DE69835893T2 - Diagnostische tests und kits für clostridium difficile - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der diagnostischen Verfahren und Kits zum Feststellen von Clostridium difficile. Diese Verfahren und Kits stellen schnelle, empfindliche bzw. leicht reagierende und genaue Assays im Hinblick auf das Vorhandensein von toxigenen Stämmen von C. difficile in einer biologischen Probe zur Verfügung.
  • Hintergrund
  • Clostridium diffcile, ein anaerober Organismus, ist der Haupterreger der pseudomembranösen Kolitis (PMC) beim Menschen. PMC ist durch Diarrhö, einer ernsten Entzündung der Kolonschleimhaut, und die Bildung von Pseudomembranen, die aus Fibrin, Schleim, nekrotischen Epithelzellen und Leukozyten bestehen, gekennzeichnet. Die Pseudomembran kann eine Hülle über die ganze Kolonschleimhaut bilden. Es wird davon ausgegangen, dass C. difficile außer beim Auslösen von PCM auch eine Rolle bei anderen, weniger ernsten gastrointestinalen Erkrankungen spielt; es wird angenommen, dass der Organismus ungefähr 25 % der berichteten Fälle von Diarrhö in Verbindung mit Antibiotika hervorruft. Brettle und Wallace (1984), J. Infect., 8: 123-128; Giligan u.a. (1981), J. Clin. Microbiol., 14: 26-31. Diarrhö beeinträchtigt allein in den USA etwa 25 Millionen Menschen jährlich und verursacht fast 11.000 Todesfälle. Peterson und Kelly (1993), Lab. Diagnosis Infect. Dis., 7: 277-292. Durch C. difficile hervorgerufene Krankheiten beschränken sich nicht auf gastrointestinale Erkrankungen, da der Organismus Abszesse, Wundinfektionen, Osteomyelitis, Urogenitaltraktinfektionen, Septikämien, Peritonitis und Pleuritis verursachen kann. Lyerly u.a. (1988) Clin. Microbiol. Rev., 1: 1-18; Hafiz u.a. (1975) Lancet, 1: 420-421; Levett (1986) J. Infect. 12: 253-263; Saginur u.a. (1983), J. Infect. Dis., 147: 1105. Antibiotika können ein Wirtstier für PMC oder andere mit C. difficile in Verbindung stehende Krankheiten prädisponieren, da die Störung der normalen Bakterienflora durch das Antibiotikum die Hauptbarriere gegen die Kolonisierung durch Erreger unterbricht, wodurch das Wirtstier für die Kolonisierung durch Erreger, wie beispielsweise C. difficile, empfänglich wird. Krankenhäuser und Einrichtungen für die Betreuung von chronisch Erkrankten sind maßgebliche Quellen für die Infektion mit D. difficile, wobei in einer Studie festgestellt wird, dass 21 % der Patienten sich eine Infektion mit C. difficile während ihres Krankenhausaufenthalts zugezogen haben. McFarland u.a. (1989), N. Engl. J. Med., 320:204.
  • Das sehr häufige Auftreten einer Infektion durch C. difficile, gekoppelt mit der Wahrscheinlichkeit eines schlechten klinischen Ausgangs für diese Fälle, die nicht sofort behandelt werden, macht den Bedarf an schnellen und genauen Tests deutlich, um eine Infektion durch C. difficile festzustellen, um zu bestimmen, ob ein vorhandenes C. difficile toxigen ist und um die Wirksamkeit der Behandlung zu bewerten. Bisher zur Verfügung stehende Verfahren zum Nachweisen von C. difficile liegen für eine wirksame Diagnose und Behandlung einer Infektion weit unter dem Optimum. Ein bereits bekanntes Verfahren zum Feststellen einer Infektion durch C. difficile ist die Kultur auf Agarmedien. Die Wirksamkeit dieses Verfahrens wird durch eine signifikante Variation der Ergebnisse, die mittels unterschiedlicher Medien erhalten werden, und die hohe Rate an falsch-positiven Ergebnissen (10-29 %) gestört. Peterson und Kelly, supra. Ein zusätzlicher Nachteil dieses Verfahrens besteht in der längeren Kulturzeit, die erforderlich ist, bevor sichtbare Kolonien von C. difficile erkennbar sind. Ein im Handel erhältlicher Assay für C. difficile beinhaltet eine Latexagglutination eines Antigens, das schließlich als Glutamatdehydrogenase von C. difficile identifiziert wurde. Lyerly u.a. (1991), J. Clin. Microbiol., 29: 2639; Lyerly u.a. (1986), J. Clin. Microbiol., 23: 622. Allerdings krankt dieser Assay daran, dass er stark variiert und nicht ausreichend empfindlich und spezifisch ist, wobei die Empfindlichkeit im Bereich von 68 % bis 93 % und die Spezifität zwischen 80 % und 95 % liegen. Peterson und Kelly, supra., Staneck u.a. ((1996) J. Clin. Microbiol., 34:2718) offenbaren einen Immunocard-C. difficile-Test, der auf der Messung der Glutamatdehydrogenase von C. difficile basiert. Bisher verfügbare Glutamatdehydrogenase-Assays wurden nicht als nützlich für das Feststellen von toxigenen Stämmen von C. difficile gehalten, weil Glutamatdehydrogenase durch nicht toxigene Stämme von C. difficile sowie toxigene Stämme erzeugt wird.
  • Nicht toxigene Stämme von C. difficile werden generell als klinisch nicht signifikant angesehen, während toxigene Stämme letal sein können. Obwohl eine Unterscheidung zwischen toxigenen und nicht toxigenen Stämmen von C. difficile daher von großer Wichtigkeit ist, waren bisher bekannte Assays, die bei Versuchen zum Erreichen dieses Ziel verwendet wurden, nicht effektiv. Bei einem üblicherweise verwendeten diagnostischen Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins von toxigenem C. difficile wird bestimmt, ob C. difficile zytotoxisch gegenüber Zelllinien ist. Diese Zytotoxizität ist das Ergebnis von einem oder beiden Toxinen, die durch C. difficile erzeugt werden, einem Enterotoxin, das als Toxin A bezeichnet wird, und einem Zytotoxin, das als Toxin B bezeichnet wird, die an der Pathogenese von PMC beteiligt sein sollen. Allerdings weist der Zytotoxizitäts-Assay signifikante Nachteile für die klinische Verwendung auf, einschließlich die Notwendigkeit, Gewebekulturlinien aufrechtzuerhalten, und die relativ niedrige Empfindlichkeit des Assays. Zum Beispiel haben Peterson und Kelly, supra, festgestellt, dass allein die Empfindlichkeit beim Nachweisen von Zytotoxin im Bereich von 67 % bis 100 % lag, und andere Forscher haben entdeckt, dass die Empfindlichkeit nur 71 % betrug. Demlee u.a. (1985), J. Clin. Microbiol., 21:323. Immunoassays für die Toxine A und/oder B sind auch zum Feststellen von C. difficile in Proben verwendet worden, aber diese Verfahren kranken an der niedrigen Empfindlichkeit (63 % bis 88 %). Peterson und Kelly, supra.
  • Daher besteht ein Bedarf an Assays zum Feststellen des Vorhandenseins von C. difficile in einer Probe, die schnell, empfindlich, spezifisch und kostengünstig sind. Assays zum Nachweisen, ob ein infizierender Stamm von C. difficile toxigen ist, werden auch benötigt. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Zusammensetzungen und Kits für den schnellen Nachweis von C. difficile in einer Testprobe, insbesondere zum Nachweis von toxigenen Stämmen von C. difficile, zur Verfügung.
  • In einer ersten Ausführungsform beinhalten die Verfahren das Nachweisen von Toxin A oder Toxin B von C. difficile und auch das Nachweisen der Glutamatdehydrogenase von C. difficile. Die Assaymittel zum Feststellen der Antigene von C. difficile können beispielsweise Immunoassays sein. Sandwich-Assays stellen eine bequeme, empfindliche Methode zur Durchführung der Verfahren dar. In einer Ausführungsform umfasst der Assay das Nachweisen des Toxins A von C. difficile mittels eines Sandwich-Assays, der einen Ankerrest verwendet, der auf einem festen Träger immobilisiert ist und spezifisch an mindestens ein erstes Epitop des Toxins A von C. difficile bindet, sowie ein oder mehr Nachweisreste, von denen jedes mit einer nachweisbaren Markierung konjugiert ist und spezifisch an mindestens ein zweites Epitop des Toxins A von C. difficile bindet. Der Assay zum Nachweisen der Glutamatdehydrogenase von C. difficile kann auch einen Sandwich-Assay beinhalten, bei dem Glutamatdehydrogenase an einen immobilisierten Ankerrest gebunden ist, der spezifisch an mindestens ein erstes Epitop der Glutamatdehydrognase von C. difficile bindet, wonach die gebundene Glutamatdehydrogenase mittels ein oder mehr Nachweisresten festgestellt wird, von denen jeder mit einer oder mehr nachweisbaren Markierungen konjugiert ist und spezifisch an mindestens ein zweites Epitop der Glutamatdehydrogenase von C. difficile bindet. Der Ankerrest, der spezifisch das Toxin A von C. difficile bindet, und der Ankerrest, der spezifisch die Glutamatdehydrogenase von C. difficile bindet, können in getrennten Bereichen auf einem einzelnen festen Träger oder auf getrennten Trägern immobilisiert sein oder können beide in einem einzelnen Bereich vorhanden sein.
  • Die Erfindung stellt auch Vorrichtungen zum Feststellen des Vorhandenseins von toxigenen Stämmen von C. difficile in einer Testprobe zur Verfügung. Die Vorrichtungen umfassen ein poröses Element mit einer oberen und einer unteren Oberfläche, das in der Vorrichtung so angeordnet ist, dass die Testprobe auf die obere Oberfläche aufgetragen werden kann, wobei eine Vielzahl von Ankerresten, die spezifisch an das Toxin A von C. difficile binden können, in einem ersten Bereich des porösen Elements immobilisiert sind, und eine Vielzahl von Ankerresten, die spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von C. difficile binden können, in einem zweiten Bereich des porösen Elements immobilisiert sind. Die Vorrichtungen umfassen weiterhin ein nicht absorptionsfähiges Element, das eine strukturierte Oberfläche mit Kanälen aufweist, die ein Netzwerk von Kapillarkanälen bilden können, wenn dieses unterhalb oder um das poröse Element in Verbindung angeordnet ist, wobei das Kapillarnetzwerk im Wesentlichen parallel zur unteren Oberfläche des porösen Elements verläuft. Die Testprobe wird, allein oder in Kombination mit anderen Fluiden, beim Auftragen auf die obere Oberfläche durch das poröse Element zum zwischen dem porösen Element und dem nicht absorptionsfähigen Element gebildeten Kapillarnetzwerk gezogen, wenn im Wesentlichen das ganze Porenvolumen des porösen Elements mit der Testprobe gefüllt ist und wenn zwischen dem porösen Element und dem nicht absorptionsfähigen Element ein Kontakt hergestellt ist.
  • Kits zum Durchführen dieser Assays für C. difficile werden auch durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt. Die Kits können einen Behälter, der einige oder alle Reagenzien umfasst, und Verfahren zum Durchführen der Assays aufweisen. Zum Beispiel kann ein Kit einen festen Träger aufweisen, auf dem ein Ankerrest, der spezifisch an Toxin A von C. difficile bindet, und ein Ankerrest, der spezifisch an Glutamatdehydrogenase von C. difficile bindet, immobilisiert ist. In den Kits können auch ein Nachweisrest, der spezifisch an Toxin A von C. difficile bindet, ein Nachweisrest, der spezifisch an Glutamatdehydrogenase von C. difficile bindet, und Reagenzien, die zum Feststellen des Vorhandenseins von zwei unterschiedlichen nachweisbaren Markierungen nützlich sind, die auf jedem der Nachweisreste vorhanden sind, enthalten sein. Diese Kits können auch mit gedruckten Anweisungen, wie der Kit zum Untersuchen auf das Vorhandensein von Toxin A und Glutamatdehydrogenase von C. difficile in einer Testprobe zu verwenden ist, ausgestattet werden. Die Kits können als Kontrollen auch Toxin A und/oder Glutamatdehydrogenase von C. difficile aufweisen; das Antigen von C. difficile kann mit dem Ankerrest in einem Kontrollbereich des festen Trägers komplexiert werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Aminosäuresequenz eines FLAG-Peptidmarkers und eine Nukleotidsequenz, die für dieses Peptid kodiert. Es ist auch eine Spaltstelle für eine Enterokinase gezeigt.
  • 2 zeigt eine schematische Darstellung eines hoch empfindlichen Assays, der zum Feststellen von Toxin A von C. difficile von Nutzen ist.
  • 3A-3C zeigen das obere Teil einer Vorrichtung zum Durchführen eines Immunoassays zum gleichzeitigen Nachweis von Glutamatdehydrogenase und Toxin A von C. difficile. 3A ist eine Ansicht von oben, die eine längliche Vertiefung in der Mitte zeigt. 3B ist eine Schnittansicht des oberen Teils, die eine Membran zeigt, die mittels Ultraschallschweißen an der Unterseite des oberen Teils angebracht ist. 3C ist eine Stirnansicht des oberen Teils der Vorrichtung.
  • 4A-4C zeigen ein unteres Teil einer Vorrichtung zum Durchführen eines Immunoassays zum gleichzeitigen Nachweisen von Glutamatdehydrogenase und Toxin A von C. difficile. 4A ist eine Ansicht von oben, 4B ist eine Schnittansicht und 4C ist eine Stirnansicht des unteren Teils. Zum Bau einer vollständigen Vorrichtung wird ein unteres Teil mit einem oberen Teil so wie in den 3A-3C gezeigt verbunden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Der Begriff „Antikörper", wie er hier verwendet wird, umfasst ein Polypeptid, das im Wesentlichen durch ein Immunoglobulin-Gen durch oder Immunglobulin-Gene kodiert wird, oder Fragmente davon, die spezifisch an einen Analyt (Antigen) binden und diesen erkennen, ist aber nicht darauf beschränkt. Beispiele umfassen polyklonale, monoklonale, chimäre und einzelkettige Antikörper und dergleichen. Fragmente von Immunglobulinen, einschließlich Fab-Fragmente und Fragmente, die durch eine Expressionsbibliothek, einschließlich Phagendisplay, erzeugt werden, sind auch von dem Begriff „Antikörper" umfasst, wie er hier verwendet wird. Siehe z.B. Paul, Fundamental Immunology, 3. Ausgabe, 1993, Raven Press, New York, in Bezug auf den Antikörperaufbau und die Terminologie.
  • Die Ausdrücke „bindet spezifisch an" oder „spezifisch immunreaktiv mit" in Bezug auf einen Antikörper oder einen anderen Bindungsrest betreffen eine Bindungsreaktion, die für das Vorhandensein des Zielanalyts in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Stoffen bestimmend ist. Daher binden unter vorgesehenen Assaybedingungen die spezifischen Bindungsreste vorzugsweise an ein bestimmtes Zielanalyt und binden nicht in signifikanter Menge an andere, in der Testprobe vorhandene Komponenten. Das spezifische Binden an einen Zielanalyt unter solchen Bedingungen kann einen Bindungsrest erforderlich machen, der wegen seiner Spezifität für einen bestimmten Zielanalyt ausgewählt wird. Eine Auswahl von Immunoassayformaten kann verwendet werden, um Antikörper, die mit einem bestimmten Protein spezifisch immunreaktiv sind, auszuwählen. Zum Beispiel werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig zur Auswahl von monoklonalen Antikörpern, die mit einem Analyt spezifisch immunreaktiv sind, verwendet. Siehe Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, wegen einer Beschreibung von Immunoassayformaten und Bedingungen, die angewendet werden können, um die spezifische Immunreaktivität zu bestimmen. Typischerweise ist eine spezifische oder gezielte Reaktion mindestens ein zweifaches Hintergrundsignal oder -geräusch und insbesondere mehr als 10 bis 100-mal der Hintergrund.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Kits und Zusammensetzungen zum Feststellen von Clostridium difficile in einer Testprobe zur Verfügung. Die Assays stellen einen schnellen, genauen und kostengünstigen Assay für eine Infektion durch C. difficile zur Verfügung. Anders als andere Assayverfahren für C. difficile sind die Verfahren der Erfindung sowohl empfindlich als auch spezifisch und in der Lage, genau zu bestimmen, ob ein infizierender Stamm von C. difficile toxigen ist oder nicht. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zum Durchführen eines Assays für eine Infektion durch C. difficile zur Verfügung, indem das Vorhandensein oder das Fehlen von zwei unterschiedlichen Antigenen von C. difficile, Glutamatdehydrogenase und Toxin A, bestimmt wird.
  • Die Verfahren, Zusammensetzungen und Kits, die durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt werden, sind zum Feststellen einer Infektion durch C. difficile in Testproben, einschließlich biologischen Proben, wie beispielsweise Kulturen, Gewebeproben, Körperfluiden und dergleichen, nützlich. Typischerweise ist die biologische Probe, die auf eine Infektion durch C. difficile hin analysiert wird, eine Stuhlprobe. Bei flüssigen oder halbfesten Stuhlproben wird ein Teil der Probe in einen Assaybehälter gegeben und wahlweise mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Wasser oder einem geeigneten Puffer verdünnt und gemischt. Geeignete Puffer umfassen zum Beispiel gepufferte Proteinlösungen und dergleichen. Feste Stuhlproben können in ein Verdünnungsmittel gegeben und durch kräftiges Mischen suspendiert werden. Typischerweise wird die Probe ausreichend verdünnt, um eine ausreichend klare Lösung für die Verwendung in den Assays vorzusehen; dabei handelt es sich im Allgemeinen um eine 3-20-fache Verdünnung, wobei eine etwa 10-fache Verdünnung typisch ist. Nach dem Mischen kann man die Probe beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation oder andere, dem Fachmann bekannte Verfahren klären. Im Allgemeinen sind bekannte Verfahren zum Herstellen von Testproben für Assays, wie beispielsweise Immunoassays, zum Herstellen von Testproben für die Analyse mittels der durch die beanspruchte Erfindung vorgesehenen Verfahren geeignet. Sowohl Toxin A als auch Glutamatdehydrogenase werden im Allgemeinen in löslicher Form vorgefunden, und zwar sowohl in der Kultur als auch in biologischen Proben. Allerdings sind die beanspruchten Verfahren auch zum Nachweisen von diesen Antigenen an der Oberfläche von C. difficile-Zellen sowie löslichen Antigenen nützlich.
  • I. Schnellnachweis einer Infektion mit C. difficile durch einen kombinierten Glutamatdehydrogenase- und Toxin A-Assay.
  • In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren, Zusammensetzungen und Kits für den Schnellnachweis von toxigenen Stämmen von C. difficile in einer Testprobe zur Verfügung. Diese Verfahren beinhalten ein Assaymittel zum Feststellen der Glutamatdehydrogenase von C. difficile und ein Assaymittel zum Feststellen des Toxins A von C. difficile. Durch den Nachweis sowohl von Glutamatdehydrogenase als auch Toxin A sieht das Verfahren eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität beim Feststellen von toxigenen Stämmen von C. difficile als bei der Untersuchung auf jedes Antigen von C. difficile allein vor. Toxigene Stämme von C. difficile, die von besonderem klinischen Interesse sind, weil diese Stämme die Erreger von Krankheiten, wie beispielsweise der pseudomembranösen Kolitis beim Menschen, sind, erzeugen Toxin A. Nicht toxigene Stämme, die wie man glaubt, keine nachteiligen Wirkungen auf den Menschen oder andere Tiere haben, erzeugen kein Toxin A. Glutamatdehydrogenase wird durch C. difficile bei viel höheren Niveaus als Toxin A erzeugt, so dass die Aufnahme eines Glutamatdehydrogenase-Assay in der beanspruchten Erfindung für einen hohen Empfindlichkeitsgrad sorgt.
  • Das Assaymittel zum Feststellen der Glutamatdehydrogenase von C. difficile und des Toxins A von C. difficile sind in einer Ausführungsform Bindungsassays. Bei diesen Assays, die Immunoassays umfassen, werden Glutamatdehydrogenase und Toxin A mittels Nachweisresten festgestellt, die spezifisch an das jeweilige Antigen von C. difficile binden können. Die Nachweisreste umfassen mindestens eine Bindungskomponente und eine nachweisbare Markierung. Geeignete Bindungskomponenten umfassen jeden Rest, der spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von C. difficile oder an Toxin A binden kann. Antikörper und Fragmente davon sind Beispiele für Bindungskomponenten, die in Nachweisresten verwendet werden können.
  • Verschiedene, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Herstellung von Antikörpern, die spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von C. difficile oder Toxin A binden, verwendet werden. Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern kann das jeweilige Antigen von C. difficile zur Impfung von verschiedenen Wirtstieren, einschließlich – aber nicht ausschließlich – Kaninchen, Mäusen, Ratten, Schafen, Ziegen und dergleichen, verwendet werden. Glutamatdehydrogenase kann beispielsweise durch rekombinante Mittel unter Verwendung eines Expressionsvektors, der ein das Enzym kodierendes Gen enthält, hergestellt werden; die vollständige Nukleotidsequenz ist in GenBank, Zugangsnummer M65250 verfügbar. Polyklonale und monoklonale Antikörper können auch mittels rekombinanter Verfahren hergestellt werden. Monoklonale Antikörper können durch jedes Verfahren hergestellt werden, das die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur vorsieht, einschließlich die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Kohler und Milstein entwickelt wurde ((1975) Nature 256: 495-497), sowie die Triomatechnik, die humane B-Zellhybridomtechnik (Kozbor u.a. (1983), Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern (Cole u.a. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77-96). Monoklonale Antikörper können auch in keimfreien Tieren erzeugt werden, wie in der PCT/US89/02545 (Veröffentlichungsnummer WO8912690, veröffentlicht am 12. Dezember 1989) und dem US-Patent Nr. 5,091, 512 beschrieben. Ein Beispiel für einen geeigneten Antikörper zur Verwendung in einem Nachweisrest für das Toxin A von C. difficile ist der rekombinant erzeugte polyklonale Antikörper CD.TXA.1.PC. Ein Beispiel für einen geeigneten Antikörper zur Verwendung in einem Nachweisrest für die Glutamatdehydrogenase von C. difficile ist CD.43.9, bei dem es sich um einen rekombinant erzeugten monoklonalen Antikörper handelt. Jeder dieser Antikörper wurde wie in den allgemein übertragenen US-Patenten Nr. 5,965,375 und 6,057,098 beschrieben hergestellt. Zellen, die jeden dieser Antikörper erzeugen, wurden nach dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852) am 3. April 1998 hinterlegt und ihnen wurden die ATCC-Hinterlegungsnummern 98388 (CD.TXA.I.PC) und 98390 (CD.43.9) zugewiesen.
  • Antikörperfragmente sind auch als Bindungsreste von Nutzen. Während verschiedene Antikörperfragmente durch Verdau eines intakten Antikörpers erhalten werden können, wird der Fachmann es begrüßen, dass solche Fragmente de novo entweder chemisch oder durch Verwendung der rekombinanten DNA-Methode synthetisiert werden können. Daher umfasst der Begriff „Antikörper", wie er hier verwendet wird, auch Antikörperfragmente, die entweder durch die Modifikation von ganzen Antikörpern oder von de novo mittels rekombinanter DNA-Methoden synthetisierten (z.B. einzelkettige Fv) erzeugt werden. Einzelkettige Antikörper sind auch zum Aufbau von Nachweisresten von Nutzen. Verfahren zum Herstellen von einzelkettigen Antikörpern sind zum Beispiel im US-Patent Nr. 4,946,778 beschrieben. Techniken zum Aufbau von Fab-Expressionsbibliotheken wurden von Huse u.a. (1989), Science, 246: 1275-1281 beschrieben; diese Techniken erleichtern die schnelle Identifikation von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für Toxin A oder Glutamatdehydrogenase. Geeignete Bindungsreste umfassen auch die mittels Verfahren, wie beispielsweise Phagendisplay, erhaltenen.
  • Die Nachweisreste, die in der beanspruchten Erfindung verwendet werden, umfassen im Allgemeinen zusätzlich zum Bindungsrest eine nachweisbare Markierung. Geeignete nachweisbare Markierungen umfassen jeden Rest, der durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische, chemische oder andere Mittel feststellbar ist. Zum Beispiel umfassen geeignete Markierungen Biotin zum Färben mit markiertem Streptavidinkonjugat, fluoreszierende Farbstoffe (z.B. Fluorescein, Texas rot, Rhodamin, grünes fluoreszierendes Protein und dergleichen), Radiomarkierungen (z.B. 3H, 125I, 35S, 14C oder 32P), Enzyme (z.B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase und andere, die üblicherweise in einem ELISA verwendet werden), und kolorimetrische Markierungen, wie beispielsweise kolloidales Gold oder Kügelchen aus gefärbtem Glas oder Kunststoff (z.B. Polystyrol, Polypropylen, Latex usw.). Patente, die die Verwendung von solchen Markierungen beschrieben haben, umfassen die US-Patente Nr. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,3509; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241. Siehe auch Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6. Ausgabe, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Mittel zum Feststellen von solchen Markierungen sind dem Fachmann bekannt. Daher können zum Beispiel Radiomarkierungen mittels eines photographischen Films oder Szintillationszählern erfasst werden, fluoreszierende Marker können mit einem Photodetektor zum Feststellen von emittiertem Licht verwendet werden. Enzymatische Markierungen werden typischerweise durch Ausstatten des Enzyms mit einem Substrat und Erfassen des Reaktionsprodukts nachgewiesen, das durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat erzeugt wurde, und kolorimetrische Markierungen werden durch einfaches Visualisieren der farbigen Markierung festgestellt. Zur Verwendung der vorliegenden Erfindung in der Klinik sind bevorzugte Markierungen nicht radioaktiv und werden sofort ohne die Notwendigkeit von komplizierten Vorrichtungen nachgewiesen. Vorzugsweise wird das Feststellen der Markierungen zu einem sichtbaren Signal führen, das bei Sichtprüfung sofort erkennbar ist.
  • Ein bevorzugtes Format zur Verwendung der beanspruchten Verfahren in der klinischen Ausstattung umfasst das Feststellen der Glutamatdehydrogenase und des Toxins A von C. difficile nachdem diese Analyte auf einem festen Träger immobilisiert wurden. Geeignete Träger umfassen zum Beispiel Gläser, Kunststoffe, Polymere, Metalle, Metalloide, Keramiken, organische Stoffe und dergleichen. Bestimmte Beispiele umfassen Mikrotiterplatten, Nitrocellulosemembranen, Nylonmembranen und derivatisierte Nylonmembranen und auch Partikel, wie beispielsweise Agarose, SEPHADEXTM und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Um die Antigene von C. difficile auf dem festen Träger zu immobilisieren, sind zwei Arten von Ankerresten in nicht diffusiver Art mit dem Träger verbunden. Eine Ankerrest-Art kann spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von C. difficile binden und die andere kann spezifisch an das Toxin A von C. difficile binden. Ankerreste können jede Verbindung sein, die spezifisch an das jeweilige Antigen von C. difficile bindet. Antikörper, die für das jeweilige Antigen von C. difficile spezifisch sind, und Fragmente von solchen Antikörpern sind Beispiele für Ankerreste, die in den Assays der Erfindung verwendet werden können. Ein geeigneter Ankerrest, der spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von C. difficile bindet, ist der rekombinante polyklonale Antikörper CD.43.5.PC, der wie in dem gleichzeitig anhängigen, allgemein übertragenen US-Patent Nr. 6,057,098 beschrieben hergestellt wurde. Zellen, die diese Antikörper erzeugen, wurden nach dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852) am 3. April 1997 hinterlegt und ihnen wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 98389 gegeben. Ein geeigneter Ankerrest für das Toxin A von C. difficile ist PCG-4, das im US-Patent Nr. 4,533,630 beschrieben ist.
  • Die Ankerreste können auf dem Träger entweder durch kovalente oder nicht kovalente, dem Fachmann bekannte Verfahren auf nicht diffusive Weise immobilisiert sein. Siehe zum Beispiel Pluskal u.a. (1986), BioTechniques, 4: 272-283. In geeigneter Weise sind der Ankerrest für Glutamatdehydrogenase und der Ankerrest für Toxin A auf benachbarten festen Trägern immobilisiert, oder besonders bevorzugt in unterschiedlichen Bereichen desselben festen Trägers. Jeder diskrete Ankerrestbereich kann dazu verwendet werden, um eine unterschiedliche immunochemische Reaktion zu vervollständigen, wodurch es ermöglicht wird, immunochemische Reaktionen für beide Antigene von C. difficile gleichzeitig durchzuführen. In einer anderen Ausführungsform, in der die Nachweisreste für die beiden Antigene von C. difficile jeweils eine unterschiedliche Markierung verwenden, die in Gegenwart eines Signals von der Markierung auf dem Nachweisrest für das zweite Antigen festgestellt werden können, können die Ankerreste für beide Antigene in demselben Bereich eines einzelnen festen Trägers immobilisiert sein.
  • Die Assays können in jedem von mehreren Formaten durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein Sandwich-Assay durchgeführt werden, indem eine biologische Probe hergestellt wird, wie oben erörtert oder wie ansonsten für die bestimmte Probe passend ist, und indem die Probe mit einem festen Träger in Kontakt gebracht wird, an den mehrere Ankerreste für die Glutamatdehydrogenase von C. difficile und mehrere Ankerreste für das Toxin A von C. difficile immobilisiert ist. Die Toxin A- und Glutamatdehydrogenase-Antigene von C. difficile binden, wenn sie in der Probe vorkommen, an die geeigneten Ankerreste. Der feste Träger wird dann mit Nachweisresten für jedes der beiden Antigene von C. difficile entweder getrennt oder als Gemisch der beiden Nachweisreste kontaktiert. Der feste Träger kann vor dem Kontakt mit den Nachweisresten gewaschen werden, um ungebundene Reagenzien zu entfernen. Nach der Inkubation der Nachweisreste für einen Zeitraum, der ausreicht, um einen wesentlichen Anteil der immobilisierten Antigene von C. difficile zu binden, werden alle nicht gebundenen, markierten Reagenzien zum Beispiel durch Waschen entfernt. Die nachweisbaren Markierungen, die mit den Nachweisresten verbunden sind, werden dann nachgewiesen. Zum Beispiel wird im Fall eines Enzyms, das als eine nachweisbare Markierung verwendet wird, ein Substrat für das Enzym, das sich nach der Einwirkung des Enzyms sichtlich verfärbt, mit dem gebundenen Nachweisrest in Kontakt gebracht. Eine sichtbare Farbe wird dann im Verhältnis zur Menge des spezifischen Antigens in der Probe festgestellt. Wenn die beiden Ankerreste sich in demselben Bereich des festen Trägers befinden und zwei unterschiedliche Nachweisreste verwendet werden, falls beide Antigene in der Probe vorkommen, ist die Farbe des Bereichs ein Gemisch aus den Farben, die aus den beiden Markierungen resultieren.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nachweisreste und/oder ein oder mehr zusätzliche Komponenten, die für den Nachweis notwendig sind, der Probe vor oder gleichzeitig mit dem Kontaktieren der Probe mit dem festen Träger zugeführt werden. Das Toxin A und die Glutamatdehydrogenase von C. difficile werden mit den Nachweisresten verbunden. Dies kann zu einem Assay führen, der vom Klinikarzt weniger Aufwand erfordert.
  • Assay-Systeme zur Verwendung in den Verfahren und Kits der Erfindung umfassen Teststäbchen-Vorrichtungen, immunchromatographische Teststreifen und Radial-Partition-Immunoassay-Vorrichtungen und Durchflusseinrichtungen, sind aber nicht darauf beschränkt. In geeigneter Weise fließt, wenn der feste Träger eine Membran ist, die Probe durch die Membran, zum Beispiel aufgrund der Schwerkraft, der Kapillarwirkung oder unter positivem oder negativem Druck. Bevorzugte Assay-Systeme zur Verwendung in den Kits und Verfahren der Erfindung sind in EP 447 154 beschrieben. Diese Systeme verwenden eine Vorrichtung, wie sie in den 3, 4 und 5 gezeigt ist, wobei die Vorrichtung ein poröses Element, wie beispielsweise eine Membran oder ein Filter, verwendet, auf dem mehrere Ankerreste für jedes der Antigene von C. difficile, jeweils in einem einzelnen Bereich, gebunden ist. Die Vorrichtung umfasst auch ein nicht absorptionsfähiges Element mit einer strukturierten Oberfläche in Verbindung mit der unteren Oberfläche des porösen Elements. Die strukturierte Oberfläche des nicht absorptionsfähigen Elements kann eine gerillte Oberfläche, wie beispielsweise die Oberfläche einer Platte, sein oder sie kann derart aus Kanälen zusammengesetzt sein, dass, wenn die porösen und nicht absorptionsfähigen Elemente miteinander in Kontakt gebracht werden, ein Netzwerk von Kapillarkanälen gebildet wird. Das Kapillarnetzwerk wird aus dem Kontakt des porösen Elements mit der strukturierten Oberfläche des nicht absorptionsfähigen Elements gebildet und kann entweder vor oder anschließend an die anfängliche Kontaktierung des porösen Elements mit einem Fluid aufgebaut werden. In einigen Ausführungsformen bevorzugt die Kapillarverbindung zwischen dem porösen Element und dem nicht absorptionsfähigen Element das Verschieben der Weiterleitung von Fluid aus dem porösen Element auf das Kapillarnetzwerk, das von dem porösen Element und der strukturierten Oberfläche des nicht absorptionsfähigen Elements gebildet ist, bis das Volumen des zugesetzten Fluids im Wesentlichen das Porenvolumen des porösen Elements übersteigt. Die Übertragung von Fluid vom porösen Element auf das Netzwerk von Kapillarkanälen, die durch das poröse Element und die strukturierte Oberfläche des nicht absorptionsfähigen Elements gebildet werden, kann ohne die Anwendung von äußeren Mitteln erfolgen, wie beispielsweise positiver externer Druck oder Vakuum oder Kontakt mit einem absorptionsfähigen Material. Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können auch ein wahlweises Element aufweisen, das mit der oberen Oberfläche des porösen Elements in Kontakt gebracht werden kann, und können dazu verwendet werden, die obere Oberfläche der Vorrichtung in einzelne Öffnungen zu unterteilen. Solche Öffnungen können entweder Zutritt zum porösen Element oder der strukturierten Oberfläche des nicht absorptionsfähigen zweiten Elements haben. Das wahlweise Element kann in Verbindung mit dem nicht absorptionsfähigen Element einen Fluidauffangbereich bilden, in dem es kein dazwischen geschaltetes, poröses Element gibt. Ein Fluidauffangbereich, der aus dem nicht absorptionsfähigen Element und dem wahlweisen Element aufgebaut ist, stellt eine Fluidkapazität zusätzlich zu der her, die durch das Netzwerk der Kapillarkanäle vorgesehen wird, die durch den Kontakt des porösen Elements und des nicht absorptionsfähigen Elements erzeugt werden. Die Öffnungen in dem wahlweisen Element können eine erste Fluidöffnung und auch eine zusätzliche Fluidöffnung umfassen. Die erste Fluidöffnung fungiert als Portal für die Einführung des ersten, der Vorrichtung zugesetzten Fluids. Die zusätzliche Fluidöffnung dient als zusätzliches Portal, durch das zusätzliche Fluide der erfinderischen Vorrichtung zugeführt werden können.
  • Um einen Assay unter Anwendung dieser Vorrichtungen durchzuführen, wird ein Volumen der Probe dem porösen Element zugesetzt, wenn die Probe durch das Porenvolumen des porösen Elements dringt und dadurch die Ankerreste kontaktiert, die auf dem porösen Element immobilisiert sind. In einem nicht kompetitiven Assay wird die zu untersuchende Probe auf das poröse Element aufgebracht und, soweit vorhanden, die jeweiligen Antigene von C. difficile von den Ankerresten gebunden. Die Nachweisreste für jedes Antigen von C. difficile werden dann als zusätzliches Fluid zugesetzt; diese binden an den Komplex des Antigens von C. difficile und den Ankerrest. Alternativ können die Nachweisreste der Probe vor dem Auftragen der Probe auf das poröse Element zugesetzt werden, so dass die Bindung des Nachweisrests an das Antigen von C. difficile vor der Bindung des Antigens von C. difficile an den Ankerrest auftritt. In einer anderen Ausführungsform werden die Ankerreste und die Nachweisreste der Probe zugesetzt, wonach der Komplex des Ankerrests, des Antigens von C. difficile und des Nachweisrests an ein Bindemittel bindet, das entweder mit diesen Reagenzien kombiniert wird oder auf dem porösen Element immobilisiert wird. Ein zusätzliches Fluid, das Reagenzien enthält, um eine Trennung von freien von gebundenen markierten Reagenzien zu bewirken, kann nötigenfalls zum Entfernen des überschüssigen Nachweisrests zugesetzt werden.
  • Diese Vorrichtung ist so aufgebaut, dass sie eine ausreichende Empfindlichkeit vorsieht, um niedrige Konzentrationen an Toxin A und Glutamatdehydrogenase von C. difficile zu messen, weil man große Mengen an Probe verwenden kann und wirksam den Überschuss des Antigens von C. difficile oder des Nachweisrest entfernen kann. In der Tat, verbessert die wirksame Trennung zwischen freier und gebundener Markierung, die durch das Netzwerk an Kapillarkanälen dieser Vorrichtung erzielt wird, die Unterscheidung eines spezifischen Signals, das mit dem Antigen von C. difficile verbunden ist, gegenüber dem nicht spezifischen Hintergrundsignal. Falls notwendig, wird dann eine Signalentwicklerlösung zugesetzt, um zu ermöglichen, dass die Markierung des Nachweisrests ein nachweisbares Signal entwickelt. Das entwickelte Signal kann dann mit der Konzentration des Zielliganden in der Probe verknüpft werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Übertragung von Fluid zwischen dem porösen ersten Element der Vorrichtung und dem Netzwerk aus Kapillarkanälen, die durch den Kontakt des porösen Elements und der strukturierten Oberfläche des nicht absorptionsfähigen zweiten Elements der Vorrichtung gebildet ist, allgemein selbst eingeleitet an dem Punkt, an dem das Gesamtfluidvolumen, das der Vorrichtung zugesetzt wurde, das Porenvolumen des porösen Elements übersteigt und so das Bedürfnis nach einer aktiven Wechselwirkung durch den Anwender umgeht, um überschüssiges Fluid aus dem Analytnachweisbereich zu entfernen. Der Punkt, an dem der Fluidtransfer eingeleitet wird, hängt von den Zielen des Assays ab. Normalerweise ist es wünschenswert, die Probe mit allen Bereichen auf dem porösen Element zu kontaktieren, die einen immobilisierten Rezeptor enthalten, so dass das Auftragen von zusätzlichem Fluid die Trennung von ungebundener Markierung von der an das poröse Element gebundener Markierung bewirkt. Dieses Verfahren ermöglicht das Nachweisen der Antigene von C. difficile auf eine Weise, die einfach, schnell, bequem, empfindlich und wirksam in der Anwendung von markierten Reagenzien ist.
  • Kompetitive Bindungsassays können auch verwendet werden, um das Toxin A und die Glutamatdehydrogenase von C. difficile zu erfassen. Bequemerweise werden diese Assays mittels der beschriebenen Vorrichtungen durch Zugabe eines markierten Analogs von jedem der Antigene von C. difficile zu einer Probe durchgeführt. Das markierte Analog und alle in der Probe vorhandenen Antigene von C. difficile kämpfen um die Bindungsstellen der Ankerreste. Alternativ können die Ankerreste mit der Probe und den markierten Analogen mit anschließender Immobilisierung der Ankerreste auf dem porösen Element durch Kontakt mit einem Bindungsmittel verbunden werden. Ein zusätzliches Fluid zum Trennen der freien von der gebundenen Markierung kann der Vorrichtung zugesetzt werden und anschließend, falls erforderlich, eine Signalentwicklungslösung, um das Feststellen der Markierung des markierten Analogs zu ermöglichen, das mit dem Ankerrest, der auf dem porösen Element immobilisiert ist, komplexiert ist. Die Menge an markiertem Antigenanalog von C. difficile, das an das poröse Element gebunden ist, steht in Beziehung zur Konzentration des Antigens von C. difficile in der Probe.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung des Toxins A und der Glutamatdehydrogenase von C. difficile durch die beschriebenen Verfahren zur Verfügung. Die Kits können einen Behälter aufweisen, der einen oder mehr der oben erörterten Nachweisreste mit oder ohne Markierungen umfasst, sowie Ankerreste, die frei oder an feste Träger gebunden sind. Auch können die Kits eine geeignete Membran umfassen, vorzugsweise in Form einer Assayvorrichtung, die an die Verwendung in dem beschriebenen Assay angepasst ist. Vorzugsweise besitzen die Kits auch Reagenzien, die in den beschriebenen Assays verwendet werden, einschließlich Reagenzien, die zum Feststellen des Vorhandenseins der nachweisbaren Markierungen nützlich sind. Andere Materialien, die zur Durchführung der Assays verwendbar sind, können auch in den Kits enthalten sein, einschließlich Teströhrchen, Transferpipetten und dergleichen. Die Kits können auch Anweisung für die Anwendung von einem oder mehr dieser Reagenzien in jedem der hier beschriebenen Assays aufweisen.
  • Die Kits der Erfindung können auch eine interne und/oder eine externe Kontrolle umfassen. Eine interne Kontrolle kann aus dem Toxin A oder der Glutamatdehydrogenase von C. difficile bestehen. Das Kontrollantigen kann in geeigneter Weise vorher an dem Ankerrest in einem Bereich benachbart zu dem Bereich, auf dem die Probe aufgetragen ist, angebracht werden. Die externe Kontrolle kann auch aus dem Toxin A oder der Glutamatdehydrogenase von C. difficile bestehen. Typischerweise liegt das in der externen Kontrolle vorhandene Antigen in einer Konzentration bei oder über der Empfindlichkeitsgrenze des Assaymittels vor. Das Antigen der externen Kontrolle kann in der Probenverdünnung verdünnt werden und auf dieselbe Weise wie eine biologische Probe untersucht werden. Alternativ kann das Antigen oder können die Antigene von C. difficile einem Aliquot einer eigentlichen biologischen Probe zugesetzt werden, um die Empfindlichkeit des Assays zu bestimmen. Die Kits der vorliegenden Erfindung können Materialien enthalten, die für einen Assay genügen, oder sie können ausreichend Material für mehrere Assays haben.
  • Die Verfahren, Zusammensetzungen und Kits, die durch diese Ausführungsform der Erfindung vorgesehen werden, können das Toxin A und/oder die Glutamatdehydrogenase von C. difficile mit hoher Empfindlichkeit feststellen. Die beanspruchten Assays und Kits stellen Glutamatdehydrogenase von C. difficile fest, wenn es in einer Probe in einer Konzentration von etwa 100 ng/ml oder weniger vorhanden ist. Vorzugsweise liegt die Nachweisgrenze für Glutamatdehydrogenase bei etwa 50 ng/ml oder weniger, besonders bevorzugt bei etwa 10 ng/ml oder weniger und noch weiter bevorzugt liegt die Nachweisgrenze für Glutamatdehydrogenase bei etwa 2 ng/ml oder weniger. In ähnlicher Weise erfassen die Assays das Toxin A von C. difficile, wenn es in einer Probe in einer Konzentration von etwa 100 ng/ml oder weniger vorhanden ist. Vorzugsweise liegt die Nachweisgrenze für Toxin A bei etwa 50 ng/ml oder weniger, besonders bevorzugt bei etwa 10 ng/ml oder weniger und noch weiter bevorzugt liegt die Nachweisgrenze für Toxin A bei etwa 2 ng/ml oder weniger.
  • II. Assays mit hoher Empfindlichkeit gegenüber toxigenen Stämmen von C. difficile
  • Glutamatdehydrogenase wird durch nicht toxigene Stämme sowie toxigene Stämme erzeugt, während Toxin A und Toxin B nur durch toxigene Stämme von C. difficile erzeugt werden. Nicht toxigene Stämme werden klinisch als unwichtig angesehen, weil dieser Zustand, selbst wenn solche Stämme in einer Patientenprobe festgestellt werden, nicht zu einer pseudomembranösen Kolitis fortschreitet. Daher ist die Untersuchung auf Toxin A oder Toxin B sowie Glutamatdehydrogenase klinisch erwünscht. Allerdings erzeugen toxigene Stämme von C. difficile im Allgemeinen Toxin A in Mengen, die weit unter den erzeugten Glutamatdehydrogenasemengen liegen können; Toxin B wird in noch kleineren Mengen erzeugt. Die Produktion von Toxin A wird signifikant durch die Umgebung beeinflusst, in der der Organismus aufwächst. Wegen der niedrigen Niveaus an Toxin A in vielen Proben, übersehen bereits bestehende Assays für das Toxin A von C. difficile, die generell nicht weniger als 2 ng Toxin A pro ml feststellen können, etwa 20-30 % der toxigenen Infektionen mit C. difficile. Daher ist es, wenn ein Assay ein positives Ergebnis für die Glutamatdehydrogenase von C. difficile gibt, aber für Toxin A negativ ist, wünschenswert, einen zweiten, empfindlicheren Assay für Toxin A oder Toxin B durchzuführen, um sicherzustellen, dass der Stamm von C. difficile wirklich nicht toxigen ist. In ähnlicher Weise sind bereits bekannte Assays für Toxin B, wie beispielsweise Zytotoxizitätsassays, manchmal empfindlicher als Assays auf Toxin A, allerdings sind sie viel weniger spezifisch. Peterson u.a. (1993), Lab. Diagnos. Infect. Dis., 7: 277-293; Schleupner u.a. (1995), J. Clin. Microbiol., 33: 1755-1759. Die Spezifität der Zytotoxizitätstests kann wesentlich verbessert werden, wenn nur Proben, die für Glutamatdehydrogenase positiv sind, einer Zytotoxizitätstestung unterworfen werden. Wieder ist ein Zwei-Stufen-Assay, wie beispielsweise der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte, nützlich, um ein genaueres Ergebnis als durch frühere Assays vorgesehen zu erhalten. Die vorliegende Erfindung stellt solche Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zum Durchführen von solchen Zwei- Komponenten-Tests für toxigene Stämme in C. difficile zur Verfügung. Diese Verfahren umfassen die Verwendung eines ersten Assays für die Glutamatdehydrogenase von C. difficile und anschließend einen hochempfindlichen Assay für das Toxin A und/oder Toxin B von C. difficile, der mit Proben durchgeführt wird, die für Glutamatdehydrogenase positiv testen.
  • A. Amplifikation von Nukleinsäuren von C. difficile.
  • Hochempfindliche Assays für Toxin A und/oder Toxin B, die dazu dienen zu bestimmen, ob ein Stamm von C. difficile toxigen ist, umfassen die Amplifikation einer Nukleinsäure, die Toxin A, Toxin B oder einen Teil davon kodiert, mittels Polymerasekettenreaktion (PCR), Ligasekettenreaktion (LCR), dem Transkriptions-Amplifikationssytem (TAS), dem selbst erhaltenden Sequenzreplikationssystem (SSR). Eine große Vielzahl von in vitro Amplifikationsverfahren ist dem Fachmann bekannt. Beispiele für die Techniken, die ausreichen, um den Fachmann durch in vitro Amplifikationsverfahren hindurchzudirigieren, werden bei Berger, Sambrook und Ausubel sowie Mullis u.a. (1987), US-Patent Nr. 4 683 202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis u.a., Hrsg.), Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1. Oktober 1990), Chemical & Engineering News, Seiten 36-47; The Journal Of NIH Research (1991), 3: 81-94; Kwoh u.a. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173; Guatelli u.a. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874; Lomell u.a. (1989), J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren u.a. (1988), Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990), Biotechnology 8: 291-294; Wu und Wallace, (1989), Gene 4: 560; und Barringer u.a. (1990), Gene 89: 117 gefunden.
  • Im Allgemeinen können ein Paar von Oligonukleotidprimer, die spezifisch an eine Nukleinsäure hybridisieren, die einen Teil des Toxins A oder Toxins B von C. difficile kodieren, oder eine Nukleinsäure, die zu einer solchen Nukleinsäure komplementär ist, mit von einer Probe erhaltenen Nukleinsäuren binden, woraufhin die Amplifikationsreaktion durchgeführt wird. Das Vorhandensein eines amplifizierten Fragments, das zum Beispiel durch Gelelektrophorese festgestellt wird, zeigt an, dass der Stamm von C. difficile toxigen ist. Beispiele für Primerpaare, die für die Amplifikation einer Nukleinsäure geeignet sind, die einen Teil des Toxins A, Toxins B und der Glutamatdehydrogenase von C. difficile kodiert, werden in dem nachfolgenden Beispiel III gefunden. Der Fachmann kann zusätzliche Primer finden, die Nukleinsäuren amplifizieren können, die Toxin A und/oder Toxin B und Glutamatdehydrogenase von C. difficile kodieren. Die Nukleotidsequenzen von Toxin A (Dove u.a., Infect. Immun., 58: 480-488 (1990); GenBank Hinterlegungsnummer M30307), Toxin B (Barroso u.a., Nucl. Acids Res. 18: 4004 (1990); GenBank Hinterlegungsnummer X53138) und Glutamatdehydrogenase (GenBank Hinterlegungsnummer M65250) sind öffentlich erhältlich. Um die Amplifikation durchzuführen, werden Zellen zum Beispiel durch Kochen oder andere Lyseverfahren lysiert, und anschließend wird eine Amplifikation unter Reaktionsbedingungen durchgeführt, die dem Fachmann bekannt sind. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von amplifizierten Fragmenten sind dem Fachmann auch bekannt.
  • Als positive Kontrolle kann man auch eine Nukleinsäure amplifizieren, die in toxigenen sowie nicht toxigenen Stämmen von C. difficile vorhanden ist. Diese Kontrollamplifikation kann als getrennte Reaktion oder in derselben Reaktion als Amplifikation von Toxin A oder Toxin B von C. difficile durchgeführt werden. Ein Beispiel für eine geeignete positive Kontrolle verwendet Primer, die spezifisch an eine Nukleinsäure hybridisieren, die Glutamatdehydrogenase von C. difficile oder einen Teil davon kodiert. Das Vorhandensein eines amplifizierten Glutamatdehydrogenase-Nukleinsäurefragments zeigt eine erfolgreiche Amplifikationsreaktion an und veranschaulicht, dass die Probe keinen Polymeraseinhibitor enthält. Wenn kein amplifiziertes Glutamatdehydrogenase-Nukleinsäurefragment im Anschluss an die Amplifikationsreaktion festgestellt wird, kann eine weitere Verdünnung der Probe erforderlich sein, um eine erfolgreiche Amplifikation zu erhalten.
  • Um Toxin B als Teil des Zwei-Komponenten-Assays festzustellen, kann auch ein Zytotoxizitätsassay verwendet werden. Solche Zytotoxizitätsassays sind dem Fachmann bekannt. Obwohl diese Assays bei niedriger Verdünnung recht empfindlich sein können, ist ihre Spezifität niedrig, da viele falschpositive Ergebnisse erhalten werden. Beim Durchführen des relativ empfindlichen aber nicht spezifischen Zytotoxizitätsassays in Verbindung mit dem Glutamatdehydrogenase-Assay, der die meisten falschpositiven Ergebnisse ausschaltet, wird ein hochgenauer Assay für toxigenes C. difficile erhalten.
  • B. Magnetkügelchen-Assays
  • Zusätzliche, hochempfindliche Assays für das Toxin A von C. difficile werden zur Verfügung gestellt. Diese Assays umfassen die Verwendung von Magnetkügelchen zur Konzentration von Toxin A aus einer Probe (siehe 2). Zusammenfassend werden diese Assays durch Zugabe eines Toxin A-Bindungsrests zu einer auf das Vorhandensein von toxigenen Stämmen von C. difficile zu testenden Probe ausgeführt. Der Toxin A-Bindungsrest und angegliedertes Toxin A werden mittels eines Magnetkügelchens konzentriert, an das ein Capture- bzw. Einfangrest angelagert ist, der in der Lage ist, reversibel an den Toxin A-Bindungsrest zu binden. Nach dem Ausbilden des Komplexes aus magnetischen Kügelchen/Toxin A-Bindungsrest/Toxin A wird der Komplex durch Anlegen eines magnetischen Felds an die Probe gesammelt.
  • Der Toxin A-Bindungsrest kann spezifisch an das Toxin A von C. difficile binden. Zum Beispiel kann ein Toxin A-Bindungsrest ein Polypeptid sein, wie beispielsweise ein Antikörper oder ein Antikörperfragment, das das Toxin A von C. difficile erkennt. Beispiele für geeignete Toxin A-Bindungsreste umfassen die oben zur Verwendung in Nachweisresten beschriebenen. Zum Beispiel ist der mittels Hybridom erzeugte monoklonale Antikörper PCG-4, der im US-Patent Nr. 4,533,630 beschrieben ist, zur Verwendung als Toxin A-Bindungsrest geeignet. Natürlich vorkommende Liganden, die für Toxin A spezifisch sind, sind auch als Toxin A-Bindungsreste nützlich; solche Liganden können zum Beispiel durch Affinitätschromatographie mittels immobilisiertem Toxin A als Affinitätsreagens identifiziert werden. Vorzugsweise wird der Toxin A Bindungsrest der Probe in ausreichender Menge zugesetzt und mit der Probe über einen Zeitraum inkubiert, der ausreicht, um im Wesentlichen das ganze Toxin A in der Probe mit dem Toxin A-Bindungsrest zu verbinden. Zum Beispiel kann zu 1 ml einer Probe, die unverdünnt oder verdünnt (z.B. Verdünnung 1-50-fach oder mehr) sein kann, 0,1 bis 5 μg Toxin A-Bindungsrest zugesetzt werden und 10 min bis 24 h lang inkubiert werden, um eine fast vollständige Verbindung von Toxin A mit dem Bindungsrest zu erhalten.
  • Um die Komplexe aus Toxin A/Toxin A-Bindungsrest zu konzentrieren, wird der Probe ein Magnetkügelchen, an das ein Einfangrest angelagert ist, der spezifisch an den Toxin A-Bindungsrest bindet, zugesetzt. Magnetkügelchen oder -partikel, wie beispielsweise magnetische Latexkügelchen und Eisenoxidpartikel, die in der beanspruchten Erfindung von Nutzen sind, sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel werden magnetische Partikel im US-Patent Nr. 4,672-040 beschrieben. Magnetische Partikel sind im Handel zum Beispiel von PerSeptive Biosystems, Inc. (Framingham, MA), Ciba Corning (Medfield MA), Bangs Laboratories (Carmel IN) und BioQAuest, Inc. (Atkinson, NH) erhältlich. Das Verbinden von Einfangresten mit Magnetkügelchen kann mittels bekannter Verfahren erreicht werden. Zum Beispiel sind Kügelchen im Handel erhältlich, die mit Amino- Carboxylgruppen derivatisiert sind, die an ein Protein oder einen anderen Einfangrest zum Beispiel mittels Glutaraldehyd, Carbodiimid, Diazotoverbindungen oder eines anderen geeigneten Vernetzungsmittels binden können. Die Silanisierung von magnetisch reaktiven Partikeln stellt ein Verfahren zum Erhalten von reaktiven Gruppen an der Oberfläche der Partikel zur Verfügung (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,672,040 für eine Beschreibung der Silanisierung und Silanverbindungschemie). Verbindende Bindungen können zum Beispiel Amid, Ester, Ether, Sulfonamid, Disulfid, Azo und andere dem Fachmann bekannte sein. In einer Ausführungsform sind die Magnetkügelchen Eisenoxidpartikel, die silanisiert werden. Ein Beispiel für geeignete silanisierte Kügelchen mit funktionellen Gruppen, die für die kovalente Bindung von Einfangresten geeignet sind, ist das BioMagTM Partikel, das im Handel von PerSeptive Biosystems, Inc. erhältlich ist. Obwohl die kovalente Bindung des Ankerrests an das Magnetkügelchen im Allgemeinen bevorzugt ist, sind nicht kovalente Bindungen in den beanspruchten Verfahren und Kits auch von Nutzen. Zum Beispiel können Einfangreste an magnetische Latexkügelchen über nicht kovalente physikalische Adsorption angelagert werden.
  • Der Einfangrest kann den Toxin A-Bindungsrest spezifisch und reversibel binden. Die reversible Bindung zwischen dem Einfangrest und dem Toxin A-Bindungsrest kann durch Anlagerung eines molekularen Tags (Markierung) an den Toxin A-Bindungsrest erreicht werden, der wegen seiner Fähigkeit, spezifisch und reversibel an den Einfangrest zu binden, ausgewählt wird. Der molekulare Tag und der entsprechende Einfangrest werden so ausgewählt, dass die Bindung des Einfangrests an den molekularen Tag unter relativ milden Bedingungen reversibel ist. Die Dissoziationsbedingungen sind vorzugsweise mild genug, damit der Toxin A-Bindungsrest und das Toxin A während und nach dem Dissoziationsschritt und der Trennung von Magnetkügelchen miteinander in Kontakt bleiben, so dass der Toxin A-Bindungsrest und das Toxin A sich direkt nach der Modifikation der Lösung zum Beispiel durch Neutralisation wieder verbinden. Insbesondere bleiben das Toxin A und der Toxin A-Bindungsrest während der ganzen Dissoziations- und Trennungsschritte verbunden. Durch Aufrechterhalten oder sofortiges Wiedereinrichten der Verbindung zwischen Toxin A und seinem Bindungsrest kann die sich ergebende, hoch konzentrierte Lösung, die Komplexe von Toxin A und dem Toxin A-Bindungsrest enthält, direkt auf eine Assayvorrichtung aufgetragen werden.
  • Ein molekularer Tag ist vorzugsweise an dem Toxin A-Bindungsrest durch kovalentes Binden angelagert. Zum Beispiel besteht ein Verfahren zum Erhalten eines einen molekularen Tags aufweisenden Toxin A-Bindungsrests darin, einen heterobifunktionellen Linker zum Verbinden des Toxin A-Bindungsrests mit dem molekularen Tag zu verwenden. Geeignete Linker sind dem Fachmann bekannt. Ein Beispiel für einen geeigneten Linker ist der heterobifunktionelle Linker SMCC (Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexan-1-arobxylat; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), der eine Verbindung zwischen einem Aminorest (zum Beispiel Lysin) und einem Thiol (wie beispielsweise der von Cystein gelieferte) bilden kann. Andere Vernetzungsmittel umfassen beispielsweise m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) (Liu u.a. (1979), Biochemistry 18:690; Green u.a. (1982), Cell, 28:477), Glutaraldehyd, ein Carbodiimidsuccinylanhydrid, N-Succinimidyl-3-[2-pyridyldithio)propionat und dergleichen.
  • Ein weiteres Verfahren, durch das ein Toxin A-Bindungsrest erhalten werden kann, der ein peptidmolekulares Tag aufweist, besteht darin, ein Fusions-Gen zu konstruieren, bei dem eine Nukleinsäure, die für die Bindungskomponente kodiert, wirksam mit einer Nukleinsäure verbunden ist, die für das molekulare Tag kodiert. Die das molekulare Tag kodierende Nukleinsäure wird vorzugsweise an einem Ort im Bindungskomponenten-Gen angeordnet, der nicht die Fähigkeit des erhaltenen Fusionsproteins stört, an das Toxin A von C. difficile zu binden. Wenn die Bindungskomponente ein Antikörper ist, kann die das molekulare Tag kodierende Nukleinsäure an oder nahe dem Bereich des Antikörper-Gens angeordnet werden, der entweder den Carboxylterminus der leichten Kette oder der schweren Kette oder von beiden kodiert. Verfahren zum Konstruieren und Exprimieren von Genen, die Fusionsproteine kodieren, sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für diese Verfahren und Anweisungen, die ausreichen, um dem Fachmann viele Klonierungsübungen zu geben, sind in Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook u.a. (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual (2. Ausgabe), Bd. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook u.a.); Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel u.a., Hrsg., Current Protocols, ein Joint Venture zwischen Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., (1994 Ergänzung) (Ausubel); Cashion u., US-Patent Nr. 5,017,478; und Carr, europäisches Patent Nr. 0,246,864 zu finden.
  • Ein Beispiel für ein geeignetes molekulares Tag/Einfangrest-Paar ist das FLAG System (Kodak). Das molekulare FLAG-Tag besteht aus einem FLAG Peptidmarker mit acht Aminosäuren, der mit dem Ziel-Bindungsrest verbunden ist. In geeigneter Weise wird ein Ziel-Bindungsrest mit einem molekularen FLAG-Tag durch Klonieren einer FLAG-Kodierungssequenz mit 24 Basenpaaren benachbart zu einer Nukleotidsequenz, die für den Ziel-Bindungsrest kodiert, und durch Exprimieren des Fusions-Gens in einen geeigneten Expressionsvektor synthetisiert. Der FLAG-Peptidmarker (1) umfasst auch eine Enterokinase-Erkennungsstelle, die den Carboxy-terminalen fünf Aminosäuren entspricht. Einfangreste, die zur Verwendung mit dem FLAG-Peptidmarker geeignet sind, umfassen Antikörper, die an das FLAGTM-Peptid binden. Zum Beispiel sind die Anti-FLAG M1, M2 und M5 monoklonalen Antikörper im Handel erhältlich. Alle acht Aminosäuren des FLAG-Peptidmarkers sind zum Binden von einigen anti-FLAG monoklonalen Antikörpern notwendig; andere Antikörper können weniger Aminosäuren erfordern.
  • Diese anti-FLAG monoklonalen Antikörper unterscheiden sich in ihrer Vorliebe für den Ort des FLAG-Markerpeptids bezüglich des Proteins, an das es fusioniert ist, und in ihrer Fähigkeit, an das FLAG-Markerpeptid in Gegenwart oder bei Fehlen von Calcium gebunden oder davon freigegeben zu werden. Der anti-FLAG M1 (IgG2b) monoklonale Antikörper bindet an das FLAG Epitop in Gegenwart von Calcium und benötigt eine freie Aminogruppe am N-terminalen Aspartat für die hohe Affinitätsbindung. Nur die ersten vier Aminosäuren der FLAG-Sequenz (N-AspTyrLysAsp-C) sind für die anti-FLAG M1 Antikörperbindung notwendig; das Vorhandensein von Glutamat an der fünften Position (AspTyrLysAspGlu) erhöht die Empfindlichkeit um das sechsfache (Knappik und Pluckthun (1994), Biotechniques, 17:754-761). Der anti-FLAG M1 monoklonale Antikörper ist daher als Einfangrest zum Binden von FLAG-Peptide nützlich, die am Aminoterminus des Ziel-Bindungsrests vorhanden sind. Ein Vorteil des anti-FLAG M1 monoklonalen Antikörpers als Einfangrest besteht darin, dass, da seine Bindung an ein FLAG-Epitop von Calcium abhängt, man den Einfangrest von dem Ziel-Bindungsrest unter extrem milden Bedingungen, wie beispielsweise durch Zugabe eines Chelierungsmittels, wie beispielsweise EDTA, [verwenden (Anmerk. d. Übers: Verb ergänzt)] kann. Alternativ kann die Dissoziation durch Wettbewerb mit dem FLAG-Peptid erreicht werden.
  • Der anti-FLAG M5 (IgG1) monoklonale Antikörper hat eine hohe relative Affinität gegenüber N-terminalen Met-FLAG Fusionsproteinen. N-terminale Met-FLAG Fusionsproteine werden durch Anordnen eines ATG-Translationsstartkodons direkt vor der FLAG-Kodierungsequenz erzeugt. Bei Transfektion in einen geeigneten Wirt wird das N-terminale Met-FLAG Fusionsprotein im Zytoplasma der Zelle exprimiert. Anders als der anti-FLAG M1 monoklonale Antikörper hängt die Bindung des anti-FLAG M5 Antikörpers an das FLAG-Markerpeptid nicht von Calcium ab. Wenn der Ziel-Bindungsrest ein Antikörper ist, der ein molekulares FLAG-Tag enthält, ist ein bevorzugter Einfangrest der monoklonale anti-FLAG M2 (IgG1) Antikörper, der auch im Handel erhältlich ist. Dieser monoklonale Antikörper bindet an das FLAG-Epitop ungeachtet seiner Position bezüglich des Rückstands des Ziel-Bindungsrests. Daher kann das molekulare FLAG-Tag in oder nahe am Carboxyterminus des zielbindenden Antikörpers angeordnet werden, wodurch eine Unterbrechung der Zielanalyt- Bindungsregion verhindert wird. Die Bindung des monoklonalen anti-FLAG M2 Antikörpers hängt nicht von Calcium ab, sondern es kann eine milde Elution von FLAG-Fusionsproteinen von anti-FLAG M2 Affinitätssäulen durch Wettbewerb mit dem FLAG-Peptid erreicht werden.
  • Ein weiteres Beispiel für ein geeignetes molekulares Tag ist eine Polyhistidinsequenz, die an Metallchelataffinitätsliganden binden kann. Im Allgemeinen sind mindestens zwei Histidinreste erforderlich, um die Bindung an den Ligand zu erhalten; die Verwendung von zusätzlichen benachbarten Histidinen erhöht die Bindungsaffinität. Typischerweise werden sechs benachbarte Histidine verwendet, obwohl auch mehr oder weniger als sechs verwendet werden können. Geeignete Metallchelataffinitätsliganden, die als Einfangrest für ein molekulares Polyhistidin-Tag dienen können, umfassen Nitriltriessigsäure (NTA) (Hochuli, E. (1990), „Purification of recombinant proteins with metal chelating absorbents" in Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Hrsg., Plenum Press, NY; im Handel erhältlich von Qiagen (Santa Clarita, CA)). Die Dissoziation von Polyhistidinsequenzen aus Metallchelataffinitätsliganden kann dadurch erreicht werden, dass die Lösung, die den mit Magnetkügelchen gebundenen Komplex enthält, auf einen leicht sauren pH-Wert, wie beispielsweise pH 4, gebracht wird. Auch kann die Bindung zwischen der Polyhistidinsequenz und dem Metallchelataffinitätsligand, der den Einfangrest umfasst, dissoziiert werden, indem zur Lösung ein Chelierungsmittel gegeben wird, das mit dem molekularen Tag um die Bindung an den Einfangrest konkurriert. Vorzugsweise hat das konkurrierende Chelierungsmittel eine höhere Affinität für den Einfangrest als das molekulare Tag, das mit dem Toxin A-Bindungsrest in Verbindung steht. Geeignete Chelierungsmittel umfassen Imidazol. Andere geeignete Metallchelataffinitätsliganden und entsprechende Verfahren zur Dissoziation sind dem Fachmann bekannt.
  • Die Decapeptidsequenz YPYDVPDYAS und der von Hybridom stammende Antikörper 7F11 sind ein weiteres molekulares Tag/Einfangrest-Paar. Die Decapeptidsequenz kann an den Toxin A-Bindungsrest zum Beispiel durch Anbringen eines Thiolesters an ein Peptidende und durch Anbringen des Peptids an den Toxin A-Bindungsrest mittels eines geeigneten heterobifunktionellen Linkers, wie beispielsweise SMCC, angelagert werden. Alternativ kann ein Fusions-Gen aufgebaut werden, bei dem die Leserahmen für die Decapeptidsequenz und den Toxin A-Bindungsrest wirksam verbunden sind. Der Antikörper 7F11, der ein von Hybridom stammender, monoklonaler Antikörper ist (hinterlegt nach dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852) am 5. Dezember 1997 mit der ATCC Hinterlegungsnummer HB-12443), bindet spezifisch an die Decapeptidsequenz und kann bei einem pH-Wert von 10,5 und mehr dissoziiert werden.
  • Um andere geeignete molekulares Tag/Einfangrest-Paare zu erhalten, für die eine Bindung unter milden Bedingungen reversibel ist, kann man nach Peptiden suchen, die ein bestimmtes molekulares Tag zum Beispiel durch Anreicherung der Displaybibliotheken, einschließlich Phagendisplaybibliotheken, bindet. Ein besonders nützliches Verfahren, bei dem solche, reversibel bindenden molekulares Tag/Einfangrest-Paare erhalten werden, ist in der allgemein übertragenen US-Patentanmeldung No. 08/832,985 (eingereicht am 4. April 1997) beschrieben. Dieses Verfahren umfasst die Anreicherung von herkömmlichen Displaybibliotheken für Elemente, die mehr als eine Kopie eines Displaypolypeptids vor dem Affinitätsscreening von solchen Bibliotheken mit einem interessanten Ziel, wie beispielsweise einem molekularen Tag, präsentiert. Die Erklärung für dieses Verfahren liegen, wie man glaubt, darin, dass die Affinitätsbindung von Bibliothekselementen an ein immobilisiertes Ziel hauptsächlich oder ausschließlich durch Bildung von mehrwertigen Bindungen zwischen mehreren Kopien von präsentierten Polypeptiden auf einem Bibliothekselement und immobilisierten Ziel auftritt. Demgemäß sind nur Bibliothekselemente, die mehrere Kopien eines Polypeptids präsentieren, in der Lage, an ein immobilisiertes, interessantes Ziel zu binden. Herkömmliche Bibliotheken haben typischerweise eine zahlenmäßige Polypeptidverteilung pro Element, bei der die meisten Elemente keine Kopien eines Polypeptids präsentieren, ein kleiner Anteil eine Kopie eines Polypeptids präsentiert, ein noch kleinerer Anteil zwei Kopien präsentiert und ein noch kleinerer Anteil drei oder mehr Kopien präsentiert. Die Verfahren, die in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung beschrieben sind, reichern den kleinen Anteil der herkömmlichen Displaybibliotheken an, die zwei oder mehr Kopien eines Polypeptids präsentieren.
  • Dieser seltene Anteil von herkömmlichen Bibliotheken ist in der Lage, spezifisch an ein immobilisiertes Ziel zu binden.
  • Die Anreicherung kann durch Einschließen eines Markers als Komponente des Fusionsproteins erzielt werden, von dem die Polypeptide präsentiert werden. Der Marker kann jedes Polypeptid mit einem bekannten Rezeptor sein, der eine hohe Bindungsspezifität für den Marker zeigt. Derselbe Marker ist in jedem Element der Bibliothek enthalten. Die Anreicherung wird durch Screenen der Bibliothek auf Affinitätsbindung an einen immobilisierten Rezeptor für den Marker bewirkt. Nur Bibliothekselemente mit zwei Markerkopien sind in der Lage, an den immobilisierten Rezeptor zu binden. Als logische Schlussfolgerung haben Bibliothekselemente mit zwei Markerkopien zwei der den Marker enthaltenden Fusionsproteinkopien und zwei Kopien eines zu screenenden Polypeptids. Die Bibliothekselemente, die an den Rezeptor binden, bilden daher die kleine Unterpopulation der Bibliothekselementen, die zwei oder mehr Polypeptide präsentieren. Die Bibliothekselemente, die nicht an den Rezeptor binden, bilden den Hauptteil der Bibliothekselemente, die weniger als zwei Kopien eines Polypeptids präsentieren (d.h. keine oder eine Kopie). Diese Bibliothekselemente, die in anschließenden Schritten ohne Dazutun irgendeines Elements, das zu einer spezifischen Bindung fähig ist, nicht spezifisch an das immobilisierte Ziel binden, können so im Wesentlichen ausgeschaltet werden.
  • Nach der Dissoziation der gebundenen Bibliothekselemente vom markerspezifischen Rezeptor können diese angereicherten Bibliothekselemente, die mehrere Polypeptidkopien präsentieren, dann einer oder mehr Affinitätsscreeningsrunden für jedes immobilisierte interessante Ziel unterworfen werden. Weil die meisten Bibliothekselemente, die sonst zu der nicht spezifischen Bindung beitragen, vor dem Affinitätsscreening nach dem Ziel ausgeschaltet würden, führt jede Affinitätsscreeningrunde typischerweise zu einer größeren Anreicherung der Bibliothekselemente mit Affinität für das Ziel als bei den herkömmlichen Verfahren. Der größere Anreicherungsgrad pro Screeningrunde ermöglicht es, dass ein angemessenes Screening in weniger Runden durchgeführt wird und/oder ein größerer Anteil am Repertoire von spezifisch bindenden Bibliothekselementen identifiziert wird.
  • Diese Auswahlverfahren sind so effizient, dass sie zu verschiedenen Populationen führen, bei denen die große Mehrzahl von Elementen, die Kodierungssequenzen voller Länge behalten, Polypeptide mit einer spezifischen Affinität für das interessante Ziel kodieren, wie beispielsweise das molekulare Tag. Diese Polypeptide können hinsichtlich der feinen Bindungsspezifität innerhalb des Ziels und der Bindungsaffinität für das Ziel unterschiedlich sein. Daher kann man diese Verfahren dazu verwenden, Polypeptide zu identifizieren, die an das Ziel in einer Art und Weise binden, die unter milden Bedingungen reversibel ist. Dieses Verfahren umfasst die Verwendung des interessanten Ziels als Affinitätsreagens. Die Bindung wird ermöglicht, um zu einem Gleichgewicht zu kommen, und dann wird das Ziel durch Kontaktieren mit einer festen Phase in einem Verfahren, das als Schwenken („Panning") bekannt ist (Parmley & Smith, Gene 73, 305-318 (1988)), außer Lösung gebracht. Bibliothekselemente, die an die feste Phase gebunden bleiben, tun dies aufgrund von mehrwertigen Bindungen zwischen ihnen und Zielmolekülen. Ungebundene Bibliothekselemente werden aus der festen Phase herausgewaschen. Beide Elemente werden dann aus der festen Phase dissoziiert (z.B. durch Änderung der Ionenstärke oder des pH-Werts). Elemente, die unter relativ milden Bedingungen dissoziiert werden, wie beispielsweise eine Änderung der Ionenstärke oder des pH-Werts oder eine Zugabe einer Substanz, die mit dem Tag um die Bindung an den Rezeptor konkurriert, werden dann gesammelt und als Einfangreste verwendet. Zum Beispiel wird die Bindung von Metallchelatliganden, die auf Agarose immobilisiert sind und Ni2+ enthalten, an eine Hexahistidinsequenz leicht durch Zugabe von Imidazol zur Lösung umgekehrt, um um die Bindung des Metallchelatligands zu konkurrieren. Die Antikörper-Peptid-Bindung kann oft durch Anheben des pH-Werts auf 10,5 oder höher dissoziiert werden.
  • Die dissoziierten Bibliothekselemente sind nun hinsichtlich zweier Merkmale angereichert: mehrwertige Polypeptiddisplay und Display von Polypeptiden mit spezifischer Affinität für das interessante Ziel. Diese Bibliothekselemente können weiteren Runde(n) eines Affinitätsscreenings des Ziels ohne Amplifikation unterworfen werden. Alternativ können die Bibliothekselemente amplifiziert werden (z.B. durch Reinfektion von Bakterien und Ernten der Nachkommen für eine Phagendisplaybibliothek), um eine sekundäre Bibliothek zu erstellen. Die sekundäre Bibliothek bleibt für das Präsentieren von Polypeptiden mit spezifischer Affinität für das Ziel angereichert, ist aber als Ergebnis der Amplifikation nicht länger für mehrwertigen Polypeptiddisplay angereichert. Daher kann dann ein zweiter Zyklus der mehrwertigen Anreicherung durchgeführt werden, der von einem zweiten Zyklus der Affinitätsanreicherung an das Screeningziel gefolgt wird. Weitere Affinitätsanreicherungszyklen für das Screeningziel, die sich wahlweise mit der Amplifikation und Anreicherung für den mehrwertigen Display abwechseln, können dann durchgeführt werden, bis ein gewünschter Grad an Anreicherung erreicht wurde.
  • Die Bibliothekselemente können auch verwendet werden, um polyklonale Einfangreste zu erhalten. Die Verwendung der Polyklonalen hat eine Anzahl von Vorteilen im Hinblick auf Monoklonale. Durch Bindung an mehrere Stellen auf einem Ziel können polyklonale Antikörper oder andere Polypeptide ein stärkeres Signal (für diagnostische Zwecke) oder eine größere Blockier/Hemm/Zytotoxizität (für therapeutische Zwecke) als ein monoklonaler, der an eine einzelne Stelle bindet, erzeugen. Weiter kann ein polyklonales Präparat an zahlreiche Varianten einer prototypischen Zielsequenz binden (z.B. allele Varianten, Artvarianten, Stammvarianten, mittels Medikamenten induzierte Fluchtvarianten), während ein monoklonaler Antikörper nur an die prototypische Sequenz oder einen engeren Bereich von Varianten dazu binden kann. Verfahren zum Erhalten von Polyklonalen sind in der allgemein übertragenen US-Patentanmeldung Nr. 08/832,985 beschrieben (eingereicht am 4. April 1997). Bei diesen Verfahren können die Nukleinsäuresequenzen, die präsentierte Polypeptide, wie sie beispielsweise mit den obigen Verfahren erzeugt werden, kodieren, ohne klonales Isolieren und Testen von einzelnen Elementen direkt in einen Expressionsvektor subkloniert werden. Im Allgemeinen wird die Sequenz, die das äußere Oberflächenprotein des Displayvektors kodiert, der an präsentierte Polypeptide fusioniert ist, in diesem Verfahren nicht herausgeschnitten oder amplifiziert. Nach dem Exprimieren in einer geeigneten Wirtszelle werden Sammlungen von Antikörpern oder anderen Polypeptiden aus den Kulturmedien und Wirtszellen gereinigt. Gewöhnlich werden Polypeptide mit Signalsequenzen exprimiert und so an die Kulturmedien freigesetzt. Allerdings können, wenn Polypeptide nicht natürlich durch die Wirtszellen sekretiert werden, die Polypeptide durch Behandlung mit milden Detergens freigesetzt werden. Polypeptide können dann mit herkömmlichen Verfahren, einschließlich Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätschromatographie für das immobilisierte Ziel, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen, gereinigt werden (siehe generell Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). Diese Polypeptide können dann an Magnetkügelchen gebunden werden, wie oben beschrieben.
  • Andere Reste sind bekannt, die reversibel und spezifisch an ein Agens binden, das als Einfangrest nützlich ist. Zum Beispiel stehen einige Derivate von Biotin, wie beispielsweise 2-Iminobiotin, zur Verfügung, das pH-empfindlich an Avidin bindet. Orr, G. (1981), J. Biol. Chem. 256:761-766; im Handel erhältlich von Pierce Chemical Co., Rockford IL. Dieses Biotinderivat kann an den Toxin A-Bindungsrest als molekulares Tag angebracht werden, während Avidin an das Magnetkügelchen angelagert wird und als Einfangrest dient. Um den Toxin A-Bindungsrest an den Einfangrest zu binden, werden die Probe und Komponenten bei einem pH von mindestens etwa 9, typischerweise zwischen pH 9-11, inkubiert, bei dem Avidin stark mit 2-Iminobiotin in Wechselwirkung tritt. Nach der Konzentration mit einem Magnetfeld werden der Toxin A-Bindungsrest und gebundenes Toxin A von dem Magnetkügelchen durch Anpassen des pH-Werts auf etwa 6 oder weniger und/oder durch Zugabe von Biotin zur Probe dissoziiert. Andere Beispiele für geeignete molekulare Tags sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Um das Feststellen von Toxin A nach dem Konzentrieren mittels des beschriebenen Verfahrens zu erleichtern, wird der Toxin A-Bindungsrest auch allgemein ein Hapten oder eine andere Gruppe umfassen, an die ein Nachweisrest binden kann. Das molekulare Tag kann für diesen Zweck dienen oder der Toxin A-Bindungsrest kann mit einer separaten Gruppe verbunden sein, vorzugsweise mit einer kovalenten Bindung. Geeignete Haptene sind dem Fachmann bekannt und werden zum Beispiel im Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6. Ausgabe, Molecular Probes, Inc., Eugene OR) beschrieben. Zum Beispiel sind Dinitrophenol (DNP), Digoxigenin, Barbiturate (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,414,085) und mehrere Arten von Fluorophoren wie auch die Derivate von diesen Verbindungen als Haptene nützlich.
  • Haptene werden in Verbindung mit einem Nachweisrest verwendet, der einen Antikörper oder einen anderen Rest aufweist, der spezifisch an das bestimmte Hapten bindet. Andere Gruppen, die zum Binden des Nachweisrests nützlich sind, umfassen Biotin, das durch einen Avidin umfassenden Nachweisrest gebunden ist. Kits zum Binden von Haptenen und anderen Resten an Proteine und andere Moleküle sind im Handel erhältlich. Das molekulare Tag und das Hapten können gleichzeitig an den Toxin A-Bindungsrest in demselben Reaktionsgemisch angelagert sein. Zum Beispiel kann, wenn sowohl das molekulare Tag als auch das Hapten ein Thiol aufweisen, ein heterobifunktioneller Linker, wie beispielsweise SMCC, verwendet werden, um das molekulare Tag und das Hapten an Lysinreste anzulagern, die am Toxin A-Bindungsrest vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst der Toxin A-Bindungsrest mehrere molekulare Tags und Haptene. Durch Auswahl des Verhältnisses von Hapten zu molekularem Tag, das in einer Anlagerungsreaktion vorhanden ist, kann man das Verhältnis von Hapten zu molekularem Tag, das an dem Toxin A-Bindungsrest vorhanden ist, kontrollieren. Typischerweise ist die Anzahl der an einen Toxin A-Bindungsrest angelagerten Haptene größer als die Zahl der molekularen Tags; zum Beispiel umfassen geeignete Verhältnisse von Hapten molekularem Tag 2:1, 5:3 und dergleichen.
  • Das Magnetkügelchen und der damit verbundene Einfangrest können der Probe vor, nach oder gleichzeitig mit dem Toxin A-Bindungsrest zugegeben werden. Vorzugsweise werden die Magnetkügelchen der Probe in einer Menge und für eine Zeitdauer zugegeben, die ausreicht, damit im Wesentlichen der ganze Toxin A-Bindungsrest und damit verbundenes Toxin A von C. difficile an den Einfangrest gebunden wird. Zum Beispiel könnte man zu einer 40 ml Probe, die entweder unverdünnt oder 1-50-fach oder mehr verdünnt wurde, zwischen 1 mg und 20 mg Magnetkügelchen zusetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ungefähr 400 μl BioMag (1 % Feststoffe) verwendet. Die Menge an zugesetzten Kügelchen ist umgekehrt proportional zu der Zeit, die erforderlich ist, um eine im Wesentlichen vollständige Verbindung des Toxin A-Bindungsrests mit dem Einfangrest zu erhalten.
  • Nach der Verbindung des Toxin A-Bindungsrests, des Toxins A und des Einfangrests zu einem mit Magnetkügelchen gebundenen Komplex wird ein Magnetfeld an die Probe angelegt, um den mit Magnetkügelchen gebundenen Komplex zu sammeln. Zum Beispiel kann der die Probe enthaltende Behälter in Gegenwart einer Polfläche eines Permanentmagneten angeordnet werden, wodurch die mit Magnetkügelchen gebundenen Komplexe an die Innenfläche des Behälters gezogen werden. Der nicht gebundene Anteil der Probe kann dann zum Beispiel durch Ansaugen oder durch Ausgießen aus dem Behälter entfernt werden, während der Behälter im Magnetfeld bleibt. Wahlweise kann der mit Magnetkügelchen gebundene Toxin A-Komplex dann gewaschen werden, wonach der Behälter wieder ins Magnetfeld zum erneuten Sammeln des mit Magnetkügelchen gebundenen Komplexes zurückgeführt wird.
  • Die Verwendung der Einfangreste und der Toxin A-Reste, die reversibel binden können, bietet einen signifikanten Vorteil gegenüber den bisher bekannten Assays. Bei den bisherigen Assays wurde ein Zielanalyt, das durch Verwendung von Magnetkügelchen konzentriert worden war, generell nachgewiesen, während es noch mit den Kügelchen verbunden war. Die Empfindlichkeit von solchen Verfahren war durch die nicht spezifische Bindung begrenzt. Wenn eine ausreichende Zahl von Kügelchen zu einer Probe zum Binden von dem ganzen oder dem meisten Analyt in der Probe zugegeben wurde, wurde die nicht spezifische Bindung an die Kügelchen erhöht, wodurch sich die Empfindlichkeit verringerte. Wenn weniger Kügelchen zum Reduzieren der nicht spezifischen Bindung verwendet wurden, verringerte sich auch die Empfindlichkeit, weil weniger als im Wesentlichen das ganze Zielanalyt eingefangen wurde. Daher war das Signal-Geräusch-Verhältnis dieser Assays relativ konstant, was eine Beschränkung der Empfindlichkeit bedeutete. Für die klinische Diagnose einer Infektion mit toxigenem C. difficile lieferten die bisherigen Verfahren keine ausreichende Empfindlichkeit, um sicherzustellen, dass keine Stämme von C. difficile fälschlicherweise als nicht toxigen diagnostiziert werden.
  • Dieses Empfindlichkeitsproblem wird durch die Dissoziation von Toxin A-Bindungskomplex und damit verbundenem Toxin A von dem Magnetkügelchen vor dem Nachweisschritt gelöst. Weil die Magnetkügelchen vor dem Nachweis entfernt werden, wird die nicht spezifische Bindung aufgrund der Kügelchen ausgeschaltet. Daher kann eine größere Menge an Kügelchen in dem Konzentrationsschritt verwendet werden, wodurch sichergestellt wird, das im Wesentlichen das ganze Toxin A, das in einem relativ großen Probenvolumen vorhanden ist, eingefangen wird. Zum Beispiel können mit der vorliegenden Erfindung 100-mal mehr Magnetkügelchen im Vergleich zu den bereits bekannten Mikrotiterassays verwendet werden. Der beanspruchte Assay für das Toxin A von C. difficile ist hoch empfindlich und in der Lage, Niveaus an Toxin A in einer so geringen Probe wie 1 ng/ml nachzuweisen. Vorzugsweise kann der Assay 0,1 ng/ml oder weniger Toxin A nachweisen, und ganz besonders bevorzugt liegt die Empfindlichkeit über etwa 0,01 ng/ml Toxin A.
  • Die Reduzierung einer nicht spezifischen Bindung, die durch Verwendung von reversibel verbindenden Einfangresten und Toxin A-Resten erreicht wird, ermöglicht die Verwendung von verschiedenen Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von Toxin A. Zum Beispiel wird in geeigneter Weise ein Immunoassayverfahren verwendet. Oft ist es wünschenswert, das Toxin A auf einem festen Träger als Teil des Nachweisschritts zu immobilisieren. Zum Beispiel kann nach dem Entfernen der Magnetkügelchen aus der Lösung, die das konzentrierte Toxin A enthält, die Lösung auf einen festen Träger aufgetragen werden, auf dem ein Ankerrest immobilisiert ist, der spezifisch an ein Epitop des Toxins A von C. difficile bindet (siehe 2). Das Epitop, an das der Ankerrest bindet, kann dasselbe wie das Epitop von Toxin A oder unterschiedlich dazu sein, an das der Toxin A-Bindungsrest bindet. Geeignete Ankerreste umfassen diejenigen, die oben zur Verwendung in dem kombinierten Assay mit Toxin A und Glutamatdehydrogenase von C. difficile beschrieben sind. Ein Nachweisrest, der für den Toxin A-Bindungsrest oder für ein Hapten spezifisch ist, das an den Toxin A-Bindungsrest angelagert ist, wird auch auf den festen Träger aufgetragen, wonach ungebundene Reagenzien durch Waschen entfernt werden und das Vorhandensein oder Fehlen der nachweisbaren Markierung mittels Verfahren bestimmt wird, die für die jeweilige verwendete Markierung geeignet sind.
  • Kits zum Nachweisen des Vorhandenseins von toxigenen Stämmen des Toxins A von C. difficile mittels Magnetkügelchen werden nun beschrieben. Die Kits können einen Behälter umfassen, der einen Toxin A-Bindungsrest enthält, der spezifisch an das Toxin A von C. difficile bindet, ein Magnetkügelchen, an das ein Einfangbindungsrest angelagert ist, der spezifisch und reversibel an den Toxin A-Bindungsrest bindet, einen festen Träger, auf dem ein Ankerrest immobilisiert ist, der spezifisch an mindestens ein Epitop des Toxins A von C. difficile bindet, und einen Nachweisrest, der an eine nachweisbare Markierung konjugiert ist und spezifisch an den Toxin A-Bindungsrest oder an ein Hapten, das auf dem Toxin A-Bindungsrest vorhanden ist, bindet. Der Ankerrest kann derselbe wie das Epitop von Toxin A oder dazu unterschiedlich sein, an das der Toxin A-Bindungsrest bindet. In geeigneter Weise kann der feste Träger in einer wie oben beschriebenen Assayvorrichtung angebracht sein. Vorzugsweise umfassen die Kits auch Reagenzien, die in den beschriebenen Assays verwendet werden, einschließlich Reagenzien, die zum Nachweisen des Vorhandenseins der nachweisbaren Markierung nützlich sind. Andere Materialien, die bei der Durchführung der Assays von Nutzen sind, können auch in den Kits enthalten sein, einschließlich Reagenzgläser, Magnete, Transferpipetten und dergleichen. Kits können Materialien enthalten, die für einen Assay ausreichen oder können ausreichend Material für mehrere Assays enthalten. Die Kits können auch Anweisungen für die Verwendung von einem oder mehr dieser Reagenzien in jedem der hier beschriebenen Assays umfassen.
  • Die Kits können auch eine interne und/oder eine externe Kontrolle enthalten. Eine interne Kontrolle kann aus Toxin A von C. difficile bestehen. Das Kontrollantigen kann in geeigneter Weise vorher an dem Ankerrest in einem Bereich benachbart zum Bereich angelagert sein, auf den die Probe aufgetragen wird. Die externe Kontrolle kann auch aus dem Toxin A von C. difficile bestehen. Typischerweise liegt das in der externen Kontrolle vorliegende Antigen in einer Konzentration bei oder über der Empfindlichkeitsgrenze des Assaymittels vor. Das externe Kontrollantigen kann in der Probenverdünnung verdünnt und auf dieselbe Weise wie eine biologische Probe untersucht werden. Alternativ kann das Antigen oder die Antigene von C. difficile einem Aliquot einer wirklichen biologischen Probe zugesetzt werden, um die Empfindlichkeit des Assays zu bestimmen.
  • Hoch konzentrierte Präparate, die das Toxin A von C. difficile und einen Toxin A-Bindungsrest enthalten, werden mit den oben beschriebenen Verfahren hergestellt, die die reversible Bindung des Toxin A-Bindungsrests an einen Einfangrest umfassen, der mit einem Magnetkügelchen verbunden ist. Die Konzentration von Toxin A in den beanspruchten konzentrierten Präparaten ist typischerweise mindestens etwa 2-mal höher als die Toxin A-Konzentration in der Testprobe, aus der das konzentrierte Präparat hergestellt wurde. Besonders bevorzugt ist das konzentrierte Präparat mindestens etwa 10-mal konzentrierter und ganz besonders bevorzugt mindestens etwa 100-mal konzentrierter als die Testprobe.
  • III. Glutamatdehydrogenase-Assay für Stämme von toxigenem C. difficile
  • Es werden Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zum Nachweisen des Vorhandenseins von Stämmen von toxigenem C. difficile in einer Testprobe durch Ausführen eines Assays für die Glutamatdehydrogenase von C. difficile beschrieben. Dieser Aspekt beruht auf der Entdeckung, dass ein hoher prozentualer Anteil der Proben, die auf die Glutamatdehydrogenase von C. difficile positiv aber auf das Toxin A und/oder Toxin B negativ testen, trotzdem toxigen sind. In den im Beispiel III beschriebenen Versuchen wurde festgestellt, dass vierzehn von siebzehn willkürlich ausgewählten Proben, die mittels Immunoassay auf Glutamatdehydrogenase positiv und auf Toxin A negativ testeten, tatsächlich toxigen waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Fehlschlagen, in diesen Proben Toxin A und/oder Toxin B festzustellen, von einer unzureichenden Assayempfindlichkeit und nicht von einem Fehlen von toxigenem C. difficile in der Probe herrührt.
  • Diese Ergebnisse zeigen auch, dass ein sehr hoher prozentualer Anteil von C. difficile, der in biologischen Proben gefunden wird, toxigen ist. Daher reicht für klinische Zwecke ein positives Ergebnis in einem Glutamatdehydrogenase-Assay aus, um zu folgern, dass die Probe toxigenes C. difficile enthält. Toxin A und/oder Toxin B müssen nicht direkt untersucht werden, um zu diesem Schluss zu gelangen. Allerdings fehlt den bisher verfügbaren Assays für die Glutamatdehydrogenase von C. difficile eine ausreichende Empfindlichkeit, um eine Infektion mit C. difficile präzise zu diagnostizieren. Der vorliegende Assay für die Glutamatdehydrogenase von C. difficile erhöht die Genauigkeit, mit der eine Infektion mit C. difficile bestimmt werden kann. Während etwa 90 % der Tests für C. difficile mittels der bisher verfügbaren Assays zu einem negativen Ergebnis führen, sind die empfindlicheren Assays in der Lage, eine beträchtliche Anzahl von zusätzlich positiven Proben zu erfassen. Diese zusätzlichen Fälle einer Infektion mit toxigenem C. difficile wären nicht festgestellt worden, oft mit sehr unerwünschten Konsequenzen.
  • In einer Ausführungsform sind die hoch empfindlichen Assaymittel zum Feststellen der Glutamatdehydrogenase von C. difficile Bindungsassays. In diesen Assays, die Immunoassays umfassen, wird Glutamatdehydrogenase mit einem Nachweisrest festgestellt, der in der Lage ist, spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von C. difficile zu binden. Das Nachweisrest umfasst mindestens eine Bindungskomponente und eine nachweisbare Markierung auf. Geeignete Bindungskomponenten, die jeden Rest umfassen, der in der Lage ist, spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von C. difficile zu binden, können die oben für die kombinierten Glutamatdehydrogenase/Toxin A-Assays sein.
  • Für die klinische Diagnose einer Infektion mit C. difficile umfasst ein bevorzugtes Format zur Verwendung der beanspruchten Verfahren das Nachweisen der Glutamatdehydrogenase von C. difficile nach der Immobilisierung auf einem festen Träger. Solche Assays werden oben für die kombinierten Glutamatdehydrogenase/Toxin A-Assays beschrieben. Ein bevorzugter Ankerrest, der spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von C. difficile bindet, ist der rekombinante polyklonale Antikörper CD.43.5.PC.
  • Die Glutamatdehydrogenase-Assays sind empfindlicher als die bisher in der Klinik verwendeten. Bisher erhältliche Assays umfassen einen Latexagglutinationsassay, der eine Empfindlichkeit von etwa 400 ng/ml aufweist, und einen weiteren schnelleren Test (ImmunoCardTM Test für C. difficile, Meridian Diagnostics, Inc., Cincinnati, OH), der eine Empfindlichkeit von etwa 125 ng/ml hat. Im Gegensatz dazu können die Assays die Glutamatdehydrogenase von C. difficile bei Niveaus von 100 ng/ml oder weniger feststellen, besonders bevorzugt ist die Empfindlichkeit etwa 10 ng/ml oder weniger, noch weiter bevorzugt etwa 2 ng/ml oder weniger and ganz besonders bevorzugt können die Assays die Glutamatdehydrogenase von C. difficile in einer Konzentration von etwa 1 gn/ml oder weniger nachweisen. Da C. difficile typischerweise Glutamatdehydrogenase in Mengen erzeugt, die etwa 100-mal höher als die Menge an erzeugtem Toxin A ist, sind die hoch empfindlichen Assays für die Glutamatdehydrogenase von C. difficile äquivalent bezüglich ihrer Empfindlichkeit mit Assays für Toxin A, die eine Empfindlichkeit von etwa 0,01 ng/ml oder weniger haben.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen, nicht aber einzuschränken.
  • I. Simultan-Assay für das Toxin A und die Glutamatdehydrogenase von C. difficile
  • A. Herstellung von Antikörper-alkalische Phosphatase-Konjugaten zur Verwendung als Nachweisreste.
  • Nachweisreste zur Verwendung im Assay wurden durch Konjugation von alkalischer Phosphatase mit Antikörpern für die jeweiligen Antigene von C. difficile hergestellt. Der rekombinante polyklonale Antikörper CD.TXA.1.PC wurde zum Nachweis von Toxin A verwendet, während CD.43.9 zum Nachweisen von Glutamatdehydrogenase diente. Beide Antikörper wurden wie in dem gemeinsamen US-Patent 6,057,098 beschrieben hergestellt. Alkalische Phosphatase (AP, Calzyme Laboratories, San Luis Obispo, CA) wurde gegen ein Minimum von 100 Volumen Säulenpuffer (50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Borat, 150 mM NaCl, 1 mM MgSO4, pH 7,0) bei 2-8°C für mindestens vier Stunden dialysiert, und der Puffer wurde mindestens zweimal vor der Verwendung von AP gewechselt. Nachdem AP aus der Dialyse entfernt und auf Raumtemperatur gebracht wurde, wurde die Konzentration durch Feststellen von A280 bestimmt, wobei eine Absorptionsfähigkeit von 0,77 eine 1 mg/ml Lösung anzeigt. Das AP wurde auf 5 mg/ml mit Säulenpuffer verdünnt.
  • Zum Vernetzen von AP mit dem Antikörper wurde AP zuerst mit Succinimidyl-4-(N-maleimidomethylcyclohexan-1-carboxylat (SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.) in einem SMCC:AP Verhältnis von 20:1 verbunden. SMCC wurde in Acetonitril bei 20 mg/ml gelöst und mit einem Faktor von 84 durch Zugabe zu AP unter Verwirbelung oder schnellem Rühren verdünnt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 90 Minuten stehen gelassen, bevor nicht reagiertes SMCC und Reaktionsprodukte mit niedrigem Molekulargewicht aus dem AP mittels Gelfiltrationschromatographie (G-50 Fine, Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) in einer mit Säulenpuffer äquilibrierten Säule getrennt wurden.
  • Rekombinante Antikörper wurden mit 1 mM Dithiothreitol (DTT, Calbiochem, San Diego, CA) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reagiert, um einen in der Nähe des Carboxyterminus der konstanten Region der schweren Kette vorhandenen Cysteinrest zu reduzieren. Das DTT wurde aus dem Antikörper durch Gelfiltrationschromatographie mittels G50 Fine in Säulenpuffer ohne MgSO4 aber mit 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) abgetrennt. Das AP und der Antikörper wurden in einem molaren Verhältnis von 6 Antikörpern zu 1 alkalischen Phosphatase zusammen gemischt, und die Konjugationsreaktion wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur weitergeführt. Um die Konjugation anzuhalten, wurde 2-Mercaptoethanol zu 1 mM Endkonzentration zur Konjugatlösung zugesetzt und 5 Minuten lang reagiert, und anschließend wurde N-Ethylmaleinimid zu 2 mM Endkonzentration zugegeben. Das Konjugat wurde mit Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von SEPHACRYLTM S-200 HR (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) gereinigt. Der freie Antikörper wurde aus dem Konjugatpool ausgeschlossen, der zur Verwendung in Immunoassays in einer Konjugatverdünnung verdünnt war, die 1 % Rinderserumalbumin (von 30 % BSA, Bayer, Kankakee, IL), 2 % Casein (Hammersten Qualität, Research Organics, Cleveland, OH), 100 mM Trehalose (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), 50 mM Kaliumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM MgSO4, 0,1 mM ZnCl2, 0,1 % Polyvinylalkohol (80 % hydrolysiert, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), pH 7,0, enthielt.
  • B. Herstellung von Antikörper-Casein-Konjugaten zur Verwendung als Ankerreste
  • Ankerreste für die Glutamatdehydrogenase von C. difficile wurden wie folgt hergestellt. Wenn rekombinante Antikörper als Ankerreste verwendet wurden, wurden die Antikörper zuerst mit Casein konjugiert. Casein wurde in deionisiertem Wasser bei 2,5 % Feststoffen unter Rühren bei 37-45°C gelöst, während konzentriertes Kaliumhydroxid zugesetzt wurde, um den pH-Wert der Lösung zwischen 7 und 8 zu halten. Nachdem sich der pH-Wert bei 7,0 stabilisiert hatte, wurde das Casein mit Säulenpuffer, der 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH 7,0, enthielt, auf ein endgültiges A280 von 10 verdünnt. Eine SMCC Lösung wurde bei 20 mg/ml (60 mM) in Acetonitril hergestellt; diese wurde in der Caseinlösung auf eine Endkonzentration von 2 mM SMCC verdünnt. Die Lösung wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann einer Gelfiltrationschromatographie in einer Säule unterworfen, die G50 Fine enthielt, das in Säulenpuffer äquilibriert war, um das Protein von den Reaktanten abzutrennen. Das Casein wurde mit rekombinantem Antikörper gemischt, der mit 1 mM DTT reagiert worden war, und einer Gelfiltrationschromatographie unterworfen, um das DTT wie im Beispiel I-A oben beschrieben zu entfernen. Der Antikörper wurde mit dem Casein in einem molaren Verhältnis von 4:1 gemischt, und die Reaktion wurde eine Stunde bei Raumtemperatur weitergeführt, bevor die Konjugation wie oben beschrieben angehalten wurde. Die Konjugatlösung wurde einer Gelfiltrationschromatographie in einer Säule unterworfen, die SEPHACRYLTM S-200 HR enthielt, um den konjugierten Antikörper von dem nicht konjugierten Antikörper zu trennen. Der konjugierte Antikörper wurde mit einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und einer Dialyse gegen boratgepufferte Kochsalzlösung (BBS, 20 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, 0,02 % Natriumazid, pH 8,2) unterworfen und bis zur Immobilisierung auf Nylonmembranen in BBS gelagert.
  • C. Herstellung von Assayvorrichtungen
  • Die Assays wurden mit Ankerresten durchgeführt, die auf Nylonmembranen immobilisiert wurden. Intakte IgG-Antikörper wurden direkt immobilisiert, während rekombinante Fab-Antikörper wie oben beschrieben vor der Immobilisierung mit Casein konjugiert wurden. Die Antikörper wurden auf den Nylonmembranen (5 μm Porengröße; IMMUNODYNETM, Pall Corporation, Glen Cove, NY) in einem kontinuierlichen Verfahren durch Pumpen einer Antikörperlösung direkt auf die Membran immobilisiert, während die Membran über eine feststehende Düse geführt wurde, die die Antikörperlösung mit einer von der Pumpe kontrollierten Strömungsgeschwindigkeit abgab. Die Antikörperlösung enthielt typischerweise Antiköper in einer Konzentration zwischen 1 und 20 mg/ml in einem Puffer, der 20 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, 0,02 % Natriumazid und 10 % Trehalose, pH 8,2 umfasste.
  • Jeder Antikörper wurde auf einer Linie von ungefähr 0,1 cm (0,040 Zoll) Breite immobilisiert, so dass ungefähr 36 μl Antikörperlösung pro 30,48 cm (1 Fuß) Membran erforderlich war. Die Antikörperlösung, die auf die Membran aufgebracht war, wurde vor dem Blockieren der gesamten Membran durch ihre Sättigung mit einer Lösung, die 2 % Casein, 40 % STABILICOATTM (Bio-metric Systems, Eden Prairie, Minn.), 0,25 % TRITON X-100TM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt, und Trocknen der Membran in einem Trocknungstunnel oder in einem Trockenraum getrocknet. Der Antikörper kann auch punktförmig aufgetragen werden, indem ein Volumen von ungefähr 1 μl Antikörperlösung an der gewünschten Stelle vor dem Blockieren und Trocknen der Membran auf die Membran aufgebracht wurde. Im Allgemeinen wurden mehrere Linien immobilisierter Antikörper auf diese Weise auf einer Membran angeordnet und die Membran wurde zum Anordnen in den Assayvorrichtungen senkrecht zur Richtung der Antikörperlinien geschnitten.
  • Die geschnittenen Membranstücke wurden mittels Ultraschallschweißen mit einer Öffnung in einem Oberteil einer Kunststoffvorrichtung verbunden (siehe 3A – Draufsicht, 3B – seitliche Schnittansicht und 3C – Stirnansicht), der dann mittels Ultraschallschweißen mit einem Bodenstück aus Kunststoff verbunden wurde (siehe 4A – Draufsicht, 4B – seitliche Schnittansicht und 4C – Stirnansicht), wobei Nuten in dessen obere Oberfläche eingeschnitten wurden. Der Kontakt zwischen der Membran und den beiden Kunststoffstücken führt zu einem Netzwerk von Kapillarkanälen, die bewirkten, dass der Membran zugesetzte Fluide durch die Membran und in das Kapillarnetzwerk zwischen den beiden Kunststoffstücken strömte. Solche Vorrichtungen sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 447 154 beschrieben.
  • Für den Immunoassay von Toxin A und Glutamatdehydrogenase in derselben Vorrichtung wurden insgesamt fünf Antikörperlinien auf der Membran immobilisiert. Die beiden oberen Linien in der Vorrichtung waren positive Kontrollen für den Immunoassay von Toxin A bzw. Glutamatdehydrogenase. Die in dem Immobilisierungsschritt verwendete Antikörperlösung für die positive Toxin A Kontrolle enthielt 1 μg/ml Toxin A, gemischt mit dem PCG-4 Antikörper für 1 μg/ml Toxin A zusammen mit zusätzlich 10 mg/ml Rinder-IgG. Für die positive Glutamatdehydrogenasekontrolle enthielt die für die Immobilisierung verwendete Antikörperlösung 1 μg/ml Glutamatdehydrogenase gemischt mit etwa 10 μg/ml mit Casein konjugierten CD.43.5.PC-Antikörper zusammen mit zusätzlich 10 mg/ml Rinder-IgG. Die nächsten beiden Linien auf der Membran waren für das Einfangen und Nachweisen von Toxin A bzw. Glutamatdehydrogenase zuständig. Die zur Immobilisierung des Antikörpers für Toxin A verwendete Antikörperlösung enthielt den PCG-4-Antikörper von 20 mg/ml. Die zur Immobilisierung des Antikörpers für Glutamatdehydrogenase verwendete Antikörperlösung enthielt ungefähr 2 mg/ml des mit Casein konjugierten CD.43.5.PC-Antikörpers. Die letzte Linie des immobilisierten Antikörpers auf der Vorrichtung war eine negative Kontrolllinie; die Antikörperlösung, die zum Auftragen dieser Linie auf die Membran verwendet wurde, enthielt einen monoklonalen Antikörper (20 mg/ml), der für ein Antigen spezifisch war, das nicht in C. difficile gefunden wurde.
  • Zum Filtern der Proben vor dem Durchführen der Assays wurden wegwerfbare Filtervorrichtungen unter Verwendung von standardmäßigen 10 cm3 Kunststoffspritzen konstruiert. Filtermaterialscheiben wurden zu einem Durchmesser geschnitten, der es ermöglichte, dass die Scheibe in den Zylinder der Spritze gelegt werden konnte, so dass ausreichend Kontakt zwischen dem Spritzenzylinder und dem Rand der Filterscheibe erzeugt wurde. Dadurch wurde verhindert, dass Fluide das Filtermaterial umgingen, wenn die Flüssigkeitsproben mittels des Kolbens durch das Filter gedrückt wurden. Am Boden der Spritze dem Auslass am nächsten befand sich eine Schiebe aus porösem Kunststoff (Porex Technologies, Fairburn, GA). Die nächsten beiden Scheiben aus Filtermaterial wurden beide aus CELLUPORETM Filtermaterial der Qualität 850 geschnitten (Cellulo Co., Fresno, CA). Die nächste Filtermaterialscheibe wurde aus CELLUPORETM Filtermaterial der Qualität 315 (Cellulo Co., Fresno, CA) ausgeschnitten. Das endgültige Filterelement in dem Spritzenzylinder war ein Bausch aus Glaswolle, der als Vorfilter für die zuvor beschriebenen Filterelemente diente. Ein zusätzlich verwendetes Filterelement war ein 13 mm Spritzenfilter mit einem Glasmikrofaser(GMF)-Filter mit einer Auslegung von 0,45 (Whatman, Clifton, NJ). Das Spritzenfilter wurde auf den Auslass der Spritze gelegt, so dass Proben, die die Filterelemente im Spritzenzylinder passierten, durch das Spritzenfilter gedrückt wurden, bevor sie in einer Röhre gesammelt wurden. Eine alternative Filtervorrichtung, die im Wesentlichen dieselben Elemente enthält, ist AUTOVIALTM (Whatman, Clifton, NJ), wobei es sich um eine wegwerfbare Spritze handelt, die ein GMF-Glassfaserfilter mit einer Auslegung von 0,45 μm hat, welches bereits mit dem Spritzenende verbunden ist. Die anderen, oben beschriebenen Filterelemente sind auch im Zylinder des Autovial in derselben Reihenfolge vorhanden.
  • D. Simultan-Immunoassay für Glutamatdehydrogenase und Toxin A
  • Stuhlproben (ungefähr 0,5 g oder 0,5 ml) wurden zehnfach mit einer Probenverdünnung verdünnt, die 1 % Casein, 100 mM Kaliumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 % Dow 193 Tensid (Dow Corning, Midland, MI), 0,1 % Rinder-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,1 % Natriumazid, pH 7,0, enthielt, und dann in den Zylinder einer Filtervorrichtung gegossen. Der Spritzenkolben wurde in die Filtervorrichtung eingeführt und nach unten gedrückt, um die filtrierte Probe durch das Spritzenende in eine Röhre zu drücken. Mit einer wegwerfbaren Transferpipette wurde 0,6 ml Probe aus der Röhre entnommen und in der oben beschriebenen Immunoassay-Vorrichtung auf die ungeschützte Membran übertragen.
  • Nachdem die Probe durch die Membran in der Vorrichtung abgelaufen war, wurde ein Gemisch aus mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörpern in einem Volumen von 140 μl aufgetragen und 3 Minuten lang inkubiert. Das Konjugatgemisch enthielt einen Antikörper, der für Toxin A (CD.TXA.I.PC) spezifisch war, und einen Antikörper, der für Glutamatdehydrogenase (CD.43.9) spezifisch war; beide sind in dem gemeinsamen US-Patent Nr. 6,057,098 beschrieben. Beide Antikörper waren in dem Gemisch bei ungefähr 10 μg/ml in der oben beschriebenen Konjugatverdünnung vorhanden. Nach der Inkubation wurden ungefähr 100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), 150 mM Natriumchlorid, 0,5 Dow 193 Tensid, 0,1 % Natriumazid und 20 mg/l NBT aus einer Tropfflasche aufgetragen. Nachdem die Waschlösung in die Membran abgelaufen war, wurden weitere sechs Tropfen Waschlösung aufgetragen und ablaufen gelassen. Drei Tropfen Substratlösung, die 10 mM Indoxylphosphat (JBL Scientific, San Luis Obispo, CA), 200 mM 2-Amino-2-methyl-1-propanol (JBL Scientific, San Luis Obispo, CA), 500 mM TRIS, pH 10,2, enthielt, wurden aus einer Tropfflasche zugegeben und die Vorrichtung wurde fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Am Ende der Inkubationszeit wurde das Vorhandensein von allen optisch nachweisbaren lila bis schwarzen Linien notiert. Die oben beschriebenen, positiven Kontrollbereiche entwickelten deutlich sichtbare Linien, die aus der Bindung der Antikörper-alkalische Phosphatase-Konjugate entweder an die immobilisierten Komplexe von Toxin A und PCG-4 oder Glutamatdehydrogenase und CD.43.5.PC resultierte. Kontrollproben, die Toxin A oder Glutamatdehydrogenase enthielten, welche sich von gereinigten Präparaten dieser Proteine auf Konzentrationen von 2 ng/ml oder mehr erhöhte, zeigten sichtbare Linien in den jeweiligen Bereichen zum Nachweisen dieser Proteine. Glutamatdehydrogenase wurde mit einem Expressionsvektor hergestellt, der ein das Enzym kodierendes Gen enthielt; die vollständige Nukleotidsequenz ist in GenBank, Hinterlegungsnummer M65250 verfügbar. Toxin A wurde von TechLab, Blacksburg VA erhalten. Der negative Kontrollbereich zum Feststellen der nicht spezifischen Bindung der Reagenzien, die zur Farbentwicklung führt, entwickelte im Verlauf der beschriebenen Assays keine sichtbare Reaktion. Das Testen von klinischen Proben führte zu Ergebnissen, die entweder negativ (keine sichtbaren Linien an den Nachweisbereichen für Toxin A oder Glutamatdehydrogenase), positiv für Glutamatdehydrogenase allein (sichtbare Linie am Nachweisbereich für Glutamatdehydrogenase, keine sichtbare Linie am Nachweisbereich für Toxin A) oder positiv für Toxin A und Glutamatdehydrogenase (sichtbare Linien an beiden Nachweisbereichen) waren.
  • Die Leistungsfähigkeit des Simultan-Assays für Toxin A und Glutamatdehydrogenase wurde mit einem im Handel erhältlichen Mikrotiterplatten-Sandwich-Assay für Toxin A (Premier, Meridian Diagnostics, Cincinnati OH) verglichen. Insgesamt wurden 46 Proben entweder von einem Krankenhauslabor oder einem Referenzlabor erhalten und wurden mit beiden Verfahren getestet. Toxin A wurde in 6 von 46 Proben mit dem hier beschriebenen Verfahren festgestellt und Glutamatdehydrogenase wurde in 23 der 46 Proben nachgewiesen. Jede Probe, die für Toxin A positiv war, war auch für Glutamatdehydrogenase positiv. Mit dem Mikrotiterplattenassay für Toxin A wurden 7 positive Proben festgestellt, von denen 2 nicht mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung für Toxin A erfasst wurden, die aber nach dem Glutamatdehydrogenaseverfahren der vorliegenden Erfindung positiv waren. Sechzehn Proben waren nach dem Glutamatdehydrogenaseverfahren der vorliegenden Erfindung positiv aber nach dem Mikrotiterplattenassay für Toxin A negativ.
  • II. Assay mit hoher Empfindlichkeit für das Toxin A von C. difficile unter Verwendung von Magnetkügelchen
  • Bei diesem Assay wurden Magnetkügelchen zum Konzentrierten des Toxins A von C. difficile aus einer Probe vor dem Nachweis von Toxin A durch einen Sandwich-Assay verwendet. Eine schematische Darstellung der Assay-Strategie ist in der 2 gezeigt.
  • A. Herstellung der monoklonalen Antikörper 7F11 und 3E12
  • I. Synthese von Acetylthiopropionsäure.
  • Zu einer gerührten Lösung von 3-Mercaptopropionsäure (7 ml, 0,08 mol) und Imidazol (5,4 g, 0,08 mol) in Tetrahydrofuran (THF, 700 ml) wurde über 15 Minuten unter Argon eine Lösung von 1-Acetylimidazol (9,6 g, 0,087 mol) in THF (100 ml) zugetropft. Die Lösung wurde weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wonach das THF in vacuo entfernt wurde. Der Rest wurde mit eiskaltem Wasser (18 ml) behandelt und die sich ergebende Lösung mit eiskaltem konzentriertem HCl (14,5 ml) auf einen pH-Wert von 1,5-2 angesäuert. Das Gemisch wurde mit Wasser (2 × 50 ml) extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft. Das restliche, rohe, gelbe, ölige feste Produkt (10,5 g) wurde aus Chloroform-Hexan umkristallisiert, um 4,8 g (41 % Ausbeute) Acetylthiopropionsäure als weißen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 44-45°C zu ergeben.
  • 2. Decapeptid- und Barbituratderivate
  • Das Decapeptid, YPYDVPDYAS (Chiron Mimotopes Peptide Systems, San Diego, CA) wurde in trockenem DMF (5,4 ml) in einem Rundkolben in Argon unter mäßigem Rühren gelöst (0,3 g). Imidazol (0,02 g) wurde der Lösung während des Rührens zugesetzt. Getrennt wurde Acetylthiopropionsäure (0,041 g) in 0,55 ml trockenem DMF in einem Rundkolben unter Rühren gelöst, und 0,056 g 1,1'-Carbonyldiimidazol (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wurde zu der Lösung unter Rühren zugegeben. Der Kolben wurde unter Argon versiegelt und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Diese Lösung wurde der Decapeptidlösung zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde mindestens sechs Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor das Lösungsmittel in vacuo entfernt wurde. Der Rest im Kolben wurde zweimal jeweils mit 10 ml Diethylether trituriert, und der Ether wurde dekantiert. Methylenchlorid (20 ml) wurde dem Rest im Kolben zugesetzt, und der Feststoff wurde vom Kolben abgekratzt und mit einem feinen gefritteten Buchner-Filter filtriert. Der Feststoff wurde zusätzlich mit 20 ml Methylenchlorid gewaschen, und das Buchner-Filter wurde im Vakuum getrocknet. Um das Derivat zur Erzeugung eines freien Thiols zu hydrolysieren, wurde es in 70 % DMF gelöst und 1 N Kaliumhydroxid zu einer Endkonzentration von 0,2 N unter kräftigem Rühren zugesetzt. Die Derivatlösung wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur vor der Neutralisation der Lösung durch Zugabe einer Lösung stehen gelassen, die 0,5 M Kaliumphosphat, 0,1 M Borat, pH 7,0, enthielt, zu der konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zu einer Endkonzentration von 1 M zugegeben wurde. Die Thiolkonzentration des hydrolysierten Dekapeptidderivats wurde durch Verdünnen von 10 μl der Lösung in 990 μl einer Lösung bestimmt, die 0,25 mM 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB, Aldrich Chemical Co., Milwaukee WI) und 0,2 M Kaliumborat, pH 8,0, enthielt. Die Thiolkonzentration in mM-Einheiten war gleich A412 (100/13,76). Das Barbituratderivat wurde wie im US-Patent Nr. 5,414,085, Beispiel 3 beschrieben hergestellt.
  • 3. Herstellung von Konjugaten des Barbituratderivats und Decapeptidderivats mit Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin und Rinderserumalbumin
  • Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin (KLH, 6 ml von 14 mg/ml, Calbiochem, San Diego, CA) wurde mit Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SULFO-SMCC) durch Zugabe von 15 mg SULFO-SMCC unter Aufrechterhalten des pH-Werts zwischen 7 und 7,5 mit 1 N Kaliumhydroxid über einen Zeitraum von einer Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren reagiert. Das Protein wurde von nicht reagiertem SULFO-SMCC durch Gelfiltrationschromatographie in 0,1 M Kaliumphosphat, 0,02 M Kaliumborat und 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,0, getrennt, und es wurde 24 ml KLH-Maleimid in einer Konzentration von 3,1 mg/ml gesammelt. Das hydrolysierte Barbituratderivat und das hydrolysierte Decapeptidderivat wurden getrennt zu Teilen des KLH-Maleimids in im Wesentlichen molaren Überschuss gegenüber den geschätzten vorhandenen Maleimidmengen zugesetzt, und die Lösungen wurden 4 Stunden lang bei 4°C gerührt und dann jeweils gegen 3 Volumen eines Liters pyrogenfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, vor der Immunisierung dialysiert.
  • Rinderserumalbumin (BSA, 3,5 ml von 20 mg/ml) wurde mit SMCC durch Zugabe einer Lösung von 6,7 mg SMCC in 0,3 ml Acetonitril und Rühren der Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur reagiert, während der pH-Wert mit 1 N Kaliumhydroxid zwischen 7 und 7,5 gehalten wurde. Das Protein wurde von den unreagierten Materialien durch Gelfiltrationschromatographie in 0,1 M Kaliumphosphat, 0,02 M Kaliumborat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,0, getrennt. Das hydrolysierte Barbituratderivat und das hydrolysierte Decapeptidderivat wurden zu Teilen des BSA-Maleimids in im Wesentlichen molarem Überschuss gegenüber den geschätzten, vorhandenen Maleimidmengen getrennt zugeführt und die Lösungen wurden 4 Stunden lang bei 4°C gerührt. Die Lösungen wurden zum Überziehen von Mikrotiterplatten zum Feststellen von Antikörpern verwendet, die mittels Standardverfahren entweder an das Barbituratderivat oder an das Decapeptidderivat gebunden hatten.
  • 4. Hersstellung von Hybridomen und primäre Auswahl von monoklonalen Antikörpern
  • Die Immunisierung von Balb/c-Mäusen wurde nach dem Verfahren von Liu D., Purssell, R. und Levy, J.G., Clin. Chem. 25: 527-538 (1987) durchgeführt. Die Fusionen von Milzzellen mit SP2/0-Ag 14 Myelomzellen, die Verbreitung von Hybridomen und das Klonieren wurden mit Standardverfahren durchgeführt. Die Auswahl der Hybridomen zum weiteren Klonieren begann mit dem Kulturüberstand in der 96-Loch-Stufe. Ein standardmäßiges ELISA-Verfahren wurde mit BSA-Konjugaten entweder von Barbituratderivat oder Decapeptidderivat, das auf die ELISA-Platte adsorbiert wurde, durchgeführt. Typischerweise wurde eine einzelne Fusion in zwanzig Platten ausplattiert und ungefähr 10-20 Löcher pro Platte waren mit dem ELISA-Assay positiv. In diesem Stadium konnte eine sekundäre Selektion vorgenommen werden, wenn Antikörper für den SMCC-Teil des Verbindungsarms aus den weiteren Überlegungen ausgenommen werden sollten. Mit einem ELISA-Assay, der mit SMCC derivatisiertes aber nicht an die Derivate gebundenes BSA verwendete, wurde ermittelt, welcher der positiven Klone, die an die BSA-Konjugate gebunden hatten, tatsächlich das SMCC-BSA bindet. Die Antikörper, die für SMCC-BSA spezifisch sind, können in diesem Schritt ausgeschaltet werden. Monoklonale Antikörper 7F11, die für das Decapeptidderivat spezifisch sind, und 3E12, die für das Barbituratderivat spezifisch sind, wurden hergestellt und mit diesem Verfahren selektiert. Zellen, die jeden dieser Antikörper erzeugen, sind nach dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852) am 5. Dezember 1997 hinterlegt worden und ihnen wurden die ATCC-Hinterlegungsnummern HB-12443 (7F11) und HB-12442 (3E12) gegeben.
  • B. Herstellung des Nachweisrests
  • Der rekombinante Antikörper 3E12 wurde dazu verwendet, um den Nachweisrest zu konstruieren. Dieser Antikörper, der spezifisch an ein Barbituratderivat bindet, das als Hapten an den Toxin A-Bindungsrest angelagert war, wurde mit alkalischer Phosphatase mittels eines Verfahrens konjugiert, das ähnlich dem in I-A oben beschriebenen war. Der intakte IgG-Antikörper 3E12 wurde mit Succinimidyl-3-(2-pyrridyldithio)propionat (SPDP, Molecular Probes, Eugene, OR) mit einem Antikörper bei 10 mg/ml und einem SPDP:Antikörper-Verhältnis von 10:1 in einem Puffer, der 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,0, enthielt, 90 Minuten lang bei Raumtemperatur reagiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Aminoethansulfonsäure (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zu einer Endkonzentration von 20 mM angehalten. Das Reagens DTT wurde zu 2 mM Endkonzentration zugesetzt, und die Reduktion wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen. Der Antikörper wurde von den Reaktanten mit niedrigem Molekulargewicht durch Gelfiltrationschromatographie mittels einer Säule getrennt, die G50 Fine in dem obigen Puffer enthielt, wobei 0,1 mM EDTA vorhanden war.
  • Das AP und der derivatisierte Antikörper wurden zusammen in einem molaren Verhältnis von 1:1 gemischt und die Konjugationsreaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur weitergeführt. Um die Konjugation anzuhalten wurde 2-Mercaptoethanol zu 1 mM Endkonzentration zu der Konjugatlösung zugesetzt und 5 Minuten im Anschluss an die Zugabe von N-Ethylmaleimid zu 2 mM Endkonzentration reagiert. Das Konjugat wurde durch Gelfiltrationschromatographie mittels SEPHACRYLTM S-500 HR (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) gereinigt. Der freie Antikörper wurde aus dem Konjugatpool ausgeschlossen, der zur Verwendung in Immunoassays mittels der oben beschriebenen Konjugatverdünnung verdünnt wurde.
  • C. Herstellung des Einfangrests
  • Der monoklonale Antikörper 7F11, der spezifisch an die Decapeptidsequenz YPYDVPDYAS bindet, wurde wie oben beschrieben hergestellt. Um den Einfangrest zu konstruieren, wurde der Antikörper 7F11 wie folgt an Magnetpartikel gebunden. Amintermininerte BioMagTM-Partikel (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) mit einer nominalen Größenverteilung von 2,5 μm wurden zuerst mit deionisiertem Wasser gewaschen. Ein Volumen von 52,6 ml 3,8 % Partikel wurde durch magnetische Trennung aus der Lagerlösung gewaschen und anschließend in deionisiertem Wasser resuspendiert und magnetisch mittels Dauermagneten, die von PerSeptive Biosystems erhalten wurden, getrennt. Die BioMag-Partikel wurden in 188 ml deionisiertem Wasser resuspendiert und 20 ml von 500 mM Kaliumphosphat, 100 mM Borat, pH 7,0, wurde zugegeben und gemischt. Das Vernetzungsmittel SMCC (124 mg) wurde in 20 ml trockenem N-N-Dimethylformamid (DMF, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) gelöst, und die Lösung wurde der BioMag-Suspension zugesetzt. Die Reaktion wurde unter leichtem Schwenken zwei Stunden lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen. Um die Reaktion anzuhalten, wurde 2-Aminoethansulfonsäure zu einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Das BioMag wurde fünfmal mittels magnetischer Trennung mit fünf 200 ml-Volumen 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Borat, 10 % DMF, pH 7,0, gewaschen. Die SMCC-BioMag-Partikel wurden in 100 ml 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH 7,0 resuspendiert.
  • Der monoklonale Antikörper 7F11 wurde durch Verdünnen auf 5 mg/ml und Mischen von 100 ml dieser Lösung mit 5,2 mg SPDP, das in 0,2 ml Acetonitril gelöst worden war, derivatisiert. Die Reaktion wurde 90 Minuten lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen, bevor 2-Aminoethansulfonsäure zu einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben wurde, und 15 Minuten lang reagiert. DTT wurde zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reagiert. Die Antikörperlösung wurde auf 20 ml mit einer YM 30 Ultrafiltrationsmembran (Amicon, Beverly, MA) konzentriert und der Antikörper wurde einer Gelfiltrationschromatographie mit einer Säule unterworfen, die GH-25 (Amicon, Beverly, MA) in 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH, 7,0, enthielt. Der aus der Säule eluierende Antikörper wurde gesammelt und mit demselben Puffer auf 100 ml verdünnt.
  • Der mit SPDP derivatisierte Antikörper 7F11 wurde dann mit der SMCC-BioMag-Partikelsuspension gemischt. Die Endantikörperkonzentration betrug 2,3 mg/ml und die Endpartikelkonzentration war 1 % Feststoffe. Die Reaktion schritt 18 Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken fort, bevor sie durch Zugabe von 2-Mercaptoethanol zu einer Endkonzentration von 2 mM gestoppt wurde, und wurde anschließend 30 Minuten lang inkubiert und dann N-Hydroxyethylmaleimid zu einer Endkonzentration von 6 mM zugegeben. Das 7F11-BioMag wurde fünfmal mit fünf 200-ml-Volumen 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,0, mittels magnetischer Trennung gewaschen, und die Partikel wurden bei 1 % Feststoffen in diesem 0,1 % Natriumazid enthaltenden Puffer gelagert.
  • D. Herstellung von Toxin A-Bindungsrest
  • Der Toxin A-Bindungsrest basierte auf dem monoklonalen Antikörper PCG-4, der spezifisch an das Toxin A von C. difficile bindet und im US-Patent Nr. 4,533,630 beschrieben ist. Ein Barbituratderivat wurde als Hapten an den Antikörper angelagert, um den Nachweisrest zu binden, und eine Decapeptidsequenz wurde als molekularer Tag an den Antikörper angelagert, um den Einfangrest zu binden.
  • Um das Barbituratderivat an den monoklonalen Antikörper PCG-4 anzulagern, wurde der Antikörper bei 10 mg/ml in 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH 7,0, hergestellt. SMCC wurde zu einem abschließenden molaren SMCC:Antikörper Verhältnis von 25:1 mit einer SMCC-Lösung von 20 mg/ml in Acetonitril zugegeben. Die Reaktion wurde 90 Minuten lang bei Raumtemperatur vor dem Trennen des Antikörpers vom SMCC durch Gelfiltrationschromatographie in eine Säule mit G50 Fine in dem obigen Puffer fortschreiten gelassen. Das SMCC-PCG-4 wurde gesammelt und die Konzentration durch A280 mittels einer Absorptionsfähigkeit von 1,4 für eine 1 mg/ml Lösung bestimmt.
  • Das Barbituratderivat wurde in 70 % DMF gelöst, und 1 N Kaliumhydroxid wurde zu einer Endkonzentration von 0,2 N unter kräftigem Mischen zugegeben. Die Derivatlösung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur vor der Neutralisation der Lösung durch Zugabe einer Lösung, die 0,5 M Kaliumphosphat, 0,1 M Borat, pH 7,0, enthielt, der konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zu einer Konzentration von 1 M zugesetzt wurde, stehen gelassen. Die Thiolkonzentration des hydrolysierten Barbituratderivats wurde durch Verdünnen von 2 μl der Lösung in 998 μl einer Lösung, die 0,25 mM 5,5'-Dithiobis(-2nitrobenzoesäure) (DTNB, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) und 0,2 M Kaliumborat, pH 8,0, enthielt, bestimmt. Die Thiolkonzentration in mM Einheiten entsprach dem A412 (500/13,76).
  • Das Dekapeptidderivat wurde in ähnlicher Weise durch Hydrolyse hergestellt und seine Thiolkonzentration wurde auch bestimmt.
  • Die Barbiturat- und Decapeptidderivate wurden wie folgt an den derivatisierten PCG-4-Antikörper angelagert. Das SMCC-PCG-4-Präparat lagen typischerweise bei einer Konzentration von 2-3 mg/ml. Die hydrolysierten Barbiturat- und Decapeptidderivate wurden zusammengemischt, so dass die Endthiolkonzentration bei Zugabe zur Antikörperlösung 0,3 mM betrug und das Verhältnis von hydrolysiertem Barbituratderivat zu hydrolysiertem Decapeptidderivat 2:1 war. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen, bevor der Barbiturat/Decapeptid-PCG-4-Antikörper in die Dialyse gegen ein Liter BBS gegeben wurde.
  • E. Assay mit hoher Empfindlichkeit für Toxin A
  • Der Assay wurde im Wesentlichen wie in der 2 gezeigt durchgeführt. Barbiturat/Decapeptid-PCG-4-Antikörper (Toxin A-Bindungsrest) wurde zu 7F11-BioMag (Einfangrest) zu einer Endkonzentration von ungefähr 50 μg/ml 7F11-BioMag bei 1 % Feststoffen zugegeben. Der Antikörper wurde über die Affinität von 7F11 für das Decapeptidderivat für 5 Minuten vor dem Waschen des BioMag mit einem Volumen Dissoziationspuffer und anschließend einem Volumen Neutralisationspuffer und danach drei Volumen 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,0, mit Endlagerung bei 1 % Feststoffen in diesem Puffer binden gelassen.
  • Stuhlproben wurden in Mengen von 5 g oder 5 ml genommen und auf 40 ml mit einer Probenverdünnung, die 10 mM Kaliumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 % Casein, 0,01 % Rinder-IgG, 0,05 % TRITON X-100TM, pH 7,6, enthielt, verdünnt. Die verdünnten Proben wurden durch Glaswolle filtriert, um große Trümmer zu entfernen, und es wurde 400 μl Barbiturat/Decapeptid-PCG-4-7F11-Biomag zur verdünnten Probe in einem konischen 50 ml Röhrchen zugesetzt. Das Gemisch wurde auf eine Schütteleinrichtung gegeben, um das BioMag 30–60 Minuten lang bei Raumtemperatur suspendiert zu halten. Die Proben wurden dann auf ein magnetisches Trenngestell (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) gegeben und das BioMag wurde sich 5 Minuten von der Probe trennen gelassen. Die Flüssigkeit wurde aus dem Probenbehälter dekantiert und verworfen, das BioMag wurde in der Probenverdünnung resuspendiert, und der Probenbehälter wurde für weitere fünf Minuten zurück in das magnetische Trenngestell gestellt. Die Lösung wurde wieder dekantiert und verworfen.
  • Um die Bindung des Einfangrests an die Decapeptidsequenz zu dissoziieren, wurde der BioMag-Komplex in 300 μm Dissoziationspuffer, der 50 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl, pH 11,5, enthielt, resuspendiert. Das BioMag wurde zwei Minuten lang in dieser Lösung inkubiert, bevor die Trennung des BioMag aus der Lösung im magnetischen Trenngestell erfolgte. Die Lösung wurde entfernt und für ungefähr 20.000 g min einer Zentrifugation unterworfen. Die geklärte Lösung wurde aus dem Zentrifugenröhrchen entfernt und durch Zugabe von 200 μl eines Neutralisationspuffers neutralisiert, der 200 mM N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[3-propansulfonsäure] (HEPPS, Calbiochem, LaJolla, CA), 150 mM Natriumchlorid, 0,8 % Casein, 0,15 Natriumazid, 50 μM Decapeptidderivat, das hydrolysiert und mit N-Ethylmaleimid, pH 7,3, reagiert worden war, enthielt.
  • Die Probe wurde dann zu einer Immunoassayeinrichtung wie oben beschrieben gegeben, die eine Linie aus immobilisiertem, für Toxin A spezifischen, polyklonalem Antikörper CD.TXA.I.PC enthielt, der mit Casein konjugiert war. Die Herstellung dieses Antikörpers, der ein rekombinanter polyklonaler Antikörper ist, ist in dem allgemein übertragenen US-Patent 6,057,098 beschrieben. Der Antikörper wurde auf der porösen Membran der Assayeinrichtung, wie oben beschrieben, immobilisiert, und zwar mittels einer Lösung, die ungefähr 5 mg/ml Antikörper enthielt. Nachdem die Probe in die Einrichtung abgelassen worden war, wurde das Konjugat von 3E12 und alkalischer Phosphatase in ein Volumen von 140 μl bei einer Konzentration von ungefähr 20 μg/ml in der oben beschriebenen Konjugatverdünnung gegeben und 3 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen.
  • Nach der Inkubation wurden fünf Tropfen Waschlösung, die 100 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), 150 mM Natriumchlorid, 0,5 Dow 193 Tensid, 0,1 % Natriumazid und 20 mg/l NBT enthielten, aus einer Tropfflasche aufgetragen. Nachdem die Waschflüssigkeit in die Membran abgelassen worden war, wurden weiter fünf Tropfen Waschlösung aufgetragen und ablaufen gelassen. Drei Tropfen Substratlösung, die 10 mM Indoxylphosphat (JBL Scientific, San Luis Obispo, CA), 200 mM 2-Amino-2-methyl-1-propanol (JBL Scientific, San Luis Obispo, CA), 500 mM TRIS, pH 10,2, enthielten, wurden aus einer Tropfflasche zugegeben, und die Vorrichtung wurde fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde das Vorhandensein einer visuell feststellbaren, lila bis schwarzen Linie am Nachweisbereich für Toxin A als positives Ergebnis festgestellt. Das Fehlen einer visuell feststellbaren Linie in diesem Bereich war ein negatives Ergebnis.
  • Die Empfindlichkeit dieses Assays wurde durch Vermischen von Toxin A mit 5 ml Volumen Probenverdünnung bei 0,1, 0,05, 0,02, 0,01 und 0 ng/ml gemessen, und der Assay wurde wie beschrieben durchgeführt. Die Vorrichtungen, die Toxin A bei 0,01 ng/ml und darüber enthielten, zeigten blasse aber sichtbare lila bis schwarze Linien am Nachweisbereich für Toxin A. Am Nachweisbereich für Toxin A in der Vorrichtung, die zum Testen der Probe verwendet wurde, die 0 ng/ml Toxin A enthielt, war keine sichtbare Linie vorhanden. Sechs Patientenproben wurden identifiziert, die positive Ergebnisse für den im Beispiel I-D beschriebenen Glutamatdehydrogenaseassay erbracht hatten, aber in dem oben beschriebenen Toxin A Assay negativ waren und ursprünglich mit dem Toxinassayverfahren, das von dem die Probe liefernden Laboratorium verwendet wurde, als negativ bewertet wurden. Diese sechs Proben wurden mit dem Assay mit hoher Empfindlichkeit für Toxin A getestet und zwei der Proben führten zu deutlich sichtbaren Linien im Nachweisbereich für Toxin A, was positive Ergebnisse im Hinblick auf das Vorhandensein von Toxin A anzeigt. Diese Ergebnisse zeigen den Wert des Glutamatdehydrogenaseassays zum Identifizieren von Proben, die toxigene Organismen enthalten, die mit den herkömmlichen Verfahren als falsch-negativ klassifiziert werden.
  • III. Assay mit hoher Empfindlichkeit für toxigene C. difficile-Stämme in Stuhlproben durch Amplifikation von Genen, die Toxin A, Toxin, B und Glutamatdehydrogenase kodieren.
  • Das Verfahren ist eine Erweiterung des von Lou u.a., J. Clin. Microbiol. (Januar 1997) 35: 281-283 beschriebenen Verfahrens. Ungefähr 200 mg Stuhl wurde mit sterilem Wasser auf 500 μl in einer 1,5 ml Polypropylenmikrozentrifugenröhre verdünnt. Die Probe wurde zur Lyse von Bakterien in einem Wasserbad 5 Minuten lang gekocht, wonach die Probe durch Zentrifugation bei 14.000 UpM für 5 Minuten in einer Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge geklärt wurde. Ungefähr 250 μl des Überstands wurde auf eine neue Röhre übertragen. Ein Gemisch aus 10 μl geklärter Probe, 30 μl steriles Wasser und 10 μl Auftragspuffer, der 25 % Glycerin, 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,05 % Bromphenol blau und 0,05 % Xylolcyanol enthielt, wurde bei 70°C in einem Wasserbad 15 Minuten lang inkubiert. Diese Lösung wurde auf eine Spinsäule gegeben, die SEPHAROSE CL-6BTM (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) enthielt, und 3 Minuten lang einer Zentrifugation bei 2000 UpM (330 g) unterworfen.
  • Das sich ergebende Elutionsmittel aus der Säule wurde für die PCR verwendet. Drei Primersätze wurden zur Amplifikation der Genfragmente für Toxin B, Toxin A und Glutamatdehydrogenase verwendet. Die zur Amplifikation eines 399 bp Fragments von Toxin B verwendeten Primer waren dieselben wie in Lou u.a. beschrieben. Ein 430 bp Fragment von Toxin A wurde mit den Primern #649 (SEQ ID NO: 1; ATGTAGAAGTAAACTTACTTGGATG) und #650 (SEQ ID NO: 2; CCCCAATAGAAGATTCAATATTAAG) amplifiziert. Ein 690 bp Fragment des Glutamatdehydrogenasegens wurde mit den Primern #659 (SEQ ID NO: 3; AAGTGTTCTGTAACAGGTATACC) und #660 (SEQ ID NO: 4; GGTCCATTACGAGCCTCACA) amplifiziert.
  • Amplifikationen wurden in 50 μl Reaktionen mittels 10 μl Matrizen-DNA und dem Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 5 μl Expand 10X HF-Puffer + MgCl2 zu 2 mM, 5 μl 2 mM dNTPs, 0,05 μM jedes PCR-Primers und 1,25 E Expand HF Polymerase durchgeführt. Nach 10-minütiger Denaturierung bei 94°C, wurden die PCR-Gemische 15 Amplifikationszyklen bei 94°C (30 s), 55°C (30 s) und 72°C (45 s) und anschließend 20 Amplifikationszyklen bei 94°C (30 s), 55°C (30 s) und 72°C (65 s + 20 s je zusätzlichem Zyklus) und einem 6-minütigen Halten/Ausbreiten bei 72°C unterworfen. Die PCR-Produkte wurden entweder auf 1,5 % Agarose oder 6 % Polyacrylamid elektrophoresiert und entweder mit Ethidiumbromid oder SYBR grün (Molecular Probes, Eugene, OR) gefärbt, um die Größe der Fragmente zu bestimmen.
  • Insgesamt siebzehn Stuhlproben wurden hergestellt und für die Fragmente des oben beschriebenen Toxin A-Gens, des Toxin B-Gens und Glutamatdehydrogenasegens einer PCR unterworfen. Die siebzehn Stuhlproben waren im Immunoassay jeweils positiv für Glutamatdehydrogenase bei einer Empfindlichkeit von 2 ng/ml und negativ im Immunoassay für Toxin A bei einer Empfindlichkeit von 2 ng/ml. Wie ursprünglich vom Krankenhaus- oder Referenzlabor berichtet, waren fünfzehn der Proben entweder unter Verwendung eines Toxin A Immunoassays oder eines Cytotoxinassays negativ und zwei der Proben waren positiv. Vierzehn der fünfzehn ursprünglich als negativ beschriebenen Proben zeigten im Anschluss an eine PCR, die die bestimmten Primer für Toxin A, Toxin B und Glutamatdehydrogenase verwendete, Genfragmente der erwarteten Größe. Proben, die nicht toxigene Stämme von C. difficile enthielten, wurden auch getestet und führten zu keinen amplifizierten Fragmenten weder für die Toxin A- noch für die Toxin B-Gene, sondern zeigten ein amplifiziertes Fragment des Glutamatdehydrogenasegens. Zwei Proben, die ursprünglich vom Krankenhaus- oder Referenzlaboratorium als positiv beschrieben wurden, waren mittels der Immunoassays mit Empfindlichkeiten von 2 ng/ml für Toxin A negativ und für Glutamatdehydrogenase positiv. Diese Proben waren mit der PCR für Toxin A und Toxin B negativ, aber für Glutamatdehydrogenase positiv. Daher wurden vierzehn der siebzehn Proben, die willkürlich ausgewählt wurden, aber mit dem Immunoassay für Glutamatdehydrogenase positiv und für Toxin A negativ waren, als toxigen ermittelt, insofern als sie die Gene für Toxin A und Toxin B beherbergen.
  • Die Hybridome oder Zellen produzierenden Antikörper CD.TXA.I.PC (ATCC 98388, 3. April 1997), CD.43.9 (ATCC 98390, 3. April 1997), CD.43.5.PC (ATCC 98389, 3. April 1997), 3E12 (ATCC HB-12442, 5. Dezember 1997) und 7F11 (ATCC HB-12443, 5. Dezember 1997) wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland nach dem Budapester Vertrag zu den angegebenen Zeiten hinterlegt und erhielten die angegebenen Hinterlegungsnummern. Diese Zelllinien werden bei einer autorisierten Hinterlegungsstelle aufbewahrt und im Falle einer Mutation, Lebensunfähigkeit oder Zerstörung für einen Zeitraum von mindestens fünf Jahren nach der letzten, bei der Hinterlegungsstelle eingehenden Anfrage zur Freigabe einer Probe, für einen Zeitraum von mindestens dreißig Jahren nach dem Hinterlegungsdatum oder während der durchsetzbaren Lebensdauer des betreffenden Patents ersetzt, je nachdem, welche die längste Zeitdauer ist. Alle Beschränkungen für diese Zelllinien hinsichtlich der Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich nach der Patenerteilung dieser Anmeldung aufgehoben.
  • Es wird davon ausgegangen, dass die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur zum Zwecke der Veranschaulichung dienen und dass verschiedene Modifikationen oder Änderungen angesichts dessen dem Fachmann nahe gelegt werden und in den Bereich dieser Anmeldung und unter den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen sollen.

Claims (12)

  1. Kit zur Unterstützung bei der Diagnose einer Infektion durch Clostridium difficile, wobei das Kit ein Assay-Kit für die Glutamatdehydrogenase von Clostridium difficile umfasst, welches umfasst: (a) ein Ankermolekül, das auf einem festen Träger immobilisiert ist und spezifisch an wenigstens ein erstes Epitop der Glutamatdehydrogenase von Clostridium difficile bindet; und (b) ein oder mehrere Nachweismoleküle, umfassend eine nachweisbare Markierung und ein Bindemolekül, das spezifisch an wenigstens ein zweites Epitop der Glutamatdehydrogenase von Clostridium difficile bindet; und wobei das Kit ferner ein Sandwich-Assay zum Nachweis des Toxin A von Clostridium difficile umfasst, welcher umfasst: (c) ein Ankermolekül, das auf einem festen Träger immobilisiert ist und spezifisch an wenigstens ein erstes Epitop des Toxin A von Clostridium difficile bindet; und (d) ein oder mehrere Nachweismoleküle, umfassend eine nachweisbare Markierung und ein Bindemolekül, das spezifisch an wenigstens ein zweites Epitop des Toxin A von Clostridium difficile bindet.
  2. Kit nach Anspruch 1, wobei wenigstens eines der Ankermoleküle und der Nachweismoleküle in dem Toxin A-Assay ein Immunoglobulin, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, insbesondere den monoklonalen Antikörper PCG-4 (ATCC-Zugangs-Nr. HB-8712), umfasst.
  3. Kit nach Anspruch 2, wobei das Ankermolekül, das spezifisch an das Toxin A von Clostridium difficile bindet, und das Ankermolekül, das spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von Clostridium difficile bindet, immobilisiert sind in: (a) getrennten Bereichen auf dem gleichen festen Träger; oder (b) einem einzigen Bereich auf dem gleichen festen Träger; und die nachweisbare Markierung, die mit dem Nachweismolekül konjugiert ist, welches spezifisch an das Toxin A von Clostridium difficile bindet, unterschiedlich zu der nachweisbaren Markierung ist, die mit dem Nachweismolekül konjugiert ist, das spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von Clostridium difficile bindet.
  4. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ankermolekül in dem Toxin A-Assay einen monoklonalen Antikörper, gegebenenfalls den monoklonalen Antikörper PCG-4 (ATCC-Zugangs-Nr. HB-8712), umfasst.
  5. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das wenigstens eine oder mehrere Nachweismolekül in dem Toxin A-Assay den rekombinanten polyklonalen Antikörper CD.TXA.1.PC (ATCC-Zugangs-Nr. 98388) umfasst.
  6. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens eines der Ankermoleküle und der Nachweismoleküle in dem Glutamatdehydrogenase-Assay einen monoklonalen Antikörper, gegebenenfalls den rekombinanten monoklonalen Antikörper CD.43.9 (ATCC-Zugangs-Nr. 98390), umfasst, wobei das wenigstens eine oder mehrere Nachweismolekül in dem Glutamatdehydrogenase-Assay vorzugsweise den rekombinanten monoklonalen Antikörper CD.43.9 (ATCC-Zugangs-Nr. 98390) umfasst.
  7. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ankermolekül in dem Glutamatdehydrogenase-Assay den rekombinanten monoklonalen Antikörper CD-43.5.PC (ATCC-Zugangs-Nr. 98389) umfasst, wobei das wenigstens eine oder mehrere Nachweismolekül in dem Glutamatdehydrogenase-Assay gegebenenfalls den rekombinanten monoklonalen Antikörper CD.43.9 (ATCC-Zugangs-Nr. 98390) umfasst.
  8. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ankermolekül in dem Glutamatdehydrogenase-Assay den rekombinanten monoklonalen Antikörper CD-43.5.PC (ATCC-Zugangs-Nr. 98389) umfasst, und das wenigstens eine oder mehrere Nachweismolekül in dem Glutamatdehydrogenase-Assay den rekombinanten monoklonalen Antikörper CD.43.9 (ATCC-Zugangs-Nr. 98390) umfasst; und wobei das Ankermolekül in dem Toxin A-Assay den monoklonalen Antikörper PCG-4 (ATCC-Zugangs-Nr. HB-8712) umfasst, und das wenigstens eine oder mehrere Nach weismolekül in dem Toxin A-Assay den rekombinanten polyklonalen Antikörper CD-TXA.1.PC (ATCC-Zugangs-Nr. 98388) umfasst.
  9. Vorrichtung zum Schnellnachweis von toxigenem Clostridium difficile in einer Testprobe, wobei die Vorrichtung umfasst: ein poröses Element mit einer oberen und einer unteren Oberfläche, das in der Vorrichtung so positioniert ist, dass die Testprobe auf die obere Oberfläche aufgetragen werden kann, wobei eine Vielzahl von Ankerresten, die spezifisch Toxin A von Clostridium difficile binden können, in einem ersten Bereich des porösen Elements immobilisiert sind und eine Vielzahl von Ankerresten, die spezifisch an die Glutamatdehydrogenase von Clostridium difficile binden können, in einem zweiten Bereich des porösen Elements immobilisiert sind; und ein nicht absorptionsfähiges Element, das eine strukturierte Oberfläche mit Kanälen aufweist, das ein Netzwerk von Kapillarkanälen bilden kann, wenn dieses unterhalb oder um das poröse Element in Verbindung angeordnet ist, wobei das Kapillarnetzwerk im Wesentlichen parallel zu der unteren Oberfläche des porösen Elements ist; wobei die Testprobe, alleine oder in Kombination mit anderen Fluiden, beim Auftragen auf die obere Oberfläche durch das poröse Element zu dem zwischen dem porösen Element und dem nicht absorptionsfähigen Element gebildeten Kapillarnetzwerk gezogen wird, wenn im Wesentlichen das gesamte Porenvolumen des porösen Elements mit der Testprobe gefüllt ist und wenn ein Kontakt zwischen dem porösen Element und dem nicht absorptionsfähigen Element hergestellt ist.
  10. Verfahren zur Unterstützung bei der Diagnose einer Infektion durch toxigenes Clostridium difficile, wobei das Verfahren umfasst: (a) Durchführen eines Immunoassays, um Glutamatdehydrogenase von Clostridium difficile in einer Testprobe nachzuweisen; und (b) Durchführen eines Assays, um Toxin A und/oder Toxin B von Clostridium difficile in der Testprobe nachzuweisen, wobei der Nachweis der Glutamatdehydrogenase von Clostridium difficile und entweder des Toxins A oder des Toxins B auf eine Infektion durch toxigenes Clostridium difficile hinweist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Assay zum Nachweisen von Toxin A und/oder Toxin B von Clostridium difficile ein Immunoassay ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Immunoassay zum Nachweis von Toxin A und/oder Toxin B von Clostridium difficile Toxin A nachweist, wobei das Durchführen von Immunoassays zum Nachweis von Glutamatdehydrogenase von Clostridium difficile und Toxin A von Clostridium difficile gegebenenfalls die Verwendung des Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
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