DE4314998A1

DE4314998A1 - Monoklonale Antikörper gegen filamentöse Phagen, ihre Herstellung und Verwendung zum Nachweis und zur Isolierung der Phagen

Info

Publication number: DE4314998A1
Application number: DE19934314998
Authority: DE
Inventors: Burkhard Prof Dr Micheel; Gudrun Scharte; Stephan Dr Heymann; Frank Dr Vogel; Frank Dr Breitling; Stefan Dr Duebel; Melvin Prof Dr Little
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 1993-05-06
Filing date: 1993-05-06
Publication date: 1994-11-10

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen filamentöse Phagen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zum Nachweis und zur Isolierung und Reinigung der Phagen, Phagenproteine, -peptide oder anderer -derivate, in erster Linie in der rekombinanten Proteintechnik für die Identifizierung und Isolierung und Reinigung von Phagenpartikeln, die spezifische Antikörper- oder Antigengene enthalten und exprimieren. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik und die pharmazeutische Industrie.

Für den Nachweis von in der rekombinanten Proteintechnik (Marks, J. D., Hoogenboom, H. R., Bonnert, T. P., Mac Cafferty, J., Griffiths, A. D., and Winter, G., J. Mol. Biol., 222, 581, 1991) eingesetzten filamentösen Phagen (der Gruppe fd, M13, f1, ZJ/2 etc.; die Phagen dieser Gruppe sind mit morphologischen, biochemischen und molekularbiologischen Methoden nicht bzw. kaum zu unterscheiden; The Single-Stranded DNA Phages, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1978, Ed. D. T. Denhardt, D. Dressler and D. S. Ray), die spezifische Antikörpergene enthalten und Antikörper bzw. Antikörperfragmente an der Oberfläche exprimieren, wodurch sie an das entsprechende Antigen gebunden werden, bzw. die spezifische Gene enthalten, die Antigene an der Oberfläche exprimieren, wodurch sie an den entsprechenden Antikörper gebunden werden, sind Anti-Phagen-Antikörper erforderlich, die spezifisch mit solchen Epitopen der Phagen reagieren, die weder die Infektion von Bakterien durch die Phagen noch die Bindung der rekombinanten Phagen an die entsprechenden Antigene bzw. Antikörper inhibieren und unabhängig von der Art der integrierten Antikörper- bzw. Antigenfragmente zum entsprechenden Phagenderivat genauso affin sind wie zum Wildtyp-Phagen. Da Antikörpergene bzw. Antigengene in eine Region des pIII-Proteins integriert werden, das an einem Terminus des Phagen lokalisiert ist und mit dem die Phagen an die Pili der Bakterien für die Infektion binden, sollten Antikörper gegen das pIII- Protein wenig sinnvoll sein. Am besten sind deshalb für Nachweiszwecke Antikörper gegen das Hauptstrukturprotein (pVIII) des Phagen geeignet, das die Phagenhülle darstellt und den gesamten Phagen bedeckt.

Für entsprechende Nachweise werden schon polyklonale Schafantikörper gegen das pVIII des filamentösen Phagen M13 verwendet (McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., and Chiswell, D. J., Nature, 348, 552, 1990) und kommerziell von der Firma Pharmacia vertrieben. Diese Antikörper sind für eine Reihe von Tests durchaus geeignet, sie haben jedoch für verschiedene Anwendungszwecke Nachteile, die aus ihrer nicht definierbaren Feinspezifität und damit ungenügenden Standardisierbarkeit resultieren.

Monoklonale Antikörper gegen filamentöse Phagen existieren bisher nicht.

Die Erfindung hat das Ziel, den Nachweis filamentöser Phagen, insbesondere für die medizinische Diagnostik, und die Möglichkeiten zur Isolierung und Reinigung dieser Phagen zu verbessern. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, monoklonale Antikörper gegen filamentöse Phagen bereitzustellen, die in der genannten Zielrichtung verwendet werden können.

Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1, 7, 12, 13, 16, 18 und 19 gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Die Hybridzellen werden erfindungsgemäß hergestellt durch:

A. Isolierung von filamentösen Phagen aus dem Überstand infizierter E. coli- Bakterien,
B. Immunisierung von Versuchstieren, in erster Linie von Mäusen, mit den filamentösen Phagen,
C. Isolierung von Lymphozyten aus dem Versuchstier und Immortalisierung der Lymphozyten durch Zellfusion mit geeigneten Myelomzellen bzw. durch eine andere geeignete Immortalisierungsmethode,
D. Selektion der danach erhaltenen ca. 10 000 immortalisierten Zellklonen,
E. Testen der immortalisierten Zellklone auf die Produktion von Antikörpern gegen die filamentösen Phagen,
F. Auswahl der Hybridzellklone, die Antikörper gegen filamentöse Phagen produzieren,
G. Auswahl der Hybridzellklone, die Antikörper produzieren, die mit Epitopen des Hauptstrukturproteins (pVIII) der filamentösen Phagen reagieren, das die Phagenhülle darstellt und den gesamten Phagen bedeckt,
H. Vermehrung dieser Hybridzellklone und Gewinnung der von diesen Zellen produzierten spezifischen Antikörper.

Zur Immunisierung werden filamentöse fd-Phagen oder andere Phagen dieser Gruppe, wie z. B. M13, f1, ZJ/2 etc. bzw. Phagenproteine, -peptide oder andere -derivate eingesetzt.

Als Versuchstiere für die Immunisierung werden vorzugsweise Mäuse, in erster Linie BALB/c-Mäuse benutzt.

Die Immortalisierung der Lymphozyten von immunisierten Versuchstieren wird vorzugsweise durch Zellfusion mit Myelomzellen der Linie X63-Ag8.653 durchgeführt.

Die Zellfusion wird vorzugsweise mit Hilfe von Polyethylenglykol (PEG) durchgeführt.

Die fusionierten Zellen werden vorzugsweise durch ein selektives Kulturmedium isoliert. Die immunologische Auswahl erfolgt aus ca. 10 000 insgesamt gewachsenen Klonen, aus denen die Hybridzellklone mit der besten Spezifität gegen filamentöse Phagen isoliert werden. Dabei werden die Hybridzellklone B62-EA11, B62-FE2 und B62-GF3 erhalten, die Antikörper produzieren, die Epitope des Hauptstrukturproteins (pVIII) der filamentösen Phagen erkennen, das die Phagenhülle darstellt und den gesamten Phagen bedeckt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper als Nachweisreagenzien.

Unter Nachweisreagenzien wird die Verwendung der monoklonalen Antikörper für den Nachweis von Phagen verstanden.

Der Nachweis von Phagen versteht sich in erster Linie als Nachweis von filamentösen Phagen.

Der Nachweis von filamentösen Phagen versteht sich in erster Linie als Nachweis von filamentösen Phagen der Gruppe fd, M13, f1, ZJ/2 etc. bzw. Phagenproteine, -peptide oder andere -derivate.

Der Nachweis von filamentösen Phagen der Gruppe fd, M13, f1, ZJ/2 etc. versteht sich in erster Linie als Nachweis von Phagen, die in der rekombinanten Proteintechnik Antikörpergene in die pIII-Region integriert haben und an der Oberfläche in der pIII-Region Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen ein spezifisches Antigen exprimieren (sog. Antikörper-Phagen) bzw. die in der rekombinanten Proteintechnik Antigengene in die pIII-Region integriert haben und die Antigene bzw. Epitope dieser Antigene an der Oberfläche in der pIII-Region exprimieren (sog. Antigen- Phagen).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper als Isolierungs- und Reinigungsreagenzien.

Unter Isolierungs- und Reinigungsreagenzien wird die Verwendung der monoklonalen Antikörper für die Isolierung und Reinigung von Phagen verstanden.

Die Isolierung und Reinigung von Phagen versteht sich in erster Linie als Isolierung und Reinigung von filamentösen Phagen.

Die Isolierung und Reinigung von filamentösen Phagen versteht sich in erster Linie als Isolierung und Reinigung von filamentösen Phagen der Gruppe fd, M13, f1, ZJ/2 etc. bzw. Phagenproteine, -peptide oder andere -derivate.

Die Isolierung und Reinigung von filamentösen Phagen der Gruppe fd, M13, f1, ZJ/2 etc. versteht sich in erster Linie als Nachweis von Phagen, die in der rekombinanten Proteintechnik Antikörpergene in die pIII-Region integriert haben und an der Oberfläche in der pIII-Region Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen ein spezifisches Antigen exprimieren (sog. Antikörper-Phagen) bzw. die in der rekombinanten Proteintechnik Antigengene in die pIII-Region integriert haben und die Antigene bzw. Epitope dieser Antigene an der Oberfläche in der pIII-Region exprimieren (sog. Antigen- Phagen).

Die einzelnen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung und zur Verwendung der monoklonalen Antikörper gegen filamentöse Phagen werden nachfolgend am Beispiel des fd-Phagen ausführlicher beschrieben.

1. Herstellung der Anti-fd-Phagen-Antikörpern produzierender Zellinien

Die Anti-fd-Phagen-Antikörper produzierenden, unbegrenzt wachsenden Zellinien werden durch Zellfusion oder eine andere geeignete Immortalisierungsmethode gewonnen.

Für die Gewinnung der Hybridzellen durch Zellfusionierung werden vorzugsweise verwendet:

1. In vitro und in vivo wachsende Myelomzellen der Linie X63-Ag8.653, die HAT-Medium sensitiv ist und selbst keine intakten Immunglobuline produziert (Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., and Rajewsky, K. J., Immunology, 123, 1558, 1979) oder andere geeignete Fusionspartner.
2. Lymphozyten, die nach Induktion einer Immunantwort (Current Protocols in Immunology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Interscience, 1992, Ed. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies and W. Strober) in vitro oder in vivo gewonnen wurden.

Zur Induktion der Immunantwort werden Phagen eingesetzt, die aus dem Überstand infizierter Bakterienzellen isoliert werden.

Die Lymphozyten und die Myelomzellen werden nach bekannten Verfahren, insbesondere Polyethylenglycol-Fusion, Sendai-Virus-Fusion oder Elektrofusion, fusioniert und die entstehenden Hybridzellen nach bekannten Verfahren, wie z. B. durch Einsatz von Selektionsmedien, selektiert (Köhler, G., and Milstein, C., Nature, 256, 495, 1975; Practical Immunology, Backwell Scientific Publications, 1989, L. Hudson and F. C. Hay).

Hybridzellen werden nach bekannten Verfahren, insbesondere durch "limited dilution" in der Zellkultur kloniert, kultiviert und vermehrt und ggf. in flüssigem Stickstoff aufbewahrt (Köhler, G., and Milstein, C., Nature, 256, 495, 1975; Practical Immunology, Backwell Scientific Publications, 1989, L. Hudson and F. C. Hay).

Zur Antikörpergewinnung werden die Hybridzellen in der Zellkultur oder ggf. in vivo durch Transplantation als Ascitestumoren weitervermehrt.

Die monoklonalen Antikörper werden aus den Zellkulturüberständen oder ggf. aus der Ascitesflüssigkeit tumortragender Versuchstiere isoliert.

2. Gewinnung der monoklonalen Antikörper

Die von den Hybridzellen synthetisierten Antikörper können in Abhängigkeit von dem Einsatzzweck direkt in der Kulturflüssigkeit der in vitro kultivierten Hybridzellen unter Einsatz von Anti-Immunglobulinen oder nach Isolierung und Reinigung mit Hilfe von an sich bekannten Verfahren verwendet werden (Practical Immunology, Backwell Scientific Publications, 1989, L. Hudson and F. C. Hay; Current Protocols in Immunology, Greene Publ. Assoc. and Wiley- Interscience, 1992, Ed. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies and W. Strober).

3. Immunologischer Nachweis von filamentösen Phagen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper

Die monoklonalen Antikörper können in den unterschiedlichsten Tests für den Nachweis der filamentösen Phagen eingesetzt werden, wobei wie in den meisten z. Z. durchgeführten Verfahren Festphasentests (Practical Immunology, Backwell Scientific Publications, 1989, L. Hudson and F. C. Hay; Current Protocols in Immunology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Interscience, 1992, Ed. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies and W. Strober) bevorzugt werden können.

Die auf die Anwesenheit von Phagen zu untersuchende Probe kann dazu zunächst an eine feste Phase (z. B. Polyvinylchlorid, Polystyrene etc.) adsorbiert werden. Danach erfolgt eine Inkubation mit den monoklonalen Antikörpern, die entweder mit einer Indikatorsubstanz (radioaktives Isotop, Fluoreszenzfarbstoff, Markerenzym, Biotin etc.) markiert sind, die in an sich gängigen Verfahren direkt oder indirekt (wie z. B. durch markiertes Avidin oder Streptavidin im Falle der Biotinmarkierung) einen Nachweis der Bindung erlauben, oder über einen zweiten markierten Anti-Immunglobulin-Antikörper den Bindungsnachweis ermöglichen. Ein derartiger Nachweis kann auch immunelektronenmikroskopisch mit Hilfe von elektronenoptisch sichtbaren Markern, z. B. kolloidalem Gold, erfolgen.

Eine andere Möglichkeit besteht in der Adsorption der isolierten monoklonalen Antikörper an die feste Phase, Inkubation mit der auf die Anwesenheit von Phagen zu untersuchenden Probe und nachfolgender Inkubation mit monoklonalen Antikörpern, die mit einer Indikatorsubstanz (radioaktives Isotop, Fluoreszenzfarbstoff, Markerenzym, Biotin etc.) markiert sind, die in an sich gängigen Verfahren direkt oder indirekt (wie z. B. durch markiertes Avidin oder Streptavidin im Falle der Biotinmarkierung) einen Nachweis der Bindung erlauben (sog. Zwei-Seiten-Bindungs- oder Sandwich-Tests).

Für den Nachweis von Phagen, die in der rekombinanten Antikörper-Technik Antikörpergene in die pIII-Region integriert haben und an der Oberfläche in der pIII-Region Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen ein spezifisches Antigen exprimieren (sog. Antikörper-Phagen), kann dieses spezifische Antigen an eine feste Phase adsorbiert werden. Danach erfolgt die Inkubation mit der Lösung, die die Antikörper-Phagen enthält. Die Proben werden dann mit den monoklonalen Antikörpern gegen die Phagen inkubiert, die entweder mit einer Indikatorsubstanz (radioaktives Isotop, Fluoreszenzfarbstoff, Markerenzym, Biotion etc.) markiert sind, die in an sich gängigen Verfahren direkt oder indirekt (wie z. B. durch markiertes Avidin oder Streptavidin im Falle der Biotinmarkierung) einen Nachweis der Bindung erlauben, oder über einen zweiten markierten Anti-Immunglobulin-Antikörper den Bindungsnachweis ermöglichen. In vergleichbaren Abläufen finden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gegen Phagen Einsatz zum Nachweis von Antigen- exprimierenden Phagenpartikeln (sog. Antigen-Phagen).

Alle diese Verfahren können unter Verwendung von Nitrocellulose, Nylonträgern oder anderen Trägern für Blotting oder Contact-Copy-Verfahren eingesetzt werden, die einen Phagennachweis durch Contact-Copy-Verfahren bzw. Abklatsch von in Agar-Kulturen gewachsenen Phagen-infizierten Bakterienkolonien erlauben, wobei die unterschiedlichsten Inkubationssequenzen möglich sind.

4. Immunologische Reinigung von filamentösen Phagen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper

Die monoklonalen Antikörper können ebenfalls für die Isolierung von filamentösen Phagen mit Hilfe einer Immunaffinitätschromatographie eingesetzt werden (Practical Immunology, Backwell Scientific Publications, 1989, L. Hudson and F. C. Hay; Current Protocols in Immunology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Interscience, 1992, Ed. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies and W. Strober).

Dazu werden die monoklonalen Antikörper zunächst entweder direkt kovalent oder auch indirekt über z. B. Anti-Immunglobulin-Antikörper an einen festen Träger (wie z. B. Sepharose 4B oder einen ähnlichen für ähnliche Zwecke eingesetzten Träger) gebunden. An diese Träger-gebundenen Antikörper werden dann bei Inkubation mit Phagen-haltiger Lösung die Phagen, jedoch keine anderen Substanzen, gebunden. Die Phagen können nach Auswaschen der nichtgebundenen Substanzen in an sich bekannter Weise wieder als reine Präparation abgetrennt werden.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der monoklonalen Anti- Phagen-Antikörper entweder direkt oder indirekt an magnetische Kügelchen. Nach Inkubation der Antikörper-beladenen Kügelchen mit Phagen-haltigen Lösungen werden die Phagen gebunden. Die beladenen Kügelchen können dann mit Hilfe eines Magneten abgetrennt werden, wonach in an sich bekannter Weise die Phagen isoliert werden können.

Diese Abläufe machen die Gewinnung von Antigen- und/oder Antikörper- exprimierenden Phagen möglich.

Durch die Erfindung wird es ermöglicht, den Nachweis filamentöser Phagen exakter als bisher durchzuführen. Der Einsatz der erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper sichert, daß eine immunologische Reaktion mit einem filamentösen Phagen definitiv nur mit einem Epitop des Hauptstrukturproteins (pVIII), das als Hüllprotein fungiert, und nicht mit einem anderen Phagenprotein, das für die Vermehrung des Phagen essentiell sein könnte, erfolgt. Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper sind besonders geeignet für Nachweisverfahren in unterschiedlichen immunologischen Tests, da sie reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse mit unterschiedlichen Proben liefern. Diese Tests sind darüber hinaus in der Herstellung letztendlich billiger als bei Einsatz von polyklonalen Antikörpern.

Die Erfindung soll nachstehend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1 Herstellung der Hybridzellinien B62-EA11, B62-FE2 und B62-GF3 Isolierung der filamentösen fd-Phagen für die Immunisierung

Die fd-Phagen wurden aus dem Kulturüberstand infizierter Bakterien eines apathogenen E. coli-Stammes mit Fertilitätsplasmid (F⁺), vorzugsweise des Laborstammes JM 109 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, J. Sambrook, E. F. Frisch and T. Maniatis). Dazu wurde eine Bakterienkolonie in M9-Mangelmedium mit Thiamin und Glukose zunächst vermehrt, dann bei einer Zelldichte, die 0,1 optischen Einheiten bei einer Wellenlänge von 600 nm entspricht, in 2YT-Medium mit 10⁹-10¹⁰ pfu (plaque forming units, Plaque-bildenden Einheiten) pro 100 ml einer fd-Phagenkultur infiziert. Nach einer Kultivierung von 4-5 Stunden bei 37°C wurden die Phagen nach Abtrennung der Bakterien und Bakterienbruchstücke durch zweimalige Fällung mit Hilfe von Polyethylenglycol (PEG 8000) in NaCl und anschließender Zentrifugation (10 000×g) gewonnen.

Die fd-Phagen wurden in TRIS/EDTA-Puffer aufgenommen und erneut präzipitiert. Der Protein- und DNA-Gehalt im Pellet wurde mit an sich bekannten Methoden bestimmt.

Immunisierung

Für die Immunisierung gegen filamentöse fd-Phagen wurden männliche Balb/c- Mäuse verwendet.

Die Mäuse wurden nach folgendem für verschiedene Antigene erprobtem Schema (Micheel, B., and Scharte, G., Hybridoma, 12, 1993) immunisiert:

Erstimmunisierung durch intraperitoneale Injektion von 50 µg Phagenpräparat (gemessen auf Proteinbasis) in 50 µl Phosphat-gepufferter Salzlösung gemischt mit 50 µl komplettem Freundschem Adjuvans (CFA), nach 2 bis 3 Monaten Nachimmunisierung einer Maus mit der gleichen Phagenmenge ohne jegliches Adjuvans durch intraperitoneale Injektion. 7 Tage danach wurde dem Tier Blut entnommen und ein Immuntest zum Nachweis von Anti-Phagen-Antikörpern im Serum durchgeführt (siehe unten). Bei Anwesenheit von Anti-Phagen-Antikörpern wurde ein zweites Tier aus der gleichen Versuchsreihe nachimmunisiert. 4 Tage später wurden von diesem Tier Milzzellen isoliert und mit Zellen der Maus-Myelomlinie X63-Ag8.653 (Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. J., Immunology, 123, 1558, 1979) fusioniert.

Fusion

Die Fusion der Milzzellen mit den Myelomzellen wurde mit Polyethylenglykol 1550 durchgeführt. Dazu wurden 6×10⁷ Milzzellen mit 6×10⁷ Myelomzellen gemischt und durch PEG-Zugabe in einer Modifikation der ursprünglichen Methode fusioniert. Anschließend wurden die Zellen in insgesamt 10 Mikrotitrationsplatten mit Feederzellen ausgesät und für eine Woche in HAT- Medium (Hypoxanthin, Azaserin und Thymidin enthaltendes Selektionsmedium) kultiviert, in dem nur die fusionierten Hybridzellen auswachsen können.

Zur Kontrolle wurde eine Kultur der ursprünglichen Milzzellen angelegt und für eine Woche kultiviert.

Die Kulturüberstände der Milzzellkultur sowie der gewachsenen Hybridzellkolonien wurden dann auf die Anwesenheit von Anti-Phagen- Antikörpern getestet (siehe unten).

Die in den Immuntests positiv reagierenden Hybridzellklone wurden durch Einzelzellverdünnung kloniert, in der Zellkultur erweitert und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Die selektierten Hybridzellklone B62-EA11, B62-FE2 und B62-GF3 zeigten ein gutes Wachstum und eine stabile Antikörperproduktion.

Beispiel 2 Immunologische Tests mit den monoklonalen Anti-Phagen-Antikörpern Test zum Nachweis der Produktion von Anti-Phagen-Antikörpern in den Seren immunisierter Tiere und im Kulturüberstand der Milzkulturen und der Hybridzellklone

Die Tests wurden als Festphasen-Immuntests in folgender Weise durchgeführt:
Adsorption von 50 µl einer Lösung mit 10 µg/ml fd-Phagen-haltigem Überstand aus infizierten Bakterienkulturen (E. coli, Stamm JM 109) an die feste Phase,

1. Inkubation mit dem Serum immunisierter Mäuse bzw. den zu testenden Kulturüberständen,
2. Inkubation mit Biotin-markiertem Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin (Boehringer Mannheim, Verdünnung 1:10 000 in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 10% neonatalem Kälberserum, PBS/NKS),
3. Inkubation mit Streptavidin-β-Galactosidase-Konjugat (Boehringer Mannheim, Verdünnung 1 : 3000 in PBS/NKS),
4. Inkubation mit 4-Methylumbelliferyl-β-_D-Galactosid (1 mg/ml in PBS mit 1,7 mM MgCl₂ und 0,1 M β-Merkaptoethanol).

Als Kontrolle wurden parallel die gleichen Tests mit dem Überstand aus nicht mit Phagen infizierten Bakterienkulturen (E. coli, Stamm JM 109; Kontrollpräparat), adsorbiert an die feste Phase, durchgeführt.

Die Inkubationen erfolgten für 1,5 Stunden bei 37°C in Mikrotitrationsplatten. Nach jeder Inkubation wurde mit Wasser gewaschen. Die Auswertung erfolgte durch Messung der Fluoreszenz in einem Fluorometer (Fluoreskan II, Labsystems).

Von den mehr als 10 000 insgesamt gewachsenen Hybridzellklonen produzierten letztendlich die drei Klone B62-EA11, B62-FE2 und B62-GF3 monoklonale Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften, einschließlich der gewünschten Spezifität (Tabelle 1).

Tabelle 1

Reaktion der monoklonalen Antikörper mit filamentösen fd-Phagen im Festphasen-Immunbindungstest, Ergebnisse in Fluoreszenzeinheiten

Nachweis des Isotyps der monoklonalen Anti-Phagen-Antikörper

Der Isotyp, das heißt die Klasse bzw. Subklasse der monoklonalen Anti- Phagen-Antikörper wurde mit einem Festphasen-Immuntest mit folgenden Inkubationsschritten bestimmt:
Ziege-Anti-Maus-Immunglobulin, adsorbiert an die feste Phase (10 µg/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung),

1. Inkubation mit den Antikörper-haltigen Kulturüberständen und mit Biotin- markiertem Klassen- bzw. Subklassen-spezifischen Ziege-Anti-Maus- Immunglobulin-Antikörpern (Serva),
2. Inkubation mit Streptavidin-β-Galactosidase-Konjugat (Boehringer Mannheim, Verdünnung 1:3000 PBS/NKS),
3. Inkubation mit 4-Methylumbelliferyl-β-_D-Galactosid (1 mg/ml in PBS mit 1,7 mM MgCl₂ und 0,1 M β-Mercaptoethanol).

Die Inkubationen erfolgten für 1,5 Stunden bei 37°C in Mikrotitrationsplatten, nach jeder Inkubation wurde mit Wasser gewaschen. Die Auswertung erfolgte durch Messung der Fluoreszenz in einem Fluorometer (Fluoreskan II, Labsystems).

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, gehören die von den 3 Hybridzellklonen produzierten Anti-Phagen-Antikörper zu folgenden IgG-Subklassen:
B62-EA11, IgG2a, B62-FE2, IgG2b und B62-GF3, IgG1.

Tabelle 2

Nachweis des Isotyps der monoklonalen Anti-Phagen-Antikörper im Zwei- Seiten-Festphasen-Immuntest, Ergebnisse in Fluoreszenzeinheiten

Tests zum Nachweis der Feinspezifität der monoklonalen Anti-Phagen- Antikörper

Der Nachweis der Reaktivität der monoklonalen Anti-Phagen-Antikörper mit Epitopen des pVIII-Proteins erfolgte mit Hilfe der Immunelektronenmikroskopie nach folgendem Inkubationsschema:

Die Phagen wurden an einen mit Pentylamin aktivierten Formvar-Kohle-Träger adsorbiert (Dubochet, J., Duconmun, M., Zollinger, M., Kellenberger, E., J. Ultrastruct. Res., 55, 147, 1971) und anschließend wurden folgende Inkubationen mit den Antikörpern durchgeführt:

1. Inkubation mit den Anti-Phagen-Antikörper enthaltenden Kulturüberständen,
2. Inkubation mit Gold-markierten Ziege-Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpern (DIANOVA; Durchmesser der kolloidalen Goldpartikel, 12 nm; 1:40 verdünnt in PBS).

Zwischen den Inkubationen wurde mit PBS gewaschen. Anschließend wurde mit Uranylacetat (2%) kontrastiert; danach erfolgte die elektronenmikroskopische Auswertung mit einem EM 400 (Philips).

Mit allen drei monoklonalen Anti-Phagen-Antikörpern (B62-EA11, B62-FE2 und B62-GF3) wurde eine über den gesamten Phagen verteilte gleichmäßige Goldmarkierung beobachtet, die für die Reaktion der Antikörper mit Epitopen des pVIII-Proteins spricht, da das pVIII-Protein die Phagen in ihrer gesamten Länge bedeckt.

Abb. 1

Immunelektronenmikroskopischer Nachweis der Reaktion eines monoklonalen Anti-Phagen-Antikörpers (B62-FE2) mit Epitopen des pVIII-Proteins (Hauptstrukturprotein an der Phagenoberfläche) eines filamentösen fd-Phagen, Goldkörnchen kennzeichnen die Antikörperbindung.

Nachweis der Anwendbarkeit der Antikörper für weitere filamentöse Phagen der fd-Gruppe

Die Reaktivität der Antikörper wurde in den oben beschriebenen Festphasen- Immuntests ebenfalls mit dem Phagen M13 und der M13-Variante K07 überprüft. Es wurden keine Unterschiede in der Bindung festgestellt. In einem Zwei-Seiten-Bindungstest wurde gezeigt, daß die monoklonalen Anti- Phagen-Antikörper und ein kommerziell erhältlicher polyklonaler Schaf-Anti- M13-Antikörper mit den gleichen Phagenpartikeln reagieren können.

Damit sind die erhaltenen Antikörper für den Nachweis und die Isolierung und Reinigung sowohl der fd-Phagen als auch der anderen filamentösen Phagen einsetzbar.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen filamentöse Phagen, Phagenproteine, -peptide oder andere -derivate mittels klonierter Hybridzellen, die hergestellt werden durch:
A. Isolierung von filamentösen Phagen aus dem Überstand infizierter E. coli- Bakterien,
B. Immunisierung von Versuchstieren, in erster Linie von Mäusen, mit den filamentösen Phagen bzw. mit Phagenproteinen, -peptiden oder anderen -derivaten,
C. Isolierung von Lymphozyten aus dem Versuchstier und Immortalisierung der Lymphozyten durch Zellfusion mit geeigneten Myelomzellen bzw. eine andere geeignete Immortalisierungsmethode,
D. Selektion der immortalisierten Zellklone,
E. Testen der immortalisierten Zellklone auf die Produktion von Antikörpern gegen die filamentösen Phagen,
F. Isolierung der Zellen aus den Kulturen, die Antikörper gegen filamentöse Phagen produzieren, Vermehrung dieser Zellklone und Gewinnung der von diesen Zellen produzierten spezifischen Antikörper,
G. Ermittlung der Feinspezifität der Antikörper gegen die filamentösen Phagen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als filamentöse Phagen fd-Phagen oder andere Phagen dieser Gruppe, wie z. B. M13, f1, ZJ/2 etc. bzw. Phagenproteine, -peptide oder andere -derivate eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß isolierte Phagen zur Immunisierung von Mäusen, vorzugsweise von BALB/c-Mäusen benutzt werden.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen für die Zellfusion vorzugsweise Zellinien der Linie X63-Ag8.653 verwendet werden.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellfusion vorzugsweise mit Hilfe von Polyethylenglykol (PEG) durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die fusionierten Zellen vorzugsweise durch ein selektives Kulturmedium isoliert werden.

7. Monoklonale Antikörper gegen filamentöse Phagen, hergestellt durch Vermehrung von Hybridomzellklonen, die nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 hergestellt werden.

8. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 7 gegen Epitope des Hauptstrukturproteins pVIII in der Hülle der filamentösen Phagen.

9. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 7 und 8, hergestellt durch Vermehrung der Hybridzellinie B62-EA11.

10. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 7 und 8, hergestellt durch Vermehrung der Hybridzellinie B62-FE2.

11. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 7 und 8, hergestellt durch Vermehrung der Hybridzellinie B62-GF3.

12. Hybridzellinien B62-EA11, B62-FE2 und B62-GF3, hergestellt nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6.

13. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11 als Nachweisreagenzien.

14. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11 als Reagenzien zum Nachweis von filamentösen Phagen der Gruppe fd, M13, f1, ZJ/2 etc., Phagenproteinen, -peptiden oder anderen -derivaten.

15. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11 als Nachweisreagenzien in einem immunologischen Test.

16. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11 als Isolierungs- und Reinigungsreagenzien.

17. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11 als Reagenzien zur Isolierung und Reinigung von filamentösen Phagen der Gruppe fd, M13, f1, ZJ/2 etc., Phagenproteinen, -peptiden oder anderen -derivaten.

18. Verwendung der gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11 als Reagenzien zum Nachweis und/oder zur Isolierung und Reinigung von Phagen, die in der rekombinanten Proteintechnik Antikörpergene in die pIII-Region integriert haben und an der Oberfläche in der pIII-Region Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen ein spezifisches Antigen exprimieren (sog. Antikörper-Phagen).

19. Verwendung der gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11 als Reagenzien zum Nachweis und/oder zur Isolierung und Reinigung von Phagen, die in der rekombinanten Proteintechnik Antigengene in die pIII-Region integriert haben und die Antigene bzw. Epitope dieser Antigene an der Oberfläche in der pIII-Region exprimieren (sog. Antigen-Phagen).