DD271709A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen pmsg - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen unterschiedliche Epitope des PMSG (Pregnant Mares Serum Gonadotrophin). Das Verfahren hat das Ziel, in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen von monoklonalen Antikoerpern, die mit unterschiedlichen Epitopen des PMSG spezifisch reagieren, zu ermoeglichen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunaechst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome werden in anschliessenden Verfahrensschritten monoklonale Antikoerper erzeugt, die mit PMSG spezifisch reagieren, wobei einzelne monoklonale Antikoerper die biologische Wirkung des PMSG blockieren und andere zwar das Hormon binden, aber seine biologische Wirkung nicht oder nur partiell beeinflussen. Die Hybridome H-BL-PMSG/1 bis 3 (ZIM 0272,0271,0270) produzieren solche spezifischen Antikoerper bei Kultivierung in vitro und in vivo, so dass die monoklonalen Antikoerper BL-PMSG/1 bis 3 unaufwendig gewonnen werden koennen. Der monoklonale Antikoerper BL-PMSG/1 blockiert die biologische Funktion des Hormons, waehrend die anderen diese Wirkung nicht oder nur partiell behindern und mit anderen Epitopen reagieren. Die monoklonalen Antikoerper eignen sich zu einem Zweiseiten - Enzymimmunassay, zur Hormonneutralisation und zur affinitaetschromatographischen Isolierung des PMSG. Anwendungsgebiete sind die veterinaermedizinische Diagnostik und biotechnologische Verfahren zur Beeinflussung des Sexualzykluses von Nutztieren.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch mit PMSG reagieren. Die monoklonaien Antikörper können zur quantitativen Bestimmung von PMSQ du'ch einen Enzymimmunassay in der veterinärmedizinischen Diagnostik, zur affinitatschromatographischen Isolierung und Hochreinigung dieses Hormons, aber auch zur Steuerung des Sexualzyklus von weiblichen Nutztieren eingesetzt werden.

Charakterisierung der bekannten technischen Lönungen

Zur Wertbemessung von PMSG-Präparaten werden ausschließlich Bioassays eingesetzt, die kosten- und zehaufwendig, ungenau, schlecht standarisierbar und ethisch anfechtbar sind. Die alternative Wertbemessung des PMSG mittels radio- oder enzymimmunologischer Methoden setzt einen hohen Reinheitsgrad der Reagenzien voraus, der auf konventionellem Wege, d. h. durch chromatographische Reinigung bzw. durch Immunisierung von Tieren nicht oder nur mit unvertretbar hohem Aufwand erreichbar ist. Dies liegt offenbar in erster Linie an der Erfassung von PMSG bzw. von Bestandteilen des Hormons, die zwar noch antigen sind, aber keine biologische Wirkung aufweisen. Mittels konventioneller Antiseren gelingt die Unterscheidung von wirksamen und unwirksamen Komponenten des PMSG nicht, auch ist eine molekulare Differenzierung damit nicht möglich. Außerdem besitzen solche konventionellem Antiseren gene;eil eine Reihe weiterer Nachteile, so sind An'iseren von differenten Tieren nicht identisch, im Gegenteil, es können beträchtliche Unterschiede hinsichtlich des Gehaltes an Antikörpern, in quantitativer und qualitativer Hinsicht, bestehen. Diese Schwenkungen und die Chargenabhängigkeit der Antiseren erlauben keine durchgehende Standardisierung der auf ihnen aufbauenden Assays.

Monokionale Antikörper, die von permanent wachsender, und produzierenden Hybridomen sezerniert werden, stehen in praktisch ausreichender Menge i/nd über einen theoretisch unbegrenzten Zeitraum zur Verfügung, so daß sich auf ihrer Grundlage reproduzierbare und standardisierbare Immunassays aufbauen lassen.

Es ist bereits bekannt, wie monokionale Antikörper hergestellt werden. Die Prinziplösung der Hybridomherstellung wurde von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, [1975], S.495) beschrieben

Es sind aber bisher keine monoklonalen Antikörper gogen PMSG beschrieben worden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper gegen PMSG gestattet. Die monoklonalen Antikörper sollen sich sowohl zur quantitativen Bestimmung von PMSG mittels eines Radio- oder Enzymimmunassays als auch zur affinitatschromatographischen Isolierung und Hochreinigung nach Ankopplung an einen festen Träger eignen.

Durch die Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper (toll die Produktionskontrolle und die Herstellung von

hochgeroinigten, indikationspezifischen PMSG-Präparaten wesentlich verbessert werden.

Durch die Injektion geeigneter monokonaler Antikörper in weibliche Nutztiere soll eine Steuerung des Sexualzykluses verbessert

werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe-zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren zur Herstellung monok.onaler Antikörper gegen PMSG anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendlg handha^u' tar sind und

deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter der Verwendung dieser Hybridome sollenin anschließenden Verfahrensschritten monoklonal Antikörper erzeugt werden, die mit PMSG spezifisch reagieren und sich zurquantitativen Bestimmung, zur Isolierung sowie zur partiellen oder vollständigen Blockierung der biologischen Aktivität des

PMSG eignen. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach den bekannten Verfahren isoliertes PMSG kovalent an Hämozyanin

gekoppelt wird und dieses hochmolekulare Konjugat als Immunogen zur Immunisierung verwendet wird. Vorzugsweise werden6-8 Wochen arte weibliche BALB/c-Mäuse zur Immunleieru ng verwendet. Die Hyperimmunisierung der Tiere wird durchmehrmalige Gabo des Immunogens induziert.

Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dioses Zellgemisches werden mit murinen Myelomzellen fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], S. 1548) werden in RPMM640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS)

gezogen.

Die Fusion wird durch Polyethylenglykol oder durch Feldsprungtechnik ausgelöst. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Amlnopterin undThymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], S. 709),

werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zeilkloneselektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität und der anderen gewünschten Eigenschaften sezernieren. Die Selektionerfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 20O-Ml-Kulturen aufgeteiltwerden.

Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern

getestet, die sich an festphasenadsorbiertes PMSG binden. Hierzu werden die Kulturüberstände mit Einern entsprechenden

Enzymimmunassay getestet. Durch Gegentestung mit einer geeigneten Palette von anderen Substanzen wird die Spezifität für

das PMSG nachgewiesen.

Unter den antikörperproduzierenden Hybridomen werden dann in einem zweiten Selektionsschritt diejenigen Hybridome

ausgewählt, deren Antikörper auch in der Lage sind, nach Bindung an eine feste Phase, z. B. an Plastoberflächen, die mit Anti-

Mausimmunglobulln beschichtet worden sind, PMSG aus einem Gemisch spezifisch, mit hoher Effektivität zu isolieren. Die Testung, ob PMSG aus dem Testgemisch isoliert wurde, erfolgt mittels Bioassay. In einen weiteren Selektionsschritt wird getestet, ob die monoklonalen Antikörper auch die biologische Wirkung des PMSG

blockieren können.

Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die

gewünschten monoklonalen Antikörper stabil in hoher Konzentration sezernieren. Die so erhaltenen Hybridome erhielten die

Bezeichnung H-BL-PMSG/1 bis 3. Die Herstellung dei monoklonalen Antikörper BL-PMSG/1 bis 3 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- oder In-vivo-Kultur der Hybridome H-BL-PMSG/1 bis 3 ausgerichtet ist. Die Hybridome H-BL-PMSG/1 bis 3 werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert bzw.

liegen kryokonserviert vor und sind Interessenten zugänglich. Die monokonalen Antikörper BL-PMSG/1 bis 3 haben die

Registriernummern ZIM 0272, ZIM 027t und ZIM 0270 im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Der monoklonal Antikörper BL-PMSG/1 weist folgende wertvollen und überraschenden Eigenschaften auf: Er bindet festphasengebundenes und gelöstes PMSG spezifisch, wobei er auch in oberflächengebundener Form PMSG bindet

und damit zur afflnitätschromatographischen Isolierung des PMSG geeignet ist.

Er bindet an einen Epitop (A) des PMSG, der für die biologische Wirkung des PMSG essentiell ist. BL-PMSG/1 blockiert die In vivo-Wirkung von PMSG. Im Gegensatz dazu binden die monoklonalen Antikörper BL-PMSG/2 und BI-PMSG/3 an Epitope des PMSG, die sich von dem PMSG/1-Epitop (A-Epitop) unterscheiden. Beide Antikörper behindern die Bindung von PMSG an den monoklonalen Antikörper BL-PMSG/1 nicht. Sie können somit als Detektio.isreagenzien für PMSG, welches durch BL-PMSG/1 isoliert wurde, in ehern Enzym- oder Radioimmunassay vorteilhaft eingesetzt werden BL-PMSG/2 und BL-PMSG/3 reagieren dabei ihrerseits mit unabhängigen Epitopen des PMSG, so daß sie bei gleichzeitiger Anwendung als Detektionsantikörper eine Sensitivitätssteigerung bzw. bei alternativem Einsatz die differentielle Diagnostik und Abtrennung ermöglichen. Ausführungsbelspid Testung der Bindung der monoklonalen Antikörper an verschiedene Substanzen

1. Mikrotlterplatten aus Polystyren werden mit verschiedenen Hormonen und Serumprpteinen beschichtet. Dazu werden die Kavitäten der Platte mit 0,25ml der Antigene (1 bis 50mg/l), in Karbonatpuffer (0,1 mol/l, pH 9,6) gelöst, gefüllt und für 2h bei Raumtemoeratur oder 16h bei +4⁰C inkubioit. Im Anschluß werden die Kavitäten ausgesaugt unc dreimal mit je 0,3 ml PBS (0,15 mol/l NaCI, 0,01 mo!/l Phosphat, pH 7,4) gewaschen.

2. Die antikörperhaltigen Lösungen (Zellkulturüberstand oder Asches) werden in unterschiedlichen Verdünnungen in die Kavitäten der beschichteten Platte gefüllt (jeweils 100μΙ) und für 2 h bei Raumtemperatur gehalten, anschließend abgesaugt und dreimal mit je 0,3 ml PBS/0,05% Tween 80 gewaschen.

3. Zugabe von ΙΟΟμΙ POD-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern. Nach einer Reaktion von 2h bei Raumtemperatui werden die Kavititen abgesaugt und, wie unter 2 angegeben, gewaschen.

4. Inkubation mil 0,2 ml Substrat-Chromogen-Geniisch, bestehend aus H₂Oi und o-Phenyldiamin, Abstoppen der Reaktion nach ausreichender Entwicklungszeit (15-45min) mit ΙΟΟμΙ H₂SO₄ (5mol/l) und Messung der Extinktion bei 492nm.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von mor.oklonalen Antikörpern gegen verschiedene Epltope des PMSG (Pregnant Mare's Serum Gonadotropin) durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit PMSG, Fusion der aus der Milz gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonale Antikörper sezornieren, die spezifisch mit Epitopen des PMSG reagieren/dadurch gekennzeichnet, daß ein kovalent gekoppeltes PMSG-Carrierkonjugat als Immunogen verwendet wird, durch die Gestaltung derTesthierarchie die HyL ridorne H-BL-PMSG/1 bis 3 ausgewählt werden, deren momnoklonale Antikörper spezifisch mit unterschiedlichen Epitopen des PMSG reagieren, so daß einzelne Glieder der Serie monoklonaler Antikörper sowohl die Hormonwirkung partiell oder vollständig blockieren als auch diese Wirkung nicht beeinflussen, indem in dem ersten Selektionaschritt ein Assay verwendet wird, der monokionale Antikörper mit besonderer Eignung ais Detektionsreagensfürfestphasengebundenes PMSG erkennt, woran sich ein zweiter Selektionsschritt anschließt, mit dessen Hilfe Hybridome aufgefunden werden, deren monokionale Antikörper in festphasengebundener Form PMSG aus einem Gemisch spezifisch und effektiv isolieren, gefolgt von einem Selektionsschritt, bei dem Antikörper aufgefunden werden können, die in einem PMSG-spezifischen Bioassay die Hormonwirkung hemmen, und schließlich in einem vierten Selektiönsschritt nachgewiesen wird, daß die Glieder der Serie monoklonaler Antikörper unterschiedliche Epitope erkennen und sich wechselseitig nicht behindern, wobei die morjoklonalen Antikörper BL-PMSG/1 bis 3 als vorteilhaft einsetzbar erkannt werden und zur Kultivierung bzw. Transplantation und damit zur Gewinnung dieser monoklonalen Antikörper die Hybridome H-BL-PMSG/1 (ZIM 0272), H-BL-PMSG/2 (ZIM 0271), und H-BL-PMSG/3 (ZIM 0270) eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung der BALB/c-Mäuse ein kovalentes PMSG-Hämozyanin-Konjugat verwendet wird.