DD271709A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen pmsg - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen unterschiedliche Epitope des PMSG (Pregnant Mares Serum Gonadotrophin). Das Verfahren hat das Ziel, in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen von monoklonalen Antikoerpern, die mit unterschiedlichen Epitopen des PMSG spezifisch reagieren, zu ermoeglichen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunaechst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome werden in anschliessenden Verfahrensschritten monoklonale Antikoerper erzeugt, die mit PMSG spezifisch reagieren, wobei einzelne monoklonale Antikoerper die biologische Wirkung des PMSG blockieren und andere zwar das Hormon binden, aber seine biologische Wirkung nicht oder nur partiell beeinflussen. Die Hybridome H-BL-PMSG/1 bis 3 (ZIM 0272,0271,0270) produzieren solche spezifischen Antikoerper bei Kultivierung in vitro und in vivo, so dass die monoklonalen Antikoerper BL-PMSG/1 bis 3 unaufwendig gewonnen werden koennen. Der monoklonale Antikoerper BL-PMSG/1 blockiert die biologische Funktion des Hormons, waehrend die anderen diese Wirkung nicht oder nur partiell behindern und mit anderen Epitopen reagieren. Die monoklonalen Antikoerper eignen sich zu einem Zweiseiten - Enzymimmunassay, zur Hormonneutralisation und zur affinitaetschromatographischen Isolierung des PMSG. Anwendungsgebiete sind die veterinaermedizinische Diagnostik und biotechnologische Verfahren zur Beeinflussung des Sexualzykluses von Nutztieren.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch mit PMSG reagieren. Die monoklonaien Antikörper können zur quantitativen Bestimmung von PMSQ du'ch einen Enzymimmunassay in der veterinärmedizinischen Diagnostik, zur affinitatschromatographischen Isolierung und Hochreinigung dieses Hormons, aber auch zur Steuerung des Sexualzyklus von weiblichen Nutztieren eingesetzt werden.
Zur Wertbemessung von PMSG-Präparaten werden ausschließlich Bioassays eingesetzt, die kosten- und zehaufwendig, ungenau, schlecht standarisierbar und ethisch anfechtbar sind. Die alternative Wertbemessung des PMSG mittels radio- oder enzymimmunologischer Methoden setzt einen hohen Reinheitsgrad der Reagenzien voraus, der auf konventionellem Wege, d. h. durch chromatographische Reinigung bzw. durch Immunisierung von Tieren nicht oder nur mit unvertretbar hohem Aufwand erreichbar ist. Dies liegt offenbar in erster Linie an der Erfassung von PMSG bzw. von Bestandteilen des Hormons, die zwar noch antigen sind, aber keine biologische Wirkung aufweisen. Mittels konventioneller Antiseren gelingt die Unterscheidung von wirksamen und unwirksamen Komponenten des PMSG nicht, auch ist eine molekulare Differenzierung damit nicht möglich. Außerdem besitzen solche konventionellem Antiseren gene;eil eine Reihe weiterer Nachteile, so sind An'iseren von differenten Tieren nicht identisch, im Gegenteil, es können beträchtliche Unterschiede hinsichtlich des Gehaltes an Antikörpern, in quantitativer und qualitativer Hinsicht, bestehen. Diese Schwenkungen und die Chargenabhängigkeit der Antiseren erlauben keine durchgehende Standardisierung der auf ihnen aufbauenden Assays.
Monokionale Antikörper, die von permanent wachsender, und produzierenden Hybridomen sezerniert werden, stehen in praktisch ausreichender Menge i/nd über einen theoretisch unbegrenzten Zeitraum zur Verfügung, so daß sich auf ihrer Grundlage reproduzierbare und standardisierbare Immunassays aufbauen lassen.
Es ist bereits bekannt, wie monokionale Antikörper hergestellt werden. Die Prinziplösung der Hybridomherstellung wurde von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, [1975], S.495) beschrieben
Es sind aber bisher keine monoklonalen Antikörper gogen PMSG beschrieben worden.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper gegen PMSG gestattet. Die monoklonalen Antikörper sollen sich sowohl zur quantitativen Bestimmung von PMSG mittels eines Radio- oder Enzymimmunassays als auch zur affinitatschromatographischen Isolierung und Hochreinigung nach Ankopplung an einen festen Träger eignen.
hochgeroinigten, indikationspezifischen PMSG-Präparaten wesentlich verbessert werden.
werden.
deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter der Verwendung dieser Hybridome sollenin anschließenden Verfahrensschritten monoklonal Antikörper erzeugt werden, die mit PMSG spezifisch reagieren und sich zurquantitativen Bestimmung, zur Isolierung sowie zur partiellen oder vollständigen Blockierung der biologischen Aktivität des
gekoppelt wird und dieses hochmolekulare Konjugat als Immunogen zur Immunisierung verwendet wird. Vorzugsweise werden6-8 Wochen arte weibliche BALB/c-Mäuse zur Immunleieru ng verwendet. Die Hyperimmunisierung der Tiere wird durchmehrmalige Gabo des Immunogens induziert.
gezogen.
werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zeilkloneselektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität und der anderen gewünschten Eigenschaften sezernieren. Die Selektionerfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 20O-Ml-Kulturen aufgeteiltwerden.
getestet, die sich an festphasenadsorbiertes PMSG binden. Hierzu werden die Kulturüberstände mit Einern entsprechenden
das PMSG nachgewiesen.
ausgewählt, deren Antikörper auch in der Lage sind, nach Bindung an eine feste Phase, z. B. an Plastoberflächen, die mit Anti-
blockieren können.
gewünschten monoklonalen Antikörper stabil in hoher Konzentration sezernieren. Die so erhaltenen Hybridome erhielten die
liegen kryokonserviert vor und sind Interessenten zugänglich. Die monokonalen Antikörper BL-PMSG/1 bis 3 haben die
und damit zur afflnitätschromatographischen Isolierung des PMSG geeignet ist.
1. Mikrotlterplatten aus Polystyren werden mit verschiedenen Hormonen und Serumprpteinen beschichtet. Dazu werden die Kavitäten der Platte mit 0,25ml der Antigene (1 bis 50mg/l), in Karbonatpuffer (0,1 mol/l, pH 9,6) gelöst, gefüllt und für 2h bei Raumtemoeratur oder 16h bei +40C inkubioit. Im Anschluß werden die Kavitäten ausgesaugt unc dreimal mit je 0,3 ml PBS (0,15 mol/l NaCI, 0,01 mo!/l Phosphat, pH 7,4) gewaschen.
2. Die antikörperhaltigen Lösungen (Zellkulturüberstand oder Asches) werden in unterschiedlichen Verdünnungen in die Kavitäten der beschichteten Platte gefüllt (jeweils 100μΙ) und für 2 h bei Raumtemperatur gehalten, anschließend abgesaugt und dreimal mit je 0,3 ml PBS/0,05% Tween 80 gewaschen.
3. Zugabe von ΙΟΟμΙ POD-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern. Nach einer Reaktion von 2h bei Raumtemperatui werden die Kavititen abgesaugt und, wie unter 2 angegeben, gewaschen.
4. Inkubation mil 0,2 ml Substrat-Chromogen-Geniisch, bestehend aus H2Oi und o-Phenyldiamin, Abstoppen der Reaktion nach ausreichender Entwicklungszeit (15-45min) mit ΙΟΟμΙ H2SO4 (5mol/l) und Messung der Extinktion bei 492nm.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von mor.oklonalen Antikörpern gegen verschiedene Epltope des PMSG (Pregnant Mare's Serum Gonadotropin) durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit PMSG, Fusion der aus der Milz gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonale Antikörper sezornieren, die spezifisch mit Epitopen des PMSG reagieren/dadurch gekennzeichnet, daß ein kovalent gekoppeltes PMSG-Carrierkonjugat als Immunogen verwendet wird, durch die Gestaltung derTesthierarchie die HyL ridorne H-BL-PMSG/1 bis 3 ausgewählt werden, deren momnoklonale Antikörper spezifisch mit unterschiedlichen Epitopen des PMSG reagieren, so daß einzelne Glieder der Serie monoklonaler Antikörper sowohl die Hormonwirkung partiell oder vollständig blockieren als auch diese Wirkung nicht beeinflussen, indem in dem ersten Selektionaschritt ein Assay verwendet wird, der monokionale Antikörper mit besonderer Eignung ais Detektionsreagensfürfestphasengebundenes PMSG erkennt, woran sich ein zweiter Selektionsschritt anschließt, mit dessen Hilfe Hybridome aufgefunden werden, deren monokionale Antikörper in festphasengebundener Form PMSG aus einem Gemisch spezifisch und effektiv isolieren, gefolgt von einem Selektionsschritt, bei dem Antikörper aufgefunden werden können, die in einem PMSG-spezifischen Bioassay die Hormonwirkung hemmen, und schließlich in einem vierten Selektiönsschritt nachgewiesen wird, daß die Glieder der Serie monoklonaler Antikörper unterschiedliche Epitope erkennen und sich wechselseitig nicht behindern, wobei die morjoklonalen Antikörper BL-PMSG/1 bis 3 als vorteilhaft einsetzbar erkannt werden und zur Kultivierung bzw. Transplantation und damit zur Gewinnung dieser monoklonalen Antikörper die Hybridome H-BL-PMSG/1 (ZIM 0272), H-BL-PMSG/2 (ZIM 0271), und H-BL-PMSG/3 (ZIM 0270) eingesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung der BALB/c-Mäuse ein kovalentes PMSG-Hämozyanin-Konjugat verwendet wird.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD31520288A DD271709B1 (de) | 1988-04-29 | 1988-04-29 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen pmsg |
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DD31520288A DD271709B1 (de) | 1988-04-29 | 1988-04-29 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen pmsg |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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DD271709A1 true DD271709A1 (de) | 1989-09-13 |
DD271709B1 DD271709B1 (de) | 1990-10-24 |
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ID=5598797
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DD (1) | DD271709B1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102876634A (zh) * | 2012-09-19 | 2013-01-16 | 中国农业大学 | 孕马血清促性腺激素双抗体夹心elisa试剂盒 |
-
1988
- 1988-04-29 DD DD31520288A patent/DD271709B1/de not_active IP Right Cessation
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN102876634A (zh) * | 2012-09-19 | 2013-01-16 | 中国农业大学 | 孕马血清促性腺激素双抗体夹心elisa试剂盒 |
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DD271709B1 (de) | 1990-10-24 |
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