DE4213497A1

DE4213497A1 - Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Interferon-gamma

Info

Publication number: DE4213497A1
Application number: DE19924213497
Authority: DE
Inventors: Franz Prof Dr Med Noll; Oliver Asche
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 1993-10-28

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Hybridom- Zellinien, die monoklonale Antikörper gegen verschiedene Epitope des humanen Interferon-gamma (HuIFN-gamma) produzieren. Diese Antikörper sind in der medizinischen Diagnostik, der Therapieüberwachung und der Grundlagenforschung sowie in der Biotechnologie verwendbar.

HuIFN-gamma tritt als Dimer auf und kann unterschiedlich stark glykolisiert sein, rekombinantes HuIFN-gamma hat als Monomer ein Molekulargewicht von 17147 Dalton und ist nicht glykolisiert. Dieses Interferon zeichnet sich durch seine antiviralen und antiproliferativen Wirkungen und gegenüber den anderen Interferonen (α, β) vor allem durch seine immunmodulatorischen Effekte aus.

Die Gewinnung monoklonaler Antikörper (mAK) gegen HuIFN-gamma und die Anwendung in entsprechenden Nachweisverfahren sind bereits beschrieben worden (Alfa, M. J., Dembinski, J. J., Jay, F. T.; Production of monoclonal Antibodies against rHu-IFN-gamma: Screening of Hybridomas without purified Antigen, Hybridoma (1987) 6, 509; Liang, C. M., Herren, S., Sand, A., Jost, T.; Study of Antigenic Epitopes by Monoclonal Antibodies to Rekombinant Interferon Gamma; Biochem. Biophys. Res. Comm. (1985) 2, 28. Dabei wurden Mäuse in herkömmlicher Weise mehrfach mit gelöstem Antigen immunisiert. Das Screening der mAK erfolgte mit direkt an die feste Phase gebundenem Interferon-gamma (Hirai, M., Terano, Y., Miura, Y.; Characterization of monoclonal antibodies to human interferon-gamma an their application to enzyme-linked immunsorbent assay; Jpn. J. Med. Sci. Biol. (1989) 8, 127; Andersson, G., Ekre, H. P., Perlman, P.; Monoclonal antibody two-site ELISA for human IFN-gamma; J. Immunol. Meth. (1989) 12, 89.

Die bisher beschriebenen mAKs gegen HuIFN-gamma haben jedoch trotz gewisser Anwendungsmöglichkeiten einige Nachteile, u. a. eine nicht ausreichend hohe Affinität.

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen unterschiedliche Epitope des HuIFN-gamma mit hohen Affinitätskonstanten herzustellen. Solche Antikörper sollen zur Entwicklung eines Testbestecks, insbesondere für den Zweiseitenbindungstest, für die quantitative Bestimmung von HuIFN- gamma und für die Präparation von Immunsorbentien zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von natürlichem sowie rekombinantem HuIFN-gamma eingesetzt werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von mAK gegen HuIFN-gamma ist dadurch gekennzeichnet, daß man Balb/c-Mäuse durch i. p. Injektion von Milzzellen einer anderen mit Interferon-gamma immunisierten Balb/c-Maus mit hohem Antikörpertiter vorimmunisiert und mit an Nitrocellulose immobilisierten HuIFN-gamma weiterimmunisiert. Die Milzzellen der so immunisierten Mäuse werden mit Mausmyelomzellen (SP2/0) mittels Polyethylenglykol in der Zellkultur hybridisiert und die erhaltenen Hybridomzellen in Zellkulturgefäßen (Mikrotestplatten) ausgesät, angezüchtet und selektiert.

Die antikörperproduzierenden Hybridome werden zunächst in einem Festphasen-Immunoassay nachgewiesen. Dazu wird ein HuIFN-gamma über polyklonale Antikörper, z. B. der Ziege, gegen HuIFN-gamma an Mikrotestplatten gebunden und anschließend mit dem Kulturüberstand der zu testenden Hybridome inkubiert. Der Nachweis gebundener mAK erfolgt mit enzymmarkierten anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpern.

Selektionskriterium ist der Extinktionswert. Zur Produktion von mAK werden erfindungsgemäß diejenigen Hybridome ausgewählt, deren Extinktion mindestens das 5fache des Leerwerts beträgt.

Nach einer Fusion, ausgehend von ca. 6×10⁷ lymphoiden Zellen werden diese in ca. 400 Näpfe ausgesät. Man erhält 17 positive Klone mit einem mindestens doppelten Extinktionswert vom Leerwert, darunter 6 Klone, deren Extinktion über dem 5fachen des Leerwerts liegt. Diese 6 Klone werden rekloniert, danach wird ihre Immunglobulin-Klasse bestimmt. 2 Klone gehören zur Klasse IgM und sind damit für die Lösung der Aufgabe weniger geeignet. Die übrigen 4 Klone gehören zur Klasse IgG 2a.

Die Spezifität der mAK hinsichtlich der Erkennung der unterschiedlichen antigenen Determinanten auf dem Interferonmolekül wird mit Hilfe der folgenden zwei Tests charakerisiert:

I) Antikörperhemmtest

1. Polyklonale Antikörper gegen HuIFN-gamma werden an eine feste Phase gebunden
2. Interferon zugeben
3. Inkubation mit dem zu testenden Antikörper
4. Inkubation mit einem zweiten spezifischen anzymmarkierten mAK

II) Zweiseitenbindungstest

1. Der zu testende mAK wird an eine feste Phase gebunden
2. Interferon zugeben
3. Ein zweiter, bekannter mAK, der enzymmarkiert wurde, wird zugegeben und die gebundene Enzymaktivität gemessen.

Ergebnisse der Tests

Die Tabelle zeigt, welche Paare der erfindungsgemäß hergestellten mAK zur Entwicklung von Testbestecks geeignet sind. Die Paare IIF2 (Fangantikörper) und IVC4 (Nachweisantikörper) bzw. IF7 und IVC4 sind besonders für einen solchen Einsatz prädestiniert. Man erreicht im Test eine Empfindlichkeit, die der Empfindlichkeit kommerziell zugänglicher Testbestecke entspricht. Die mAK lassen sich auch erfolgreich in Testsystemen mit polyklonalen Antikörpern kombinieren. Hierbei wird eine Empfindlichkeit von 0,5 IE/ml (=50 pg/ml) HuIFN-gamma erreicht.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber dem Stand der Technik. Durch die Vorimmunisierung mit Milzzellen einer anderen Maus (adoptiver Milzzellentransfer) wird weniger Tiermaterial benötigt und gleichzeitig auch die gesamte Tierversuchszeit verkürzt. Außerdem bietet diese Tierimmunisierungsmethode die Gewähr, bei geringerem Antigeneinsatz für die Lymphozytenhybridomtechnik gut immunisierte Tiere zu erhalten. Der Einsatz von Nitrocellulose zur Immobilisierung des HuIFN-gamma bei der Weiterimmunisierung führt ebenfalls zur Einsparung von HuIFN-gamma.

Die erfindungsgemäße Selektion erfaßt die Antikörper, die in Lösung befindliches HuIFN-gamma erkennen, und vermeidet die bei den bekannten Selektionsverfahren auftretende teilweise Denaturierung des HuIFN-gamma bei der Adsorption, wonach auch Hybridome erhalten werden, die mAK gegen denaturiertes HuIFN-gamma produzieren. Solche mAKs sind für Immuno-Assays und für die Immunoaffinitätschromatographie nicht verwendbar. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Selektion von mAK bietet einen weiteren bedeutenden Vorteil: Einsparung von antigenem Material - es wird weniger als ½₀ der Menge der üblichen Screening-Verfahren benötigt.

Die erfindungsgemäß hergestellten mAK haben eine hohe Affinität und weisen keine Kreuzreaktivität mit den β-Interferonen und den Subtypen des α-Interferons auf. Sie lassen sich auch zur Herstellung von Immunsorbentien verwenden, mit deren Hilfe HuIFN-gamma sehr effektiv bis zur Homogenität aufgereinigt werden kann.

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel 1) Die Gewinnung der Hybridome erfolgt nach bekanntem Verfahren (Köhler, G. and Milstein, 1975)

Einer Balb/c-Maus, die durch Immunisierung mit HuIFN- gamma einen hohen Serumtiter an spezifischen Antikörpern hat, wird die Milz entnommen, und daraus werden die lymphoiden Zellen präpariert. Jeweils ca. 1-5×10⁶ Zellen werden Balb/c-Mäusen i. p. injiziert. Etwa 3 Wochen später wird mit immobilisiertem HuIFN-gamma immunisiert. Weitere Immunisierungen folgen in ca. 3-5wöchigem Abstand, wobei die Antigendosis jeweils 5-10 g beträgt.

Die Fusion der 6×10⁷ Milzzellen mit 6×10⁶ Zellen der Myelomzellinie SP2/0 erfolgt in Gegenwart von Polyethylenglykol. Die entstehenden Hybridome werden zunächst in einem Selektivmedium (HT+Azaserin) in 96-well-Mikrotiterplatten angezüchtet und dann kloniert.

2) Das Screening der angezüchteten Hybridome wird in folgender Weise durchgeführt

a) Adsorption des Fang-AK an die Mikrotiterplatte:
5 µg/ml Ig-5-Z1 (AK der Ziege) in PBS; 100 µl/Napf; ü. N.; 4 C;
b) Inkubation mit HuIFN-gamma-haltigem Blockierungsmittel:
500 IE/ml rHuIFN-gamma in TBS-Tween mit 2,5% RSA; 100 l/Napf; 1,5 h; 1× waschen
c) Auftragen des Nachweis-AK: monoklonaler AK (Kulturüberstand)
50 l/Napf; 1,5 h; 1× waschen
d) Erfassen des Nachweis-AK mittels: anti-Maus Ig-POD 1 : 1000 in TBS-Tween;
50 l/Napf; 1 h; 6× waschen
e) Nachweisreaktion gemäß Patentbeschreibung

Folgende positive Klone werden erhalten:

Verteilung der Extinktionswerte im Screening

3) Herstellung der Antikörper

Die Gewinnung der Antikörper durch Kultivierung der ausgewählten Hybridomklone mit einer Extinktion 0,35 in vitro oder in vivo erfolgt nach bekannten Verfahren.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Interferon-gamma (HuIFN-gamma), dadurch gekennzeichnet, daß man Balb/c-Mäuse mit Milzzellen einer anderen Maus mit hohem Antikörpertiter vorimmunisiert und mit an Nitrozellulose immobilisierten HuIFN-gamma weiterimmunisiert, die Milzzellen dieser Mäuse mit Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikörperbildenden Hybridome mittels ELISA selektiert, die Eigenschaften der von den Hybridomen gebildeten monoklonalen Antikörper bestimmt und diejenigen Hybridome zur Produktion auswählt, deren Antikörper zur Extinktion im Screening führen, die mindestens das 5fache des Leerwertes beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion durch Bindung von HuIFN-gamma mit Hilfe eines polyklonalen HuIFN-gamma-spezifischen Antikörpers eines Säugetiers an eine Mikrotestplatte, Zugabe der Zellkulturüberstände der einzelnen Hybridomklone und Nachweis der gebundenen mAK mit markierten anti- Maus-Immunglobulin-Antikörpern erfolgt.