥後，將紙膜存放於4℃。7-2 偵測

將100 μl之經培養E. coli (MG1655/pH-SA-eGFP)與1 μl不同濃度之來自小鼠之測試抗體(abcam/ab10020)均勻混和。之後立刻將紙膜置於上述溶液混和物，乾燥約10分鐘，並以倒立式螢光顯微鏡(Leica DMi8)觀察；以軟體MetaMorph將倍率設定為2.5X，並調整對比，之後照相記錄。7-3 結果

已發現當抗體之量為10^-19 mol時，正結果線顯示訊號；當該量介於10^-19 mol及10^-17 mol之間時，抗體量越高，訊號越強；當濃度介於10^-17 mol及10^-14 mol之間時，由於訊號皆非常強，彼此間無顯著差異。於負結果線，當該量介於10^-20 mol及10^-17 mol之間時，由於訊號皆非常強，彼此間無顯著差異；當該量為10^-16 mol時，訊號變弱；且當該量介於10^-15 mol及10^-14 mol之間時，無訊號顯示(參圖9)。實例 8 ：以孢子及 HRP/3,3',5,5'- 四甲基聯苯胺 (TMB) 藉由 ELISA 偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體 8-1 ELISA 盤製備

以200 μl之PBS/T (含0.05% Tween 20之PBS)洗滌ELISA盤(GeneDireX/2115-196J)三次，之後加入1 μl濃度為2 mg/ml之山羊抗小鼠IgG抗體(SIGMA/M8890)及100 μl之塗覆液(coating buffer)(500 mL H₂ O中含1.89 g NaHCO₃ 及0.954 g Na₂ CO₃ )。在置於4℃ 18小時後，以200 μl之PBS/T洗滌該盤三次，之後加入200 μl之5%脫脂乳。90分鐘後以200 μl之PBS/T洗滌該盤三次。8-2 ELISA

將1000 μl OD₆₀₀ 為1之孢子(B.s. 168/pSH-SA)以12000 ×g離心3分鐘，之後移除上清液，並加入80 μl之PBS及10 μl不同濃度之抗鏈黴抗生物素蛋白抗體(abcam/ab10020)，且與10 μl濃度為10^-8 M之抗孢子抗體(mybiosource/mbs612878)混和兩小時。將該混和物以12000 ×g離心3分鐘，之後移除上清液，並加入100 μl之PBS。將該溶液加至如上述製備之ELISA盤並混和兩小時。之後，以200 μl之PBS/T洗滌該盤三次；隨後於該盤加入100 μl濃度為0.2 μg/ml之山羊抗兔子IgG (HRP)(abcam/ab6721)並混和30分鐘，之後以200 μl之PBS/T洗滌10次(每次包含2分鐘之浸泡步驟)。加入100 μl之3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB受質，Thermo Scientific/34021)並混和15分鐘(避光)，之後加入100 μl之2 M H₂ SO₄ 以進行量測。以具內建軟體SkanIt RE for Varioskan Flash 2.4.3之ELISA讀取器(Thermo Scientific 5250500 Microplate reader Varioscan Flash LemiSens option)量測吸光度。針對盤模版(plate template)係選用96孔Greiner Bio-One平底盤，且利用波長450 nm量測吸光度。8-3 結果

已發現當抗體量為10^-16 mol時，就吸光度而言抗體之存在與不存在間具有差異(參圖10)。實例 9 ：以孢子及 TMB 藉由 ELISA 偵測 β- 半乳糖苷酶 9-1 ELISA 盤製備

以200 μl之PBS/T (含0.05% Tween 20之PBS)洗滌ELISA盤(GeneDireX/2115-196J)三次，之後加入1 μl濃度為1 mg/ml之抗β-半乳糖苷酶抗體(Novusbio/NBP2-52702)及100 μl之塗覆液(500 mL H₂ O中含1.89 g NaHCO₃ 及0.954 g Na₂ CO₃ )。在置於4℃ 18小時後，以200 μl之PBS/T洗滌該盤三次，之後加入200 μl之5%脫脂乳。90分鐘後以200 μl之PBS/T洗滌該盤三次。9-2 ELISA

將1000 μl OD₆₀₀ 為1(約5×10⁷ 孢子/mL)之孢子(B.s. 168/pSH-SA)以12000 ×g離心3分鐘，之後移除上清液，並加入80 μl之PBS、10 μl濃度為10^-8 M之生物素化抗β-半乳糖苷酶抗體(abcam/ab6645)及10 μl濃度為10^-8 M之抗孢子抗體(mybiosource/mbs612878)且混和兩小時。將該混和物以12000 ×g離心3分鐘，之後移除上清液，並加入100 μl之PBS(重複兩次)。隨後加入1 μl不同濃度之β-半乳糖苷酶並混和兩小時。以12000 ×g將該混和物離心3分鐘並移除上清液；將沉澱物與100 μl之PBS混合(重複兩次)。將該溶液加至如上述製備之ELISA盤並混和兩小時。之後，以200 μl之PBS/T洗滌該盤三次；隨後於該盤加入100 μl濃度為0.2 μg/ml之山羊抗兔子IgG (HRP)(abcam/ab6721)並混和30分鐘，之後以200 μl之PBS/T洗滌10次(每次包含2分鐘之浸泡步驟)。加入100 μl之TMB受質(Thermo Scientific/34021)並混和15分鐘(避光)，之後加入100 μl之2 M H₂ SO₄ 以進行量測。以具內建軟體SkanIt RE for Varioskan Flash 2.4.3之ELISA讀取器(Thermo Scientific 5250500 Microplate reader Varioscan Flash LemiSens option)量測吸光度。針對盤模版係選用96孔Greiner Bio-One平底盤，且利用波長450 nm量測吸光度。9-3 結果

已發現當β-半乳糖苷酶之量為10^-15 mol時，就吸光度而言β-半乳糖苷酶之存在與不存在間具顯著差異，且β-半乳糖苷酶之量越高，吸光度越高(參圖11)。實例 10 ：以 E. coli 及 TMB 藉由 ELISA 偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體 10-1 ELISA 盤製備

以200 μl之PBS/T (含0.05% Tween 20之PBS)洗滌ELISA盤(GeneDireX/2115-196J)三次，之後加入1 μl濃度為2 mg/ml之山羊抗小鼠IgG抗體(SIGMA/M8890)及100 μl之塗覆液(500 mL H₂ O中含1.89 g NaHCO₃ 及0.954 g Na₂ CO₃ )。在置於4℃ 18小時後，以200 μl之PBS/T洗滌該盤三次，之後加入200 μl之5%脫脂乳。90分鐘之阻隔(blocking)後以200 μl之PBS/T洗滌該盤4次。10-2 ELISA

將200 μl OD₆₀₀ 為10之MG1655/pH-SA-eGFP以12000 ×g離心3分鐘，之後移除上清液，並加入90 μl之PBS及10 μl不同濃度之小鼠抗鏈黴抗生物素蛋白抗體(abcam/ab10020)，並於室溫混和兩小時。將該混和物以12000 ×g離心3分鐘，之後移除上清液，並加入100 μl之PBS。將該溶液加至如上述製備之ELISA盤並混和兩小時。之後，以200 μl之PBS/T洗滌該盤三次；隨後於該盤加入100 μl濃度為0.2 μg/ml之山羊抗兔子IgG (HRP)抗體(abcam/ab6721)並混和30分鐘，之後以200 μl之PBS/T洗滌10次(每次包含2分鐘之浸泡步驟)。加入100 μl之TMB受質(Thermo Scientific/34021)並混和15分鐘(避光)，之後加入100 μl之2 M H₂ SO₄ (作為終止溶液)以進行量測。以具內建軟體SkanIt RE for Varioskan Flash 2.4.3之ELISA讀取器(Thermo Scientific 5250500 Microplate reader Varioscan Flash LemiSens option)量測吸光度。針對盤模版係選用96孔Greiner Bio-One平底盤，且利用波長450 nm量測吸光度。10-3 結果

已發現當抗體量為10^-14 mol時，就吸光度而言抗體之存在與不存在間具差異，且抗體量越高，吸光度越高(參圖12)。實例 11 ：以孢子藉由流式細胞分析技術偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體 11-1 孢子之預處理

將250 μl之0.05% SDS加至1000 μl OD₆₀₀ 為1之孢子(B.s. 168/pSH-SA)並混和30分鐘。將該混和物離心兩次(以12000 ×g進行3分鐘)，加入1000 μl之1% BSA(w/v, BSA/PBS)並混合2小時。將該等孢子之OD₆₀₀ 調整為0.1。11-2 樣品混和

將10 μl OD₆₀₀ 為0.1之孢子與10 μl不同濃度之抗鏈黴抗生物素蛋白抗體(abcam/ab10020)(來自小鼠)混和兩小時，之後離心及洗滌兩次，並加入PBS使總體積為100 μl。加入3.33 μl濃度為1×10^-7 M之山羊抗小鼠IgG螢光素異硫氰酸鹽(FITC)二級抗體(Leinco Technologies, Inc., 目錄編號M113)並混和1.5小時，之後進行一次離心及洗滌。將另外10 μl OD₆₀₀ 為0.1之孢子與10 μl之PBS溶液混合2小時，之後離心及洗滌兩次並加入PBS使總體積為100 μl。加入3.33 μl濃度為1×10^-7 M之山羊抗小鼠IgG螢光素異硫氰酸鹽(FITC)二級抗體(Leinco Technologies, Inc., 目錄編號M113)並混和1.5小時，之後進行一次離心及洗滌(不加入待偵測抗體，作為負對照組)。將溶液注入流式細胞儀(CytoFLEX Flow Cytometer; Beckman Coulter; C02946)。11-3 數據處理

以內建CytExpert軟體分析螢光激發細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting; FACS)圖。將螢光孢子定義為螢光強度高於負對照組FACS圖波形主峰右下之螢光強度(於本實例係4×10³ )之孢子。因此，螢光孢子之量為螢光強度高於4×10³ 之孢子的數量總數。11-4 結果

於圖13，x軸經對數尺度化(log scaled)以代表目標抗體之量，且y軸代表測得的數據；經繪製之圖係如圖13所示。已發現可偵測到1×10^-17 mol之抗體量，且其結果如圖13所示。介於10^-11 mol及10^-17 mol間之目標抗體的斜率為9.86，R² : 0.9748。實例 12 ：以孢子藉由流式細胞分析技術偵測 β- 半乳糖苷酶 12-1 孢子之預處理

將250 μl之0.05% (w/v) SDS加至1000 μl OD₆₀₀ 為1之孢子(B.s. 168/pSH-SA)並混和30分鐘。將該混和物離心兩次(以12000 ×g進行3分鐘)，之後加入1000 μl之1% BSA(w/v, BSA/PBS)並混合2小時。將該等孢子之OD₆₀₀ 調整為0.1。此後，將100 μl之孢子與100 μl濃度為10^-7 M之生物素化抗β-半乳糖苷酶抗體(abcam/ab6645)混合過夜，之後離心及洗滌兩次，並加入100 μl pH7.4之PBS，並將該等孢子之OD₆₀₀ 調整為0.1。12-2 螢光組混和

將100 μl濃度為1×10^-7 M之山羊抗小鼠IgG-FITC二級抗體(Leinco Technologies, Inc., 目錄編號M113)與100 μl濃度為1×10^-7 M之來自小鼠之抗β-半乳糖苷酶抗體(Novusbio/NBP2-52702)混合過夜。12-3 樣品混和

將10 μl OD₆₀₀ 為0.1之孢子與10 μl不同濃度之β-半乳糖苷酶混和兩小時，之後加入PBS使總體積為100 μl，離心及洗滌兩次，並加入3.33 μl之螢光組以混和1.5小時。將另外10 μl OD₆₀₀ 為0.1之孢子與3.33 μl之螢光組混合60分鐘，之後加入PBS使總體積為100 μl(不加入待偵測β-半乳糖苷酶，作為對照組)。將溶液注入流式細胞儀(CytoFLEX Flow Cytometer; Beckman Coulter; C02946)。12-4 數據處理

以內建CytExpert軟體分析螢光激發細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting; FACS)圖。將螢光孢子定義為螢光強度高於負對照組FACS圖波形主峰右下之螢光強度(於本實例係3×10³ )之孢子。因此，螢光孢子之量為螢光強度高於3×10³ 之孢子的數量總數。12-5 結果

於圖14，x軸經對數尺度化以代表β-半乳糖苷酶之量，且y軸代表測得的數據；經繪製之圖係如圖14所示。已發現可偵測到1×10^{-1 6} mol之β-半乳糖苷酶量，且其結果如圖14所示。介於10^{-1 2} mol及10^{-1 6} mol間之β-半乳糖苷酶的斜率為3.708，R² : 0.9878。實例 13 ：以孢子藉由流式細胞分析技術偵測生物素 13-1 孢子之預處理

將20 μl之0.05% (w/v) SDS及880 μl之PBS加至100 μl OD₆₀₀ 為0.1之孢子(B.s. 168/pSH-SA)或100 μl OD₆₀₀ 為0.1之孢子(B.s. 168)並混和30分鐘。將該混和物離心及洗滌兩次(以12000 ×g進行3分鐘)，之後加入1000 μl之PBS並將該等孢子之OD₆₀₀ 調整為約0.1。13-2 樣品混和

將200 μl預處理之B.s. 168/pSH-SA孢子與20 μl不同濃度之生物素混和1分鐘，之後加入2 μl之2×10^-5 M之生物素-螢光素(Biotium, 80019)並混和5分鐘。將另外200 μl OD₆₀₀ 為0.01之經預處理B.s. 168孢子與2 μl之2×10^-5 M之生物素-螢光素(Biotium, 80019)混和5分鐘(作為對照組)。將溶液注入流式細胞儀(CytoFLEX Flow Cytometer; Beckman Coulter; C02946)。13-3 數據處理

以內建CytExpert軟體分析螢光激發細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting; FACS)圖。將螢光孢子定義為螢光強度高於對照組FACS圖波形主峰右下之螢光強度(於本實例係2×10³ )之孢子。因此，螢光孢子之量為螢光強度高於2×10³ 之孢子的數量總數。13-4 結果

於圖15，x軸經對數尺度化以代表生物素之量，且y軸代表測得的數據；經繪製之圖係如圖15所示。已發現可偵測到5×10^-17 mol之生物素量，且其結果如圖15所示。介於10^-11 mol及10^-17 mol間之生物素的斜率為-2.10，R² : 0.9498。實例 14 ：以金奈米粒子 (AuNP) 藉由傳統 LFA 偵測 β- 半乳糖苷酶 14-1 AuNP 修飾

將100 μl濃度為26 mM之碳酸鉀溶液加至600 μl之AuNP溶液(0.355 nM)(最終體積：AuNP溶液為0.3 nM;碳酸鉀溶液為3.714 mM)。加入1 μl濃度為2 mg/ml之生物素化抗β-半乳糖苷酶抗體(abcam/ab6645)(來自兔子)，並將該混和物置於4℃ 16小時，之後加入200 μl之5% BSA並等待30分鐘。隨後於4℃以4000 ×g離心該混和物40分鐘。其後，移除上清液，並以600 μl之PBS使沉澱物再懸浮；將該溶液儲存於4℃供使用。14-2 紙帶製作

將1 mg/ml之抗β-半乳糖苷酶抗體(Novusbio/NBP2-52702)及2 mg/ml之山羊抗兔子IgG抗體(abcam/ab6702)分別噴至紙膜(Millipore/HF1200)上的正結果線及負結果線 (紙膜上每1 cm噴上2 μl)，之後於室溫乾燥兩小時。隨後將紙膜浸泡於1% PVA30分鐘，之後於室溫乾燥兩小時。此後，將紙膜浸泡於5%蔗糖溶液30秒。於乾燥後，將紙膜裁切為寬度為0.5 cm之紙帶，並存放於4℃。14-3 偵測

將經修飾AuNP與1 μl不同濃度之β-半乳糖苷酶充分混和。此後，立刻將紙帶置於上述溶液混和物，並於乾燥約10分鐘後拍照記錄結果。14-4 結果

已發現當β-半乳糖苷酶之量為10^-12 mol時，正結果線顯示微弱訊號，且β-半乳糖苷酶濃度越高，訊號越強(參圖16)。此外，針對含有10^-13 mol、10^-14 mol或10^-15 mol之β-半乳糖苷酶的樣品，正結果線無訊號。

顯然地，就以孢子及AuNP藉由LFA偵測β-半乳糖苷酶(如實例3所示)而言，本發明偵測系統之靈敏度較傳統LFA方法提高了1,000倍。參考文獻 Engvall, E. and Perlmann, P. (1972). "Enzyme-linked immunosorbent assay, Elisa." The Journal of Immunology.109 (1): 129–135. Lequin, R. M. (2005). "Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)." Clinical Chemistry.51 (12): 2415–8. Schmidt, SD; Mazzella, MJ; Nixon, RA; Mathews, PM (2012). Aβ measurement by enzyme-linked immunosorbent assay. Methods in Molecular Biology.849 . pp. 507–27. Chittamma, A., S.J. Marin, J.A. Williams, C. Clark and G.A. McMillin Detection of In Utero Marijuana Exposure by GC–MS, Ultra-Sensitive ELISA and LC–TOF–MS Using Umbilical Cord Tissue.  Journal of Analytical Toxicology 2013; 37: 391–394. Kim, H. J., Jeong, H., Lee, S. J. "Synthetic biology for microbial heavy metal biosensors" (2018) Analytical and Bioanalytical Chemistry, 410, pp. 1191–1203 Sany, S. B. T., Narimani, L., Soltanian, F. K., Hashim, R., Rezayi, M., Karlend, D. J., Mahmud, H. N. M. E. "An overview of detection techniques for monitoring dioxin-like compounds: latest technique trends and their applications" (2016) RSC Adv. 6, pp. 55415–55429 Gui, Q., Lawson, T., Shan, S., Yan, L., Liu, Y. "The Application of Whole Cell-Based Biosensors for Use in Environmental Analysis and in Medical Diagnostics" (2017) Sensors, 17, 1623; doi:10.3390/s17071623 Bereza-Malcolm, L.T., Mann, G., Franks, A.E. "Environmental sensing of heavy metals through whole cell microbial biosensors: a synthetic biology approach" (2015) ACS Synth Biol., 4, pp. 535–46. Mehta, J., Bhardwaj, S.K, Bhardwaj, N., Paul, A.K., Kumar, P., Kim, K.H. "Progress in the biosensing techniques for trace-level heavymetals." (2016) Biotechnol Adv., 34, pp. 47–60. Liu, Q.; Wu, C.; Cai, H.; Hu, N.; Zhou, J.; Wang, P. Cell-based biosensors and their application in biomedicine.  Chem. Rev.2014 , 114, 6423–6461. Tian, Y.; Lu, Y.; Xu, X.; Wang, C.; Zhou, T.; Li, X. Construction and comparison of yeast whole-cell biosensors regulated by two RAD54 promoters capable of detecting genotoxic compounds. Toxicol. Mech. Methods2017 , 27, 115–120. Xu, T., Young. A., Marr, E., Sayler, G., Ripp, S., Close, D. "A rapid and reagent-free bioassay for the detection of dioxin-like compounds and other aryl hydrocarbon receptor (AhR) agonists using autobioluminescent yeast" (2018) Analytical and Bioanalytical Chemistry 410, pp. 1247–1256. Dusserre, C., Mollergues, J., Lo Piparo, E., Smieško, M., Marin-Kuan, M., Schilter, B., Fussell, K. "Using bisphenol A and its analogs to address the feasibility and usefulness of the CALUX-PPARγ assay to identify chemicals with obesogenic potential" (2018) Toxicology in Vitro, 53, pp. 208-221. Steinberg, P., Behnisch, P.A., Besselink, H., Brouwer, A.A., "Screening of molecular cell targets for carcinogenic heterocyclic aromatic amines by using calux reporter gene assays" (2017) Cell Biology and Toxicology, 33, pp. 283-293. Nguyen, QA., Schumann, W. "Use of IPTG-inducible promoters for anchoring recombinant proteins on the Bacillus subtilis spore surface" (2014) Protein Expression and Purification, 95, pp. 67-76. Francisco, J., CHARLES F. EARHART, AND GEORGE GEORGIOU. Transport and anchoring of 8-lactamase to the external surface of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 2713-2717, April 1992, Biochemistry. Georgiou, G., Daren L. Stephens, Christos Stathopoulos, Heather L. Poetschke, John Mendenhalls and Charles F. Earhart. Display of pMactamase on theEscherichia coli surface: outer membrane phenotypes conferred by Lpp'-OmpA'-β- lactamase fusions.  Protein Engineering vol. 9 no. 2 pp. 239-247. 1996. Sullivan, M. A., Yasbin, R. E., Young, F. E. "New shuttle vectors forBacillus subtilis andEscherichia coli which allow rapid detection of inserted fragments." (1984) Gene, 29 (1-2), pp. 21-26. Argarana, C.E., Kuntz, I.D., Birken, S., Axel, R. and Cantor, C.R. "Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene." (1986) Nucleic Acids Res, 14 (4), pp. 1871-1882. Duc le H, Hong HA, Atkins HS, Flick-Smith HC, Durrani Z, Rijpkema S, Titball RW, Cutting SM: Immunization against anthrax usingBacillus subtilis spores expressing the anthrax protective antigen. Vaccine 2007; 25: 346–355. Errington, J. Regulation of endospore formation inBacillus subtilis . Nature ReviewsMicrobiol 2003 , 1, pp. 117-126. Henriques AO, Costa T, Martins LO, Zilhao R: Functional architecture and assembly of the spore coat; in Ricca E, Henriques AO, Cutting SM (eds): Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. London, Horizon Science Press, 2004, pp. 34–52. Hinc K, Iwanicki A, Obuchowski M: New stable anchor protein and peptide linker suitable for successful spore surface display in B. subtilis. Microb Cell Fact 2013; 12: 22. Hinc K, Isticato R, Dembek M, Karczewska J, Iwanicki A, Peszynska-Sularz G, De Felice M, Obuchowski M, Ricca E: Expression and display of UreA ofHelicobacter acinonychis on the surface ofBacillus subtilis spores. MicrobCell Fact 2010b; 9: 2. Isticato R, Cangiano G, Tran HT, Ciabattini A, Medaglini D, Oggioni MR, et al. 2001. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. J. Bacteriol. 183: 6294-6301. Isticato R, Ricca E. 2014. Spore Surface Display. Microbiol. Spectr. 2(5). Katarzyna M. Koczula and Andrea Gallotta. Lateral flow assays.Essays in Biochemistry (2016) 60: 111-120. Kim J, Schumann W: Display of proteins on Bacillussubtilis endospores. Cell Mol Life Sci 2009; 66: 3127–3136. Kunst F., Ogasawara N., Moszer I., Albertini A.M., Alloni G., Azevedo V., Bertero M.G., Bessières P. et al., The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis.Nature 1997 ,390 (6657), 249–256. Kwon SJ, Jung HC, Pan JG: Transgalactosylation in a water-solvent biphasic reaction system with beta-galactosidase displayed on the surfaces of Bacillus subtilis spores. Appl Environ Microbiol 2007; 73: 2251–2256. McKenney, PT., Driks, A., Eichenberger, P. "The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat" (2013) Nature Reviews Microbiology, 11, pp. 33-44. Mohab A. Al-Hinai, Shawn W. Jones, Eleftherios T. Papoutsakis. The Clostridium Sporulation Programs: Diversity and Preservation of Endospore Differentiation Mohab A.Microbiology and Molecular Biology Reviews 2015 , 79 (1), pp. 19-37. Pan JG, Kim EJ, Yun CH: Bacillus spore display. Trends Biotechnol 2012; 30: 610–612. Rowley, T Flow Cytometry - A Survey and the Basics.MATER METHODS 2012, 2: 125. Setlow, P. Germination of Spores of Bacillus Species: What We Know and Do Not Know.Journal of Bacteriology 2014, 196 (7), pp. 1297-1305. Smith, G. P. ,Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.Science 1985 , 228 (4705), pp. 1315–1317. Takamatsu H, Watabe K: Assembly and genetics of spore protective structures. Cell Mol Life Sci 2002; 59: 434–444. Taylor, R. G.; Walker, D. C.; McInnes, R. R.,E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing.Nucleic Acids Research 1993, 21 (7): 1677-1678. Van Bloois E, Winter RT, Kolmar H, Fraaije MW: Decorating microbes: surface display of proteins on Escherichia coli. Trends Biotechnol 2011; 29: 79–86. Yuan Y, Feng F, Chen L, Yao Q, Chen K: Surface display ofAcetobacter pasteurianus AdhA onBacillus subtilis spores to enhance ethanol tolerance for liquor industrial potential. Eur Food Res Technol 2013; 238: 285–293. Zeigler, D. R.; Pragai, Z.; Rodriguez, S.; Chevreux, B.; Muffler, A.; Albert, T.; Bai, R.; Wyss, M.; Perkins, J. B., The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains.J Bacteriol 2008 ,190 (21): 6983-95. Barat, Bhaswati; Wu, Anna M. (2007). "Metabolic biotinylation of recombinant antibody by biotin ligase retained in the endoplasmic reticulum."Biomolecular Engineering .24 (3): 283–91.doi :10.1016/j.bioeng.2007.02.003.PMC 2682619 Negri A, Potocki W, Iwanicki A, Obuchowski M, Hinc K. (2013). "Expression and display ofClostridium difficile protein FliD on the surface ofBacillus subtilis spores." J Med Microbiol., 62: 1379-1385. 10.1099/jmm.0.057372-0. Ning Z, Peng Y, Hao W, Duan C, Rock DL, Luo S. (2011). "Generation of recombinant Orf virus using an enhanced green fluorescent protein reporter gene as a selectable marker." BMC Vet Res., 7: 80-10.1186/1746-6148-7-80.

圖1顯示pSH-SA之質體圖譜。

圖2顯示pLH-SA-eGFP之質體圖譜。

圖3顯示pSH-SA-eGFP之質體圖譜。

圖4顯示利用孢子及金奈米粒子藉由LFA偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之結果。

圖5顯示利用孢子及金奈米粒子藉由LFA偵測β-半乳糖苷酶之結果。

圖6顯示利用孢子及金奈米粒子藉由LFA偵測生物素之結果。

圖7顯示利用孢子及螢光(eGFP)藉由LFA偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之結果。

圖8顯示利用E. coli 及金奈米粒子藉由LFA偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之結果。

圖9顯示利用E. coli 及螢光(eGFP)藉由LFA偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之結果。

圖10顯示利用孢子及HRP/3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)藉由ELISA偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之結果。

圖11顯示利用孢子及TMB藉由ELISA偵測β-半乳糖苷酶之結果。

圖12顯示利用E. coli 及TMB藉由ELISA偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之結果。

圖13顯示利用孢子藉由流式細胞分析技術偵測抗鏈黴抗生物素蛋白抗體之結果。

圖14顯示利用孢子藉由流式細胞分析技術偵測β-半乳糖苷酶之結果。

圖15顯示利用孢子藉由流式細胞分析技術偵測生物素之結果。

圖16顯示利用金奈米粒子藉由傳統LFA偵測β-半乳糖苷酶之結果。

Claims (20)

1. 一種用於偵測樣品中分析物存在之系統，其包含(a)重組大腸桿菌或枯草桿菌內孢子，其表現一或多個相同或相異之重組蛋白於其表面，其中該重組蛋白中至少一者特異性地結合至該分析物，該結合係直接結合或透過特異性地結合至該重組蛋白及該分析物之結合劑結合；及(b)可被偵測之訊號產生物質，該訊號產生物質包含染劑(dye)、螢光蛋白、膠態金奈米粒子、有顏色的奈米粒子或可將未提供訊號之受質轉化為提供訊號之受質之酵素，其中該重組蛋白中至少一者與該分析物之結合係藉由流式細胞分析技術、側層流分析法或ELISA偵測，且其中該系統為診斷套組。
2. 如請求項1之系統，其中該分析物係化合物或蛋白分子。
3. 如請求項1之系統，其中表現於該重組大腸桿菌或枯草桿菌內孢子表面之該一或多個相同或相異之重組蛋白中之各者包含獨立選自以下之外源蛋白質：鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、增強型綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein；eGFP)、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、過氧化氫酶、蟲漆酶(laccase)、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、β-內醯胺酶、與分析物或結合劑特異性或非特異性結合的蛋白質、抗體、抗原、蛋白A、蛋白G、蛋白L及蛋白A/G。
4. 如請求項3之系統，其中表現於該重組大腸桿菌或枯草桿菌內孢子表 面之該一或多個重組蛋白包含eGFP及/或鏈黴抗生物素蛋白。
5. 如請求項3之系統，其中表現於該重組大腸桿菌或枯草桿菌內孢子表面之該一或多個重組蛋白係融合蛋白。
6. 如請求項5之系統，中該融合蛋白包含(i)該重組枯草桿菌內孢子之外套蛋白及外源蛋白，或(ii)該重組大腸桿菌之膜蛋白及外源蛋白。
7. 如請求項6之系統，其中該外源蛋白係鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白L及/或蛋白A/G。
8. 如請求項1之系統，其中該染劑係螢光染劑。
9. 如請求項1之系統，其中該重組枯草桿菌內孢子係由選自以下之枯草桿菌菌株產生：菌株168、PY79、W23及NCIB3610。
10. 如請求項1之系統，其中表現於該重組枯草桿菌內孢子表面之該一或多個重組蛋白中之各者包含獨立選自以下之外套蛋白：CotA、CotB、CotC、CotE、CotG、CotW、CotX、CotY及CotZ。
11. 如請求項2之系統，其中該蛋白分子係抗體。
12. 如請求項1之系統，其中該結合劑係抗該分析物之抗體。
13. 如請求項12之系統，其中該抗體係與生物素或其他蛋白結合分子結合。
14. 如請求項1之系統，其中該訊號產生物質係用於偵測該重組蛋白中至少一者與該分析物之結合或偵測該結合劑與該分析物之結合。
15. 如請求項1之系統，其中該系統進一步包含競爭劑，該競爭劑與該分析物競爭結合該重組蛋白中至少一者或結合劑。
16. 如請求項15之系統，其中該競爭劑本身為訊號產生物質。
17. 如請求項14之系統，其中該訊號產生物質係特異性結合至該分析物之抗體或抗原。
18. 如請求項1之系統，其中該系統進一步包含(a)具正區域及負區域之紙膜，其中抗體、抗原或競爭劑經固定於該正區域及/或該負區域以偵測樣品中分析物存在或不存在；或(b)ELISA盤，其具有固定於其上之可結合至該分析物、抗體、抗原或競爭劑之蛋白質，以偵測樣品中分析物存在或不存在。
19. 如請求項18之系統，其中該紙膜係硝化纖維素紙膜。
20. 一種利用如請求項1至19中任一項之系統偵測樣品中分析物之方法，其中該重組蛋白中至少一者與該分析物之結合係藉由流式細胞分析技術、側層流分析法或ELISA偵測。