DE19807389C2 - Monoklonale Antikörper gegen Glycodelin A, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen das Glykoprotein Glycodelin A, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Enzymimmunoassays, zur Schwangerschaftsdianostik sowie zum Nachweis gynäkologischer Erkrankungen. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Glykoproteine sind bekanntermaßen Eiweiße mit Kohlenhydratanteil, die vielfältige Funktionen besitzen. So führen zum Beispiel physiologische Veränderungen, wie z. B. Schwangerschaft oder Alter, und Krankheiten zu einer Veränderung der Konzentration bestimmter Glykoproteine. Ein Beispiel ist das Glykoprotein Glycodelin A, einem Protein, das im Serum und im Amnion vorkommt und unter anderem ein Indikator zum Nachweis von Schwangerschaften und gynäkologischen Erkrankungen ist.

Nach Riitinen et al. besitzt Glycodelin A als Monomer ein Molekulargewicht von 28 kD, bei der Reinigung des Proteins mit Hilfe der Gelfiltration verhält sich Glycodelin A wie ein Protein mit einer Masse von 56 kD, was einem Dimeren entspricht.

Glycodelin A besitzt einen hohen Kohlenhydratanteil von 17.5% (H. Bohn et al.). Untersuchungen zur Struktur der N- glycosidisch verknüpften Oligosaccharide (A. Dell, H. R. Morris, R. L. Easton, M. Panico, M. Patankar, S. Oehninger, R. Koistinen, H. Koistinen, M. Seppälä, G. F. Clark, J. Biol. Chem. 1995, 270, 24116) ergaben sialinierte und fukosylierte LacdiNAc-Sequenzen, die in höher entwickelten Lebewesen sehr selten auftreten.

Seit längerem werden Untersuchungen zum Serum- und Amnionkonzentrationsverlaufs von Glycodelin A, welches auch unter den Namen: human chorionic microglobulin, PP14, EP15 oder PAEP bekannt ist, während der Schwangerschaft mit Hilfe von verschiedenen Antikörpern durchgeführt. (H. Bohn, W. Kraus, W. Winckler, Placenta (Supplement 4) 1982, Kap. 6; D. D. Petrunin, I. M. Gryaznowa, Y. A. Petrunina, Y. S. Tatarinov, Byull. Eksp. Biol. Med., 1982, 5, 600; S. C. Bell, H. Bohn, Plazenta, 1986, 7, 283). Die mit Hilfe von polyklonalen Antiseren durchgeführten Untersuchungen zur Identität der oben angeführten Proteine ergaben unterschiedliche Molekulargewichte für die jeweiligen Glycoproteine. Die Angaben schwanken zwischen 25-56 kD.

Wesentliche Voraussetzung für die Erzeugung von spezifischen Antiseren war die Isolierung von Glycodelin A aus dem Amnion und die Aufklärung der kompletten Aminosäuresequenz (L. Riitinen, M. Julkunen, M. Seppälä, R. Koistinen, M.-L. Huhtala, Clin. Chim. Acta, 1989, 184, 19; M. Julkunen, R. Koistinen, A. M. Suikkari, M. Seppälä, O. Jänne, Endocrinology 1990, 4, 700).

Monoklonale Antikörper (mAK) gegen PP14 wurden bereits gewonnen und vor allem in der Schwangerschaftsdiagnostik und zur Reinigung von PP14 eingesetzt (L. Riitinen, O. Närvänen, I. Virtanen, M. Seppälä, J. Immunol. Methods 1991, 136, 85).

Desweiteren ist dem US-PS 5,039,521 (1991) von Bolton et al die Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems mit mAK zu entnehmen. Ein Antikörper wurde erzeugt, aber außer seinem Isotyp (IgG) nicht weiter charakterisiert. In einem weiteren Patent von Bolten et al. US-PS 5,256,411 (1993) ist Schwerpunkt die Behandlung einer drohenden Frühgeburt und die Unterstützung der artefiziellen Insemination. Es wird ein Antikörper (mAK) beschrieben und mit dem Isotyp IgG charakterisiert.

Es steht außer Zweifel, daß sich verschiedene monoklonale Antikörper gleicher nomineller Spezifität, d. h. selbst wenn sie gegen ein und dasselbe Antigen gerichtet sind, in der Feinstruktur ihrer Epitope sowie in ihren weiteren Eigenschaften, die für ihre Eignung in einem bestimmten Test wichtig sein können, unterscheiden. Ein kommerziell vertriebenes Testsystem zum Nachweis von Glycodelin A ist bisher nicht bekannt.

Die Erfindung hat die Aufgabe, die bisherigen Nachweismethoden für Glycodelin A durch monoklonale Antikörper gegen das Glykoprotein Glycodelin A zu ergänzen, zu erweitern und zu verbessern. Diese monoklonalen Antikörper sollen insbesondere für den Aufbau von Enzymimmunoassays zum Nachweis von Glycodelin A in Serum und in der Amnionflüssigkeit von Schwangeren sowie im Serum zum Nachweis von gynäkologischen Tumoren geeignet sein. Darüber hinaus sollen die Antikörper zum Nachweis von Glycodelin A in histologischen Schnitten geeignet sein.

Die Lösung der Aufgabe konnte durch drei monoklonale Antikörper realisiert werden, die mit Glycodelin A spezifisch reagieren. Die Spezifität der Antikörper wurde durch Enzymimmunoassays unter Verwendung von potentiell kreuzreagierenden Materialien als Zielantigene und durch immunhistochemische Untersuchungen nachgewiesen.

Die erfindungsgemäßen Hybridomzellklone A87-D/C5 und A87- D/F4, die diese mAK produzieren, wurden in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, DE, hinterlegt und erhielten die Nummern
DSM ACC2336 (A87-D/C5),
DSM ACC2335 (A87-D/F4).

Überraschend reagieren nur die von diesen Hybridomen produzierten monoklonalen Antikörper im Enzymimmunoassay nicht mit anderen relevanten Amnionproteinen wie hCG und Amniontransferrin.

Die Isotypen der monoklonalen Antikörper wurden als IgG1 (A87-D/F4) bzw. IgG1/IgM (A87-D/C5) ermittelt.

Das Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Glycodelin A ist dadurch gekennzeichnet, daß man in bekannter Weise zunächst Milzzellen von BALB/c-Mäusen, die 2× mit auf Nitrocellulose geblotteten Glycodelin-A-Proben immunisiert und anschließend mit dem chromatographisch gereinigten Glycodelin A immunisiert wurden, mit Zellen der Maus-Myelomzellinie X63-Ag8.653 fusioniert und die erhaltenen Hybridome in einem geeigneten Selektivmedium selektioniert.

Die antikörperproduzierenden Hybridome werden mit einem Enzymimmunoassay nachgewiesen, der folgendermaßen durchgeführt wird:

Chromatographisch gereinigtes Glycodelin A wird an Mikrotestplatten gebunden. Danach erfolgt eine Inkubation mit dem Kulturüberstand der Hybridome, eine weitere Inkubation mit peroxidase-konjugiertem Anti-Maus-Antikörper und anschließend eine Farbreaktion mit o-Phenylendiamin. Die Extinktion wird bei 480 nm gemessen. Parallel dazu werden die antikörperproduzierenden Hybridome in Enzymimmunoassays, bei denen eine Vielzahl von menschlichen und tierischen Proteinen und Glykoproteinen eingesetzt werden, auf ihre Spezifität geprüft.

Diejenigen Hybridome, deren Antikörper ausschließlich mit Glycodelin A reagieren, werden kloniert, weitervermehrt, zur Reserve in flüssigem Stickstoff gelagert und erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung herangezogen.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind für den Aufbau eines Enzymimmunoassays zum Nachweis von Glycodelin A gut geeignet.

So werden polyklonale Kaninchenantikörper gegen Glycodelin A in geeigneter Konzentration an eine ELISA-Platte gebunden. Danach wir mit PBS-Tween 20 Lösung gewaschen, und die zu untersuchenden Proben werden unverdünnt bzw. in geeigneter Verdünnung zugegeben (Inkubationszeit: 120 min. 37°C). Nach erneutem Waschen wird 90 min bei 37°C mit dem monoklonalen Antikörper gegen Glycodelin A inkubiert. Nach dem Waschen erfolgt die Inkubation mit POD-konjugiertem Anti-Maus-Ig (60 min, 37°C). An ein weiteres Waschen schließt sich die Zugabe von Substratlösung (o-Phenylendiamin) an. Die Farbreaktion wird nach 15-20 min mit Schwefelsäure gestoppt und die resultierende Extinktion gemessen.

Außerdem sind die monoklonalen Antikörper zum Nachweis gynäkologischer Erkrankungen einsetzbar. So können z. B. anhand von Serumproben gynäkologische Tumore nachgewiesen werden.

Dazu wird die Glycodelin A-Konzentration im Serum mit Hilfe des oben beschriebenen ELISAs bestimmt und mit der Konzentration dieses Proteins in der entsprechenden Zeit der Periode verglichen.

Besonders bevorzugt können die erfindungsgemäßen mAK zur immunhistologischen Verifizierung von Endometriumstumoren verwendet werden.

Dabei wird der Kulturüberstand (konditioniertes Kulturmedium) der betreffenden Hybridomzellinie oder der gereinigte mAK in geeigneter Verdünnung eingesetzt. Der immunhistologische Test selbst wird mittels gängigen histologischen Techniken an Gefrier- oder Praffinschnitten durchgeführt, z. B. mittels der sogenannten ABC-Technik.

Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel 1. Herstellung der Hybridome

BALB/c-Mäuse wurden mit auf Nitrozellulose geblottetem Glycodelin A und abschließend mit chromatographisch gereinigtem Glycodelin A immunisiert. Milzzellen dieser Mäuse wurden mit Maus-Myelomzellen der Zellinie X63-Ag8.653 (Kearney, J. F. et al.; J. Immunol. 1979, 123, 1548) mittels Polyethylenglykol fusioniert (Peters, H. H. et al.: "Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung" Springer, Berlin, 1985).

2. Selektion der antikörperproduzierenden Hybridome

Dies erfolgte in einem Enzymimmunoassay. Dazu wurden Mikrotiterplatten mit gereinigtem Glycodelin A in geeigneter Verdünnung bzw. mit anderen Proteinen über Nacht beschichtet. Danach wurde mit PBS-Tween 20 Lösung gewaschen, und die Kulturüberstände wurden unverdünnt zugegeben (Inkubationszeit: 90 min. 37°C). Nach erneutem Waschen wurde 60 min bei 37°C mit POD-konjugiertem Anti-Maus-Ig inkubiert. An ein weiteres Waschen schloß sich die Zugabe von Substratlösung (o-Phenylendiamin) an. Die resultierende Extinktion wurde nach 15-20 min nach Abstoppen der Farbreaktion mit Schwefelsäure gemessen.

3. Spezifitätsnachweis der selektionierten monoklonalen Antikörper

Die Spezifität der Antikörper wurde nachgewiesen durch Enzymimmunoassays unter Verwendung von Glycodelin A und von potentiell kreuzreagierenden Materialien wie hCG und Amniontransferrin als Zielantigene und durch immunhistochemische Untersuchungen.

4. Isotypen

Die Isotypen der drei monoklonalen Antikörper wurden als IgG1 (A87-B/D2 und A87-D/F4) bzw. IgG1/IgM (A87-D/C5) ermittelt.

5. Gewinnung der Antikörper

Die Gewinnung der monoklonalen Antikörper erfolgte gemäß üblicher Techniken (Peters, H. H. et al., Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung, Springer, Berlin 1985) in vitro.

Claims (6)

1. Monoklonaler Antikörper gegen Glycodelin A produziert vom Hybridomzellklon A87-D/C5-DSM ACC2336.

2. Monoklonaler Antikörper gegen Glycodelin A produziert vom Hybridomzellklon A87-D/F4-DSM ACC2335.

3. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das Glycoprotein: Glycodelin A, erzeugt durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit dem chromatographisch gereinigten Glycoprotein, Fusion ihrer Milzzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridome in einem Selektivmedium, Klonierung und Weitervermehrung der reaktiven und spezifischen Hybridome durch Kultivierung, dadurch gekennzeichnet, daß zu Kultivierung und Antikörperproduktion die Klone A87- D/C5-DSM ACC2336 und A87-D/F4-DSM ACC2335 gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 eingesetzt werden.

4. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zum Nachweis von Tumoren.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekenzeichnet, daß die mAK zum immunhistologischen Nachweis von Tumoren verwendet werden.

6. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zum Aufbau eines Enzymimmunoassays zum Nachweis von Glycodelin A.