KR970000637B1

KR970000637B1 - 인체 다능성 과립구 군체 자극인자에 대한 하이브리도마

Info

Publication number: KR970000637B1
Application number: KR1019870700690A
Authority: KR
Inventors: 장 데이비드; 알트로크 브루스
Original assignee: 키린-암젠, 인코포레이티드; 로버트 디. 웨이스트
Priority date: 1985-12-09
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1997-01-16
Also published as: ZA869042B; DK412887A; EP0227367A2; ES2046173T3; IL80718A0; DE3684264D1; US5552286A; KR880700936A; JPH0745519B2; NO873334D0; PT83892B; EP0227367A3; GR3004612T3; DK412887D0; CN1070611C; EP0227367B1; JPS63501769A; FI91542B; CA1296662C; CN86107666A

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

인체 다능성 과립구 군체 자극인자에 대한 하이브리도마

[발명의 상세한 설명]

[발명의 배경]

본 발명은 일반적으로 생물학적 체액으로부터 조혈성장인자의 분리 및 정량적 검출을 위한 면역학적 과정에 사용되는 물질 및 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 조형성장인자와 특이하게 반응하는 새로운 하이브리도마 세포주(A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C.HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 및 A.T.C.C. HB-8962)에 의해 생산되는 단일클론 항체 및 조혈선장인자를 검출하기 위한 측정법과 그과같은 성장인자응 연구하기 위한 면역학적 수법에 있어서 친화성 정제 수법을 통하여 조혈성장인자를 분리하기 위한 이들 항체의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로는 본 발명은 인체 다능성 과립구 군체 자극인자(hbG-CSF)와 특이하게 반응하는 천연 및 제조합성 자원으로부터 수득한 당일클론 항체에 관한 것이다.

인체 혈액 생성(조혈) 체계는 다양한 백혈구 세포(호증구, 대식세포 및 호염기 성구/마스크 세포를 포함), 적혈구 세포(적혈구) 및 혈병 형성세포(거핵구/혈소판)로 구성된다. 평균적인 남성의 조혈체계는 매년 4.5×10¹¹과립구와 적혈구를 생산하는 것으로 추정되며 이는 매년 전체 몸무게에 해당하는 양을 대치하는 것과 같다. Dexter 등, BioEssays, 2, 154-158(1985)참조.

소량의 특정 조혈성장인자는 소수의 간 세포가 다양한 혈구계로 분화되는 것과 그 계들의 거대한 증식 과정 및 그 계들로부터 성숙 혈구의 마지막 분화를 설명해 준다고 믿어진다. 조혈성장인자는 지극히 소량으로 존재하므로 이들인자의 검출 및 확인은 인위적 조건하에서 배양된 세포에 대한 자극 효과를 기초하여 상이한 상이한 인자들을 서로 구비하는 일련의 분석에 의존한다. 그 결과로서 매우 작은 수의 인자들을 나타내기 위한 많은 이름들이 생겨났다. 결론적인 예로서 IL-2, BPA, 멀티 CSF, HCGF, MCGF와 PSF같은 용어들이 지금은 단일 쥐의 조혈성장인자를 지칭하는 것으로 보는 약성어들이다. Metcalf, Science, 29, 16-22(1985)참조.

재조합 유전학 수법을 이용함으로써 이와같은 무질서에 다소의 규칙이 생기게 되었다. 예를들면, 적혈구의 생산을 자극하는 인체 적혈구 생성인자의 아미노산과 DNA서열이 밝혀졌다(참조 : Lin, PCT 출원공고 제85/02610호, 1985년 6월 20일 공고됨). 인체의 과립구-대식세포 군체자극인자(GM-CSF)와 인체의 대식세포 특이적 군체자극 인자(CSF-1)에 대한 cDNA의 분리에도 재조합법이 또한 적용되었다[참조 : Lee등 Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 82, 4360-4364(1985) 와 Wong 등, Science, 228, 810-814(1985) 및 Kowasaki 등, Science, 230, 291-196(1985)].

인체 다능성 군체 자극인자(hpCSF) 또는 플루리포이에틴으로 불리는 인체 조혈성장인자는 인체 방광 암 세포주[5637로 명명되고 메릴랜드 로크빌레에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 A.T.C.C. 기탁번호 HTB-9로 제한 조건하에 기탁됨]의 배양배지에 존재하는 것이 발견되었다. 이 세포주로부터 정제된 hpCSF는 다능성 전구세포의 증식과 분화를 자극하여 모든 주요 혈구 유형을 생산한다는 것이 인체 골수 전구세포를 이용한 측정법에 의해 밝혀져 보고되었다. Welte 등, Proc, Natl. Acad, Sci, (USA), 82, 1526-1530(1985).

예비 연구는 hpCSF로 밝혀진 인자가 인체 CFU-GM분석의 첫 7일 동안 탁월한 과립구 군체 자극 활성을 갖는다는 것을 제시한다.

인체 CSF-β로 명명되는 다른 인자가 또한 인체 방광 암세포주 5637로부터 분리되었고, 표지되지 않은 쥐의 G-CSF와 동일한 투여-반응 관계에 있는 WEHI-3B D⁺세포에 결합되는데 있어 쥐의¹²⁵I-표시된 고립구 군체 자극인자(G-CSF)의 경쟁자로서 설명된다[Nicola 등, Nature, 314, 625-628(1985)]. 이 투여-반응관계는 표시되지 않은 주의 G-CSF에 도특한 것이고 M-CSF, GM-CSF 또는 IL-3과 같은 인자에는 존재하지 않는 것으로 보고되었다[참조 : Nicola등, Proc. Natl. Acad, Sci,(USA), 81, 3765-3769(1984)]. 또한 Metcalf 등, Leukemia Research, Vol. 9, No. 5, pp. 521-527(1985) 참조. 많은 CSF중에서 CSF-β와 G-CSF는 WEHI-3B D⁺세포분화를 고도로 유도하는 점에서 독특하다. Nicola등, Immunology Today, 5,76-80(1984)참조. 고농도에서 G-CSF는 혼합된 과립구/ 대식세포 군체-형성세포들을 자극하며[Nicola 등, (1984) 상기문헌 참조), 이는 hpCSF와 함께 인체 골수 배양물을 14일간 배양한 후 과립구, 단구, 과립구와 단구의 혼합물과, 호산성 군체(CFU-GEMM)의 발현을 나타내는 예비 결과와 일치한다. CSF-β는 또한 쥐 골수 세포를 사용한 분석에서 호중성 괴립구 군체의 형성을 자극하는 것으로 설명되며, 이는 G-CSF와 같은 인자의 확인에 기준이 되는 특성이다. 이와같은 이들의 유사성을 기초로 인체 CSF-β는 동일한 것으로간주된다. Nicola 등, Nature, 314, 625-628(1985)참조.

상기한 공통된 특성을 토대로할 때, Nicola등(상기문헌)의 인체 CSF-β와 Welte등(상기문헌)의 hpCSF는 인체 다능성 과립구 군체 자극인자(hpG-CSF)로 적절히 언급될 수 있는 동일 인자임이 명백하다.

본 출원의 참고문헌에 포함된 것으로 공동소유로 출원계류중인 다능성 과립구군체 자극인자의 생산에 관한 1985년 8월 23일자 출원 제768,959호에는 인체 다능성 과립구 군체 자극인자의 일차 구조의 일부 또는 전체 및 한개 이상의 생물학적 특성을 포함하는 신규 재조합 생산된 폴리펩티드가 기재되어 있다. 또한 그와같은 폴리펩티드를 코팅하는 DNA서열, 그와같은 폴리펩티드를 코팅하는 형성전환된 숙주 세포 및 재조합 방법에 의해 그와같은 인자를 합성하는 방법도 기재되어있다.

선정된 항원에 대하여 매우 특이적인 단일클론 항체를 생산하는 종양세포주 제조를 위한 하이브리도마 수법을 중심한 현재의 연구가 본 발명의 중요한 배경이 된다. 단일 클론 항체 생산수법은 일반적으로 잘 알려져 있다. 이 생산에 대한 전형적인 것은 Wands, J.R. 및 Zurawski, V.R.,Gastroenterology 80 : 225(1981) ; Marhak-Rothstein 등, J. Immunol. 122 : 2491(1979) ; Oi, V. T 및 L. A. Herzenberg, Immuno-globulin Producing Hybrid, Mishell, B. B. 및 S. M. Shiigi(편집자) Selected Methods in Celluar Immunology, San Francisco : W. H. Freeman Publishing, 1979 및 Goding, Antibody Production by Hydridomas, J. of Immunol. Meth. 39, 289-308(1980)에 나타나 있다. 간단히 요약하면 관심을 두고 있는 항원을 미리 주사한 동물의 비장으로부터 제거해 낸 임파구를 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에 골수종 세포와 융합하도록 유도한다. 이러한 융합으로 수천개의 잡종 골수종 세포가 생산된다. 각 하이브리도마세포 배양물의 성장으로부터 상청액을 사용하여 원하는 항체 활성의 존재여부를 시험한다. 그와같은 활성이 어떤 세포 배양물의 상청액내에서 발견되면 제한희석법으로 클론화시키고 그 클론을 상청액 활성 분석에 각각 사용한다.

단일클론 항체의 아주 특이적인 면역학적 특성 때문에 하이브리도마 수법으로 개발된 단일 클론 항체는 진단시약, 치료제 및 미처리 자원으로부터 특이한 교차 반응성 항원 단백질의 친화성 정체를 위한 약품으로 사용되도록 제안되어왔다. 예를들면 Trends Biotechnology, Vol.3,No 7(1985년 7월) 및 미국특허 제4,465,624호,제4,514,505 및 제4,514,507호 참조.

인체 다능성 과립구 군체 자극인자와 같은 조혈성장인자를 검출, 분리, 정체 및 연구하는데 사용하기 위한 특이한 단일클론 항체가 필요하지만 hpG-CSF에 대한 단일클론 항체를 얻기위한 하이브리도마 수법의 성공적인 사용이 보고된 바 없다.

[간단한 요약]

본 발명은 항원/항체 반응에서 인체 다능성 과립구 군체 자극인자와 특이하게 면역활성인 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 처음으로 제공한다.

보다 상세하게는 본 발명은 세로운 위 유래의 하이브리도마 세포주 A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C.-8960, A.T.C.C. HB-8961 및 A.T.C.C. HB-8962를 제공하며, 이들은 각기 생육배양중인 상청액의 한성분으로서 hpG-CSF와 특이하게 반응하는 단일클론 항체를 생산한다. 하이브리도마 세포주 A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C.-8960, A.T.C.C. HB-8961 및 A.T.C.C. HB-8962는 메릴랜드 20852롤크빌레 파크로운 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되어있다.

본 발명에 따르면, 잡종, 종양 세포주는 Oi와 Herzenberg, Immunoglobuiln Producing Hybrid, 상기 참조 및 Goding, Antibody Production by Hydridomas, J. of Immunol. Meth. 39(1980), 285-308에 서술한 바와 같이 표준 면역학적 수법을 사용하여 생산된다. 천연 hpG-CSF로 고도면역처리된 비장세포를 폴리에틸렌 글리콜 존재하에서 쥐 골수종 세포주와 융합시킨다. 각 하이브리도마 세포 배양주의 성장으로부터 얻은 상청액을 사용하여 원하는 항체 활성이 존재하는지 시험한다.

선택된 하이브리도마 세포는 클론되어 매우 특수한 항-hpG-CSF활성을 갖는 그의 성장 상청액에서 항체를 생산하는 세포주가 증식된다.

본 발명의 단일클론 항체는 천연 또는 재조합원으로부터 hpG-CSF(공통된 또는 관련 항원결정인자를 공유할 수 있는 다른 조혈장치인자 뿐만아니라)의 친화성 정제 및 분리를 위한 면역학적인 과정에 위한 면역학적인 과정에 사용될 수 있다. 그와같은 과정에서 선택된 항체는 고정(예를들면, 관 상에)되고 또 원료 물질은 고정된 항체와 접촉될 것이다. hpG-CSF또는 항원적으로 관련된 물질이 상기 항체와 결합할 것이며, 그후 고정된 항체로부터매우 정제된 형태로 용출될 것이다. 본 발명의 항체는 단독으로 또는 서로 결합하거나 폴리클론상 항체와 결합하여 hpG-CSF의 정량 검출을 위한 면역학적 과정(RIA,ELISA등)에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 그와같은 인자의 과정생산의 경우 생체내에서 hpG-CSF 또는 관련 인자와 결합하는 유용성을 가질 것이다. 본 발명의 다른 특징은 다음 상세한 설명으로 분명히 알 수 있을 것이다.

[상세한 설명]

이하의 실시예는 A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C.-8960, A.T.C.C. HB-8961 및 A.T.C.C. HB-8962를 포함한 많은 하이브리도마 세포주의 생산, hpG-CSF에 대한 항체의 분리 및 단일클론 항체의 증식과 특정화에 대한 본 발명의 실시를 설명하는 것이다.

더 구체적으로는, 실시예 1은 hpG-CSF에 대한 폴리클론성 혈청 항체의 생산을 위한 쥐 숙주의 자극, 골수종 세포와 비장 세포의 융합, 하이브리도마 세포의 스크리닝, 클로닝과 성장 그리고 그로부터 단일클론 항체의 분리에 관한 것이다. 실시예2는 생산된 단일 클론 항체의 ELIS 및 RIA분석에 의한 특정화 및 경쟁적인 억제 및 중화측정 뿐만 아니라 생성되는 단일 클론항체의 복수법에 의한 증폭에 관한 것이다. 실시예3은 본 발명의 단일클론 항체를 사용하여 hpG-CSF를 분리하고 정제하는 과정을 설명한다. 실시예 4는 본 발명의 항체를 이용한 hpG-CSF를 정량 검출하는 방법을 설명한다.

실시예 1

A. 폴리클론성 혈청의 생산

BALB/C 쥐 각각에 인체 방광 암세포주 5637(서브클론1A)로부터 HPLC에 의해 정제된 hpG-CSF를 미국특허출원 제768,959호의 실시예1(b)의 방법에 따라 주사하였다. 그 물질은 C4 HPLC관을 통하여 85%순도로 과량 정제되었고, 50% 프로판올 및 100mM 암모늄 아세테이트(pH7)를 포함화는 용액중에서 약 60μg/ml의 농도를 가졌다.

고속 진공장치에 의해 0.6ml로 농축된 후 초음파 처리에 의해 BACTO-Freund의 완전 보조액 H37 Ra(DIFCO 31130-60) 0.6ml와 혼합된 hpG-CSF용액 1.2ml를 포함하는 전체 약 1.0ml의 접종원(쥐 한 마리당 7.2μg의 hgG-CSF)을 10마리의 쥐 각각에 다수회 피하주사하였다. 18일후 각각의 쥐에 0.75ml로 농축되고 프로인트(Freund)의 불완전 보조액(DIFCO 사의 제조 BACTO 0639-60-6) 0.75ml와 혼합된 hgG-CSF용액 1.2ml를 포함하는 전체 약 0.15ml의 접종원(쥐 한 마리당 7.2μg의 hgG-CSF)을 다수회 추가로 주사하였다.

4일후 쥐를 출혈시키고 항-hpG-CSF항체가 생산되는지 확인하기 위해 혈청을 RIA에 의해 스크리닝하였다. 혈청 분석에 사용된 hpG-CSF는 4회 농축된 100mM 황산암모늄 및 50%프로핀올을 포함하는 용액중에서 약 100μg/ml농도의 80%순수한 hpG-CSF약 0.5ml를 포함한다. 상기 용액 250μl를 150μl로 농축시키고 5ml의 50mM CO₃ ^-2/CHO₃ ^-1완충액(pH9.2)과 혼합하였다. 상기 물질50μl를 96개 웰을 갖는 트레이의 각각의 웰에 붓고 실온에서 2시간동안 또는 4℃에서 철야로 배양하였다. 5%소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 저지 화합물을 웰에 부가하여 30분간 배양하였다. 1:5, 1:25, 1:625 및 1:3125의 비율로 희석된 시험 혈청과 1:5, 1:125의 비율로 희석된 대조(예방 접종되지 않은)혈청을 웰당 50μl씩 붓고 실온에서 2시간동안 배양하였다. 그후 세척용액[(메릴랜드(케이피엘)가이더스버그 컬캐가드 앤드 페리 래보래토리스)]을 사용하여 웰을 3회 세척하였다. 50μl 웰당 1분에 약 199,000개 생산되는¹²⁵I로 표지된 토끼 항-쥐 IgG항체를 적용하고 실온에서 1.5시간동안 배양하였다. 웰을 세척용액으로 5회 세척하고 그들의 방사성은 감마계수기로 측정하였다.

재주사한지 21일후 RIA에 의해 항-hpG-CSF항체를 셍산하는 것으로 밝혀진 5마리의 쥐에 3차 주사하였다. 재주사시와 동일한 물질로 면역처리되었으나 그 양은 쥐1마리당 약 10μg의 hpG-CSF를 투여하였다.

B. 세포 융합

하이브리도마 생산과정에서, 접종된 쥐의 비장을 파쇄시켜 항-hgG-CSF항체 생산 임파구를 현탁시킨다. 이 비장 세포를 SP2/0골수종 세포주로부터의 세포와 융합시켜 잡종 세포를 형성시켰다. 비장의 세포막과 골수종 세포는 융합되어 둘 또는 그 이상의 핵을 갖는 공통 원형질로 둘러싸게 된다. 세포막의 융합된지 수일후 핵이 융합되어 동시 유사분열을 할 수 있게 된다. 이들 융합된 세포가 분열됨에 따라 잡종 세포주가 안정될때까지 융합 상대의 다수의 크로모좀이 손실된다. 하이포크산틴아미노프테린-티미틴(HAT)배지는 잡종형성하는 동안 셍산된 SP2/0 : SP2/0잡종 또는 융합되지 않은 SP2/0세포의 생장을 억제하는 반면에 비장 : 비장세포 잡종 또는 융합되지 않은 비장 세포들은 대개 배양 2주후에 죽는다. 따라서 SP2/0:비장 잡종 세포만이 배지에서 생존할 것이다.

두 번째 추가 접종한지 3일후 쥐를 경부 탈구시켜 치사시키고 70% 에탄올을 끼얹었다. 쥐의 비장을 무균적으로 제거하여 ml당 100 유닛의 페니실린 G와 100mcg의 스트렙토마이신을 포함하는 페니실린 G-스트렙토마이신 용액(1X용액 이후 1XPS용액 (Irvine Scientific 제품, 카탈로그 번호 9366) 이라 함)이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium, GIBCO 제품, 카탈로그 번호 302-1885, lot 18K3252)를 함유하는 얼음 위에 놓은 페트리접시 안에 둔다. 비장에 붙어있는 지방조직은 제거하고2XPS(ml당 200유닛의 페니실린 G와 200mcg의 스트렙토마이신)을 함유하는 DEMA로 2회 세척하고 얼음위에 멸균 스토마커(Stomacher)백내에 둔다. 이 백에 DMEM-2XPS를 포함하는 용액을 첨가한다.

비장은 스토마커 기구 내에서 파열되고 이것을 50ml원심분리 관 내로 네겹의 멸균 기아제를 통해 여과시킨다. 백 및 필터는 DMEM-2XPS용액을 함유하는 용액40ml로 세척한다. 세포를 IEC NH-SII원심분리기(Damon/IEC Division 제품)내에서 1000rpm으로 10분간 원심분리시킨 후 그 상청액은,　부드럽게 흡인시킨다. 이 세포를 DMEM에 재현탁시킨다.

1XPS 및 1%소의 태아 혈청(FBS)을 포함하는 HB0101배지(Irvine Scientific 제품, 카달로그 번호 3000, Lot,290608, 열불활성화됨)내에서 골수종 세포(Sp2/0)를 생육시키고 3일동안 로그 성장 상으로 증폭시킨다.IEC NH-SII 원심분리기에서 1000rpm으로 10분간 원심분리함으로써 펠릿화하는 것에 의해 Sp2/0세포를 수집한다. 이 세포를 DMEM용액으로 세척하고 DMEM용액에 현탁시킨다.

비장 세포를 50ml의 원심분리관내에서 4:1비율로 골수종 세포와 섞고 1000rpm으로 10분간 원심분리한 후 상청액을 흡인하였다. 펠릿은 후드 아래의 37℃의 물증탕기중에 둔다. 폴리레틸렌 글리콜(분자량 1500, M. A. Bioprodeucts 제품, 카탈로그 번호 17-780Z, Lot번호 4J030)을 녹인 후 부피비 1:1로 DMEM용액의 50%PEG용액을 만든다. PEG용액을 다음 과정에 따라 세포에 첨가한다. 처음 1분동안에는 1.0ml의 50%PEG용액을 첨가한다. 2분동안에는 피펫을 사용하여 관의 측면과 바닥에 닿지 않도록하여 원형으로 지속적으로 교반한다. 4분째는 DMEM, 10%FCS 및 1XPS를 포함하는 용액 1.0ml를 첨가한다. 이 혼합물은 기와 동일 용액 1.0ml를 다시 첨가한다. 5분째 및 6분째는 상기와 동일 용액 8.0ml를 첨가한다. 이 혼합물은 IEC NH-SII 원심분리기 상에서 1000 rpm으로 10분간 원심분리한다. 원심분리관내의 상청액은 흡인시키고 새포를 10% FBS 및 1XPS와 함께 DMEM을 포함하는 100 내지 150ml의 배지에 부드럽게 재현탁한다. 세포 현탁액 CO₂배양기에서 미리 평형이 된 8 1/2개의 96개웰 플레이트상의 약 80개 웰에 0/1ml씩 플레이탕한다. 이어 플레이트를 약 7% CO₂가 들어있는 37℃ CO₂배양기로 돌려보낸다.

1일후, 10% FBS를 갖는 DMEM중의 100μl의 HAT배지를 각 웰에 첨가한다. 2일째에는 사용된 100μl의 배지를 각 웰로부터 흡인해내고 10% FBS를 갖는 DMEM중의 새로운 HAT배지 100μl로 대체한다. 이과정을 2일, 4일, 7일 및 11일째 되풀이 한다. 14일째, 사용된 100μl의 배지를 각 웰로부터 제거해내고 1.36mg/dl의 하이포크산틴 및 0.76mg/dl의 티미딘을 포함하는 HT 배지 100μl로 대체한다. 이 과정을 18일, 22일 및 26일째에 되풀이한다. 23일째에는 배양물에 10% FBS를 갖는 FBS를 갖는 DMEM을 포함하는 완전 배지를 공급한다. 배양물에 1주일 2회씩 계속하여 상기 완전 배지를 공급한다. 17일째에 항-쥐 IgG항체를 사용하여 면역 글로블린의 생산 여부를 확인하기 위해 웰을 스크리닝한다. RIA 및 ELISA분석을 행하면 800개 웰중의 약 260개가 쥐 IgG에 대해 현저한 양성을 나타냄을 제시한다.

실시예 2

A. 단일클론 항체의 초기 특성화

항 -hpG-CSF항체를 생산하는 클론을 검출하기 위해 ELISA측정법을 실시하였다. 실온에서 2시간 동안 50mM의 CO₃ ^-2/HCO₃ ^-완충용액(pH 9.2)으로 희석된 100ng의 90% 순수한 hpG-CSF를 함유하는 약 50μl의 용액으로 96웰 트레이의 웰을 피복한 다음 4℃에서 철야로 배양하였다. 이어 30분간 배양된 5% BSA 저지용액으로 웰을 처리하였다.

하이브리도마 배양액의 상청액을 1%의 BSA를 함유하는 PBS용액(pH 7.0)으로 희석시킨 후 실온에서 2시간 동안 피복된 웰에 대하여 배양하였다, 이어 웰을 세척 용액으로 3회 세척하고 항-쥐 IgG항체(BMB번호 605-250로 표지된 양고추냉이 과산화효소를 1:300으로 희석하여 1.5시간 동안 처리하였다. 웰을 세척용액으로 5회 세척한 후 과산화요소 가질ABTS(KPL)을 각 웰당 50μl 비율로 첨가한다. 티터테크 멀티스캔(Flow Labs, Mclean, VA)분광광도계를 사용하여 각 웰의 414nm에서의 광학 밀도를 판독하였다. 웰중 23개 번호(3,4,5,20,21,28,35,37,39,40,58,61,63,64,66,68,72,74,75,98,151,182 및 231번)는 환원된 hpG-CSF와 상당히 잘 반응하는 것으로 나타났다. 양성 웰로부터 수득한 하이브리도마 세포의 정식 클로닝은 세포를 약 3개 웰당 3개의 세포가 존재하도록 다른 웰로 희석시킴으로써 실행하였다. 일반적으로 활성 웰로부터의 클로닝은 동일한 하이브리도마 세포의 서브클론이되는 정식 클론을 생산하였으나 몇몇 경우에는 다른 항체 아형 및 반응 특성을 나타내는 다른 클론 집단을 나타냈다. 같은 웰로부터 얻은 서브클론에는 동일 문자를 부여하였다(예를들면 웰4호부터 얻어진 클론은 4A,4B등으로 표기).

천연 hpG-CSF뿐만 아니라 환원된 천연 hpG-CSF에 대한 단일클론 항체의 반응성을 측정하기위해 ELISA분석을 실행하였다. hPG-CSF와 반응성인 항체를 생산하는 것으로 알려진 웰로부터 수득한 상청액을 천연 hpG-CSF 및 SDS/머캅토 애탄올로 변성한 천연 hpG-CSF 모두에 대하여 시험하였다. 클론으로부터의 항체는 양쪽 물질과 거의 동일한 특이성으로 반응하였고, 이는 항체가 단백질 아미노산의 연속 서열(1차 구조)에 의해 주로 결정되는 항원성 항원결정기와 특이적으로 반응할 수 있음을 나타낸다.

B. 포유동물 및 재조합성 hpG-CSF에 대한 단일클론 항체의 반응성

본 실시예에서는 활성된 웰로부터 수득한 하이브리도마 상청액의 활성을 측정하기 위해 재조합 대장균에 의해 생산된 hpG-CSF뿐만 아니라 초유동물의 hpG-CSF에 대해 고상 RIA 및 ELRISA분석을 실시하였다. 한 경우를 제외한 모든 경우에서 포유동물이 생산한 천연 hpG-CSF와 반응하는 단일클론 항체 물질이 재조합으로 생산된 hPG-CSF과 동일하게 반응하였다. 그 경우에는 직접적인 결합준석시 포유동물 유래물질보다 재조합성 물질과 상당히 미약하게 반응하는 항체를 생산하는 서브클론 35B, 35D 및 35I가 포함된다.

C. 항체 아형(subtype)의 스크리닝(Screening)

본 실시예에서는 본래 활성인 것으로 알려진 23개 웰로부터 수득한 정식 클론을 그들의 항체 아형을 결정하기 위해 RIA에 의해 스크리닝하였다. 96개 웰 트레이를 아형 특이성이 상이한 토끼 항-쥐-면역글로불린 항체로 처리하였다. 항-쥐-면역글로불린 항체는 토끼 항-쥐 IgG₁(MILES,Laboratories, Naperville, IL 64-360-1), 토끼 항-쥐 IgG_2a(MILES 64-361-1), 토끼 항-쥐 IgG_2b(MILES 64-362-1), 토끼 항-쥐 IgG₃(MILES 64-363-1), 토끼 항-쥐 IgM(MILES, 64-364-365-1) 및 토끼 항-쥐 IgG(MILES, 65-157-2)를 포함하였다. 각 웰을 약 0.5μg의 항체를 포함하는 CO₃ ^-2/HCO₃ ^-(pH 9.6)완충용액중의 항-쥐-면역글로불린 항체용액 50μl로 피복하고 실온에서 2시간 동안 또 약 4℃에서 철야로 배양하였다. 5% BSA용액과 30분간 배양함으로써 웰을 차단시켰다. 이어 각 웰을 실온에서 하이브리도마 조직 배양액 상청액과 2시간 동안 배양하고 세척용액으로 3회 세척하였다.

항-IgG 항체로 처리된 웰은 웰당 50μl의¹²⁵I토끼 항-쥐 IgG 항체 50μl와 함께 1.5시간 배양하는 한편 항-IgM 항체로 처리된 웰은 웰당 50μl의¹²⁵I 토끼 항-쥐 IgM 항체와 함께 1.5시간 배양하였다. 웰을 세척 용액으로 5회 세척한 후 감마 계수기로 측정하였다. 본래의 23개 클론의 분석 결과는 2개의 웰(번호 37 및 182)이 IgG의 합성을 중지하였고; 1개의 웰은 IgG 양성으로 나타났으며 hpG-CSF에 대한 초기 스크리닝에서는 반응성을 입증하기 못하였고(번호 58) ; 15개 웰은 IgG₁에 대하여 양성을 보였다(번호 4C, 5, 28, 39, 40, 61, 63, 64, 66, 68, 72, 74, 75, 98 및 231). 이들중 하나인 서브클론 번호 5d는 항-IgG₃및 항-IgM 항체 모두와 반응성인 것으로 밝혀졌다. 4개 웰은 IgG_2a생산에 대해 양성이었고(번호 3, 4A, 21및 151) 또 1개 웰을 IgG_2b에 대해 양성이었다(번호 35).

D.³H-티미딘 흡수에 의해 측정되는 hpG-CSF활성의 중화.

본 실시예에서는 hpG-CSF에 대하여 생성된 단일클론 항체가 인체 골수 세포로의³HH-티미딘의 편입을 자극하는 hpG-CSF의 생물학적 활성을 중화시키는 능력을 갖는지에 대해 시험하였다.³H-티미딘 흡수의 중화를 시험하기 위해 재조합 또는 천연 hpG-CSF를 본 발명에 다른 다양한 농도의 항체와 함께 4℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이 용액을 저밀도, 비-점착성의 인체 골수세포로 첨가한 후 공동계류 중인 미국특허 출원 제768,959호의 실시예의 7에 서술된 방법에 따라 처리하였다.

클론 번호 20A, 35B, 39B, 40A, 61D, 75A 및 151K로부터의 항체를³H-티미딘 흡수에 있어서 hpG-CSF의 효과를 중화하는데 있어서 가장 효과적인 클론 번호 75A로부터 수득한 항체와 함께 시험하고 또 클론 번호 35B에 의해 생산되는 항체를 제외하고.³H-티미딘 흡수에 대하여 다양한 중화 정도를 나타내고 상기한 모든 항체를 사용하여 시험하였다.

E. 세포 분화 유도에 의해 측정되는 바와 같은 hpG-CSF활성의 중화

본 실시예에서는 hpG-CSF에 대해 생성된 항체가 주의 골수성 단구 백혈구 세포주 WEHI-3B D⁺의 분화를 유도하는 hpG-CSF의 능력을 중화하는 능력을 갖는지에 대해 시험하였다. 본 발명에 따라 생산되는 다양한 농도의 항체(클론번호 20A, 39B, 40A, 61D, 63D 및 75A로부터 생산됨)를 4℃에서 12시간 동안 hpG-CSF와 함께 배양하였다. 이 용액을 공동계류인 미국 특허 출원 제768,959호의 실시예 7에 서술된 방법에 따른 한천 현탁액중의 WEHI-3B D⁺세포에 첨가하였다. 클론번호 40A, 61D 및 75A에 의해 생산되는 항체는 분화저지능을 나타내었다. 이들 단일클론 항체는 hpG-CSF에 대하여 상이한 석출능을 가지고 있기 때문에 일부는 hpG-CSF의 분화유도능을 저지하는 반면에 다른 것은 그렇지 않은 사실은 단순히 친화성 강도를 기초로 해서는 설명될 수 없다. 놀랍게도 클론 75A에 의해 생산되는 단일클론 항체는 WEHI-3B D⁺세포의 분화를 억제했을 뿐만 아니라 세포성장도 억제했는데 이는 상기 항체가 WEHI-3B D⁺세포에 의해 분비되는 쥐의 성장인자와 교차반응할 수 있어 hpG-CSF결합능과는 독립적으로 반증식 효과를 가질수 있음을 나타낸다.

F. 항원결정기 특성화

본 실시예에서는 클론 75A 및 151K로부터 수득한¹²⁵I로 표지된 항체와 고정된 재조합 생산된 hpG-CSF를 사용하여 결정적인 결합 연구를 실행하였다. 이들 연구에서 다른 클론으로부터 수득한 항체는 재조합 생산된 hpG-CSF에 결합되는 방사성 동위원소가 표지된 75A 및 151K단일클론 항체와 경쟁하게 되었다. 기술상 잘 알려진 방법에 따라 배양 및 세척한 후 방사성 계수기를 이용하여 75A에 의해 생성된 항체 또는 151K에 의해 생산된 항체중 어느 것이 hpG-CSF와 반응하였는지 측정하였다.

이들 분석 결과는 클론 번호 63D, 75A 및 151K에 의해 생산된 항체가 hpG-CSF단백질상에서 일부 증복되는 공통 항원성 항원결정기를 갖는다는 것을 시사하였다. 이 결과는 클론 75A 및 151K에 의해 생산된 항체가 특이적으로 활성이 아니므로 클론 4C, 28A 및 38B에 의해 생산되는 항체는 hpG-CSF단백질의 항원결정기(들)과 반응성인 것을 의미한다. 이 결과는 또한 클론 40A 및 61D에 의한 생산되는 항체의 hpG-CSF결합 특성을 클론 4C, 28A, 35B, 75A 및 151K에 의해 생산되는 항체의 그것과는 구별될 수 있음을 시사한다.

G. 기탁된 대표적인 세포주로부터 수득한 항체의 특성

본 발명에 의해 제공되는 대표적인 단일 클론 항체를 생산할 수 있는 대표적인 신규 하이브리도마 세포주는 메릴랜드 20852 파크로운 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 거쳐 콜랙션에 기탁되어있다. 이들 세포주는 정식 클로닝 과정동안 개발된 세포주로 다음과 같다 : 클론 4C(A.T.C.C.HB-8962), 클론 28A(A.T.C.C. HB-8957), 클론 35B(A.T.C.C. HB-8960), 클론 63D(A.T.C.C. HB-8958), 클론 75A(A.T.C.C. HB-8959) 및 클론 (A.T.C.C. HB-8961).

또한 상기 대표적인 하이브리도마 세포주를 한국과학기술원에 1987년 8월 8일자로 기탁하였으며 그 수탁번호는 다음과 같다 :

쥐 하이브리도마 세포주 BADCPPFI-4C(KCTC 8278P), 쥐 하이브리도마 세포주 BADCPPFI-28C(KCTC 8279P), 쥐 하이브리도마 세포주 BADCPPFI-35B(KCTC 8280P), 쥐 하이브리도마 세포주 BADCPPFI-63D(KCTC 8282P), 쥐 하이브리도마 세포주 BADCPPFI-75A(KCTC 8277P), 쥐 하이브리도마 세포주 BADCPPFI-151C(KCTC 8281P).

이들 클론에 의해 생산되는 항체의 특성을 다음 표 1에 요약하였다.

ND(실험을 실시하지 않음)

H. 복수(ascites)방법에 의한 항체 산출의 증대

조직 배양으로 생산되는 항체보다 더 농축된 항체를 얻기 위하여 본 발명의 단일 클론 항체를 Kenneth 등(편집), Monoclonal Antibodies, Hydridomas : A New Dimension in Biological Analysis, p. 403, New York : Plenum Press(1981)에 전반적으로 서술되어 있는 복수(ascites)방법에 의해 증대시켰다. 이 방법에 따르면 쥐에 25 또는 27게이지 바늘을 이용하여 0.5ml의프리스테인(2,6,19,14-테트라멜틸타데칸, 알드리히 케미칼 캄페니 제품)을 복강주입하였다. 프로스테인 처치로 복강내에서 종양 세포가 복수형태로 성장하게 된다. 약 1-2주후 둘레코스의 변형된 이글배지(DMEM)(어빈 사이언티픽 캄페니 제품 )또는 HB101(캘리포니아 버클리 소재의 한나 바이올로지컬스 제품)중의 약 10하이브리도마 세포를 쥐의 복강에 주입하였다. 상기 주입은 각 클론에 대하여 쥐에서 실행하였다.

하이브리도마 세포를 주입한지 약 1-3부후 쥐의 피부를 절개하여 체액을 피펫으로 받아냄으로써 복강내로부터 복수액을 수득하였다. 이 복수액을 원심분리하여 동결시켰다. 복수액 항체는 45% 황산암모늄 및 단백질 A-세파로스 크로마토그래피로 침전시킴으로써 복수액 알부민으로부터 더 정제될 수 있다.

실시예 3

조형성장인자의 분리 및 정제

본 발명은 매우 특이적이고 고반응성인 항-hpG -CSF단일클론 항체를 공급함으로써 발효 배양 뿐만 아니라 당해 기술분야에 잘 알려진 친화성 정제 방법에 따라 천연 포유류로부터 hpG-CSF 및 조혈성장　자를 최초로 분리할 수 있었다. 간단히 말하자면, 바람직한 분리방법은 고형 지지체(예를들면 크로마토그래피용 관)상에 본 발명의 항체를 고정시키고, 이렇게 고정된 항체에 hpG-CSF또는 조혈 인자를 함유하는 체액과 접촉시킨 수 항체와 결합된 면역 복합체로서 정제된 hpG-CSF또는 조혈성장인자를 용출시키는 과정을 포함한다. 사용되는 특정 항체를 조정함으로써 상기 정제 수법은 주적합하게 접히거나 변성된 hpG-CSF로부터 바로 접힌 형태의 천연 hpG-CSF를 분리할 수 있다. hpG-CSF의 동족체는 분리될 수 있으며 조혈성장인자 분자의 항원결정기로서 연구될 수 있다.

실시예 4

조혈성장인자의 정량적 검출

본 발명은 매우 특이한 항-hpG-CSF단일클론 항체를 공급함으로써 하나 이상의 항체를 사용하는 체액샘플레서 hpG-CSF 및 조혈성정인자를 정량적으로 검출하기 위한 새로운 고상또는 액상 분시법을 제공할 수 있다. 고상 분석법은 전형적으로 다음 단계를 포함한다 :

(1) 체액중의 hpG-CSF의 제1항원 결정인자와 반응하는 고정된 제1항원체의 체액을 접촉시켜 hpG-CSF 및 제1항원의 면역학적 복합체를 형성하고 ;

(2)제1항원결정인자 이외의 hpG-CSF 의 항원결정인자와 반응하는 제2항체를 (1)단계에서 형성된 복합체와 접촉시켜 hpG-CSF 및 제2항체의 면역학적 복합체를 형성시키며;

(3)(2)단계에서 형성된 면역학적 복합체에 결합된 제2항체의 양을 정량한다.

액상 경쟁 분석법은 hpG-CSF의 표지화 및 이들과 본 벌명에 따른 하나 또는 그 이상의 항체의 침전반응을 포함한다. 표지되지 않은 hpG-CSF 또는 관련인자의 정성분석은 경쟁적인 결합형식으로 실시할 수 있다. 그와 같은 분석과정은 바람직하게는 상기한 단일클론 항체중의 2개를 적용하지만, 단일클론 항체중의 한 개와 포리클론성 혈청으로부터 유도된 hpG-CSF에 대한 항체를 적용하여 개발될 수도 있다.

상술한 본 발명의 실시예를 참조하여 당해 기술 분야의 기술자는 다양한게 본 발명을 변형시킬수 있을 것이다. 따라서 다음 특허청구범위에 기재된 것으로써 본 발명에 제한을 둘 뿐이다.

Claims

항원/항체 반응으로 hpG-CSF와 특이하게 결합될 수 있고, 배양물에서 WEHI-3B D⁺세포의 분화를 유도하는 hpG-CSF의 능력을 중화시킬 수 있으며 또 골수세포에 의한 티미딘의 흡수를 자극하는 hpG-CSF의 능력을 중화시킬 수 있는 단일클론 항체를 생육배지에서 생산할 수 있는 쥐 유래의 하이브리도마 세포주.
제1항에 있어서, IgM, IgG, IgG_2a,IgG_2b및 IgG₃로 구성되는 군으로부터 선택되는 아형의 단일클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주.
제1항에 있어서, A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C.HB-8961 및 A.T.C.C. HB-8962로 구성되는 세포주 군으로부터 선택되는 하이브리도마.
항원/항체 반응으로 hpG-CSF와 특이하게 결합할 수 있고, 배양물에서 WEHI-3B D⁺세포의 분화를 유도하는 hpG-CSF의 능력을 중화시킬 수 있으며 또 골수세포에 의한 티미딘의 흡수를 자극하는 hpG-CSF의 능력을 중화시킬 수 있는 단일 클론 항체를 생육배지에서 생산할 수 있는 세포주에 의해 생산되는 단일클론 항체.
제4항에 있어서, IgM, IgG, IgG_2a, IgG_2b및 IgG₃로 구성되는 군으로부터 선택되는 아형을 갖는 단일클론 항체.
제4항에 있어서, A.T.C.C. HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960, HB-8961 및 HB-8962로 구성되는 군으로부터 선택되는 단일클론 항체.
hpG-CSF에 대해 특이한 항체와의 선택적인 면역반응을 기초로 하여 생물의 체액으로부터 생물학적 활성의 hpG-CSF를 분리해내기 위한 면역학적 방법에 있어서, 항원,항체 반응으로 hpG-CSF와 특이하게 결합할 수 있는 단일클론 항체를 채용하는 것을 특징으로 하는 면역학적 방법.
제7항에 있어서, 단일클론 항체가 IgM, IgG₁, IgG_2a, IgG_2b및 IgG₃로 구성되는 군으로부터 선택되는 아형인 면역학적 방법.
제7항에 있어서, 단일클론 항체가 A.T.C.C. HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960, HB-8961 및 HB-8962로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포주에 의해 생산되는 면역학적 방법.
hpG-CSF에 대해 특이적인 항체와의 한번 또는 그 이상에 선택적 면역반응을 기초로하여 생물 체액내의 hpG-CSF를 정량적으로 검출하는 면역학적 방법에 있어서, 항원/항체 반응으로 hpG-CSF와 특이하게 결합할 수 있는 하나 또는 그 이상의 단일 단일 클론 항체를 채용하는 것을 특징으로 하는 면역학적 방법.
제10항에 있어서, 단일클론 항체가 IgM, IgG₁, IgG_2a, IgG_2b및 IgG₃로 구성되는 군으로부터 선택되는 아형인 면역학적 방법.
제10항에 있어서, 단일클론 항체가 A.T.C.C. HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960, HB-8961 및 HB-8962로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포주에 의해 생산되는 면역학적 방법.