DD277916A1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen follikel-stimulierendes hormon (fsh) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikoerpern gegen Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), die in der medizinischen Diagnostik angewendet werden koennen. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man zunaechst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit gereinigtem FSH immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die Antikoerper-produzierenden Hybridzellklone selektiert, kloniert, vermehrt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung oder nach Transplantation einsetzt. Die fuer die erfindungsgemaesse Antikoerperproduktion eingesetzten Hybridzellklone wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle fuer Zellinien im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie unter folgenden Nummern hinterlegt:Name des KlonsRegistriernummer B33-AE10 ZIM-0332 B33-BC12 ZIM-0333 B33-AF5 ZIM-0334 B33-AD7 ZIM-0335 B33-BH8 ZIM-0336

Description

NamedßsKlons	Restriernummer
ß 33-AE10	ZIM-0332
B33-BC12	ZIM-0333
B 33-Αι" 5	ZIM-0334
B 33-AD 7	ZIM-0335
B33-BH8	ZIM-0336

Die durch die hinterlegten Hybridzellklone B33-AE10, B33-BC12 und B33-AF5 synthetisierten monoklona'en Antikörper gegen FSH reagieren ausschließlich mit FSH und nicht mit LH, TSH, HCG oder ß-HCG, wie aus nachstehender Tabelle ersichtlich ist.

Reaktion der produzierten Antikörper

Klon mit 125 J-markiertem FSH HCG ß-HCG LH TSH

B33-AE10 + + + - -

B 33-BC12

B 33-AF 5

B 33-AO 7

B33-BH8 ++ " ++ - ++ + +

Die durch die Klone B33-AD7 und B33-BH8 produzierten Antikörper zeigen Kreuzreaktionen, sind jedoch in Kombination mit spezifischen Antikörpern in 2-Seiten-Bindungstests ebenfalls zum Aufbau von Testbestecks geeignet.

Die Immunglobulinklasse bzw. -Subklasse der durch die Hybridzellklone produzierten Antikörper zeigt die nächste Tabelle.

Nama des Klons Immunglobulinklasse bzw. -Subklasse

der produzierten Antikörper

B 33-AE10 IgM

B 33-BC12 IgGI

B 33-AF 5 ' IgGI

B33-AD7 lgG2a

B33-BH8 lgG3

Alle Hybridzellklone besitzen gute Wachstumseic enschaften und zeigen über mehrere Monate in der Zellkultur eine stabile Antikörperproduktion ohne die Notwendigkeit einer Reklonierung. Sie lassen sich sehr gut in der Aszitesform zur Gewinnung großer Antikörpermengen weitertransplantieren. Die Antikörper sind in drr Aszitesflüssigkeit noch in einer Verdünnung von mehr als 1:10OOCOO nachweisbar; alle Klone gehören demzufolge zu den stark produzierenden Hybridomen. Die Erfindung ermöglicht die Herstellung hochspezifischer und stark reaktiver Antikörper gegen FSH und demzufolge die Entwicklung von effektiven Testbestecks, die zusammen mit LH-Testbestecks zum Nachweis des Eisprungs und damit des optimalen Zeitpunkts einer Konzeption eingesetzt werden können. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel

1. Balb/c-Mäuse wurden mit gereinigtem FSH immunisiert, und die Milzzellen dieser Tiere wurden zur Fusion mit X63-Ag8.653 Myelomzellen verwendet. Die Fusion, Selektion mit Selektionsmedium, Klonierung usw. erfolgte entspr. der Standardmethode nach G. Köhler und C.Milstein, Nature 256 (1975), 495 und L.Hudson und F.C.Hay Practical lmmonology 2.Aufl. Oxford 1980.

2. Die Selektion der antikörperproduzierenden Hybridzellen wurde mit einem Festphassn-Radioimmuntest entsprechend etablierter Methode.! durchgeführt (B. Micheel et al., J. Immunol. Msth. 46 [1981 ], 41). Dazu wurde Anti-Maus-Immunyiobulin an PVC-Tablettenfolio adsorbiert, danach erfolgte die Inkubation mit den Kulturüberständen der Hybridzelikolonien und anschließend mit 125 J-markiertem FSH.

3. Die Spei'ifitätsprüfung der synthetisierten Antikörper erfolgte mit dem gleichen Festphasen-Radioimm'jntest unter Verwendung von 125 J-markiertem FSH, HCG, ß-HCG, LH und TSH im letzten Inkubationsschritt.

Entsprechend dieser Tests reagieren die durch die Hybridzellklone B33-AE10, B33-BC12 und B33-AF5 synthetisierten monoklonolen Antikörper ausschließlich mit FSH und nicht mit HCG, ß-HCG, LH und TSH, während die durch die Klone B33-AO7 und B33-BH8 produzierten Antikörper mit FSH, HCG, LH und TSH reagieren.

4. Die Subklasse der Antikörper wurde mit einem Festphasen-Radioimmuntest (B. Micheel et al., Biomed. Biochim. Acta 42 [19831,13) und einem Hämagglutinationshemmtest unter Verwendung von SubMassen-spezifischem Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin ermittelt.

Danach gehören die durch d^:e selektierten Klone produzierten Antikörper zu folgenden Klassen bzw. Subklassen: IgM (B33-AE10), IgGI (B33-BC12 und B33-AF5), lgG2a (B33-AD7), lgG3 (B33-BH8).

C Die ausgewählten Klone, die Anti-FSH-Antikörper produzierten, wurden in bekannter Weise in flüssigem Stickstoff eingefroren und in der Zellkultur und in Mäusen in der Aszitesform zur Antikörpergewinnung eingesetzt (R. H. Kennet, T. J. McKearn und K. B. Bechtol, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, New York und London 1981). Alle erhaltenen Klone zeigten in der Zellkultur eine stabile Antikörperproduktion über mehrere Wochen ohne die Noiwendigkeit einer Reklonisrung. Nach Transplantation auf Mäuse zeigten sie eine gute Produkiionsstabilität (Verlust der AntiKörperproduktion erst nach mehr als 5 Transplantationspassagen). Da Antikörper (besonders die von den

Klonen B33-AE10und B33-BC12 produzierten) noch bei Verdünnungen der Aszitesilüssigkeiten von mehr als 1:1000000 nachgewiesen werden konnten, gehören die wichtigsten selektierten Klone zu der» stark produzierenden Hybridomen. Die seloktierton Hybridzellklone wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle für Zellinien im Zentralinstitut für Molekularbiologie unter folgenden Nummern hinterlegt:

NamedesKlons	Registriernummer
B 33-AE10	ZIM-0332
B33BC12	ZIM-0333
B 33 AF 5	ZIM-0334
B33-AD7	ZIM-0335
B 33-BH 8	ZIM-0336

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen follikelstimulierendes Hormon (FSH) durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit FSH, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridzellen und Vermehrung der Hybridzellklone durch Kultivierung bzw. Transplantation auf Mäuse in der Aszitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation die Klone B33-AE10, B 33-BC12, B33-AF5, B33-AD7 oder B33-BH 8 eingesetzt werden.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   . Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern verschiedener Reaktionsspezifität gegen das follikelstimuüerende Hormon (FSH).
   Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

   Charakteristik des bekannten Standes der Technik'

   Das follikelstimulierende Hormon (FSH) i=t wie die nahe verwandten Hormone humanes Choriongonadotropin (HCG), luteinisierendes Hormon (LH) und thyreotropes Hormon (TSH) ein Glykoprotein, das aus zwei Untereinheiten, einer α-Kette und einer ß-Kette, aufgebaut ist. Während die α-Kette bei diesen Hormonen fast identisch ist, besitzen die ß-Ketten neben einer beträchtlichen Aminosäuresequenzhomologie auch eine Reihe spezifische Segionen. FSH erscheint im Serum und im Urin von Frauen in erhöhter Konzentration in der Mitte des normalen Menstruationszyklus. FSH fördert hier das Hollikel wachstum und die Eireifung und ist demzufolge ein Indikator für den Reifezustand des Graafschen Follikels. Die Messung der FSH-Konzentration in Körperflüssigkeiten kann weiterhin Aufschluß über primäre Störungen in der Produktion dieses gonadotropen Hormons sowie über die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Funktion geben.

   Für den Nachweis und. die quantitative Erfassung des follikelstimulierenden Hormons (FSH) sind spezifische Antikörper erforderlich, die in einem spezifischen Immuntest FSH von den nahe verwandten Hormonen unterscheiden können. Für den Aufbau von
2. 2-Seiten-Bindungstests werden z. B. zwei monoklonal Antikörper (MoAK) gegen zwei verschiedene Epitope benötigt, von denen einer der Antikörper spezifisch sein muß. Da die spezifischen Epitope der Gonadotropine offensichtlich in enger räumlicher Nachbarschaft liegen, ist für derartige Tests die Kombination eines spezifischen mit einem kreuzreagierenden Antikörper, der mit einem weit entfernten Epitop reagiert, am günstigsten. Gerade für die Auswahl der effektivsten Kombinationen, die die sensitivsten Tests ergeben, sind oftmals nur sehr wenige Antikörper geeignet. Die Herstellung spezifischer Antikörper wird durch die Aminosäuresequenzhomologien der verwandten Hormone und die damit verbundene Kreuzreaktivität beim Immunisieren erheblich erschwert. Ein Zeichen für diese Schwierigkeiten ist die Tatsache, daß bisher im internationalen Rahmen nur sehr wenige FSH-spezifische monoklonale Antikörper beschrieben wurden (Patent DE 3507849A1,1986; H.Hojo und R.J.Ryan, Endocrinol. 117 [1985], 2428).

   Für die unzureichende Anzahl der bisherigen Antikörper spricht auch die z.Z. noch geringe Auswahl an kommerziellen Testbestecks (Firma Serono). Eine wichtige Voraussetzung für aile immunologischen Nachweis- und Reinigungsverfahren ist das Vorhandensein stabiler und gut produzierender Hybridzellinien. Zu den bisher beschriebenen Hybridzellklonen liegen zur Stabilität und Produktivität keine Angaben vor.

   Ziel der Erfindung

   Die Erfindung hat das Ziel, stabile Klone herzustellen, die monoklonale Antikörper gegen FSH von starker Bindungsfähigkeit in guten Ausbeuten produzieren. Die Antikörper sollen zum Aufbau eines spezifischen Testsystems zum qualitativen und quantitativen Nachweis von FSH und darni' zur Unterscheidung von den nahe verwandten Hormonen HCG, LH und TSH sowie tür weitere immunologische Tests (z.B. m'i immunhistologischen Methoden) und für Reinigungsverfahren geeignet sein.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen FSH ist dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Mäusen, dia mit gereinigtem FSH immunisiert wurden, mit X 63-Ar 8.6Ü3 Myelomzellen in der Zellkultur unter Zusatz von PEG 1 500 fusioniert, das Fusionsgemisch in Mikrotestplatten aussät, Hybridzellen mit einem Selektionsmedium selektiert und die antikörperproduzierenden Hybride mit einem Festphasen-Immuntest bestimmt. Die Hybridzellen, die spezifische Antikörper gegen FSH produzieren, werden ausgewählt, vermehrt und ggf. nach Lagerung in flüssigem Stickstoff, erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung oder nach Transplantation auf Mäuse in der Aszitesform eingesetzt. Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridzellklone wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle für Zeilinten im Zentralinstitut für Molekularbiologie unter folgenden Nummern hinterlegt: