DE3785994T2

DE3785994T2 - Antikörper gegen Interleukin-1.

Info

Publication number: DE3785994T2
Application number: DE87116724T
Authority: DE
Inventors: Hisakazu Aoki; Yoshikatsu - Hirai; Kenji - Nagamura; Yasukazu - Ohmoto
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-11-13
Filing date: 1987-11-12
Publication date: 1993-11-11
Anticipated expiration: 2007-11-13
Also published as: KR900004420B1; DK590387A; ES2054644T3; DE3785994D1; DK590387D0; EP0267611B1; EP0267611A2; KR880006357A; EP0267611A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen Interleukin-1 (IL-1) und insbesondere neue Antikörper gegen Human IL-1, die es ermöglichen, IL-1 immunologisch zu reinigen und zu bestimmen.
Human IL-1 wird durch Makrophagenmonocyten und viele andere Zellen produziert und ist dafür bekannt, verschiedenartige molekulare Formen und biologische Aktivitäten zu zeigen. Gegenwärtig sind als Human IL-1 zwei Arten bekannt, die sich im isoelektrischen Punkt unterscheiden, d.i. IL-1α und IL- 1β. Die Primärstrukturen dieser IL-1-Arten sind aufgeklärt worden. (Nature, 315, S.641 (1985; J.Exp. Med., 164, S 237 (1986); usw.)
Für die Applikation der IL-1-Arten als Arzneimittel sind ausgedehnte Forschungsarbeiten durchgeführt worden. Die Aufmerksamkeit richtete sich auf Bestimmung der IL-1-Arten insbesondere aus klinischen Proben für die Erforschung verschiedener Immunmangelkrankheiten und von abnormalen Immunreaktionen sowie auf die klinische Diagnose dieser Krankheiten und Abnormalitäten.
Gegenwärtig sind Bioassays als Techniken für die Bestimmung der IL-1-Arten bekannt. Mit diesem Verfahren wird das IL-1 als biologische Aktivität der Testprobe bestimmt. Dieses Verfahren ist dennoch nur mittelmäßig hinsichtlich der Bequemlichkeit und der Genauigkeit, und es bringt die Notwendigkeit mit sich, stets eine gewisse Komponentenüberlagerung bei der Messung in Betracht zu ziehen. Darüber hinaus hat die Methode den ernsthaften Nachteil, daß sie nicht fähig ist, IL-1α und IL-1β voneinander getrennt zu unterscheiden, da diese die gleiche Aktivität zeigen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Antikörper gegen Human IL-1α und Human IL-1β bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Antikörpern gegen Human IL-1-Arten zur Verwendung in einem neuen Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Human IL- 1α und Human IL-1β jeweils einzeln.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Antikörpern gegen Human IL-1-Arten, die in der Lage sind, die biologische Aktivität von IL-1 zu neutralisieren oder zu unterdrücken und verschiedene Krankheiten zu heilen, die eine abnorm große Menge an IL-1 hervorbringen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Methode zur Herstellung dieser Antikörper bereitzustellen.
Diese Ziele und andere Merkmale der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich.
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper gegen Human IL-1 bereit, der dadurch gekennzeichnet ist, daß der Antikörper eine spezifische Reaktionsfähigkeit mit Human IL-1α oder Human IL-1β hat, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben.
Die Erfindung stellt weiterhin bereit ein neues Verfahren zur Immunoassay, durch das Human IL-1α und Human IL-1β leicht einzeln unterschiedlich voneinander bestimmt werden können mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit unter Verwendung des Antikörpers der Erfindung.
Da der Antikörper der Erfindung spezifisch für Human IL-1α oder Human IL-1β ist, stellt die Verwendung des Antikörpers eine spezielle Methode zur Reinigung des IL-1 zum Beispiel durch Affinitätschromatografie bereit.
Darüber hinaus schließt der Antikörper der Erfindung einen Typ ein, der die biologische Aktivität des Human IL-1 neutralisieren kann und der zur Behandlung verschiedener Krankheiten nützlich ist, die eine abnorm große Menge IL-1 produzieren, wie chronische rheumatische Arthritis, Thyroiditis, Hepatitis, Nephritis und ähnliche chronische Entzündungskrankheiten; Arteriosklerose, Kawasaki-Krankheit und ähnliche Angitis; disseminiertes intravaskuläres Gerinnungs(DIC)-Syndrom; Blutkrebs usw. Der Antikörper kann die beschleunigte Aktivität des Human IL-1, das durch die obigen Krankheiten produziert wird, unterdrücken. Daher führt der erfindungsgemäße Antikörper zu Arzneimitteln, die zur Verhütung und Heilung dieser Krankheiten nützlich sind.
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch Verwendung von Human IL-1α oder Human IL-1β als ein Immunisierungsantigen hergestellt werden. Der Antikörper kann genauer gesagt zum Beispiel hergestellt werden durch Immunisierung eines Säugers mit dem Antigen, Verschmelzen der Plasmacyten (Immunzellen) des Säugers mit den Plasmacytomzellen eines Säugers, um Hybridomzellen zu erhalten, Klonieren der Zellen, Selektieren eines Klones, der den gewünschten Antikörper produziert, der Human IL-1α oder Human IL-1β erkennt, und Inkubieren des Klones.
Human IL-1α oder Human IL-1β zur Verwendung im obigen Verfahren als Immunisierungsantigen sind nicht speziell eingeschränkt. Zu diesem Zweck ist zum Beispiel nützlich ein Kulturüberstehendes, das Human IL-1α und/oder Human IL-1β enthält, abgeleitet nach einem bekannten in vitro-Verfahren, oder ein gereinigtes Standardprodukt davon, Human IL-1α oder Human IL-1β, hergestellt durch gentechnische Verfahren und ein synthetisches Polypeptid, das einen Teil der Aminosäuresequenz eines solchen Human IL-1 aufweist.
Für den mit dem Antigen zu immunisierenden Säuger gibt es keine spezielle Einschränkung. Es ist allerdings wünschenswert, ein geeignetes Lebewesen im Hinblick auf die Zugänglichkeit zur Fusion von dessen Zellen mit dem zu verwendenden Plasmacytomzellen auszuwählen. Im allgemeinen sind Mäuse und Ratten vorteilhaft einsetzbar.
Der Säuger wird mittels einer üblichen Methode immunisiert, zum Beispiel durch intravenöse, subkutane oder intraperitoneale Gabe des Antigens, spezieller durch Verabreichung des Antigens an das Tier mehrmals alle zwei bis vierzehn Tage bei einer Gesamtdosis von etwa 100 bis 500 ug/Tier. Wie üblich ist, wo erforderlich, ein Begleitstoff für die Verabreichung einsetzbar. Es ist wünschenswert, daß die zu verwendenden Immunzellen Milzzellen sind, die etwa drei Tage nach der finalen Verabreichung des Immunisierungsantigens entfernt werden.
Plasmacytomzellen von Säugern sowie die anderen mit den Immunzellen zu verschmelzenden Wirtszellen sind verschiedene bekannte Zellinien, einschließlich Myelomzellen, wie P3 (P3/X63-Ag8) [Nature, 256, 495-497 (1975)] P3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], NS-1 (Eur. J. Immunol., 6, 511-519 (1976)], MPC-11 [Cell, 8, 405-415 (1976)], SP2/0 [Nature, 276, 269-270 (1978)], FO [J. Immunol. Meth., 35, 1-21 (1980)], X63.6.5.3. [J. Immunol., 123, 1548-1550 (1979)], S194 [J. Exp. Med., 148, 313-323 (1978)] usw., R210 der Ratte [Nature, 277, 131-133 (1979)].
Die Verschmelzung (Fusionierung) der Immunzellen und der Plasmacytomzellen wird grundsätzlich nach einem bekannten Verfahren durchgeführt, wie dem Verfahren von Milstein et al. (Method in Enzymology, Bd. 73, S.3 (1981)). Insbesondere wird die Fusionierungsreaktion zum Beispiel in einem üblichen Nährmedium in Gegenwart eines üblichen Fusionierungsbeschleunigungsmittels wie Polyethylenglycol (PEG) oder dem Hämagglutinierungsvirus von Japan (HVJ) durchgeführt. Um eine verbesserte Fusionierungseffektivität zu erreichen, können Hilfsmittel wie Dimethylsulfoxid dem Medium hinzugesetzt werden, wenn dies erwünscht ist. Die Immunzellen und die Plasmacytomzellen werden in einem üblichen Verhältnis verwendet. Zum Beispiel werden die Immunzellen mit etwa dem 1- bis etwa dem 10-fachen der Menge der Plasmacytomzellen eingesetzt. Beispiele für Medien, die für die Fusionierung nützlich sind, sind das RPMI-1640- Medium und das MEM-Medium, die üblicherweise für die Vermehrung von Plasmacytomzellen verwendet werden, sowie verschiedene andere Medien, die zur Inkubierung von Zellen dieses Typs verwendet werden. Im allgemeinen ist es wünschenswert, solche Medien zu verwenden, bei denen der Serumzusatz, wie fötales Kalbsserum (FCS), entfernt wurde. Um die Fusionierung zu bewirken, wurden vorbestimmte Mengen an Immunzellen und Plasmacytomzellen in dem Medium gründlich miteinander vermischt, und eine Lösung von PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 6000 wird vorgewärmt auf etwa 37ºC dem Medium hinzugemischt, üblicherweise bei einer Konzentration von etwa 30 bis etwa 60 W/V%. Nachfolgend wird ein geeignetes Medium von Zeit zu Zeit der Kultur hinzugemischt, gefolgt von einer Zentrifugierung und jedesmaligen Entfernung des Überstehenden. Die Wiederholung dieses Verfahrensablaufes ergibt das gewünschte Hybridom.
Das erhaltene gewünschte Hybridom wird durch Inkubierung in einem üblichen Selektionsmedium, wie HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltend), abgetrennt. Die Inkubation mit dem HAT-Medium wird für einen gewissen Zeitraum durchgeführt, üblicherweise mehrere Tage bis mehrere Wochen, der ausreichend ist, die Zellen (z. B. unfusionierte Zellen) abzutöten, im Unterschied zu den gewünschten Hybridomzellen. Die erhaltenen Hybridomzellen werden der dann üblichen eingeschränkten Verdünnungsmethode unterzogen, um die dem gewünschten Antikörperproduzierenden Klone wiederzugewinnen, gefolgt von der Produktion des monoklonalen Antikörpers.
Die Antikörper-produzierenden Klone können durch verschiedene Methoden bestimmt werden, die im allgemeinen für die Bestimmung von Antikörpern eingesetzt werden, wie der ELISA-Methode (Engvall, E., Meth. Enzymol., 70, 419-439 (1980), der Plaque-Methode, der Spot-Methode, der Agglutinierungsreaktionsmethode, der Ouchterlony-Methode und der Radioimmunoassay (RIA) ("Hybridom-Methode und monoklonale Antikörper", veröff. v. R & D Planning Co., Ltd., S. 30-53, 5. März 1982). Das Immunisierungsantigen ist für die Bestimmung einsetzbar.
Das so erhaltene Hybridom, das den gewünschten monoklonalen Antikörper produziert, der Human IL-1α oder Human IL-1β erkennt, kann in einem üblichen Medium subkultiviert und für einen längeren Zeitraum in flüssigem Stickstoff geschützt aufbewahrt werden.
Der gewünschte Antikörper der Erfindung kann aus dem Antikörper-produzierenden Hybridom als Kulturüberstehendes gesammelt werden durch Inkubieren des Hybridoms in üblicher Weise, oder als das Bauchwasser eines Säugers, das der Vermehrung des Hybridoms zugänglich ist durch Verabreichung des Hybridoms an das Tier. Die erstere Methode ist für die Herstellung des Antikörpers mit einer hohen Reinheit geeignet, während die letztere Methode geeignet ist für die Quantität der Produktion des Antikörpers.
Wenn gewünscht, kann der Antikörper der Erfindung leicht durch ein übliches Verfahren gereinigt werden, wie dem Aussalzen, der Gelfiltration, der Affinitätschromatografie oder ähnlichen.
Der auf diese Weise erhaltene erfindungsgemäße monoklonale Antikörper hat eine Reaktionsfähigkeit spezifisch gegen Human IL-1α oder Human IL-1β.
Die Antikörper der Erfindung schließen jene des Typs ein, die in Richtung auf die Neutralisierung der biologischen Aktivität von Human IL-1 wirken. Derartige Antikörper sind für die spezielle Bestimmung von Human IL-1 mit biologischer Aktivität geeignet. Derartige Antikörper, insbesondere die Antikörper, die in der Lage sind zur Erkennung der IL-1- Rezeptorbindungsstelle des IL-1-Moleküls, sind wirksam für die Heilung verschiedener Krankheiten, die abnormal große Mengen an IL-1 produzieren.
Die Antikörper der Erfindung schließen weiterhin solche des Typs ein, die unterschiedliche Stellen des Human IL-1- Moleküls erkennen, die frei von sterischer Behinderung zwischen Antikörpern sind und fähig sind zur Bindung an das Human IL-1-Molekül. Diese Antikörper sind sehr nützlich für eine Immunoassay, zum Beispiel mittels der Sandwich-Technik.
Zusätzlich gehören zu den Antikörpern der Erfindung jene von dem Typ, der eine hohe Reaktionsfähigkeit insbesondere in einem Flüssig- oder Festphasensystem hat. Diese Antikörper sind sehr vorteilhaft verwendbar für Flüssigphasen- oder Festphasen-Immunoassays.
Unter den Antikörpern der Erfindung sind bevorzugte Beispiele folgende.
1) Ein Antikörper mit einer Erkennungsstelle in der Sequenz der Aminosäuren Nr. 121 bis 140 von Human IL-1β.
2) Ein Antikörper, der eine Erkennungsstelle in der Sequenz der Aminosäuren Nr. 24 bis 82 von Human IL-1β hat.
3) Ein Antikörper, der eine Erkennungsstelle in der Sequenz der Aminosäuren Nr. 83 bis 102 von Human IL-1β hat.
4) Ein Antikörper, der eine Erkennungsstelle in der Sequenz der Aminosäuren Nr. 145 bis 148 von Human IL-1β hat.
Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper der spezifisch gegen Human IL-1α oder Human IL-1β ist. Die Verwendung dieses Antikörpers führt zu einem Verfahren der genauen Bestimmung mit hoher Empfindlichkeit und hoher Spezifizität von Human IL-1α oder Human IL-1β, wie zum Beispiel in klinischen Proben in einer geringen Konzentration enthalten, mittels einer Immunoassay.
Die Erfindung wird detaillierter unter Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, die in keiner Weise die Erfindung einschränken.

Beispiel 1

Herstellung von Antikörpern gegen Human IL-1β

Human IL-1β (10 ug), erhalten durch Genrekombinationstechniken (Biochemistry, 58, Nr. 8. S. 840 (1986); EP-A-187991), wurde intraperitoneal einer BALB/C- Maus zusammen mit komplettem Freundschem Adjuvans gegeben. Das Interleukin wurde weiterhin alle drei bis vier Wochen zweimal mit der gleichen Dosis zusammen mit einem unvollständigem Adjuvans gegeben, um das Tier zu immunisieren. Drei bis vier Wochen danach wurde eine Lösung von 30 ug Human IL-1β in physiologischer Kochsalzlösung intravenös dem Tier zur finalen Immunisierung verabreicht. Drei bis vier Tage danach wurde die Zellfusionierung in üblicher Weise durchgeführt (siehe zum Beispiel Method in Enzymonology, 73, S.3 (1981)) unter Verwendung von Milzzellen, gesammelt von dem immunisierten Tier und Myelomzellen (P3U1, Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)) im Verhältnis von 10 : 1 und Polyethylenglycol (PEG-4000).
Die gewünschten Hybridomzellen wurden auf HAT-Medium selektiert. Das überstehende wurde durch eine Enzym- Immunoassay getestet unter Verwendung einer 96-Vertiefungs- Mikroplatte, überzogen mit Human IL-1β und Peroxidasemarkiertem Ziege-Anti-Maus-Globulin (Produkt von E. Y. Lab.), um Zellen zu bestimmen, die die gewünschten Antikörper gegen Human IL-1β produzieren.
Die Zellen wurden wiederholt kloniert mittels der eingeschränkten Verdünnungsmethode, um sieben Klone zu erhalten, die die gewünschten Antikörper produzierten.
Die Merkmale der erhaltenen Antikörper aus jedem der Klone wurden bestimmt mittels der folgenden Methoden.

(1) Unterklasse des Antikörpers

Bestimmt unter Verwendung einer Maus-Antikörper- Unterklassenbestimmungsausrüstung (produziert von Bio-Rad).

(2) Antikörperproduktionshöhe

Ausgedrückt als Menge von IgE (ug/ml) in dem Kulturüberstehenden des Hybridoms, wenn die höchste Zellkonzentration erreicht worden ist.

(3) Wirksamkeit

Bestimmt nach den folgenden Verfahren.

RIA:

Entsprechend der Iodgen-Methode (B.B.R.C., 80, 849-857 (1978)) wurden 100 ul (etwa 10000 cpm) von ¹²&sup5;I-markiertem Human IL-1β, 100 ul einer Verdünnung des Hybridom- Überstehenden und 100 ul PBS, enthaltend 0,01 % NaN&sub3;, 5 mMol EDTA und 0,1 % BSA miteinander vermischt und bei 4ºC umgesetzt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 50 ul normalen Ziegenserums hinzugegeben, das als Trägerprotein diente, und 600 ul Lösung von 20 % PEG in PBS, und das Gemisch wurde gerührt und anschließend für 20 Minuten in einem Eisbad stehengelassen und danach zentrifugiert. Die Radioaktivität des Sedimentes wurde durch einen Gammazähler gemessen. Das Verdünnungsverhältnis des Kulturüberstehenden, das in der Sedimentierung von 15% von ¹²&sup5;I-markiertem IL-1β resultierte, wurde als RIA-Wirksamkeit bestimmt.

EIA:

Human IL-1β, eingestellt auf eine Konzentration von 20 ug/ml, wurde in die Löcher einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (100 ul/Vertiefung) plaziert, und man ließ es bei Raumtemperatur für eine Stunde stehen. Nach dem Waschen der Platte mit PBS, wurde BSA auf die Platte zur Abblockierung unspezifischer Adsorption aufgebracht, und die Platte wurde anschließend mit PBS-Tween 20 gewaschen. Eine Verdünnung des Hybridom-Kulturüberstehenden wurde in die Vertiefung plaziert (100 ul/Vertiefung), gefolgt von einer Reaktion bei 37ºC für zwei Stunden, und anschließend wurde gewaschen. Das Peroxidase-markierte Anti-Maus-Immunglobulin (Produkt von Cappel Labs. Inc., X5000), wurde anschließend in die Vertiefungen in einer Menge von 100 ul/Vertiefung plaziert, gefolgt von einer Reaktion unter den gleichen Bedingungen wie oben. Nach dem Waschen der Platte wurde die Enzymaktivität auf der Platte durch kolorimetrische Analyse bestimmt. Das Verdünnungsverhältnis des Kulturüberstehenden, das zur OD&sub4;&sub9;&sub2;=1,0 führte, wurde als EIA-Wirksamkeit bestimmt. RIA/IgE und EIA/IgG. Dies sind die Werte, die durch Teilen der RIA-Wirksamkeit und der EIA-Wirksamkeit durch den Antikörper-Produktionshöhe erhalten werden.
RIA/IgG stellt die Reaktivität des Antikörpers der Erfindung dar (mit ¹²&sup5;I-markiertem Human IL-1β) in dem Flüssigphasensystem, während EIA/IgG für die Reaktivität des vorliegenden Antikörpers steht (mit Human IL-1β in Form einer festen Phase) in dem Festphasensystem.

(4) Molekulargewicht

Das Hybridom wurde intraperitoneal in einer Maus inkubiert, und die IgG&sub1;-Fraktion gesammelt und gereinigt aus dem Aszites unter Verwendung der IgG-Reinigungsausrüstung (MOPS- Ausrüstung, Produkt von Bio-Lad), wurde auf das Molekulargewicht geprüft (das die Summe der Molekulargewichte der schweren Kette und der leichten Kette war, wie bestimmt durch SDS-PAGE).

(5) Kreuzreaktivität

Bestimmt durch Western Blotten (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 4350 (1979); Anal. Biochem., 112, 195 (1981)) unter Verwendung menschlicher rekombinanter Proteine, hergestellt durch gentechnische Verfahren. Das Symbol "-" stellt die Abwesenheit von Kreuzreaktivität dar.

(6) Bindungskonstante (kb)

Bestimmt durch Scatchard-Blotanalyse.

(7) Neutralisierungsaktivität

Bestimmt aus der LAF-Aktivität J. Immunol., 116, 1466 (1976). Das Zeichen "+" stellt das Vorhandensein von Neutralisierungsaktivität dar.
Tabelle 1 zeigt die so bestimmten Charakteristika. Tabelle 1 Antikörper Antikörperunterklasse Wirksamkeit Produktionshöhe (ug/ml) Tabelle 1 (Fortsetzung) Antikörper Molekulargewicht Kreuzreaktivität Bindungskonstante Neutralisierungsaktivität

(8) Bestimmung der Bindungsstelle

Die folgenden Fragmente von Human IL-1β wurden hergestellt durch das Verfahren, das in der EP-A-187991 für die Herstellung von Human IL-1β beschrieben ist.
Fragmente
N-10: Polypeptid von Human IL-1β, umfassend die Aminosäuren Nr. 11-153
N-16: Polypeptid von Human IL-1β, umfassend die Aminosäuren Nr. 17-153
N-23: Polypeptid von Human IL-1β, umfassend die Aminosäuren Nr. 24-153
C-82: Polypeptid von Human IL-1β, umfassend die Aminosäuren Nr. 1-82
C-102: Polypeptid von Human IL-1β, umfassend die Aminosäuren Nr. 1-102
C-120: Polypeptid von Human IL-1β, umfassend die Aminosäuren Nr. 1-120
C-140: Polypeptid von Human IL-1β, umfassend die Aminosäuren Nr. 1-140
C-144: Polypeptid von Human IL-1β, umfassend die Aminosäuren Nr. 1-144
C-148: Polypeptid von Human IL-1β, umfassend die Aminosäuren Nr. 1-148
Zu den E.coli-Zellen, die Human IL-1β exprimieren oder jedem der Fragmente, wurden 100 ul von 6,25 mMol Trist-Puffer (pH 6,8, enthaltend 2 % SDS, 5 % 2ME, 10 % Glycerol und 0,001 % BPB) hinzugegeben, um eine Lösung zu erhalten, die anschließend bei 100ºC für zwei Minuten auf gekocht wurde, um eine Probe für die Elektrophorese zu erhalten. Die auf diese Weise hergestellten Proben wurden auf Reaktionsfähigkeit mit Antikörpern der Erfindung durch Western-Blotten getestet.
Tabelle 2 zeigt das Ergebnis. Tabelle 2 Human IL-1β Bindungsstelle
Tabelle 2 läßt folgendes erkennen. Die Antikörper ANOC 201, 206 und 207 haben jeweils eine Erkennungsstelle in der Sequenz der Aminosäuren Nr. 121 bis 140 von Human IL-1β, die Antikörper ANOC 202 und 204 in der Sequenz der Aminosäuren Nr. 24 bis 82, der Antikörper ANOC 203 in der Sequenz der Aminosäuren Nr. 83 bis 102 und der Antikörper ANOC 205 in der Sequenz der Aminosäuren Nr. 145 bis 148.

(9) Sterischer Hinderungstest der vorliegenden Antikörper

Jeder der erfindungsgemäßen Antikörper wurde mit ¹²&sup5;I markiert nach der Iodgen-Methode, um einen markierten Antikörper zu erhalten. Für jeden der vorliegenden Antikörper wurde die Adsorption durch ein Polysterenkügelchen (6,4 mm Durchmesser) bewirkt mittels der physikalischen Adsorptionsmethode (Clin. Chem. Acta, 135, 263 (1983)), um einen insolubilisierten Antikörper zu erhalten. Der insolubilisierte Antikörper wurde mit 20 ng Human Il-1β in 0,5 ml PBS-Lösung, die 1 % BSA und 0,01 % Thimerosal enthielt, bei 37ºC für zwei Stunden umgesetzt. Die gleiche PBS-Lösung (0,5 ml) wie oben, die etwa 100 000 cpm des oben erhaltenen markierten Antikörpers enthielt, wurde zu dem Kügelchen hinzugegeben, das nach der Reaktion gewaschen wurde, gefolgt von einer Reaktion bei 37ºC für zwei Stunden unter Schütteln.
Nach dem Waschen des Kügelchens wurde die an das Kügelchen gebundene Radioaktivität gezählt, um die Reaktivität zwischen den Antikörpern zu bestimmen (ob oder nicht das Sandwich von insolubilisiertem Antikörper-Human IL-1β markiertem Antikörper gebildet worden war).
Konsequent wurde kein Sandwich zwischen den Antikörpern ANOC 201, 206 und 207 gebildet, was ein Zeichen dafür war, daß diese Antikörper im wesentlichen die gleiche Stelle von IL- 1β erkennen.
Keine Hinderung wurde bei der Reaktion zwischen allen anderen getesteten Antikörpern gefunden (mit Ausnahme der Reaktion des Antikörpers mit sich selbst).

(10) Inhibierung der Bindung von IL-1β an den IL-1-Rezeptor auf Fibroblasten (Test A).

BALB/c3T3-Fibroblasten (ATCC CCL-163) nahezu gleichförmig über eine Platte mit sechs Vertiefungen (1 · 10&sup6; Zellen/Vertiefung) gewachsen, wurden bei 37ºC für vier Stunden mit 8500 cpm/Vertiefung von ¹²&sup5;I-markiertem IL-1β umgesetzt (wenigstens 250 uCi/ug Protein in spezifischer Aktivität, hergestellt nach dem Verfahren von Bolton und Hunter (Biochem. J., 133, 529 (1973)) und mit einem Antikörper der Erfindung (Anti-IL-1β-monoklonaler Antikörper) vorinkubiert bei 37ºC in D-MEM, ergänzt mit 10 % FCS. Anschließend wurden 50 ul Rattenserum und 250 ul 20 % PEG mit dem Reaktionsgemisch bei 4ºC für 20 Minuten umgesetzt. Die Platte wurde dann zentrifugiert (12000 U/Min, 15 Minuten), um ein Sediment (gebundenes Produkt) und ein davon getrenntes Überstehendes (ungebundenes Produkt) zu erhalten. Die gebundene Reaktivität wurde anschließend durch einen Gammazähler gemessen.
Die Aktivität (%) des vorliegenden Antikörpers, um IL-1β am Binden an den IL-Rezeptor auf dem Fibroblasten zu hemmen, wurde nach der folgenden Gleichung berechnet
Inhibierungsaktivität (%) =A - C/A - B· 100
worin darstellen A: Radioaktivität der Kontrollprobe ohne den Antikörper der Erfindung
B: Radioaktivität, unspezifisch durch die Platte adsorbiert
C: Radioaktivität infolge der Verwendung des vorliegenden Antikörpers.
In diesem Test betrug der Wert A 3895 cpm/Vertiefung, und der Wert C betrug 301 cpm.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse, die durch die Antikörper der Erfindung, d.i. ANOC 203 und 205 erhalten wurden. Tabelle 3 Konz. d. Antikörpers Inhibierungsaktivität
Tabelle 3 zeigt, daß ANOC 203 der Erfindung die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem IL-1β an den IL-1-Rezeptor inhibiert, was ein Zeichen dafür ist, daß der Antikörper die IL-1- Rezeptorbindungsstelle von IL-1β erkennt. Der Antikörper ANOC 205 der Erfindung hat im wesentlichen keine Inhibierungsaktivität. Dies zeigt, daß der Antikörper eine Stelle erkennt, die sich von der der IL-1- Rezeptorbindungsstelle unterscheidet.

(11) Inhibierung der Bindung an den IL-1-Rezeptor auf Fibroblast (Test B)

In jede der Vertiefungen, in denen Fibroblasten wuchsen, wurde ¹²&sup5;I-markiertes IL-1α, 10 ng/ml IL-1β und eine spezielle Menge an erfindungsgemäßem Antikörper plaziert. Das Gemisch wurde in gleicher Weise wie beim obigen Verfahrensablauf (10) umgesetzt. Nach ähnlichem Zentrifugieren der Platte wurde die Radioaktivität der Vertiefung gemessen, und die Aktivität (%) des vorliegenden Antikörpers zur Inhibierung von IL-1β beim Binden an den IL- 1-Rezeptor auf dem Fibroblasten wurde berechnet. In diesem Test betrug der Wert A 8278 cpm/Vertiefung, und der Wert C betrug 410 cpm.
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse, die durch Antikörper der Erfindung erreicht wurden, d.i. ANOC 203 und 205. Tabelle 4 Antikörperkonzentr. Inhibierungsaktivität
Tabelle 4 läßt folgenden Schluß zu. IL-1β inhibiert ¹²&sup5;I- markiertes IL-1α vom Binden an den IL-1-Rezeptor, wohingegen der vorliegende Antikörper ANOC 203 die Stelle erkennt, wo IL-1β an den IL-1-Rezeptor bindet, IL-1β vor dem Binden an den Rezeptor inhibiert und somit eine wiedergewonnene Bindungs-Inhibierungsaktivität zeigt. Der vorliegende Antikörper ANOC 205 erkennt die IL-1-Rezeptorbindungsstelle für IL-1β nicht, offensichtlich in Ermangelung wiedergewonnener Bindungs-Inhibierungsaktivität.

Beispiel 2

Herstellung des Antikörpers gegen Human IL-1α

Klone, die den gewünschten Antikörper gegen Human IL-1α produzierten, wurden in gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhalten unter Verwendung von Human IL-1α, hergestellt in gleicher Weise wie das oben verwendete Human IL-1β (Nature, 315, S. 641 (1985)) als ein Immunisierungsantigen. ANOC 301, ein Antikörper der Erfindung gegen IL-1α, wurde aus den Klonen erhalten. Dieser Antikörper hatte die folgenden Merkmale.
Unterklasse : IgG2a
Antikörper-Produktionshöhe : 75 ug/ml
Wirksamkeit : RIA X3200 EIA X2000
Kreuzreaktivität : keine Kreuzreaktivität auf IL-2, IL-1β, GM-CSF und TNF
Bindungskonstante (kd) : 3,6 · 10&supmin;&sup8; M/L
Neutralisierungsaktivität : aktiv
Jede der in den Beispielen erhaltenen vier Hybrid-Zellinien wurde im Fermentation Research Institute, Agentur für Industrielle Wissenschaft und Technik, seit 5. November 1987 unter den folgenden Hinterlegungsnamen und -nummern hinterlegt. (1) Hybrid-Zellinie die ANOC 203 produziert Name Nummer

Claims

1. Monoklonaler Antikörper gegen Human-Interleukin-1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper eine spezifische Reaktionsfähigkeit mit Human-Interleukin-1α oder Human- Interleukin-1β aufweist.

2. Antikörper nach Anspruch 1, der eine spezifische Reaktionsfähigkeit mit Human-Interleukin-1α aufweist.

3. Antikörper nach Anspruch 1, der eine spezifische Reaktionsfähigkeit mit Human-Interleukin-1β aufweist.

4. Antikörper nach Anspruch 1, der eine Aktivität aufweist, die biologische Aktivität von Human-Interleukin-1 zu neutralisieren.

5. Antikörper nach Anspruch 1, der eine Erkennungsstelle in der Sequenz der Aminosäure Nr. 121 bis 140 von Human- Interleukin-1β hat.

6. Antikörper nach Anspruch 1, der eine Erkennungsstelle in der Sequenz der Aminosäure Nr. 24 bis 82 von Human- Interleukin-1β hat.

7. Antikörper nach Anspruch 1, der eine Erkennungsstelle in der Sequenz der Aminosäure Nr. 83 bis 102 von Human- Interleukin-1β hat.

8. Antikörper nach Anspruch 1, der eine Erkennungsstelle in der Sequenz der Aminosäure Nr. 145 bis 148 von Human- Interleukin-1β hat.

9. Antikörper nach Anspruch 1, der durch die Hybrid-Zellinie FERN BP-1551 produziert wird.

10. Antikörper nach Anspruch 1, der durch die Hybrid- Zellinie FERM BP-1552 produziert wird.

11. Antikörper nach Anspruch 1, der durch die Hybrid- Zellinie FERM BP-1553 produziert wird.

12. Antikörper nach Anspruch 1, der durch die Hybrid- Zellinie FERM BP-1554 produziert wird.

13. Verwendung eines Antikörpers nach den Ansprüchen 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung einer Krankheit verwendbar ist, die eine abnormal große Menge an IL-1 produziert.