DD241823A3 - Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Alpha-Fetoprotein - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Alpha-FetoproteinInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen verschiedene Antigendeterminanten des humanen Alpha-Fetoproteins (AFP). Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Antikoerpern hoher Spezifitaet und starker Bindungsfaehigkeit in guten Ausbeuten. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man zunaechst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb-c-Maeusen, die mit gereinigtem humanen AFP immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikoerperproduzierenden Hybridome selektiert, ihre Antigendeterminantenspezifitaet mit einem Antikoerperinhibitionstest bestimmt, die spezifischen Hybridome auswaehlt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung oder nach Transplantation einsetzt. Die spezifischen Hybridome wurden im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie (Liste 1984) unter folgenden Nummern hinterlegt: 0008, 0010, 0012, 0013, 0015, 0016, 0017, 0018. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Antigendeterminanten des humanen Alpha-Fetoproteins (AFP). Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
AFP ist ein Glykoprotein, das in der Embryonalentwicklung auftritt und im adulten Stadium auf bestimmte Krankheitsbilder hinweisen kann (primäre Leberzellkarzinome, Teratome, Defekte in der Embryonalentwicklung). Seit 1980 sind monoklonal Antikörper gegen humanes AFP bekannt (u.a. Uotila M., Engvall E., Ruoshlahti E. Molec. Immunol. 1980,77,791-799). Die Herstellung dieser Antikörper erfolgte durch die bekannten Techniken der Zellfusion und Selektion antikörperproduzierender Hybridome. Die Antikörper wurden u. a. zum Nachweis des humanen AFP mit Hilfe von Immuntests eingesetzt (Uotila M., Ruoslahti E., Engvall E., J. Immunol. Meth. 1981,41,11-15). Quantitative Angaben zur Affinität der hergestellten Antikörper wurden von den Autoren nicht gemacht.
Weitere monoklonale Antikörper gegen humanes AFP wurden von M.-H.Stenmanbesch rieben (MT-H.Stenrnan et al, J. Immunol.
Meth. 46 [1981] 337).
Es gibt bisher jedoch noch kein kommerziell vertriebenes Testsystem für humanes AFP auf der Basis monoklonaler Antikörper.
Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper hoher Spezifität und starker Bindungsfähigkeit in guten Ausbeuten herzustellen. Diese Antikörper sollen zum Aufbau eines Testsystems geeignet sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Antigendeterminanten des humanen AFP ist dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit gereinigtem humanen AFP immunisiert wurden, mit X63-Ag 8.653 Myelomzellen in der Zellkultur unter Zusatz vom PEG1500 fusioniert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotestplatten aussät. Die antikörperproduzierenden Hybridome werden mit einem Festphasen-Radioimmuntest nachgewiesen, der folgendermaßen durchgeführt wird: Anti-Maus-Immunglobulin wird an PVC (Tabletten-Blister) gebunden, danach erfolgt eine Inkubation mit dem Kulturüberstand der Hybridome und anschließend mit radioaktiv markiertem (125J) AFP. Die reaktiven Hybridome werden kloniert, ihre Antigendeterminantenspezifität wird erfindungsgemäß mit einem Antikörperinhibitionstest bestimmt. Die spezifischen Hybridome gegen die Hauptantigendeterminante bzw. eine andere diagnostisch relevante Determinante werden ausgewählt, weitervermehrt und, ggf. nach Lagerung in flüssigem Stickstoff, erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung oder nach Transplantation eingesetzt.
Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridome wurden im Zentralinstitut für Molekularbiologie (Liste 1984) unter folgenden Nummern hinterlegt:
0008: Mo9 —ZIK-A34-B/B5
0010: Mo 38 ZIK-A34-A/B4
0012: Mo23ZIK-A34-A/D12
0013: Mo 41 ZIK-A34-B/E 1a
0015: Mo46ZIK-A34-A/E5a
0016: Mo 21 ZIK-A34-A/A5
0017: Mo 11 ZIK-A34-B/F7
0018: Mo43/5ZIK-A43-B/F3
Durch die Erfindung wird die Herstellung von insgesamt 8 monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Antigendeterminanten (Epitope) des diagnostisch relevanten Turmormarkers AFP ermöglicht. Eine solche Palette von Antikörpern hat bisher noch nicht zur Verfügung gestanden. Da diese Antigendeterminanten nicht auf anderen menschlichen Serumproteinen vorkommen, sind die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper von diagnostischer Relevanz
Die Affinität der neuen Antikörper ist höher als die der in der Literatur beschriebenen Antikörper. So zeigt der vom Hybridom Mo 9-ZIK-A34-B/B5 (ZIM 0008) produzierte Antikörper eine Affinität von 8,5 · 109l/Mol, was eine halbe Größenordnung über dem Wert des besten bekannten Antikörpers liegt (1,7 · 109l/Mol bei Stenman et al. J. Immunol. Meth. 46 [1981 ]. 337). Dieser Antikörper zeichnet sich weiterhin durch eine ausgezeichnete Adsorption an Polystyrol aus, wodurch gute Voraussetzungen zum Aufbau eines Testbestecks gegeben sind.
Das Hybridom ZIM 0008 besitzt eine ausgezeichnete Stabilität. Die Antikörperbildung bei Kultivierung in vitro bleibt mindestens Monate ohne Reklonierung konstant, in vivo können die Hybridome bis zu 15 Passagen mit hoher Antikörperausbeute (5-10 mg/ml) transplantiert werden.
Wichtiger Bestandteil der Erfindung ist ferner der Antikörperinhibitionstest zur Selektion der Hybridome, die Antikörper gegen bestimmte Antigendeterminanten des AFP produzieren. Er wird folgendermaßen durchgeführt: Anti-Maus-Immungiobulin wird wie bei der Selektion an fester Phase gebunden, danach erfolgt eine Inkubation mit monoklonalem Antikörper, der mit einer bestimmten Antigendeterminante reagiert (ermittelt aus vorhergehenden Tests mit gleicher Anordnung). Anschließend wird mit normalem Mausserum behandelt und mit radioaktiv (125J)-markierten AFP im Gemisch mit Hybridomkulturüberstand inkubiert. Reagiert der monoklonale Antikörper im Gemisch mit der gleichen Antigendeterminante wie der Antikörper, der an die feste Phase gebunden ist, dann ist keine Radioaktivität an der festen Phase nachweisbar.
Der erfindungsgemäße Test erlaubt die Suche nach monoklonalen Antikörpern gegen bisher nicht nachgewiesene Antigendeterminanten sowie von weiteren Antikörpern besserer Eigenschaften gegen bekannte Antigendeterminanten.
Die Erfindung ermöglicht die Herstellung hochspezifischer Antikörper gegen AFP und damit die Entwicklung von effektiven Testkits für die Tumordiagnostik.
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
1) Herstellung der Hybridome aus Milzzellen von Balb/c Mäusen und X63-Ag8,653 Myelomzellen.
Fusion, Kultivierung, Klonierung etc. nach der Originalarbeit KÖHLER, G. u. C. MILSTEIN, Nature 1975,256,495-497.
Die Myelomlinie X63-Ag8,653 wurde von KEARNY, JF., RADBERUH, A., LIESEGANG, B. u. RAJEWSKY, K., J. Immunol. 1979, 123,1547-1557 hergestellt.
2) Die Selektion Antikörper-produzierender Hybridome wurde nach MICHEEL, B., KARSTEN, U. u. FIEBACH, H., J. Immunol. Meth. 1981,46,41-46 durchgeführt. ^
3) Antikörper-Inhibitions-Test
1 μg Ziege anti-Maus Ig Antikörper (affinitätschromatografisch gereinigt) in 50 μΙ Phosphat-gepufferter Salzlösung werden in jede Vertiefung einer PVC-Platte (Tablettenblister) eingegeben und angetrocknet. Danach wird mit Leitungswasser gewaschen und für etwa 4 Stunden mit der Anti-AFP-Antikörper-haltigen Kulturflüssigkeit von den Hybridomkulturen inkubiert. Nach weiterem Waschen erfolgt eine Behandlung mit 50μ11:10 verdünntem normalen Mausserum für 2 bis 4 Stunden. Nach.erneutem Waschen mit Leitungswasser wird in die Vertiefungen ein Gemisch aus25pl 125J-markiertem AFP (0,5 bis 5ng AFP, 20000cpm) und 1:50 verdünnter Hybridomkulturflüssigkeit gegeben und für weitere 4 bis 12 Stunden inkubiert. Die Vertiefungen werden gewaschen, getrocknet und ausgeschnitten, und in einem Gammastrahlen-Zählgerät wird die gebundene Radioaktivität gemesssen.
Keine gebundene Radioaktivität ist ein Indikator für die Reaktion des an die feste Phase gebundenen und als Inhibitor im Gemisch eingesetzten Antikörpers mit der gleichen Antigendeterminante.
Antigendeterminante
a b c d e f
Die Anzahl der erhaltenen Hybridome weist nach, daß Antigendeterminante a die Hauptdeterminante darstellt. Konventionelle Mausimmunsera gegen AFP haben die höchste Konzentration an Antikörpern gegen die Determinante a.
4) Herstellung der Antikörper
Die ausgewählten spezifischen Hybridome werden zur Herstellung der Antikörper gemäß üblicher Techniken (KENNETT, R. H., McKEARN, T. J. u. BECHTOL, K. B.: Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses. Plenum Press, New York u. London 1981) eingesetzt.
| Anzahl der erhaltenen | Bezeichnung des ermittelten | Immunglobulin |
| Hybridome | Standardantikörpers | klasse |
| 11 | Mo 9 | IgG 2 a |
| 5 | Mo 38 | IgGI |
| 3 | Mo 23 | IgG 1 |
| 4 | Mo41 | IgG 2 a |
| 4 | Mo 46 | IgGi |
| 2 | Mo 21 | IgGi |
| 1 | Mo 11 | IgG 2 a |
| 1 | Mo 43/5 | IgG 2 a |
Claims (2)
- Erfindungsanspruch:1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Alpha-Fetoprotein (AFP) durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit humanem AFP, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomzellen, Selektion der erhaltenen Hybridome, Bestimmung ihrer Antigendeterminatenspezifität. Auswahl der spezifischen Hybridome und ihre Kultivierung bzw. ihre Transplantation auf Mäuse in der Ascitesform, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigendeterminantenspezifität durch einen Antikörperinhibitionstest bestimmt wird und zur Kultivierung bzw. Transplantation die Klone MO 9-ZIK-A34-B/B5 (ZIM-Liste 1984: 0008), MO 38-ZIK-A34-A/B4 (ZIM 0010), MO 23-ZIK-A34-A/D12 (ZIM 0012), MO 41-ZIK-A34-B/E1 a (ZIM 0013), MO 46-ZIK-A34-A/E5a (ZIM 0015), MO 21-ZlK-A34-A/A5 (ZIM 0016), MO 11-ZIK-A34-B/F7 (ZIM 0017), MO 43/5-ZIK-A43-B/F3 (ZIM 0018) eingesetzt werden.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigendeterminantenspezifität der selektierten Hybridome durch Bindung von Anti-Maus-Immunglobulin an fester Phase, Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper, der mit einer bestimmten Antigendeterminante reagiert, Behandlung mit normalem Mausserum und Inkubation mit radioaktiv (125J)-markiertem AFP im Gemisch mit Hybridomkulturüberstand und anschließender Messung der Radioaktivität an der festen Phase bestimmt wird.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AP255A (en) * | 1990-07-23 | 1993-05-05 | Patrick T Prendergast | A method of inoculation with an antigenic peptide. |
Cited By (1)
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| AP255A (en) * | 1990-07-23 | 1993-05-05 | Patrick T Prendergast | A method of inoculation with an antigenic peptide. |
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