CN1035628C - 生产单克隆抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

鼠类来源的杂交瘤细胞系和由该细胞系产生的、单克隆的抗人多能粒细胞集落刺激因子的抗体物质。在免疫学方法中单独或联合应用上述单克隆抗体物质来分离人多能粒细胞集落刺激因子和定量检测液体样品中的人多能粒细胞集落刺激因子。

Description

生产单克隆抗体的方法
一般地说，本发明涉及在分离和定量检测生物性液体中造血生长因子的免疫学技术中所应用的材料和方法。具体地说，就是包括由新的杂交瘤细胞系(以A.T.C.C.HB-8957，A.T.C.C.HB-8958，A.T.C.C.HB-8959，A.T.C.C.HB-8960，A.T.C.C.HB-8961和A.T.C.C.HB-8962为例)产生的、能与造血生长因子起特异性反应的单克隆抗体，以及应用这些抗体在亲和纯化技术中分离造血生长因子,检测造血生长因子和应用免疫学技术研究这些生长因子。更明确地说，本发明涉及与天然的和重组的人多能粒细胞集落刺激因子(hpG-CSF)特异性反应的单克隆抗体。
人的成血(造血)系统负责各种白细胞(包括中性白细胞，巨噬细胞及嗜碱细胞/肥大细胞)，红细胞和凝血形成细胞(巨核细胞/血小板)的更新。据估计，一般男性成人的造血系统每年产生4.5×1011左右的粒细胞和红细胞，这相当于每年将全部体重更新一次。Dexter等，BioEssays，2，154-158(1985)。
据信，小量祖始“干细胞”向各种血细胞系的分化以及这些血细胞系惊人的增殖和最终分化成为成熟的血细胞都是由少量的特定造血生长因子所负责。因为造血生长因子仅以极微量的形式存在，迄今为止检测与鉴别这些因子所应用的一套方法都仅是根据不同因子对人工培养细胞的不同刺激效应来区分它们。结果，创造出大量的名称来命名实际上数目很少的因子。由此造成的混乱可从下面的例子中窥见一斑：IL-3(白细胞介素3)，BPA(多集落促发活性)，multi-CSF(多集落刺激因子)，HCGF(造血细胞生长因子)，MCGF(肥大细胞生长因子)和PSF(P细胞刺激因子)等，目前认为这些皆适用于一种鼠类造血生长因子的缩写词。Metcalf，Science，229，16-22(1985)。
遗传重组技术的应用已从这种混乱中获得某些条理。例如，刺激产生红细胞的人促红细胞生成素的氨基酸和脱氧核糖核酸的顺序已被获得(见Lin，PCT公布的85/02610号申请书1985年6月20日公布)。重组方法也已被用于分离人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人巨噬细胞特异性集落刺激因子(CSF-1)的互补脱氧核糖核酸(见Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4360-4364(1985)；Wong等，Science，228，810-814(1985)和Kowasaki等，Science，230，291-296(1985)。
一个称为人多能集落刺激因子(hpCSF)或多能生成素(pluripoietin)的人造血生长因子已被证明存在于命名为5637的人膀胱癌细胞系的培养基中，该细胞系在一些限制性条件下寄存在马里兰州罗克维尔的美国典型培养物收集中心(American TypeCulture Collection)，贮存号为HTB-9。据报告从该细胞系纯化的人多能集落刺激因子在用人骨髓原祖细胞所进行的测定中刺激了多能祖始细胞的增殖和分化，最终导致所有主要类型血细胞的产生。Welte等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)，82，1526-1530(1985)。
初步研究表明在人粒细胞-巨噬细胞集落形成单位试验的头7天期间，被鉴定为人多能集落刺激因子，主要具有粒细胞集落刺激活性。
另一个被命名为人集落刺激因子β的因子(CSF-β)，也是从人膀胱癌细胞系5637中分离得到。该因子被认为是一种125I标记的鼠类粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与WEHI-3BD+细胞结合的竞争物，并具有与非标记鼠类粒细胞集落刺激因子相同的剂量-反应关系(Nicola等，Nature，314，625-628(1985)。这种剂量-反应关系以前曾被报告为非标记鼠类粒细胞集落刺激因子所独有，并且为诸如巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3所不具备的(Nicola等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，81，3765-3769(1984))。还可参考Metcalf等，Leukemia  Research9，No.5，521-527(1985)。集落刺激因子β和粒细胞集落刺激因子在诸多集落刺激因子中占独特地位，还因为它们都具有诱导WEHI-3BD+细胞分化的高度能力(Nicola等，Immunology Today，5，76-80(1984)。高浓度粒细胞集落刺激因子刺激混合的粒细胞-巨噬细胞集落形成细胞(Nicola等(1984)同上)，其结果与人骨髓培养物加人多能集落刺激因子培养14天后出现粒细胞性、单核细胞性、混合粒细胞性/单核细胞性和嗜酸细胞性集落(GEMM集落形成单位)的初步结果一致。集落刺激因子β也被描述为能在用小鼠骨髓细胞进行的测定中刺激嗜中性粒细胞集落形成，后一性质已是鉴定粒细胞集落刺激因子的一个标准。根据这些相似性，人集落刺激因子β已被认为就是粒细胞集落刺激因子，见Nicola等，Nature，314，625-628(1985)。
根据具有共同的性质这一点，看来Nicola等的人集落刺激因子β(文献见前)和Welte等的人多能集落刺激因子(文献见前)是同一个因子。应正确地称为人多能粒细胞集落刺激因子(hpG-CSF)。
具有人多能粒细胞集落刺激因子的部分或全部一级结构构象及其一种或多种生物学性质的、由重组体产生的新多肽已在1985年8月23日作为“多能粒细胞集落刺激因子的生产”而提出的、共同拥有和共同未决的第768959号美国专利申请书(列此备考)中公开。同时被公开的有编码这些多肽的脱氧核糖核酸顺序和转化的宿主细胞以及用重组方法合成这些多肽的步骤。
与本发明的背景有关的是当前的研究集中在杂交瘤技术上。目的是为获得能分泌针对一个既定抗原的高特异性单克隆抗体的肿瘤细胞系。产生单克隆抗体的技术在此研究领域中为人所普遍熟知，其技术步骤的典型描述可在下列文献中查到：WandsJ.R.和ZurawskiV.R.，Gastroenterology，80，225(1981)；Marshak-Rothstein等，J.Immunol.122，2491(1979)；Oi，V.T.和L.A.Herzenberg，“产生免疫球蛋白的杂交细胞系”，载于Mishell.B.B.和S.M.Shiigi编著的《细胞免疫学方法选编》一书中，旧金山，弗里曼出版公司，1979年以及Goding的“杂交瘤的抗体产生”，J.of Immunol.Meth，39，285-308(1980)。简要总结如下：从预先注射过有关抗原的动物脾脏中分离出淋巴细胞，并在聚乙二醇存在下诱导其与骨髓瘤细胞融合。数以千计的“杂交”骨髓瘤细胞在融合过程中产生。测定每个“杂交瘤”细胞培养的上清，以确定是否存在所需抗体活性。当在某个细胞培养上清中发现这种抗体活性时，即用有限稀释法对其进行克隆化，并再次对每个克隆分别进行上清活性的测定。
由于具有高度特异的免疫学性质，用杂交瘤技术产生的单克隆抗体已被建议作为诊断和治疗剂以及用来从粗制品中亲和纯化出具有特异性交叉反应抗原的蛋白质，例如可参见Trends in Biote-chnology，3，No.7(1985年7月)，及第4465624、4514505和4514507号美国专利。
尽管迫切需要特异性单克隆抗体以便用来检测、分离、纯化和研究诸如人多能粒细胞集落刺激因子这样的造血生长因子，至今为止尚无成功地应用杂交瘤技术来获得抗人多能粒细胞集落刺激因子单克隆抗体的成功报告。
本发明首次提供了可产生在抗原抗体反应中能与人多能粒细胞集落刺激因子起特异性免疫反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。做为例证，本发明提供了新的鼠源杂交瘤细胞系A.T.C.C.HB-8957，A.T.C.C.HB-8958，A.T.C.C.HB-8959，A.T.C.C.HB-8960，A.T.C.C.HB-8961和A.T.C.C.HB-8962，每个细胞系都产生一个作为培养上清中的一种成分形式存在的，可与人多能粒细胞集落刺激因子起特异反应的单克隆抗体。杂交瘤细胞系A.T.C.C.HB-8957，A.T.C.C.HB-8958，A.T.C.C.HB-8959，A.T.C.C.HB-8960，A.T.C.C.HB-8961和A.T.C.C.HB-8962，目前存放在美国典型培养物收集中心(马里兰州20852，罗克维尔市帕克劳恩路12301号)。
在本发明的实践中，杂交瘤细胞系的产生采用在Oi和Herzenberg的“产生免疫球蛋白的杂交细胞系”(见前)和Goding的“杂交瘤的抗体产生生”(J of Immunol.Meth.1980年第39卷第285-308页)中描述的标准免疫学技术。用天然人多能粒细胞集落刺激因子超免疫的小鼠的脾细胞，在聚乙二醇存在下与一个小鼠骨髓瘤细胞系相融合。对每个有杂交瘤细胞生长的培养上清进行测定，以确定有无所需的抗体活性存在。筛选出的杂交瘤细胞被克隆化以便扩增成为一个细胞系，后者在其生长的上清中产生具有高特异性抗人多能粒细胞集落刺激因子活性的抗体。
本发明的单克隆抗体在免疫学技术中可用于从天然或重组来源的材料中亲和纯化和分离出人多能粒细胞集落刺激因子(以及拥有共同或相关决定簇的其他造血生长因子)，在此技术中，一个预先选择的抗体被固相化(例如固化在一个层析柱上)，然后使原材料与固相抗体接触。人多能粒细胞集落刺激因子或具相关抗原性的物质可与固相抗体结合，然后将其以高度纯化的形式从固相抗体上洗脱下来。本发明的抗体也可单独或相互结合，或与多克隆抗体结合在免疫学技术(各和放射免疫分析，酶联免疫吸附试验等等)中用于定量检测人多能粒细胞集落刺激因子。本发明的抗体或许也可在体内应用以结合那些过度产生的人多能粒细胞集落刺激因子或相关因子。本发明的其他方面，在考虑了下面的详细描述后，更为清楚。
下面的实施例说明了在本发明中产生包括A.T.C.C.HB-8957、A.T.C.C.HB-8958、A.T.C.C.HB-8959、A.T.C.C.HB-8960、A.T.C.C.HB-8961和A.T.C.C.HB-8962在内的许多杂交瘤细胞系，分离抗人多能粒细胞集落刺激因子抗体，以及扩大并鉴定这些单克隆抗体的实际过程。
更具体地说，实施例1涉及刺激小鼠以产生抗人多能粒细胞集落刺激因子的多克隆血清抗体、脾细胞与骨髓瘤细胞的融合和杂交瘤细胞的筛选、克隆化以及生长以及从中分离单克隆抗体。实施例2与用酶联免疫吸附试验，放射免疫分析以及用竞争性抑制和中和试验来鉴定所产生的单克隆抗体，和用腹水方法来扩大单克隆抗体产量有关。实施例3描述应用本发明的单克隆抗体来分离和纯化人多能粒细胞集落刺激因子的步骤。实施例4描述了在测定技术中应用本发明的抗体来定量检测人多能粒细胞集落刺激因子的步骤。
                  实施例1A.多克隆抗血清的产生
给每只BALB/C小鼠注射用高压液体色谱法从人膀胱癌细胞系5637(1A6亚克隆)纯化的人多能粒细胞集落刺激因子，纯化方法按照第768959号美国专利申请书中实施例1(b)所描述的步骤进行。该物质经一个C4高压液体色谱柱纯化后，纯度大于85％，在含有50％丙醇和100毫摩醋酸铵的溶液(pH7)中浓度约为60微克/毫升。开始时，给10只小鼠的每一只多点皮下注射，每每只小鼠总剂量约为0.1毫升(每鼠7.2微克的人多能粒细胞集落刺激因子)，注射物是由用快速真空法将1.2毫升的人多能粒细胞集落刺激因子溶液浓缩成0.6毫升，再通过声处理将它和0.6毫升BACTO-弗氏完全佐剂H37Ra(DIFCO公司，产品目录号311360)混合组成。18天以后，每只小鼠给予多点皮下加强注射，总剂量每只小鼠约0.15毫升(每鼠7.2微克人多能粒细胞集落刺激因子)，注射物为由1.2毫升浓缩至0.75毫升的人多能粒细胞集落刺激因子溶液与0.75毫升弗氏不完全佐剂(DIFCO公司，BACTO 0639-60-6)的混合液。
4天以后，小鼠放血，用放射免疫分析法检查其血清以确定有无抗人多能粒细胞集落刺激因子的抗体产生。用于该血清试验中的人多能粒细胞集落刺激因子约为0.5毫升，它已经4次浓缩并有100毫摩尔硫酸铵和50％丙醇，纯度为80％，浓度约为100微克/毫升。250微升上述溶液再被浓缩至150微升，尔后与5毫升50毫摩的碳酸根/碳酸氢根缓冲液(pH9.2)混合。在96孔板的每一孔中加入50微升上述溶液，室温下温育2小时尔后4℃过夜。再用一个含5％牛血清白蛋白(BSA)的封闭物质加入孔中，温育30分钟。待检血清以1∶5，1∶25，1∶625和1∶3125的比例稀释。对照血清(未经注射的小鼠的血清)以1∶5和1∶125的比例稀释。每孔加50微升，室温下温育2小时。各孔然后用洗涤液柯克加德和佩里实验室(Kirkeguard&Perry Laboratories，(KPL)，马里兰州盖瑟斯堡市〕洗3遍。加入125I标记的兔抗小鼠IgG抗体，加入量为每孔50微升，每分钟计数大约为199000室温下温育1.5小时后各孔用洗涤液洗5次，最后用γ计数器测定孔中的放射性。
加强注射后21天，经放射免疫分析法检查证明正在产生抗人多能粒细胞集落刺激因子抗体的5只小鼠被给予第三次注射，这次免疫所用的材料与加强注射时相同，但每只小鼠给予大约10微克。B.细胞融合
在产生杂交瘤的技术过程中，首先将接受过免疫注射的小鼠脾弄碎以便悬浮那些产生抗人多能粒细胞集落刺激因子抗体的淋巴细胞。这些脾细胞与来自SP2/0骨髓瘤细胞系的细胞融合，形成杂交细胞。脾细胞与骨髓瘤细胞的胞膜融合在一起，并在最初的几天中包围着一个含有2个或更多个核的共同胞浆。几天后，细胞核融合，并能同步进行有丝分裂。当这些融合细胞分裂时，数量不等的来自两个参与融合的细胞的染色体被丢失，直到杂交瘤细胞系稳定下来。含有次黄嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)的培养基防止杂交过程中产生的SP2/0∶SP2/0杂交细胞或未融合的SP2/0细胞生长，而脾细胞和脾细胞杂交体或未融合的脾细胞一般在培养两周后死亡。因此只有SP2/0与脾细胞融合形成的杂交细胞能在培养中存活。
第二次加强注射后3天，用颈脱位法处死小鼠。以70％乙醇浸泡，无菌取出其脾脏，置于一个放在冰上的陪替氏培养皿中。培养皿内盛DMEM杜氏改良伊格尔培养基(GIBCO公司，目录号320-1885，批号18K3252)，培养基中加有100单位/毫升青霉素G和100微克/毫升链霉素溶液(1倍液)，下称1倍青链(1XPS)溶液〔欧文尼科学公司(Irvine Scientific)，产品目录号9366〕。除去粘附在脾脏上的脂肪组织。用含2倍青链溶液(每毫升200单位青霉素G和200微克链霉素)的杜氏改良伊格氏培养基洗涤脾脏两次。并将其放入一个置于冰上的无菌袋内。向袋内加入由杜氏改良伊格尔培养基和2倍青链溶液组成的溶液，将脾脏在此装置中弄碎，然后通过四层无菌纱布滤入50毫升离心管。用40毫升含有杜氏改良伊格尔培养基和2倍青链溶液组成的溶液冲洗袋和滤层。然后将细胞在一个IECNH-SII型离心机(Damon/IEC部)内以每分钟1000转离心10分钟，轻轻吸去上清。细胞用含杜氏改良伊格尔培养基和2倍青链的溶液洗2次，再用无添加剂的杜氏改良伊格尔培养基洗一遍，尔后重悬于杜氏改良伊格尔培养基中。
骨髓瘤细胞(SP2/0)培养在含有1倍青链溶液和1％胎牛血清(FBS)(欧文尼科学公司，目录号3000，批号209608，热灭活)的HB101培养基中，并在对数生长期中扩增3天。在IEC NH-SII型离心机上以每分钟1000转离心10分钟收集SP2/0细胞，用杜氏改良伊格尔培养基洗涤，然后重悬在此培养基内。
将脾细胞和骨髓瘤细胞以4∶1的比率混合于一只50毫升离心管中，每分钟1000转离心10分钟吸去上清。然后将细胞沉块放在一个有通风罩的37℃水浴箱内。融化聚乙二醇(分子量1500，M.A.Bioproducts，目录号17780z，批号4J030)然后以1∶1体积比与杜氏改良伊格尔培养混合便成为50％溶液。按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞。在第1分钟里加入1毫升50％聚乙二醇溶液。在第2分钟里，用一只吸管轻轻搅拌溶液，该吸管做连续的圆周运动但需避免接触试管壁或底部。在第3分钟里加入1毫升含有杜氏改良伊格尔培养基、10％胎牛血清和1倍青链的溶液。在第4分钟里再加入1毫升上述溶液。在第5和第6分钟里再加入8毫升相同的溶液。此混合液用IEC NH-SII型离心机以每分钟1000转的速度离心10分钟，吸出离心管中的上清，再用100到150毫升含杜氏改良伊格尔培养基、10％胎牛血清和1倍青链的培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入8块半在二氧化碳培养箱中预平衡过的96孔培养板上的大约800个孔中，每孔加0.1毫升。将培养板放回到温度为37℃，二氧化碳含量为7％的二氧化碳培养箱中。
一天以后，每孔加入100微升用杜氏改良伊格尔培养基和10％胎牛血清配成的次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷培养基。第二天从每孔吸出100微升陈旧的培养基，再加入100微升新鲜的上述培养基。这一过程在第2、第4、第7和第11天重复进行一次。在第14天，从每孔中吸出100微升陈旧的培养基，加入100微升含1.36毫克/分升次黄嘌呤和0.76毫克/分升胸腺嘧啶脱氧核苷的次黄嘌呤-胸腺嘧啶脱氧核苷培养基。同样的过程在第18、第22和第26天重复一次。在第28天，用含10％胎牛血清的杜氏改良伊格尔完全培养基进行换液。以后每周用此完全培养基给培养物换液两次。在第17天，用抗小鼠IgG的抗体检查各孔有无免疫球蛋白产生。放射免疫分析和酶联免疫吸附试验的结果表明，800个孔中大约有260个孔显示小鼠IgG明显阳性。实施例2A.单克隆抗体的初步鉴定
为检测产生抗人多能粒细胞集落刺激因子抗体克隆的存在，进行了酶联免疫吸附试验。用以50毫摩尔碳酸根/碳酸氢根缓冲液(PH9.2)稀释的纯度为90％的人多能粒细胞集落刺激因子包被96孔板，室温下2个小时每孔加入50微升含100毫微克人多能粒细胞集落刺激因子的上述溶液，4℃下温育过夜。各孔然后用5％牛血清白蛋白封闭液温育处理30分钟。
杂交瘤培养上清用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(pH7.0)稀释，加入包被好的孔中，室温下温育2小时。然后用洗涤液洗3次，加入1∶300稀释的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(BMB公司，目录号605-250)温育1.5小时。各孔用洗涤液洗5次。加入过氧化物酶底物ABTS(连氨基双乙基苯噻唑啉磺酸盐，柯克加德和佩里实验室)，每孔50毫微升。然后用一个TitertekMultiscan分光光度计(Flow实验室，弗吉尼亚州麦克莱恩市)读取各孔在414毫微米波长处的光密度值。发现23个孔(孔3，4，5，20，21，28，35，37，39，40，58，61，63，64，66，68，72，74，75，98，151，182和231)与还原后的人多能粒细胞集落刺激因子有明显反应。
对阳性孔中的杂交瘤细胞进行了正式的克隆化，即将细胞稀释后加入另外的孔中，大约平均3个孔有1个细胞。一般来说，对一个活性孔进行正式克隆化产生的正式克隆似乎是同一杂交瘤细胞的亚克隆，不过在若干孔中，正式克隆化后出现了不同抗体亚型和反应性质的不同克隆群体。从同一孔获得的亚克隆都用一个字母编号(例如从孔4获得的克隆编号为4A，4B等等)。
应用酶联免疫吸附实验以确定单克隆抗体对天然的以及还原后的天然人多能粒细胞集落刺激因子的反应性。我们利用天然的和经十二烷基磺酸钠/巯基乙醇变性的天然人多能粒细胞集落刺激因子，检查了与人多能粒细胞集落刺激因子起阳性抗体反应的孔中上清。发现这些克隆所产生的抗体与上述两种形式的因子反应时具有几乎相等的特异性，说明与这些抗体发生特异性反应的抗原决定簇可能是由蛋白质的连续氨基酸顺序(一级结构)所确定的。B.单克隆抗体与哺乳类的和重组体的人多能粒细胞集落刺激因子的反应性
在本实施例中进行了固相放射免疫分析和酶联免疫吸附试验以确定活性孔杂交瘤上清与由哺乳类产生的以及重组体大肠杆菌产生的人多能粒细胞集落刺激因子的反应性。在除了一次例外的所有实验中，所获得的单克隆抗体无论与哺乳类产生的(天然的)或和重组体产生的人多能粒细胞集落刺激因子都皆发生同样良好的反应。例外的情况涉及亚克隆35B、35D和35I，它们产生的抗体在直接结合实验中与重组体材料的反应性明显低于与哺乳类来源的材料的反应性。C.检查抗体亚类
在本实施例中用放射免疫分析检查从原先发现的23个活性孔获得的正式克隆以确定其产生的抗体亚类。用具有不同亚类特异性的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体处理96孔板，这些抗体包括兔抗小鼠IgG1(迈尔斯实验室，伊利诺斯州内珀维尔市，目录号64-360-1)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目录号64-361-1)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目录号64-362-1)，兔抗小鼠IgG3(同上，目录号64-363-1)，兔抗小鼠IgM(同上，目录号64-365-1)和兔抗小鼠IgG(同上，目录号65-157-2)。每孔用50微升含有约0.5微克抗体、用碳酸氢根/碳酸氢根(PH9.6)缓冲液稀释的抗小鼠免疫球蛋白溶液溶液包被，室温下温育2小时后4℃过液。经5％牛血清白蛋白溶液温育30分钟封闭后，每孔与杂交瘤组织培养上清在室温下共育2小时，再用洗涤液洗3次。对用抗IgG包被的孔中与每孔加入50微升125I标记兔抗小鼠IgG抗体，共育1.5小时，而对用抗IgM包被过的孔则每孔加入50微升125I标记兔抗小鼠IgM抗体，共育1.5小时。各孔然后用洗涤液洗5次。用伽马计数器计数。对初始23个克隆进行分析的结果表明，两个孔(孔37和182)停止合成IgG；1个孔表现为IgG阳性，但在早期的筛选中并未显出对人多能粒细胞集落刺激因子有反应性(孔58)；15个孔表现免疫球蛋白G1阳性(孔4c，5，28，39，40，61，63，64，66，68，72，74，75，98和231)。其中一孔的一个亚克隆5d被发现与抗IgG2和抗IgM抗体都发生反应；4个孔表现IgG2a阳性(孔3，4A，21和151)，1个孔IgG2b阳性(孔35)。D.利用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入测量对人多能粒细胞集落刺激因子刺激活性的中和效应
在本实施例中，测定了抗人多能粒细胞集落刺激因子的单克隆抗体对该因子刺激3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入人骨髓细胞这一生物活性的中和能力。为此目的，重组体或天然的人多能粒细胞集落刺激因子与不同浓度的本发明中的抗体在4℃共育12小时。然后将此溶液加到低密度、非粘附的人骨髓细胞中，按照共同未决的第768959号美国专利申请书中实施例7所描述的方法进行处理。对包括克隆20A、35B，39B，40A，61D，63D，75A和151K在内的各克隆所产生的抗体进行了测定，以克隆75A产生的抗体对人多能粒细胞集落因子刺激3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入效应的中和效力最强，上面提到的抗体除由克隆35B产生者外都表现不同程度的对3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入的中和效应。E.对人多能粒细胞集落刺激因子诱导细胞分化活性的中和效应
在本实施例中，测定了抗人多能粒细胞集落刺激因子抗体对该因子诱导鼠类骨髓单核细胞白血病细胞系WEHI-3BD+分化的能力的中和效应。各种浓度的由本发明产生的抗体(由克隆20A，39B，40A，61D，63D和75A产生)与人多能粒细胞集落刺激因子在4℃共育12小时。然后将此溶液按照共同未决的第768959号美国专利申请书中实施例7所描述的方法加至悬浮于琼脂中的WEHI-3BD+细胞上。由克隆40A，61D和75A产生的抗体显示出阻断细胞分化的能力。因为这几个单克隆抗体对人多能粒细胞集落刺激因子具有不同的沉淀能力，因此某些单克隆抗体具有阻断人多能粒细胞集落刺激因子的诱导分化能力，而另一些单克隆抗体则否的事实不能简单地用亲和力强度不同来解释。有意义的是，由克隆75A产生的单克隆抗体不仅抑制了WEHI-3BD+细胞的分化而且也抑制了细胞生长。提示该单克隆抗体也许与WEHI-3BD+细胞分泌的一种鼠类生长因子有交叉反应；或具有与其结合人多能粒细胞集落刺激因子能力无关的抗增殖效应。F.决定簇鉴定
在本实施例中应用125I标记的，由克隆75A与151K产生的抗体和固相化的、由重组体产生的人多能粒细胞集落刺激因子进行了竞争性结合的研究。在这些研究中，让其他克隆产生的抗体与已结合在重组体产生的人多能粒细胞集落刺激因子上的、放射标记的75A和151K单克隆抗体相竞争。在按照为本领域所熟知的方法温育和洗涤后，以放射性计数为指标来确定75A克隆产生的抗体或者151K克隆产生的抗体从人多能粒细胞集落刺激因子上被取代下来的程度。
这些实验的结果表明，由克隆63D.75A和151K产生的抗体可能都能与人多能粒细胞集落刺激因子蛋白分子上一个共同抗原决定簇互相反应。这些实验的结果也表明，由克隆4C、28A和35B产生的抗体与人多能粒细胞集落刺激因子蛋白分子上的一个或数个抗原决定簇起反应，而克隆75A和151K产生的抗体并不与之发生特异性反应。这些实验的结果还表明，克隆40A和61D所产生之抗体与人多能粒细胞集落刺激因子结合的性质不同于它和克隆4C、28A、35B、75A和151K产生之抗体相结合的性质。G.已保管的代表性细胞系所产生的抗体的特性
由本发明提供的具有代表性的能分泌单克隆抗体的、新杂交瘤细胞系已经委托美国典型培养物收集中心(马里兰州20852，罗克维尔市帕克劳恩路12301号)保管。这些细胞系相应于在正式克隆化过程中产生的下述细胞系：克隆4C(A.T.C.C HB-8962)，克隆28A(A.T.C.C.HB-8957)，克隆35B(A.T.C.C.HB-8960)，克隆63D(A.T.C.C.HB-8958)，克隆75A(A.T.C.C HB-8959)和克隆151K(A.T.C.C.HB-8961)。由这些克隆所产生的抗体的特性总结于下面的表1中。
                   表1
                                     抗原决定簇
              结合        中和效应        特征
          大肠        3H-胸苷   WEHI    相似性克隆号  亚类  杆菌  天然(人骨髓细胞) 3B D+ 75A 151K4C     IgG1   +     +    未做      未做    -   -28A     IgG1   +     +    未做      未做    -   -35B     IgG1   ±         +     -        未做    -   -63D     IgG1   +     +    ±                   -      +   +75A     IgG1   +     +    +++        +      +   +151K    IgG2a  +     +    ++        未做    +   +H.用腹水法扩大抗体产量
为获得比组织培养法所产生的更浓的抗体，采用了腹水法来扩大本发明中单克隆抗体的产量，该法在Kenneth等人编著的《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析中的新天地》(纽约：普莱南出版公司，1981年)一书第403页中有全面的描述。按照这一方法，用25或27号标准针头向每只小鼠腹腔内注射0.5毫升降植烷(2，6，10，14-四甲基十五烷，获自Aldrich化学品公司)。降植烷处理使瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。大约1-2周后，106个左右悬浮于无血清杜氏改良伊格尔培基(欧文尼科学公司)或者HB101培养基(汉纳生物制品公司，加利福尼亚州伯克利市)的杂交瘤细胞被注入腹腔。每个克隆都按上述程序注入小鼠。
注射杂交瘤细胞大约1-3周后，在皮肤上做小切口，用吸管从腹腔中吸出腹水。腹水经离心澄清后冻存。腹水抗体可通过45％硫酸铵沉淀和蛋白A-琼脂糖色谱进一步纯化除去腹水白蛋白。
                  实施例3
         分离与纯化造血细胞生长因子
通过提供高特异和高反应性的抗人多能粒细胞集落刺激因子的单克隆抗体，本发明首次使利用本领域所熟知的亲和纯化技术从发酵培养及天然哺乳类中分离人多能粒细胞集落刺激因子和造血细胞生长因子成为可能。简单地说，推荐的分离步骤涉及将本发明的一个抗体固定在一个固相支持物(例如一个色谱柱)上，令含有人多能粒细胞集落刺激因子或造血细胞生长因子的液体与固化的抗体接触，然后从与固相抗体相结合的免疫复合物中洗脱下纯化的人多能粒细胞集落刺激因子或造血细胞生长因子。通过调整使用的特异性抗体，这一纯化技术可使以正确折叠构象形式存在的天然人多能粒细胞集落刺激因子与正确折叠的或变性的该因子相分离。人多能粒细胞集落刺激因子的类似物可被分离和加以研究，如对造血细胞生长因子分子的特异性抗原决定簇即可进行这样的研究。
             实施例4
    定量检测造血细胞生长因子
通过本发明提供高特异性的抗人多能粒细胞集落刺激因子的单克隆抗体，可以建立利用一个以上抗体的新的固相或液相测定方法，来定量检测液体样品中人多能粒细胞集落刺激因子和造血细胞生长因子含量。典型的固相测定方法包括下述步骤：
(1)令待测液体与固相化的第一抗体相接触，该抗体即与液体中人多能粒细胞集落刺激因子上的一个抗原决定簇反应形成该因子与第一抗体的免疫复合物
(2)将第(1)步中形成的复合物与第二个抗体接触，该抗体即与人多能粒细胞集落刺激因子上不同于第一个抗原决定簇的另一个抗原决定簇反应形成该因子与第二个抗体的免疫复合物；
(3)测定在第(2)步中所形成的免疫复合物中结合的第二个抗体的量。
液相竞争分析法涉及人多能粒细胞集落刺激因子的标记和用一个或多个本发明的抗体沉淀标记物。这样即可以竞争结合的方式对非标记的人多能粒细胞集落刺激因子或相关的因子进行定量。这样的测定方法最好采用两个前述的单克隆抗体，不过也可用一个单克隆抗体和一个抗人多能粒细胞集落刺激因子的多克隆血清的抗体来建立。
可以预料，熟悉本门技术的人思考了前面所描述的具体例子之后，会想出许多对本发明实施的改进和变化。因此对他们在本发明的权利要求中仅做出这样一些限制。
本发明涉及的6个细胞系，已于1991年6月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，为便于公众查阅起见，将其CCTCC保藏号与ATCC保藏号一并列出如下；
鼠源杂交瘤BADCPPF1-28A ATCC No.HB8957 CCTCC No.C91007
鼠源杂交瘤BADCPPF1-63D ATCC No.HB8958 CCTCC No.C91008
鼠源杂交瘤BADCPPF1-75A ATCC No.HB8959 CCTCC No.C91009
鼠源杂交瘤BADCPPF1-35B ATCC No.HB8960 CCTCC No.C91010
鼠源杂交瘤BADCPPF1-151K  ATCC No.HB8961 CCTCC No.C91011
鼠源杂交瘤BADCPPF1-4C  ATCC No.HB8962 CCTCC No.C91012。

Claims (4)

1.生产在抗原/抗体反应中能与人多能粒细胞集落刺激因子特异性结合的单克隆抗体的方法，该方法包括在鼠源杂交瘤细胞系生长培养基中培养能产生所述单克隆抗体的该杂交瘤细胞系，其中所述鼠源杂交瘤细胞系选自具有BADCPPF1-28A(CCTCC No.C91007)，BADCPPF1-63D(CCTCC No.C91008)，BADCPPF1-75A(CCTCC No.C91009)，BADCPPF1-35B(CCTCC No.C91010)，BADCPPF1-151K(CCTCC No.C91011)和BADCPPF1-4C(CCTCC No.C91012)的细胞系特征的细胞系。
2.按权利要求1的生产单克隆抗体的方法，其中所产生的单克隆抗体选自IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3亚型的单克隆抗体。
3.按权利要求1或2的生产单克隆抗体的方法，其中所述单克隆抗体能够中和人多能粒细胞集落刺激因子诱导培养的WEHI3BD+细胞分化的能力。
4.按权利要求1或2的生产单克隆抗体的方法，其中所述单克隆抗体能够中和人多能粒细胞集落刺激因子刺激骨髓细胞摄取胸腺嘧啶脱氧核苷的能力。
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