JPH07145080A - 新規の抗−タンパク質仲介物質キット、それらの製造方法及びそれらを含む医薬組成物 - Google Patents

新規の抗−タンパク質仲介物質キット、それらの製造方法及びそれらを含む医薬組成物

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JPH07145080A
JPH07145080A JP6170967A JP17096794A JPH07145080A JP H07145080 A JPH07145080 A JP H07145080A JP 6170967 A JP6170967 A JP 6170967A JP 17096794 A JP17096794 A JP 17096794A JP H07145080 A JPH07145080 A JP H07145080A
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antibody
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ブレリー ヘルベ
Felix Alejandro Montero-Julian
アレジャンドロ モンテロ−ジュリアン フェリス
Bernard Klein
クレーヌ ベルナール
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、新規の治療的な抗- タンパク質仲
介物質キット、それらの製造方法及びそれらを含む医薬
組成物を提供することを目的とする。 【構成】 本発明のキットは、短寿命のタンパク質仲介
物質であって少なくとも3 つの抗体結合部位を含んで成
るのに十分なサイズを有しているタンパク質仲介物質を
中和するために、そのタンパク質仲介物質の3 つの明確
なエピトープを認識する少なくとも3 つの別々の抗体で
あってその中の少なくとも1 つがそのタンパク質仲介物
質の生物学的活性を遮断するような抗体を含んで成り、
例えば、サイトカン、好ましくはIL-6を、インビボにお
いて、遊離IL-6のものよりもより長いインビボにおける
残留時間をもつ免疫複合体の形態で後者の蓄積を回避し
ながら、そのサイトカインに結合する剤により、選択的
に遮断することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野及び従来の技術】インターロイキン
6(IL-6) は、多くに病的過程に関係する。特にIL-6は、
多発性骨髄腫及び単芽球性急性白血病を含む幾つかの腫
瘍のためのインビボにおける基本的な成長因子である。
それは、腎臓肉腫及びカポジ肉腫を含む他の多くの腫瘍
のための成長因子である。IL-6は、インビボにおいて、
肝臓細胞内の急性期タンパク質の合成を誘導する主要な
仲介物質であり、そしてこのようなやり方で敗血性ショ
ックの間の急性全身性炎症応答に係わっている。IL-6
は、B リンパ球による免疫グロブリンの末梢分化及び生
産の誘導に参加しており、そしてそれ故に、B 成分に影
響を与える自己免疫疾患、例えば、リウマチ様関節炎及
びHIV 感染において観察されるオリゴクローンの活性化
及び高グロブリン血症に関係する。全てのこれらの理由
のために、IL-6のインビボにおける活性に拮抗させるた
めの方法及び生成物をもつことが望ましい。様々なアプ
ローチがこの目的を達成するために記載されてきた。幾
つかの免疫抑制剤及び抗炎症剤が、サイトカイン型の仲
介物質の合成を阻害する。しかしながら、これらの剤
は、たった1 つの仲介物質の活性を選択的に遮断しな
い。より選択的なアプローチが、特異的な拮抗剤により
インターロイキン-6レセプタを遮断することに在る。IL
-6レセプタ(IL-6R) をIL-6と競合的に結合させるモノク
ロナール抗体がEP-A-0409607中に記載されている。しか
しながら、IL-6レセプタ(IL-6R) は、血清中での高い濃
度における循環可溶性形態において生じ、そして肝臓細
胞内で特に発現されながら、組織内に広く分配されてい
る。これらの2 つの事実は、抗-IL-6R抗体による治療の
効果及び特異性を先験的に限定する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】他の可能性は、IL-6に
結合し、そしてそれがその膜レセプタに結合することを
防止する剤を使用することから成る。ヒト治療のために
使用できる幾つかのモノクロナール抗-IL-6 抗体が記載
されている( 例えば、DE-A-3939706を参照のこと。) 。
これらの中の1 つは、末期形質芽球性白血病の治療のた
めの臨床的検定。において使用されている(Klein, B. e
t al., "Murine anti-interleukin-6 monoclonal antib
ody therapy for a patient with plasma cell leukemi
a" Blood 78: 1198, 1991)。この検定は、IL-6が腫瘍増
殖を効果的に調節することを示した。しかしながら、患
者は治療に抵抗した。なぜなら、IL-6が抗IL-6抗体との
免疫複合体の形態において循環内に蓄積したからであ
る。WO-A-92 01472 は、多価免疫グロブリン複合体であ
ってその免疫グロブリンが一緒に結合しているものの使
用、及びヒトにおけるサイトカインの活性を中和するた
めのそれらの使用、並びに特に多量体の免疫グロブリ
ン、について開示している。このような複合体における
免疫グロブリンの数は、可溶性を考慮することにより、
限定される。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明は、サイトカン、
好ましくはIL-6を、インビボにおいて、例えば、IL-6の
場合においては、遊離IL-6のものよりもより長いインビ
ボにおける残留時間をもつ免疫複合体の形態で後者の蓄
積を回避しながら、そのサイトカインに結合する剤によ
り、選択的に遮断することができ、そしてより一般的に
は、特定のタンパク質仲介物質を遮断することができ
る、製品を提供する。このため、本発明の1 つの態様
は、少なくとも3 つの抗体結合部位をもつのに十分なサ
イズの短寿命タンパク質仲介物質を中和するための治療
キットであって、そのタンパク質仲介物質の3 つの別個
のエピトープを認識する少なくとも3 つの別々の抗体で
あってその3 つの抗体の中の少なくとも1 つがそのタン
パク質仲介物質の生物学的活性を遮断するものを含むキ
ットである。
【０００４】" 短寿命をもつタンパク質仲介物質" と
は、特に、循環する糖蛋白又はタンパク質仲介物質、特
にサイトカイン、例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL
-6、IL-7、IL-9、IL-10 、IL-11 、オンコスタチン-M(o
ncostatin-M)、造血成長因子、例えば、G-CSF 、GM-CS
F、M-CSF 、SCF 及び特にIL-6を意味する。これらの仲
介物質は、少なくとも3 つの明確な機能的な抗体部位を
含んで成るのに十分な大きさである。" キット" とは、
同一容器内の個々の抗体の組み合わせだけではなく、別
れた個々の容器内の抗体の会合をも意味する。このキッ
トは、抗体の使用のための好ましくは追加の指示書を含
んで成る。本発明に係る抗体及び対応する仲介物質を選
ぶために、ある者は、その仲介物質に対する抗体の阻害
能力を調査し、そして上記の少なくとも3 つの抗体がそ
れぞれの部位において活性があることを証明することが
できる。このような実験を、以下の実験パート中に記載
する。
【０００５】驚くべきことに、複合体仲介物質、例え
ば、IL-6の血漿半減期は、本質的に変更なく、約12〜24
時間だけれども、2 つの抗体の中のたった1 つの又は2
つのいずれかの使用にもかかわらず、その2 つの抗体の
中のたった1 つ又は少なくとも1 つがその仲介物質の活
性を遮断する場合には、本発明に係る3 つの抗体の混合
物と複合体を形成する同一の仲介物質の血漿半減期は、
その遊離の仲介物質のものと、すなわち、20分間のオー
ダーのものと類似する。本発明に係る上記の少なくとも
3 つの抗体の中の1 つがタンパク質仲介物質の機能を遮
断することができるということで十分であるけれども、
少なくとも3 つの抗体の中の2 つがこの性質を賦与され
ることが好ましい。本発明に従って使用される抗体は、
幾つかの好ましくはモノクロナールの抗体の会合であ
る。使用される抗体は、好ましくはIgG イソタイプの内
にある。正常には、マウス、ラット又はヒトIgG 、そし
て好ましくは、マウスIgG2a 又はヒトIgG1型の抗体が、
使用される。後者の2 つのタイプが、細胞レセプタ(FcR
I)の免疫グロブリンの定常部(Fc)のためのこれらの抗体
のより高いアフィニティーの視点において好ましい。使
用される抗体は、109 リッター/ モルを超える抗原につ
いてのアフィニティー及び好ましくは1010リッター/ モ
ルを超えるアフィニティーをもつべきである。
【０００６】本発明において使用される抗体は、動物、
特にネズミ起源の内にあるが、好ましくは、例えば、G.
Winter and C. Milstein により"Man-made antibodie
s", Nature Vol. 349, pages 293-299 中に記載されて
いるような技術の中の1 つにより完全に又は部分的にヒ
ト化されている。部分的にヒト化されたときは、少なく
ともそれらのFc部分がヒト化されている。ヒト化抗体の
治療的使用は、注射された製品の免疫原性の減少を導
く。これは、反復性又は遅延化治療のために有利である
ことができる。そのFc部分がヒト型IgG1抗体由来である
キメラ抗体を使用すること、それ故、同時に、注射され
た製品の免疫原性を減少させ、そしてヒトFcレセプタに
ついてのこれらの抗体のより高いアフィニティーから利
益を得ることが、特に有利である。したがって、本発明
の1 つの主要な用途は、ヒト起源の抗体由来のペプチド
配列を含むように遺伝子操作により修飾された、1 又は
幾つかのいずれかの、好ましくはマウス又はラットのモ
ノクロナール抗体を含むキットから成る。本発明に記載
のこのような態様に例は、その起源がマウス又はラット
のモノクロナール抗体である抗原結合断片、ヒト起源の
Fc断片のレセプタに結合する少なくとも1 の部分を含ん
で成る、1 又は幾つかのいずれかのハイブリッド抗体を
含むキットから成る。本発明の実施の他のタイプは、ヒ
トB リンパ球クローンのから得られた、又はヒト免疫レ
ーパートリーの遺伝子のインビボにおける組換えにより
得られた、1 又は幾つかのいずれかの抗体を含む本発明
に係るキットから成る。
【０００７】本発明に係る抗体の混合物は、例えば、以
下の会合: -BE4, BE8 及びAH65、BE4, AH64 及びAH65、及び -BE4, BE8, AH64 及びAH65 により構築されたものである。ハイブリドーマBE4 及び
BE8 は、それぞれ、寄託番号1-911 及び1-913 により19
89年11月22日にCollection Nationale de Culture de M
icroorganismes of Paris に寄託された。ハイブリドー
マAH64及びAH65は、それぞれ、寄託番号1-1333及び1-13
34により1993年7 月13日にCollection Nationale de Cu
lture de Microorganismes of Paris に寄託された。抗
体BE4 、BE8 、AH64及びAH65の記載は、後に実験パート
中に提供される。本出願は、また、先に記載したような
抗体の会合又はキットの製造方法であって、そのタンパ
ク質仲介物質の3 つの別個のエピトープを認識する少な
くとも3つの抗体であってその3 つの抗体に中の少なく
とも1 つがそのタンパク質仲介物質の生物学的活性を遮
断するものを会合させることを含んで成る方法に関す
る。この会合(association) は、示したように、同一の
容器内の個々の抗体の混合物又は好ましくはそれらの使
用のための指示書を含む1 つの包装内に組み合わされた
別々の容器内にあることができる抗体のいずれかに関す
ることができる。上記の方法を実施するための有利な条
件の下で、仲介物質及び抗体の好ましい選択が等しく適
用される。上記の会合物又は治療キットは、顕著な性質
を賦与される。それらは、治療される個体がその治療に
対して抵抗性とならないような、すなわち、その治療が
免疫複合体の蓄積を伴わなずに有益な効果を作り続ける
ような、ヒト又は動物内でそれらが向けられるところの
仲介物質の活性に、顕著に拮抗することができる。
【０００８】上記の性質は、後に実験パート中に説明さ
れ、そして医薬としての上記抗体会合物の使用を正当化
する。このように、本出願は、さらに、対象として、先
に記載したようなキット又は会合物から成る医薬をも
つ。これらの医薬は、例えば、それが様々な病的症状の
下でインビボにおける活性を阻害するのに有利であろう
ところの仲介物質に対して作用させるために使用され
る。特に、本法は、有益には、2 つのタイプの病的症状
において:a) 正常には循環中で検出できないサイトカイ
ン型分子の慢性的低レベル生産の場合において、及びb)
サイトカイン型分子の組織の広範囲に及ぶ急性生産の場
合において、使用されることができる。本発明の1 つの
態様は、したがって、腫瘍の成長に味方するサイトカイ
ンの働きを遮断するように記述された上記抗体の会合物
を使用することから成る。主な用途は、悪性の血液失
調、例えば、急性骨髄性白血病、B-細胞リンパ腫及び多
発性骨髄腫におけるIL-1、IL-6及びGM-CSFの、並びにT-
細胞リンパ腫におけるIL-2、IL-7及びIL-9の、インビボ
における阻害である。特に、重要な態様は、それについ
てIL-6が不可欠な増殖因子である多発性骨髄腫に対する
IL-6の作用のインビボにおける阻害から成る。他の重要
な使用方法は、Hodgkin's リンパ腫におけるIL-4及びIL
-5の作用のインビボにおける阻害から成る。
【０００９】本発明の他の用途は、増殖がその仲介物質
により助けられる場合の固体性腫瘍におけるサイトカイ
ン型仲介物質の阻害に関する。主な用途は、特に、カポ
ジ肉腫におけるIL-6の作用のインビボにおける阻害であ
る。他の主な使用方法は、カポジ肉腫におけるオンコス
タチン-Mの作用の遮断に在る。急性の症状においては、
その働きが阻害されなければならない仲介物質を素早く
遮断し且つ取り除くことが必要である。したがって、記
載した方法は、特にこのような症状に適用される。考え
られる1 つの用途は、敗血症におけるIL-1及びIL-6の阻
害から成る。重要な使用方法は、過好酸球増加症候群に
おけるIL-5の作用のインビボにおける阻害に在る。特に
重要な用途は、特に、多発性骨髄腫、及び先に述べたよ
うな様々な悪性の血液失調の場合における、並びにカポ
ジ症候群をもつエイズ患者についての、IL-6によりその
成長が助けられる腫瘍を患う患者に影響を与える敗血症
(sepsis)の症状の発現(episode) の間の組織の広範囲に
及ぶIL-6の作用の阻害から成る。これらの用途は、本発
明により標的化された様々な薬理学的活性の起源におけ
る様々な短寿命タンパク質仲介物質に視点における例示
の方法によってのみ、引用される。このように、本出願
は、また、対象として、少なくとも3 つの抗体部位を含
むのに十分なサイズの短寿命のタンパク質仲介物質の活
性に拮抗する方法であって、そのタンパク質仲介物質の
3 つの別個のエピトープを認識する少なくとも3 つの抗
体の会合物であってその3 つの抗体の中の少なくとも1
つがそのタンパク質仲介物質の生物学的活性を遮断( 又
は中和) するのに十分な量であるものを使用するような
方法を、もつ。
【００１０】先に記載した方法の好ましい態様において
は、第一に、先に記載した会合物を、先に述べた様々な
病的症状に対して顕著に戦うために、これも先に記載し
た仲介物質に拮抗させるために、使用する。また、本発
明は、対象として、それらが少なくとも1 の先に記載し
た医薬を含むということを特徴とする医薬組成物をも
つ。一般的に言えば、第一に使用されることができる医
薬組成物は、注射可能な調製物である。抗体は、液体又
は固体の形態で、例えば、凍結乾燥形態で保存されるこ
とができる。主な用途は、3 つの抗体が同一バイアル内
にあるようなもののためのものである。他の態様におい
ては、注射されるべき3 つの注射可能な抗体は、3 つの
別々のバイアル内にある。本発明の用途のすべてにおい
ては、3 つの抗体が、1 又は幾つかの活性動因並びに有
用なアジュバントがその組成物の薬理動態特性上に担持
されながら、医薬組成物内で組み合わされることができ
る。治療される患者、関連する疾患及び注射された組み
合わせ物を構成する抗体の特性に従って変動する普通の
投与量は、例えば、1 日当たり1 から25mgまで変動し、
組み合わせ(BE4 + BE8 + AH65)についてヒト内に静脈中
に投与され、そして多発性骨髄腫を患った患者における
敗血性の症状発現の間の10〜20日間にわたり毎日投与さ
れることができる。
【００１１】
【実施例】以下の実施例は、本発明を説明するものであ
り、これを限定するものではない。 1. 抗IL-6抗体 モノクロナールの抗- サイトカイン抗体を、様々な株の
マウス( 例えば、Balb/c又はDBA2) を部分的に又は完全
に精製したヒト組換えサイトカインにより免疫感作し、
そして慣用の手順に従って免疫感作されたマウスの脾臓
をX63 型のネズミ骨髄腫と融合させることにより、得る
ことができる。精製されたサイトカインを使用して抗-
サイトカイン抗体産生ハイブリドーマを選択することが
好ましい。本発明中で記載されるような治療キットの使
用可能な抗体は、さらに、特定の性質、すなわち、(1)
これらの抗体の少なくとも3 つがIL-6に同時に結合する
能力;(2)これらの抗体の少なくとも1 つがIL-6の生物学
的活性を遮断する能力、をもたなければならない。これ
らの2 つの基準に従って抗体の選択を許容する実験手順
を、以下に記載する。以下の例において使用されるマウ
スのモノクロナール抗体は、それぞれ、BE8、BE4 、AH6
4及びAH65と言われる。抗体BE4 及びBE8 を作り出すハ
イブリドーマは、寄託番号BE8: CNCM 第1/913 号; BE4:
CNCM第1/911 号により、1989年11月27日にCollection N
ationale de Culture de Microorganismes(CNCM)にPari
s において寄託され、そして記録されている。精製抗体
を、Besancon( フランス国) のCTS において商業的に得
た。これらの抗体についての完全な記載は、EP-A-04301
93及びDE-A-3939706中に提供される。精製抗体を+4℃に
おいて無菌で保管した。
【００１２】AH64及びAH65として命名された抗体の場合
においては、対応するハイブリドーマ( それぞれ、D801
D6M 及びD8812D3M) を、慣用の技術に従って培養した。
抗体を、nu/nu マウスの腹水内で生産し、そして次に、
最新法に従って、プロテインA(Pharmacia)カラム上で精
製した。精製抗体の溶液を、最終的に0.22μm における
濾過により滅菌され、そして+4℃において保存された等
張性の0.9g/lの生理食塩水溶液中で希釈した。抗体AH64
及びAH65を作るハイブリドーマは、寄託番号AH64: CNCM
第1/1333号; AH65:CNCM 第1/1334号により、1993年7 月
13日にCollection Nationale de Culture de Microorga
nismes(CNCM)にParis において寄託され、そして記録さ
れている。
【００１３】2. 本発明に係る治療キットにおいて使用
されることができる抗体の特徴 2.1. 使用された抗-IL-6 抗体の阻害能力の特徴付け:I
L-6の生物学的活性をインビボにおいて遮断するように
設計された抗-IL-6 抗体から成る治療キットは、その仲
介物質の生物学的能力を阻害する少なくとも1の抗IL6
抗体を含んで成らなければならない。IL-6活性を阻害す
るこの能力は、IL-6活性を測定する生物学的検定の助け
を借りてインビトロにおいて評価されることができる。
IL-6の生物学的活性は、L.A. van Aarden(Eur. J. Immu
nol. 17:1411, 1987)により記載されている、IL-6- 依
存性ネズミ形質細胞系、B9の助けにより、測定される。
この系は、5% CO 2 を伴い調湿されたインキュベーター
内で、RPMI 1640 培地((ATCC catalog, 1988 edition,
page 354中の組成、2mM L-グルタミン、1mM ピルベー
ト、50 IU/mlのペニシリン及びストレプトマイシンであ
って、10v:v%のウシ胎児血清(Gibco) を補われ、そして
25pg/ml のヒト組換えインターロイキン-6(Prepotech,
Rocky Hill, NJ, USA)を含むものを参照のこと。) 中
で、37℃において培養される。培養のための製品の全て
を、Flow Laboratories, Scotland により提供した。
【００１４】この系を、それぞれ48時間継代し; その細
胞懸濁液の濃度を、5 x 105 細胞/ml 未満に保った。実
際の生物検定を、以下の様に行った: 検定に先立つ夕方
に、細胞懸濁液を遠心分離し、RPMI 1640 中で3 回洗浄
し、そして前と同一の培地であるがIL-6を含まないもの
の中に2 x 105 細胞/ml において培養物中に戻した。こ
の生物検定のために、細胞懸濁液を遠心分離し、105 細
胞/ml にけるIL-6を含まない完全培地中に取り出し、そ
して100 μl/ウェル、すなわち、2 x 104 細胞/ml にお
いて96- ウェル・マイクロタイター・プレート(Falcon)
に添加する。完全培地中のIL-6の、又はテストされるべ
き阻害剤の存在中のIL-6の、様々な測定された希釈(0.5
〜50pg/ml)を、このマイクロタイター・プレートに添加
する。培養の48時間後、0.25μCiのトリチウム化したチ
ミジン(Amersham)を、それぞれのウェルに添加し、そし
てそのマイクロタイター・プレートを、37℃において8
時間インキュベートする。最後に、その細胞を、沈降剤
(Skatron) の助けによりフィルター上に沈降させ、その
フィルターをポリプロピレン・チューブに移し、これに
3ml のシンチレーション液(Amersham)を添加し、そして
その細胞ペレット内に取り込まれた放射能を、ベータ・
カウンター(Kontron) 内で測定する。
【００１５】異なるIL-6希釈における放射能の取り込み
についての標準レンジを確立し、与えられたIL-6含有サ
ンプルについての細胞により、又はIL-6の阻害剤の存在
中で、取り込まれた放射能を、その標準レンジの対応す
る値と比較する。それぞれの点について、測定を、3 つ
のウェルを使用して行う。 実験番号1:使用した4 つの抗体(AH64, AH65, BE4, BE8)
を、インターロイキン-6により誘導された系B9の増殖を
阻害するそれらの能力に関して特徴付けた。その検定
を、一定濃度の換算されたIL-6(25pg/ml) 及び先に記載
した実験条件下でテストされた様々な希釈の抗体によ
り、行った。それぞれの抗体について、得られた滴定曲
線は、25pg/ml のIL-6の存在中、50% 程、B9系の増殖を
阻害するのに必要な濃度(ED50)を測定することを可能に
する。結果を、表A 中に示す。この4 つの抗体は、IL-6
の活性の阻害剤である。抗体AH65は、最も有効である。
薬理学的使用の視点から、テストされた3 つの抗体の中
のいずれか1 つが、その後に使用されることができるで
あろうが、有効投与量を減少させるためには、最も高く
阻害性の抗体、例えば、AH65を、幾つかの抗-IL-6 抗体
を組み合わせる調製物内に含むことが、より有利であろ
う。
【００１６】
【表１】
【００１７】実験番号2: 抗体阻害剤の組み合わせの共
同作用的(synergistic) 効果 IL-6依存性B9系の増殖を遮断する抗-IL-6 抗体の組み合
わせの阻害的効果を評価することを試みた。この検定
を、測定されたIL-6の一定濃度(25pg/ml) 及び、抗体AH
64又はAH65の中のいずれか1 つ、又は等しい濃度におけ
るこれらの2 つの抗体の混合物の様々な希釈により、行
った。それぞれの組み合わせの阻害能力を、50% 程、B9
の増殖を阻害する抗体の全投与量に基づき評価する。抗
体の阻害的投与量がその混合物を構成する抗体の中の1
のそれぞれについての抗体の投与量よりも混合物を使用
した時に、より低いものを、見つける。このように、等
部におけるAH65 + AH64 の混合物の阻害的投与量は、AH
65の阻害的投与量よりも3 倍低く、そしてAH64の阻害的
投与量よりも20倍低い。
【００１８】これは、阻害性抗体の組み合わせの効果の
共同作用を証明している。それ故、IL-6のインビボにお
ける活性を阻害するために、幾つかの阻害性抗体のい組
み合わせを使用することが有利である。2.2 抗-IL-6 抗
体に結合するIL-6エピトープの定義- インターロイキン
-6の酵素 免疫検定 始めに、モノクロナールの抗-IL-6 抗体により被覆され
たマイクロタイター・プレートを調製する。この目的の
ために、精製IL-6に対する抗体の溶液(PBSといわれる20
mMリン酸塩、0.15M NaCl、pH 7.5バッファー中の10μg/
ml) を、96ウェルのポリスチレン・マイクロタイター・
プレート(Nunc)のウェル内で+4℃において24時間インキ
ュベートした。このプレートを、自動洗浄器(SLT, Salz
burg) の助けを借りて洗浄し;300μl/ウェルの、10g/l
のウシ血清アルブミン(Boehringer, Mannheim)を含むPB
S 溶液を、次に、室温におけるさらなる4 時間インキュ
ベーションの間に添加した(PBS-BSAバッファー) 。同時
に、テストされるべき異なる抗体を、製造者の指示に従
ってビオチン-N- ヒドロキシスクシンイミド・エステル
(Boehringer, Mannheim)とそれらを反応させることによ
りビオチン化する。
【００１９】実際の免疫検定を、以下のやり方で行っ
た:抗-IL-6 被覆マイクロタイター・プレートに、順番
に、100 μl の、PBS-BSAバッファー又はPBS-BSA 中の1
若しくは10ng/ml のIL-6溶液のいずれかを、その後、1
00 μl の、同一のバッファー中で1mg/mlに希釈したビ
オチン化した抗体溶液を、添加した。特定の実験におい
ては、このビオチン化モノクロナール抗-IL-6 抗体を、
第三の抗-IL-6 抗体の10μg/ml溶液に添加する。このマ
イクロタイター・プレートを+4℃において4 時間インキ
ュベートし、次に洗浄溶液(PBS-Tween80 、自動洗浄溶
液(STL) との0.05%v:v) により3 回洗浄する。第二段階
においては、それぞれのウェルに、PBS/BSA 中で1:10,0
00に希釈したペルオキシダーゼに結合したストレプトア
ビジンの200 μl の溶液(Jackson) を添加した。室温に
おいて1 時間半のインキュベーションの後、このプレー
トを、前にように洗浄し、そしてアビジン- ペルオキシ
ダーゼ、及びこの故のビオチン化抗体の結合は、それぞ
れのウェルに1mg/mlのo-フェニレンジアミン・ジヒドロ
クロリド(Sigma)を含む200 μl の基質溶液及び10mlの
0.1M, pH 4.5リン酸塩- クエン酸塩バッファー中で30%
に希釈された10μl のH 2 O 2 を添加することにより、
比色計内反応において表された。それぞれのウェルの49
2nm における吸光度を、マイクロタイター・プレート・
リーダー(SLT, Salzburg) 内で測定する。ある者は、対
応する免疫検定における陽性シグナルが得られる場合
に、2 つの抗体がIL-6の区別されるエピトープに結合し
ていると、結論付けることができる。最後に、3 つの抗
体は、第三抗体の存在が抗体の与えられた結合により得
られた陽性シグナルに影響を及ぼさない場合に、IL-6に
同時に結合することができる。
【００２０】実験番号3: 免疫計量型検定における可能
なすべての組み合わせをテストするための4 つの抗-IL-
6 抗体、AH65、AH64、BE8 及びBE4 により被覆されたマ
イクロタイター・プレート並びに4 つの対応するビオチ
ン化抗体を、調製した。この検定を先に記載した手順に
従って行う。結果を、インキュベートされたIL-6の1ng/
mlについて492nm における吸光度として表す。この4 つ
の抗体は、3 つの群:AH65 、BE4 及びAH64とBE8 とに共
通なエピトープに入るようである( 表B)。この結果は、
3 つの抗体が同時にIL-6に結合することができるという
ことを示唆している: この可能な組み合わせは、AH64,
AH65及びBE4 又はAH65, BE4 及びBE8 である。
【００２１】
【表２】
【００２２】実験番号4: 第二の実験は、3 つの独立し
た同定された抗体の組み合わせが実際に同時にIL-6に結
合することができるであろうということの確認を導い
た。この目的のために、免疫検定を、それぞれの組み合
わせの第三の抗体の存在中で交換可能な抗体の様々な対
により、走らせた。ビオチン化対(AH64 、AH65) につい
て得られたシグナルを10μg/mlにおいて抗体BE4 の存在
により影響を受けなかった。同様に、カップル(BE4、BE
8)について得られたシグナルは、抗体AH65の存在により
影響を受けない。このことから、ある者は、2 つの組み
合わせ、一方におけるAH64 + AH65 +BE4、及び他方にお
けるAH65 + BE8 + BE4、の場合において、3つの抗体が
インターロイキン-6に同時に結合することができ、その
分子の区別できるエピトープを定めるということを、結
論付ける。
【００２３】インビボにおける放射標識IL-6の薬理動態
及び抗-IL-6 抗体の中の1 つ又は幾つかの注射の効果 3 つの明確なIL-6エピトープに同時に結合する3 つの抗
体の注射は、免疫複合体の形態における標的分子の安定
化及び蓄積を防止する。反対に、2 つの抗体の中のたっ
た1 つ又は2 つの抗体の注射は、標的分子を安定化し、
そして循環内のその持続性を増加させる。これらの3 つ
の実験結果は、標的分子の3 つの明確なエピトープに結
合する3 つの抗体から成る治療キットの優秀性を証明し
ている。3.1 125 I によるインターロイキン-6の放射
標識 ヒト・インターロイキン-6(CLB, Amsterdam により供給
された大腸菌(E.coli)内で作られた組換え分子) を、以
下に簡単に想起するようなクロラミンT 法により放射標
識した: 試験管内に、pH 7.5の等張性生理食塩水リン酸
塩バッファー(PBS) 中の100 μg/mlの濃度における2 μ
g のIL-6及び100mCi/ml におけるNa125I(Amersham) の
0.5mCiの溶液を、順番に添加する。次に、この反応を、
PBS 中の1mg/mlにおけるクロラミンT(Merck)の10μl の
溶液の添加により開始させる。この反応混合物を、室温
(18-23℃) において正確に10秒間インキュベートし、そ
してその反応を、グリシル- チロシンの10mM溶液(Bache
m)の50μl の添加により、終了させる。1 分間のインキ
ュベーションの後、その混合物を、10g/l のウシ血清ア
ルブミン(Boehringer)(PBS/BSA) をPBS バッファー中で
0.5ml の最終容量まで希釈する。この混合物を、次に、
PBS-BSA 中で前飽和させた50cm Sephadex 650 ファイン
(Pharmacia) カラム上の分子篩いにより分画する。この
カラムを、10ml/ 時間の流速においてPBS-0.2%BSA によ
り溶出させ、そして2ml の画分を集める。それぞれの画
分の放射能を、ガンマ・カウンター(Packard) 内で測定
し、そしてIL-6濃度を、商業的な免疫検定(Immunotech)
により測定する。放射標識されたIL-6を含む画分を、次
に、3 x 107 cpm/mlの溶液を得るようにPBS-BSA 中で希
釈する。最終的な比活性を、IL-6の濃度の他の免疫検定
により得る。この比活性は、常に、7.5 x 106 から17 x
10 6 cpm/p モルまでの、すなわち、3 から6 x105 cpm
/ngまでの範囲にある。
【００２４】3.2 放射標識IL-6の薬理動態 インビボにおける薬理動態実験を、(Charles Riverによ
り供給された) 生後19週間の雌Balb/cマウスにより行
い、そして標準的な条件下で飼養した。実験に先立つ夕
方に、動物に、滅菌非発熱原性PBS-BSA 中で希釈したテ
スト剤の50μl の量を静脈内に与える。対照動物は、等
張性溶液のみを受ける。実験の日に、それぞれのマウス
に、50μl の放射標識したIL-6溶液を、すなわち、正確
に106 cpmを、静脈内に注射する。与えられた時間間隔
の後(5、10、30、60分間、3 、6 及び24時間の後) 、そ
の動物を殺し、そして精密秤により計量する。Pasteur
ピペットを使用して、そして標準的な技術に従って、1.
5ml の末梢血液を、ヘパリン含有チューブに添加し、そ
して直ちに、約500 μl の血漿を得るために遠心分離機
(Jouan) 内で4000G において5 分間、遠心分離する。次
に、動物を、解剖し、そして以下の臓器: 腎臓、肺、心
臓、脾臓、肝臓、腸及び甲状腺を分析するために摘出す
る。血漿及びそれぞれの臓器の放射能を、ガンマ・カウ
ンター(Packard) 内で測定する。それぞれの臓器により
取り出された放射能を、最後に、臓器の1 グラム当たり
に取り出された注射された投与量全体のパーセンテージ
として表す。最終的に、血漿サンプルを、存在する放射
性分子を同定するために分子篩いにより分画する( 以下
を参照のこと。) 。テストされたそれぞれの剤につい
て、及びそれぞれの時間点について、2 匹の動物を、並
行処理する。
【００２５】3.3 分子篩いクロマトグラフィー 放射標識されたIL-6により注射された動物の血漿を、分
子篩いカラム上の分画により分析する。このクロマトグ
ラフィーを、FPLC型(Pharmacia) クロマトグラフィー装
置によりSuperdex HI-充填16/60 カラム(Pharmacia) 上
で行う。100 μl の血漿サンプルを、適用する。カラム
を、2ml/分間の流速においてpH 7.5の等張性リン酸塩バ
ッファーにより溶出させる。1ml の画分を集め、そして
それぞれの画分の放射能を、ガンマ・カウンター(Packa
rd) 内で測定する。カラムを、推定されるべき、異なる
画分中に溶出された成分の分子量を決定することを可能
にする、タンパク質(Pharmacia) の混合物により分子量
について前換算した。 実験番号5: 非処理Balb/cマウス内の放射標識ヒトIL-6
の薬理動態を、先に記載した手順( 実験に先立つ夕方に
おける100 μl の等張性生理食塩水溶液の注射)に従っ
て、最初に検査した。結果を図１中に示す。血漿中の放
射能は、急速に減少している。血漿中の標識分子の半減
期は、40-60 分間と推定されることができる。テストさ
れた様々な臓器内の減少を示す曲線の平行性は、標識さ
れた分子の非特異的な蓄積が在ることを、示している。
放射標識IL-6の注射10分間後に取り出された血漿は、分
子篩いにより分画された。約25kDにおける放射能の主要
ピークは、遊離のIL-6に従ったものである溶出プロフィ
ール内のようである。
【００２６】実験番号6: 放射標識されたIL-6の除去
を、抗-IL-6 抗体により処理されたマウスにおいて分析
した。実験の先立つ夕方に、動物に、5 μg の、4 つの
抗体AH64、AH65、BE4 又はBE8 の中の1 つを注射した。
標識ヒトIL-6の薬理動態を、先のように研究した。結果
を、図３中に示す。血漿中の並びにテストされた様々な
臓器内の放射能は、非常によりゆっくりと減少した。血
漿中の標識分子の半減期の推定は、使用した抗-IL-6 抗
体に依存して、12と24時間の間にある。IL-6の注射後の
様々な時間間隔において存在する放射能の性質を確認す
るために、血漿サンプルを、先に記載した条件下で分子
篩いにより分画した。実施例により、抗体AH65により処
理された動物についての10分目及び6 時間目の点におけ
る溶出プロフィールを、図４中に表す。上記の2 つの時
間点において、その放射能は、約180kD の分子量に対応
する主要ピーク内において溶出された。この実験は、優
勢な血漿形態が、標識されたIL-6であり、1 価複合体に
おいて抗-IL-6 に結合されていることを、確かめた。抗
IL-6抗体により処理された動物内において、インターロ
イキン-6は、その後、安定化され、そして免疫複合体の
形態で蓄積される。
【００２７】実験番号7: 放射標識されたIL-6の薬理動
態を、その分子の異なるエピトープに結合する幾つかの
抗-IL-6 抗体の組み合わせにより処理された動物におい
て検定し; 以下の処理を使用した:AH64 + AH65、BE4 +
BE8 、AH65 + BE4 + BE8、AH64+ AH65 + BE4 + BE8 。4
つの抗体の組み合わせは、実際には、IL-6分子の3 つ
の区別されたエピトープに対応する。それぞれの処理に
ついて、注射された抗体の全投与量は、5 μg であっ
た。それぞれの抗体の同一量を、上記それぞれの組み合
わせにおいて使用した:2つの抗体の組み合わせについて
2.5 μg 、3 つの抗体の組み合わせについて1.66μg 、
及び4 つの抗体の組み合わせについて1.25μg 。IL-6の
除去の動態は、以下のようであった。2 つの抗体により
処理の場合には、放射能の除去速度は、たった1 のモノ
クロナール抗体により処理された動物において観察され
たものと近かった。この結果は、使用した2 対の抗体に
ついて類似である。AH64 + AH65 の組み合わせにより処
理された動物中への標識IL-6の注射の後に、15分目及び
2 時間目にそれぞれ取り出された血漿サンプルの分子篩
い画分は、2 価免疫複合体(IL-6 及び2 つの抗体) が、
実際に、循環IL-6の優勢な形態であることを示している
( 図５及び６を参照のこと。) 。
【００２８】IL-6の3 つの別個のエピトープに結合する
3 つの抗体( 例えば、AH65 + BE4 +BE8) により処理さ
れる場合には、放射標識IL-6の除去の開始速度は、遊離
IL-6のものに近い。放射能の組織分布の分析は、肝臓、
脾臓及び腸内のIL-6の特異的な一時的蓄積を示し、これ
は、除去の経路における変更を示唆している( 図７を参
照のこと。) 。血漿の分画は、3 価複合体(IL-6 及び3
つの抗体) が直ちに除去されることを示している。これ
らの複合体は、注射10分間後には、検出されない。この
優勢な循環形態は、モノマー及びダイマーの形態であ
り、これは、上記3 価の複合体が優先的に除去されると
いうことを、確かなものとしている。1 価及び2 価複合
体の存在は、それぞれ、ヨウ素化段階により導入された
異質性(heterogeneity) に基づく、トレーサーと使用さ
れた抗体との部分的反応性により説明されることができ
る( 図８を参照のこと。) 。
【００２９】4 つの抗体、AH65 + AH64 + BE4 +BE8によ
る処理の場合には、3 つの抗体だけが、IL-6に同時に結
合することができる。この混合物の注射は、IL-6との3
価複合体の2 つのタイプ、すなわち、AH64, AH65及びBE
4 を組み合わせたもの、AH65, BE4 及びBE8 を組み合わ
せた他のもの、の形成を成し遂げなければならない。観
察される薬理動態の挙動は、先に記載したものと非常に
類似している。特に、IL-6の除去の開始速度は、遊離の
IL-6のものに近い。ある者は、残存3 価複合体を注射10
分後に検出することができ、これは、注射1 時間後に完
全に消失した(図９) 。血漿の分画は、3 価複合体の優
先的な除去の減少を、確かなものとした( 図１０) 。
【００３０】4. 3 価免疫複合体の、p388DI 単球系の
免疫グロブリン・レセプタへの優先的結合 免疫複合体のインビボにおける除去の、経路及びその結
果としての動態は、この複合体が免疫グロブリンのため
のレセプタ担持細胞により認識される能力に依存する。
標的分子の3 つの別個のエピトープに結合することがで
きる3 つの抗体によりIL-6と形成された3 価の免疫複合
体は、その免疫グロブリン・レセプタに優先的に結合す
ることができる。この性質は、3 価の複合体と、1 価及
び2 価の複合体とを、区別する。以下の実施例により引
用された実験は、標的分子の3 つの別個のエピトープに
結合する少なくとも3 つの抗体を含んで成る混合物から
予測されることができる薬理動態の挙動における差異を
示す。同時に、その実験は、インビボにおける使用のた
めに必要な性質をもつ抗体の組み合わせの選択につい
て、容易に設定できるインビボ検定のための基礎を提供
する。
【００３１】4.1 ネズミp388 DI 系の培養 単球由来のネズミp388DI系は、ATCC(ATCC 番号TIB63)か
ら入手可能である。この系を、5% CO 2 の下37℃におい
て調湿インキュベーター(Narco incubator) 内で、非必
須アミノ酸、2mM グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウ
ム、50 IU/mlのペニシリン、50 IU/mlのストレプトマイ
シン及び全容量の10% 最終濃度までのウシ胎児血清を補
ったPRMI 1640 培地中で、連続培養において維持する。
これらの試薬のすべては、Flow Laboratories, Scotlan
d により提供された。この系を、250ml の培養容器(Fal
con)内で培養した。この細胞は、癒着性であった。細胞
が集密にあるとき、この培養物を、公開された手順に従
ってトリプシン-EDTA 溶液(Flow)により処理し、そして
得られた細胞懸濁液を、5 倍希釈の後に培養に戻す。こ
の結合実験を、集密に達した培養物から得られた細胞懸
濁液により行った。
【００３２】4.2 p388 DI系細胞による放射標識IL-6の
結合検定 最初に、p388 DI 系細胞懸濁液を、トリプシンにより制
御された処理による集密培養物から調製する。このよう
に得られた細胞懸濁液を、遠心分離により等張性生理食
塩水リン酸塩(PBS) により3 回洗浄する。この細胞を、
10g/l のウシ血清アルブミン(Boehringer)及び5mM のア
ジ化ナトリウム(Sigma) を含む等張性生理食塩水リン酸
塩バッファー、pH 7.5(PBS/BSA/N3 バッファーといわれ
る) 中に取り出し、そしてその細胞密度を、1 x 106 細
胞/ml に調整する。実際の結合検定については、細胞懸
濁液を、ウェル当たり100 μl 、すなわち、ウェル当た
り105 細胞において、丸底96ウェル・マイクロタイター
・プレート(Falcon, Becton Dickinson)に添加する。そ
れぞれのウェルに、次に、順番に、150 μl の、放射標
識IL-6の溶液を添加し、PBS/BSA/N 3 バッファー中で3
x 106 cpm/mlまで希釈し、その後のテストされるべき剤
の100 μl 溶液又は剤を同一バッファー中で希釈する。
この混合物を、インキュベーター(Narco) 内で37℃にお
いて振とうしながら2 時間インキュベートする。細胞に
より結合された放射能を、次に、先に記載した手順(Dow
er S.K. et al;, Biochemistry 20:6326, 1981) に従っ
て遊離の放射能から分離する。150 μl の細胞懸濁液
を、それぞれのウェルから取り出し、そして500 μl の
ポリプロピレン・チューブ(Eppendorf) 内の200 μl の
フタレート混合物(1.2容量の90% ジメチル・フタレー
ト、1 容量の97% ジ(2- エチル- ヘキシル) フタレー
ト) に添加する。このチューブを、Beckman マイクロフ
ュージ型遠心分離機内で10,000G において20秒間遠心分
離する。遠心分離後、遊離の放射能を含む50μl の水相
を取り出し、そして次に、そのチューブを、ハサミで切
り、結合放射能を含む細胞ペレットを得る。次にこのサ
ンプルを、ガンマ・カウンター(Packard) 内で計数し、
そして結果を、テストされた様々な条件下で結合したIL
-6の画分を得るために、異なる希釈について補正する。
この検定をそれぞれの条件について2 連において行う。
2 つの実験を、先に記載した手順(p388 DIへの結合検
定) に従って行った。
【００３３】実験番号8: 放射標識IL-6を、1 、2 、3
又は4 つの抗IL-6抗体の存在中で細胞懸濁液と共にイン
キュベートする。その実験において使用した抗体は、BE
4, BE8, AH64及びAH65である。抗体の全濃度は、全ての
条件下、3.57μg/ml( ウェル内の最終濃度) である。幾
つかの抗体が存在するとき、それらは、同一濃度におい
て存在し: 2 つの抗体が存在するときそれぞれの抗体に
ついて1.8 μg/mlであり-3つの抗体が存在するとき1.2
μg/ml-4つの抗体について0.9 μg/mlである。実験の結
果を表C 中に示す。抗体の非存在中、放射標識IL-6は、
p388 DI 系の細胞に結合しない。ある者は、放射標識IL
-6の結合が3 つの抗体の存在中により大きくなることを
発見する。この効果は、IL-6に同時に結合することがで
きる3 つの抗体についてのみ観察される。したがって、
BE8, BE4, 及びAH64を使用するとき、その結合レベル
は、BE8 とAH64との間の競合に対応する2 つの抗体の組
み合わせについて観察されるものに、対応する。本実験
は、3 価の免疫複合体の、免疫グロブリンの定常部を介
しての、レセプタへの優先的結合について証明してい
る。
【００３４】
【表３】
【００３５】実験番号9: 放射標識されたIL-6を、全抗
体の様々な濃度において3 つの抗-IL-6 抗体(AH64, AH6
5 及びBE4)の組み合わせと共に、インキュベートする。
3.57μg/mlの抗体の全てを含む溶液、すなわち、それぞ
れの抗-IL-6 抗体について1.2μg/mlから出発して、全
抗体の110mg/mlまでの一連の1:1 希釈物を、作る。この
希釈シリーズを、p388 DI 結合検定においてテストす
る。結果を表D 中に示す。テストしたすべての濃度にお
いて、AH64 + AH65 + BE4 の組み合わせは、放射標識IL
-6の有効な沈降を導いた。この結果は、3 価の免疫複合
体の優先的な結合が抗-IL-6 抗体の低濃度において生じ
ることを示している。
【００３６】
【表４】
【００３７】医薬組成物の例: 1)- 1mg の凍結乾燥AH65抗体 1mg の凍結乾燥BE4 抗体 1mg の凍結乾燥BE8 抗体 を含む、3 つのバイアルを調製し、 - 他のバイアルを、注射液の調製のために、2ml の水で
満たし、 - その4 つのバイアルを、使用書を備えた箱内に集め
た。 2)- 1mg の凍結乾燥AH65抗体 1mg の凍結乾燥BE4 抗体 1mg の凍結乾燥BE8 抗体 を含むバイアルを調製し、 - 第二のバイアルを、注射液の調製のために、2ml の水
で満たし、 - その2 つのバイアルを、使用書を備えた箱内に集め
た。
【００３８】
【発明の効果】
結論 1)サイトカイン型分子は、この分子に同時に結合するこ
とができる3 つのモノクロナール抗体を同定し、そして
これ故に3 価の免疫複合体を形成することができる。こ
の基準を満足し、そして標的分子の生物学的活性を阻害
する少なくとも1 の抗体を含む会合物を同定することが
できる。 2)サイトカイン型分子を認識するモノクロナール抗体が
動物内に注射されるとき、得られた抗体- サイトカイン
免疫複合体がその抗体自体と同じやり方で除去される。
その抗体に結合したサイトカインの残留時間は、遊離の
サイトカインのものより10倍優れている。この抗体の注
射は、1 価の免疫複合体の形態でのサイトカインの蓄積
を導き、この事実は、その治療の効果を汚す。 3) 3つの別個のエピトープを認識する3 つの抗- サイト
カイン抗体の同時注射は、循環から急速に除去される複
合体の形成を導く。この場合には、その活性を阻害しよ
うとするところのサイトカインの蓄積が存在しない。こ
の結果は、3 価複合体によってのみ特異的に得られ;2価
複合体は、1 価複合体と同様に除去される。それ故、上
記サイトカイン型分子のインビボにおける活性を阻害す
るために、サイトカイン型分子の3 つの別個のエピトー
プに結合する3 つの抗体の会合物を使用することが有利
である。 4)サイトカイン型分子と、その分子の別個のエピトープ
を認識する3 つの抗体との反応により得られた3 価免疫
複合体は、免疫グロブリンの定常部のためのレセプタ(F
cR) により優先的に結合される。この結果は、3 価複合
体によってのみ特異的に得られ、2 価複合体は、有意に
は、FcR に結合しない。この結果は、網組織球系(retic
ulohistiocytary system) を介しての標的分子の除去を
可能にすることができる3 抗体の組み合わせのインビボ
における使用の利点を、確かなものとする。
【００３９】5)2 つの抗サイトカイン抗体、並びに阻害
剤であって、そのサイトカインの2つの別個のエピトー
プを認識する会合物の使用は、標的分子の活性を遮断す
るのに必要な抗体の全体量を減少させる。それ故、遮断
抗体の会合物をインビボにおいて使用すること、そして
さらに、先に記載した結果の視点において、標的分子の
3 つの別個のエピトープを認識し且つ少なくとも2 つの
遮断抗体を含む3 つの抗体の会合物を使用することが、
有利である。 6)得られる免疫複合体が非常に安定であり且つ 3価の形
態が優勢であるように、使用する抗体が抗原に高いアフ
ィニティーをもつことが、その製造の効果のために有利
である。溶液中でのタンパク質抗原との結合動態は、抗
体から抗体へほとんど変化しない。反対に、形成された
免疫複合体は、より大きな又はより小さな安定性をもつ
ことができる。抗原- 抗体結合の半減期が循環中の抗体
の半減期よりもより大きいことが有利である。この基準
は、109 を超える、そして好ましくは1010リッター/Mの
アフィニティーをもつ抗体により、満足される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、放射標識ヒトIL-6の、それぞれの臓器
についての薬理動態を示す。
【図２】図２は、放射標識ヒトIL-6の注射10分後の血漿
サンプルの分子篩いにおける放射性分子の溶出プロフィ
ールである。
【図３】図３は、放射標識ヒトIL-6、IL-6 +抗-IL-6 抗
体AH65、及びIL-6 + 抗-IL-6抗体AH64の、それぞれの
臓器についての薬理動態を示す。
【図４】図４は、抗体AH65により処理された動物につい
ての注射10分後及び6 時間後の血漿サンプルの分子篩い
における放射性分子の溶出プロフィールである。
【図５】図５は、放射標識ヒトIL-6、IL-6 +抗-IL-6 抗
体AH65 + AH64 、及びIL-6 +抗-IL-6 抗体BE8 + BE4
の、それぞれの臓器についての薬理動態を示す。
【図６】図６は、抗体AH64 + AH65 により処理された動
物についての注射15分後及び2時間後の血漿サンプルの
分子篩いにおける放射性分子の溶出プロフィールであ
る。
【図７】図７は、放射標識ヒトIL-6、IL-6 +抗-IL-6 抗
体AH65、及びIL-6 + 抗-IL-6抗体AH65 + BE8 + BE4
の、それぞれの臓器についての薬理動態を示す。
【図８】図８は、抗体AH65 + BE8 + BE4により処理され
た動物についての注射10分後及び2 時間後の血漿サンプ
ルの分子篩いにおける放射性分子の溶出プロフィールで
ある。
【図９】図９は、放射標識ヒトIL-6、IL-6 +抗-IL-6 抗
体AH65、IL-6 +抗-IL-6 抗体AH64及びIL-6 + 抗-IL-6
抗体AH65 + AH64 + BE8 + BE4 の、それぞれの臓器につ
いての薬理動態を示す。
【図１０】図１０は、抗体AH65 + BE8 + BE4により処理
された動物についての注射10分後及び2 時間後の血漿サ
ンプルの分子篩いにおける放射性分子の溶出プロフィー
ルである。
フロントページの続き (72)発明者 フェリス アレジャンドロ モンテロ−ジ ュリアン フランス国，13008 マルセイユ，リュ マリ−ルイス，６，バティマ セ，ル マ リ−ルイス (72)発明者 ベルナール クレーヌ フランス国，44120 ベルトゥ，リュ ド ゥ ラ ミネ，30

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 短寿命のタンパク質仲介物質であって少
    なくとも3 つの抗体結合部位を含んで成るのに十分なサ
    イズを有しているタンパク質仲介物質を中和するための
    治療キットであって、そのタンパク質仲介物質の3 つの
    別個のエピトープを認識する少なくとも3 つの別々の抗
    体であってその中の少なくとも1 つがそのタンパク質仲
    介物質の生物学的活性を遮断するような抗体を含むキッ
    ト。
  2. 【請求項２】 仲介物質がサイトカインである、請求項
    １に記載の治療キット。
  3. 【請求項３】 抗体がモノクロナール抗体である、請求
    項１及び２の中のいずれか1 項に記載の治療キット。
  4. 【請求項４】 抗体がIgG タイプの内にある、請求項１
    〜３の中のいずれか1 項に記載の治療キット。
  5. 【請求項５】 少なくとも3 つの抗体の中の2 つの抗体
    がタンパク質仲介物質の生物学的活性を遮断することが
    できる、請求項１〜４の中のいずれか1 項に記載の治療
    キット。
  6. 【請求項６】 抗体が109 リッター1/モルよりも大きな
    アフィニティーをもつ、請求項１〜５の中のいずれか1
    項に記載の治療キット。
  7. 【請求項７】 抗体が部分的にヒト化されている、請求
    項１〜６の中のいずれか1 項に記載の治療キット。
  8. 【請求項８】 以下の抗体の組み合わせ:AH64, AH65及
    びBE4 又は、AH65, BE4 及びBE8 又は、AH64, AH65, BE
    4 及びBE8 、を含んで成る、請求項１〜６の中のいずれ
    か1 項に記載の治療キット。
  9. 【請求項９】 タンパク質仲介物質の3 つの別個のエピ
    トープを認識する少なくとも3 つの抗体が組み合わさ
    れ、その少なくとも3 つの抗体の中の少なくとも1 つが
    そのタンパク質仲介物質の生物学的活性を遮断する、請
    求項１中に記載した如きキットの製造方法。
  10. 【請求項１０】 以下の組み合わせ:AH64, AH65及びBE4
    又は、AH65, BE4 及びBE8 又は、AH64, AH65, BE4 及
    びBE8 、に従って少なくとも3 つの抗体が組み合わされ
    ている、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜８の中のいずれか1 項中に
    記載の治療キットを含んで成る医薬組成物。
JP6170967A 1993-07-23 1994-07-22 新規の抗−タンパク質仲介物質キット、それらの製造方法及びそれらを含む医薬組成物 Pending JPH07145080A (ja)

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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5888510A (en) * 1993-07-21 1999-03-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
US8017121B2 (en) 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
CA2301847A1 (en) * 1997-08-26 1999-03-04 Genentech, Inc. Rtd receptor
GB9806530D0 (en) * 1998-03-26 1998-05-27 Glaxo Group Ltd Inflammatory mediator
ES2624547T3 (es) * 2001-11-14 2017-07-14 Janssen Biotech, Inc. Anticuerpos anti il 6, composiciones, métodos y usos
US20050100550A1 (en) * 2003-11-10 2005-05-12 Mohit Trikha Anti-angiogenic uses of IL-6 antagonists
PE20061324A1 (es) 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
EP2336181A1 (en) 2005-12-09 2011-06-22 UCB Pharma, S.A. Antibody molecules having specificity for human IL-6
US8062864B2 (en) 2007-05-21 2011-11-22 Alderbio Holdings Llc Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies
US8404235B2 (en) 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US8178101B2 (en) 2007-05-21 2012-05-15 Alderbio Holdings Inc. Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia
US7906117B2 (en) 2007-05-21 2011-03-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
MX2009012493A (es) * 2007-05-21 2010-01-20 Alder Biopharmaceuticals Inc Metodos de humanizacion de anticuerpo de conejo novedosos y anticuerpos de conejo humanizados.
US8252286B2 (en) 2007-05-21 2012-08-28 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9701747B2 (en) 2007-05-21 2017-07-11 Alderbio Holdings Llc Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration
US20090238825A1 (en) * 2007-05-21 2009-09-24 Kovacevich Brian R Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
SG183742A1 (en) 2007-05-21 2012-09-27 Alderbio Holdings Llc Antibodies to il-6 and use thereof
NZ581742A (en) 2007-06-08 2012-09-28 Biogen Idec Inc Biomarkers for predicting anti-tnf responsiveness or non-responsiveness
US8188235B2 (en) 2008-06-18 2012-05-29 Pfizer Inc. Antibodies to IL-6 and their uses
US9212223B2 (en) 2008-11-25 2015-12-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US8992920B2 (en) 2008-11-25 2015-03-31 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis
US8420089B2 (en) 2008-11-25 2013-04-16 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US8337847B2 (en) 2008-11-25 2012-12-25 Alderbio Holdings Llc Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies
US9452227B2 (en) * 2008-11-25 2016-09-27 Alderbio Holdings Llc Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments
US8323649B2 (en) * 2008-11-25 2012-12-04 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and use thereof
US9775921B2 (en) 2009-11-24 2017-10-03 Alderbio Holdings Llc Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
MX2012005927A (es) 2009-11-24 2012-11-23 Alder Biopharmaceuticals Inc Anticuerpos para il-6 uso de los mismos.
WO2012071561A2 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-il-6 antibodies for the treatment of anemia

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2881311B2 (ja) * 1989-07-28 1999-04-12 味の素株式会社 抗ヒトｂｃｄｆモノクローナル抗体及びそれを用いたヒトｂｃｄｆの定量法
DE3939706C1 (ja) * 1989-12-01 1991-03-21 Centre Regional De Transfusion Sanguine, Besancon, Fr
GB9015908D0 (en) * 1990-07-19 1990-09-05 Celltech Ltd Multivalent immunoglobulin

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Publication number Publication date
US5559012A (en) 1996-09-24
FR2707882B1 (fr) 1997-08-01
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FR2707882A1 (fr) 1995-01-27
AU690557B2 (en) 1998-04-30

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