CN103936854A - 抗il-17a单克隆抗体及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体、包含编码所述抗体的多核苷酸序列的表达载体，宿主细胞，以及单克隆抗体用于制备治疗由IL-17A介导的免疫系统疾病中的用途。本发明的目的在于从全合成噬菌体抗体库中筛选出抗IL-17A单克隆抗体，然后用一种构建小容量定点突变的全合成噬菌体抗体库的方法，对筛选出的抗IL-17A单克隆抗体的重链可变区CDR3区突变建库进行抗体体外亲和力成熟，最终获得高亲和力的抗体，同时增加了抗体库的多样性。
Description
技术领域
本发明涉及抗体工程技术领域，特别涉及一种抗IL-17A的单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
白细胞介素IL-17A是一种重要的炎症细胞因子，与炎症、肿瘤、过敏性疾病、自身免疫性疾病等的发生发展有着密切关系，在体内主要由CD4+T细胞(如Th17细胞)产生，也可由巨噬细胞、星形细胞、Langerhans细胞和肥大细胞分泌，其受体广泛表达于成纤维细胞、角化细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞、上皮细胞、软骨细胞及成骨细胞。因此，由IL-17A/Th17介导的免疫反应是全身性的，由此引发的炎症反应主要表现为中性粒细胞浸润。类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生过程中也都有此免疫反应参与。
类风湿性关节炎(RA)是一种常见的以累及周围关节为主的多系统性炎症的自身免疫性疾病。其特征为对称性的大小关节滑膜的炎性反应。起初症状包括指关节肿胀疼痛，并且在关节部位有晨僵。滑膜炎持久反复发作，导致关节软骨和骨质破坏，关节功能障碍，终致残废。类风湿性关节炎属于难治性疾病，发病率高，致残率高，严重危害人类健康。据最近报道，我国的患病率为0.2-0.93％(Zeng QY，Chen R，Darmawan J，et al.Rheumatic diseases in China[J].Arhritis Res Ther，2008，10(1)：R17)，是造成我国人群丧失劳动力和致残的重要因素之一。因而RA的早期诊断和及时治疗对控制该病的病情非常重要。
IL-17A上调滑膜成纤维细胞产生炎性细胞因子和前列腺素，促进滑膜成纤维细胞核关节软骨细胞产生MMP(基质金属蛋白酶)，其在破骨性骨再吸收中可能有作用。IL-17A的不当或过度产生与多种疾病或病症的病理学相关联，所述疾病或病症例如为类风湿性关节炎，骨关节炎、骨侵蚀、腹膜内脓肿与粘连、炎性肠病、同种异体移植排除、牛皮癣、某些类型的癌、血管发生、动脉粥样硬化和多发性硬化(Witkowski等人，Cell.Mol.Life Sci.61：567-579.2004)。
IL-17A与促炎应答的诱导有关，且诱导或介导多种其他细胞因子、因子和介质的表达，包括组织坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8、IL-1β、粒细胞集落刺激因子、前列腺素E2、IL-10、IL-12、IL-1R拮抗剂、白血病抑制因子和溶基质蛋白酶等。IL-17A还诱导软骨细胞核人关节炎外植体中的氧化氮。通过其在T细胞介导的自身免疫中的作用，IL-17A诱导细胞因子、趋化因子和生长因子的释放，是嗜中性粒细胞积聚的重要局部协调物，并且在软骨和骨破坏中起作用。
诸多研究证实，在健康者体内，IL-17A在外周血单核细胞(PBMCs)中的表达水平正 常，但在免疫性疾病或炎症患者体内其水平明显升高，而使用特异性抗IL-17A抗体治疗，可减轻炎症。所以，开发靶向IL-17A/Th17免疫反应的特异性抗体，对于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的有效治疗具有重大意义。IL-17A中和抗体治疗动物在自身免疫性脑脊髓炎(autoimmune encephalomyelitis)中降低疾病发病率和严重性(Komiyama，Y.等，免疫学杂志(J.Immunol.)177(2006)566-573)。IL-17A在MS患者脑脊髓液中过量表达(Hellings，P.W.等，美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.)28(2003)42-50；Mstusevicius，D.等，多发性硬化(Multiple Sclerosis)5(1999)101-104；W02005/051422)。此外，IL-17A中和抗体降低小鼠胶原蛋白诱导的关节炎RA模型的严重性和发病率，并且高水平的IL-17A可在来自于RA患者的发炎关节的滑膜液中检测到(Ziolkowska，M.等，免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)2832-2338；Kotake，S.等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)103(1999)1345-1352；Hellings，P.W.等，美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.)28(2003)42-50)。
目前多家大型国际制药公司都在积极开发针对IL-17A或IL-17R的单抗药物，其中至少三种单抗药物已经进入临床研究(I/II/III期)，包括EliLilly公司的Ixekizumab和Novartis公司的Secukinumab等，如表1所示。其中，Novartis公司在2013年7月8日宣称，其secukinumab在一项治疗银屑病的直接比较研究中击败Enbrel(etanercept for injection，注射用依那西普)，而Enbrel是目前对银屑病的标准治疗方案。secukinumab的作用机制与Enbrel的作用机制不同，它是阻断参与银屑病进展的细胞因子白介素-17A(IL-17A)，这也是首款以这种作用机制进入III期临床研究的银屑病治疗药物。
表1.当前正在开展临床试验的抗IL-17A单抗
目前全人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向，噬菌体抗体库技术的出现为全人源性抗体的制备提供了良好的技术平台。噬菌体抗体库技术无需经过杂交瘤技术，甚至无需经过免疫过程即可直接获得特异性的各种抗体基因及其抗体分子片段。噬菌体抗体库技术模拟了 抗体免疫系统的选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外与固相化的靶向抗原相互作用，然后反复洗涤去除非特异性结合抗体，在洗脱并收集与抗原结合的噬菌体，再次感染大肠杆菌，使特异性的噬菌体得到富集。噬菌体抗体库技术绕过动物免疫，直接利用抗原从抗体库中筛选出特异性的人源性单克隆抗体，不需细胞培养和融合，生产周期大大缩短；重链可变区和轻链可变区的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所产生的抗体都是高亲和力的抗体；因噬菌体易扩增，可大量制备蛋白和多肽，同时所得抗体比杂交瘤技术所得的抗体稳定。
本发明从全合成噬菌体抗体库中快速的筛选出抗IL-17A的单克隆抗体，然后应用一种构建小容量定点突变的全合成噬菌体抗体库的方法，在筛选出的抗体基础上对VHCDR3区突变建库进行抗体的体外亲和力成熟，获得了高亲和力的抗体，同时增加了抗体库的多样性。
发明内容
本发明的目的在于从抗体库中筛选出抗IL-17A单克隆抗体，然后应用小容量定点突变的全合成噬菌体抗体库的构建方法，来对初筛获得的抗体进行体外亲和力成熟。用该抗体库获得高亲和力的抗IL-17A的单克隆抗体。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体，其包含含CDR1、CDR2、和CDR3序列的重链可变区，其中：
所述重链可变区CDR1序列为选自GFTFSGYW、GFTFSDYW的氨基酸；
所述重链可变区CDR2序列为选自INQDGTEK、INQDGNEK的氨基酸；
所述重链可变区CDR3序列为选自VRDYYDFVSDYYIHYWYFDL、VRDYYSLISNYYIHYWYFDL、VRDYYSLISDYYIHYWYFDL、VRDYYSFVSNYYIHYWYFDL的氨基酸。
所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：1、2、3或4所示。
本发明还提供了一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体，其包含含CDR1、CDR2、和CDR3序列的轻链可变区，其中：
所述轻链可变区CDR1序列为选自RASQGVNSYLT、RASQNISNYLA的氨基酸；
所述轻链可变区CDR2序列为选自GASNRES、AASSLET的氨基酸；
所述轻链可变区CDR3序列为选自QQYHGSPLT、QQHWGSPTT的氨基酸。
所述单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：5、6所示。
本发明还提供了一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体，其包含含CDR1、CDR2、和CDR3序列的重链可变区及含CDR1、CDR2、和CDR3序列的轻链可变区，其中：
所述重链可变区CDR1序列为选自GFTFSGYW、GFTFSDYW的氨基酸；
所述轻链可变区CDR1序列为选自RASQGVNSYLT、RASQNISNYLA的氨基酸；
所述重链可变区CDR2序列为选自INQDGTEK、INQDGNEK的氨基酸；
所述轻链可变区CDR2序列为选自GASNRES、AASSLET的氨基酸；
所述重链可变区CDR3序列为选自VRDYYDFVSDYYIHYWYFDL、VRDYYSLISNYYIHYWYFDL、VRDYYSLISDYYIHYWYFDL、VRDYYSFVSNYYIHYWYFDL的氨基酸；
所述轻链可变区CDR3序列为选自QQYHGSPLT、QQHWGSPTT的氨基酸。
所述单克隆抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO：1，轻链可变区序列为SEQ ID NO：5；或重链可变区序列为SEQ ID NO：2，轻链可变区序列为SEQ ID NO：5；或重链可变区序列为SEQ ID NO：3，轻链可变区序列为SEQ ID NO：6；或重链可变区序列为SEQ ID NO：4，轻链可变区序列为SEQ ID NO：6。
所述单克隆抗体可以为全抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段。
所述单克隆抗体是全人源抗体。
本发明还提供了一种构建所述单克隆抗体的方法，其步骤在于：
(1)构建全合成噬菌体抗体库，进行抗IL-17A单链抗体的生物淘选，共进行三轮抗体库的富集筛选；
(2)挑取第三轮富集后的抗IL-17A单克隆抗体，进行phage-Abs阳性克隆的筛选，获得四种不同的抗体；
(3)phage ELISA测定步骤(2)所述筛选出的四种单链抗体的亲和力，挑取亲和力高的两株抗体；
(4)以步骤(3)所述挑取的两株亲和力高的抗体为基础，对VHCDR3区进行定点突变构建小容量抗体库，并对该库进行生物淘选和阳性克隆的筛选，获得所述单克隆抗体。
其中，步骤(3)所述挑取的两株抗体的重链可变区序列分别为SEQ ID NO：7和8，轻链可变区的序列分别为SEQ ID NO：5和6。
本发明提供了一种表达载体，所述载体包含编码所述抗体的多核苷酸序列，所述的载体是pCDNA3.1。
本发明提供了一种转染上述载体的宿主细胞；所述的宿主细胞是293细胞。
本发明提供了一种单克隆抗体用于制备治疗由表达IL-17A的细胞介导的自身免疫系统疾病中的用途；所述的自身免疫系统疾病为银屑病、类风湿性关节炎或强直性脊柱炎。
附图说明
图1：pcomb3质粒图谱
图2：单克隆phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力
图3：梯度稀释phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力
图4：PCR扩增B52C/B1111D-CDR1，2，CDR3M-Vkappa以及B52C/B1111D-CDR3M-Vkappa DNA片段全长(其中DNA marker为MarkerIII(TIANGEN，MD103))
图5：单克隆phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力
图6：B5，B11-CDR3M全抗体与IL17R的竞争抑制实验
图7：B5，B11-CDR3M全抗体跟不同来源的IL-17A结合特异性分析
图8：B5，B11-CDR3M全抗体在胎牛血清中的稳定性分析
图9：B5，B11-CDR3M全抗体在胎牛血清中亲和力下降百分比
图10：抗huIL-17A单抗抑制huIL-17A诱导产生IL-6的生物活性
具体实施方式
本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而，应当理解，本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其他的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1抗IL-17A单链抗体的生物淘选
采用一系列基因克隆的方法对pcomb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pHBg，其质粒图谱如图1所示，并以此pHBg为基础，构建全合成噬菌体抗体库。
以IL-17A-his为抗原包被免疫管，抗原包被量为5ug/管，4℃包被过夜。采用4％的脱脂奶粉/PBST封闭免疫管，室温封闭1h。同时将全合成噬菌体抗体库用4％的脱脂奶粉室温封闭1h。封闭后的噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗体抗原结合，噬菌体的投入量约为1012个，室温反应1h。PBST洗去未结合的噬菌体，O.1M的HCL-Glycine洗脱抗体，用1.5M的Tris-HCL(pH8.8)中和洗脱下来的噬菌体。
将中和后的噬菌体感染生长至对数生长期的TG1菌液，37。℃静置30min，吸出一部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG(Amp：100ug/ml，Glucose：2％)平板上，用于计算产量。剩下的菌液4000rpm，离心15min后，弃去上清，将菌体涂布于2YTAG(Amp：100ug/ml，Glucose：2％)大平板上，为第二轮筛选做准备。
将大肠杆菌从2YTAG(Amp：100ug/ml，Glucose：2％)大平板刮下，重新摇菌并加入M13辅助噬菌体进行噬菌体扩增，PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选。
实施例2抗IL-17A单链抗体阳性克隆的筛选
挑取经过三轮筛选后产出的分隔良好的单克隆菌落，接种于2YTAG(Amp：100ug/ml，Glucose：2％)培养基中，37℃，220rpm培养至其对数生长期，每孔加入约1010个的辅助噬菌体M13K07，37℃静止感染30min。4000rpm，4℃离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK(Amp：100ug/ml，kan：70ug/ml)重悬沉淀，28℃，220rpm培养过夜。吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，单克隆phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力如图2所示。对获得的阳性克隆进行测序，共获得4个不同的抗体序列。分别命名为B52C、B51F、B1111D、B1112A。
实施例3phage ELISA测定抗IL-17A单链抗体的亲和力
将实施例2中获得的克隆进行单克隆pahge的展示和纯化，进行phage梯度稀释ELISA实验鉴定phage-abs的亲和力。
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被IL-17A，4℃包被过夜。PBST洗涤三次，4％milk-PBST37℃封闭1h。将纯化后的单克隆phage按比例稀释于4％的脱脂奶粉中，每孔加入100ul稀释后的样品，RT静置1h。用PBST洗涤ELISA板，将4％脱脂奶粉稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色5min。用10％H2S04终止显色，50μl/孔。酶标仪450nm单波长测定光密度值。梯度稀释phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力如图3所示，结果显示筛选出的几株不同的噬菌体抗体均能与IL-17A进行结合，而且B52C，B1111D的亲和力明显高于其它克隆。
B52C的重链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：5所示，其中VHCDRl、VHCDR2、VHCDR3序列分别为GFTFSGYW、INQDGTEK、VRDYYDILTDYYIHYWYFDL，VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3序列分别为RASQGVNSYLT、GASNRES、QQYHGSPLT。
B1111D的重链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：8所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：6所示，其中VHCDRl、VHCDR2、VHCDR3序列分别为GFTFSDYW、INQDGNEK、VRDYYDILTDYYIHYWYFDL，VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3序列分别为RASQNISNYLA、AAS SLET、QQHWGSPTT。
实施例4对筛选出的抗IL-17A单链抗体B52C，BllllD进行体外亲和力成熟
1.B52C/B1111D-CDR3M抗体库的构建
分别以B52C，B1111D为模板，设计引物P2，PR2，PCR反应扩增单链抗体B52C和B1111D的重链CDR1，2区基因(图4中的上图)。分别以B52C，B1111D为模板，设计引物P1，PR1，PCR反应扩增单链抗体B52C和B1111D重链CDR3-Vkappa区基因(图4中的中图)。其中在引物P1上设计突变位点，进行定点突变。
引物Pl，P2，PRl，PR2如下所示：
P1：5’GTATTACTGTGTGAGAGACTATTACRVTYTTVTKTCTRATTATTACATACACTAC3’
PR1：5’TGATGTGCGGCCGCTTTGATCTC3’
P2：5’TGACCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG3’
PR2：5’GTAATAGTCTCTCACACAGTAATACACAGCCG3’
QIAgene胶回收试剂盒回收PCR片段。将上述两部分PCR反应获得的DNA片段进行Overlap PCR，采用引物P2，PR1扩增B52C/B1111D-VHCDR1，2，3M-Vkappa全长。反应条件：95℃30s，【95℃10s，60℃30s，72℃30s】3cycle，【95℃10s，74℃40s】22cycles，72℃2min，4℃保存。QIAgene胶回收试剂盒回收PCR片段(图4中的下图)。
用NcoI-HF和NotI分别对质粒pHBg和B52C/B111lD-VHCDRl,2，3M-Vkapp PCR全长进行双酶切。质粒pHBg经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。PCR片段采用QIAgene PCR purification kit试剂盒进行回收。回收后的PCR片段与pHBg质粒按摩尔比3∶1比例经T4DNA连接酶室温连接过夜。将连接片段电击法转化至TG1感受态中。使用SOC培养基37℃培养1h复苏细菌。取一定菌液，涂平板，计算库容量。其余菌液4000rpm，室温下离心15min。弃上清，沉淀涂布于2～3个2YTAG大平板上，37℃倒置培养过夜。
共构建了2个不同的抗体库，每个抗体库库容大约为105个，抗体库的库容量远远超过抗体库的多样性。从该抗体库中随机挑取12个克隆进行序列分析，正确率为92％。
2.噬菌体抗体库的生物淘选和阳性克隆的筛选
将上述构建的两种抗体库，进行phage展示，纯化和沉淀。然后从该库中淘选抗IL-17A的单链抗体。噬菌体抗体库的生物淘选方法同实施案例1。抗IL-17A单链抗体阳性克隆的筛选的方法同实施案例2，单克隆phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力如图5所示。结果发现共筛选到4株不同的抗IL-17A抗体序列，分别命名为B55E，B510F1，B113C和B112E。
B55E的重链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：5所示，其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3序列分别为GFTFSGYW、INQDGTEK、VRDYYDFVSDYYIHYWYFDL，VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3序列分别为RASQGVNSYLT、GASNRES、QQYHGSPLT。
B510F1的重链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：5所示，其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3序列分别为GFTFSGYW、INQDGTEK、VRDYYSLISNYYIHYWYFDL，VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3序列分别为RASQGVNSYLT、GASNRES、QQYHGSPLT。
B113C的重链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：6所示，其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3序列分别为GFTFSDYW、INQDGNEK、 VRDYYSLISDYYIHYWYFDL，VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3序列分别为RASQNISNYLA、AASSLET、QQHWGSPTT。
B112E的重链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：4所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IN NO：6所示，其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3序列分别为GFTFSDYW、INQDGNEK、VRDYYSFVSNYYIHYWYFDL，VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3序列分别为RASQNISNYLA、AASSLET、QQHWGSPTT。
将这四株抗体的轻链和重链可变区基因克隆至装有轻链和重链恒定区基因的pCDNA3.1(Invitrogen公司)载体上，转染293细胞，进行全抗体分泌表达，经过protein A纯化，超滤管超滤后获得全抗体蛋白。
实施例5抗IL-17A单链抗体B55E，B510F1，B113C和B112E亲和力鉴定
1.竞争抑制实验检测全抗体的亲和力
用pH9.6的碳酸盐包被IL-17A，4℃包被过夜。PBST洗涤三次，1％BSA-PBST37℃封闭1h。用3μg/ml的IL-17R-His分别稀释B55E，B510F1，B113C和B112E四种全抗体，全抗体与IL-17A的摩尔比从10∶1开始，三倍梯度稀释，每个样品做11个稀释度，37℃孵育1h。用200μL/孔PBST洗五次，将HRP标记的小鼠抗His二抗按1∶5000稀释于1％BSA-PBST中，37℃孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色8min。用10％H2SO4终止显色，50μL/孔，450nm/630nm读数，结果如图6所示，B55E，B510F1，B113C和B112E均能抑制IL-17A与IL-17R的结合。
2.BIAcore测定全抗体的亲和力
采用捕获法测定全抗体的亲和力。将抗人Fc段的抗体偶联至芯片CM5的表面上，分别稀释B55E，B510F1，B113C和B112E保证大约250RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。将IL-17A设置一系列的浓度梯度(30nm，20nm，15nm，10nm，5nm，2.5nm，1.25nm，0.625nm，0.3125nm)流经固定相表面，测定抗体的亲和力。结果见表2所示，筛出的抗体的亲和力没有太大的差别。
表2.B5，B11-CDR3M抗体亲和力常数测定数值
| Sample | Kon(1/MS) | Koff(1/S) | KD |
| B55E | 1.377E+6 | 1.160E-4 | 8.425E-11 |
| B510F1 | 4.178E+5 | 8.373E-5 | 2.004E-10 |
| B112E | 4.760E+5 | 8.231E-5 | 1.729E-10 |
| B113C | 2.396E+6 | 1.173E-4 | 4.894E-11 |
实施例6B55E，B510F1，B113C和B112E全抗体的结合特异性分析
将来源于食蟹猴的IL-17A(mfIL-17A)，恒河猴的IL-17A(mmIL-17A)，小鼠IL-17A(moIL-17A)和人源IL-17A(huIL-17A)基因分别克隆至pCDNA3.1载体上，转染293细胞， 进行蛋白分泌表达，经过镍柱纯化，超滤管超滤后获得抗原蛋白。
用pH9.6的碳酸盐包被ELISA板，包被huIL-17A，mfIL-17A，mmIL-17A，moIL-17A，4℃包被过夜。200μL/孔PBST洗涤ELISA板三次，1％BSA-PBST37℃封闭1h。PBST稀释样品至0.5ug/ml，最后一孔做为阴性对照37℃孵育1h。200μL/孔PBST洗涤ELISA板五次，将HRP标记的山羊抗人IgG二抗按1∶10000稀释于1％BSA-PBST中，100μL/孔，37℃孵育1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色5min。用10％H2SO4终止显色，50μL/孔，450nm/630nm读数，结果如图7所示。筛出的抗体B55E，B510F1，B113C和B112E可以很好的跟猴源和人源的IL-17A发生抗体抗原结合反应，而跟鼠源的IL-17A几乎不发生反应。
实施例7B55E，B510F1，B113C和B112E抗体在胎牛血清中的稳定性分析
用pH9.6的碳酸盐包被ELISA板，包被IL-17A，4℃包被过夜。200μL/孔PBST洗三次，震荡洗板。封闭：ELISA板：1％BSA-PBST37℃封闭1h，200μL/孔。
样品：
①用牛血清FBS稀释样品至0.6ug/ml，37℃封闭1h
②用PBS稀释样品至0.6ug/ml，37℃封闭1h
③FBS，37℃孵育1h
④用PBS稀释样品至0.6ug/ml，不封闭，正常操作
200μl/孔PBST洗两次，将封闭好的样品依次加入ELISA板子中，37℃孵育1h。用200μ/孔PBST洗五次。将HRP标记的山羊抗人IgG二抗按1∶10000稀释于1％BSA-PBST中，37℃孵育1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色5min。用10％H2SO4终止显色，450nm/630nm读数。全抗体在胎牛血清中的稳定性分析如图8所示，全抗体在胎牛血清中亲和力下降百分比如图9所示，结果发现B55E，B113C的亲和力有一定程度的下降，跟PBS对照组相比下降了15％左右。而B510F1和B112E的亲和力下降的比较明显，大约下降了40％左右。
实施例8抗huIL-17A单抗抑制huIL-17A诱导人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts)产生IL-6的生物活性
在补充2％FCS、L-谷氨酰胺、L-Glutamine(左旋谷酰胺)、rh-insulin(重组人胰岛素)、ascorbic aicd(抗坏血酸)、rhFGF-b(重组人成纤维细胞生长因子-b)、hydrocortisone hemisuccinate(氢化可的松琥珀酸单酯)的medium for the culture ofhuman fibroblasts(人成纤维细胞培养基)中培养人皮肤成纤维细胞(HDF，human dermal fibroblasts，Adult)，使用胰蛋白酶/EDTA消化HDF细胞，以5×104/500ul/孔接种48孔板，培养过夜。次日，DPBS配置2000ng/ml IL-17A与220ug/ml B510F1、B113C、B55E、B112E等比例混合液，用DPBS配置的1000ng/ml IL-17A做3倍梯度稀释，而后HDF完全培养基 10倍稀释；弃掉48孔板培养基，将HDF完全培养基10倍稀释的各浓度样本500ul/孔加入到相应48孔板中，各设2个复孔，共培养24h，收集上清，ELISA检测上清中IL-6的浓度。
ELISA(human IL-6ELISA)检测培养上清IL-6的浓度：从以平衡至室温的密封袋中取出所需板条，分别将标本原液或者不同浓度标准品加入相应孔中，100ul/孔，封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min，洗涤液洗板5次；提前30min制备生物素化抗体工作液，100ul/孔，封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60min，洗涤液洗板5次；提前30min制备酶结合物工作液，100ul/孔，封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱避光孵育30min，洗涤液洗板5次，加入100ul/孔显色底物，37℃避光孵育15min，加入100ul/孔终止液，混匀后即刻检测OD450/OD630的值，数据见表3。
表3.抗huIL-17A单抗抑制huIL-17A诱导产生IL-6的生物活性
用sigmaPlot进行数据分析，Graphpad进行作图，结果如图10所示，B510F1、B113C、B55E、B112E均能抑制IL-17A诱导HDF产生IL-6，其中B113C的抑制功能强于其他三组。
Claims (14)
1.一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体，其包含含CDR1、CDR2、和CDR3序列的重链可变区，其特征在于：
所述重链可变区CDR1序列为选自GFTFSGYW、GFTFSDYW的氨基酸；
所述重链可变区CDR2序列为选自INQDGTEK、INQDGNEK的氨基酸；
所述重链可变区CDR3序列为选自VRDYYDFVSDYYIHYWYFDL、VRDYYSLISNYYIHYWYFDL、VRDYYSLISDYYIHYWYFDL、VRDYYSFVSNYYIHYWYFDL的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：1、2、3或4所示的氨基酸序列。
3.一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体，其包含含CDR1、CDR2、和CDR3序列的轻链可变区，其特征在于：
所述轻链可变区CDR1序列为选自RASQGVNSYLT、RASQNISNYLA的氨基酸；
所述轻链可变区CDR2序列为选自GASNRES、AASSLET的氨基酸；
所述轻链可变区CDR3序列为选自QQYHGSPLT、QQHWGSPTT的氨基酸。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：5、6的氨基酸序列。
5.一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体，其包含含CDR1、CDR2、和CDR3序列的重链可变区及含CDR1、CDR2、和CDR3序列的轻链可变区，其特征在于：
所述重链可变区CDR1序列为选自GFTFSGYW、GFTFSDYW的氨基酸；
所述轻链可变区CDR1序列为选自RASQGVNSYLT、RASQNISNYLA的氨基酸；
所述重链可变区CDR2序列为选自INQDGTEK、INQDGNEK的氨基酸；
所述轻链可变区CDR2序列为选自GASNRES、AASSLET的氨基酸；
所述重链可变区CDR3序列为选自VRDYYDFVSDYYIHYWYFDL、VRDYYSLISNYYIHYWYFDL、VRDYYSLISDYYIHYWYFDL、VRDYYSFVSNYYIHYWYFDL的氨基酸；
所述轻链可变区CDR3序列为选自QQYHGSPLT、QQHWGSPTT的氨基酸。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，所述抗体的重链可变区序列为SEQID NO：1，轻链可变区序列为SEQ ID NO：5；或重链可变区序列为SEQ ID NO：2，轻链可变区序列为SEQ ID NO：5；或重链可变区序列为SEQ ID NO：3，轻链可变区序列为SEQ ID NO：6；或重链可变区序列为SEQ ID NO：4，轻链可变区序列为SEQ ID NO：6。
7.根据权利要求1-6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为全抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体是全人源抗体。
9.一种构建权利要求1-6任一项所述单克隆抗体的方法，其步骤在于：
(1)构建全合成噬菌体抗体库，进行抗IL-17A单链抗体的生物淘选，共进行三轮抗体库的富集筛选；
(2)挑取第三轮富集后的抗IL-17A单克隆抗体，进行phage-Abs阳性克隆的筛选，获得四种不同的抗体；
(3)phage ELISA测定步骤(2)所述筛选出的四种单链抗体的亲和力，挑取亲和力高的两株抗体；
(4)以步骤(3)所述挑取的两株亲和力高的抗体为基础，对VHCDR3区进行定点突变构建小容量抗体库，并对该库进行生物淘选和阳性克隆的筛选，获得权利要求1-6任一项所述单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)挑取的两株抗体的重链可变区序列分别为SEQ ID NO：7和8，轻链可变区的序列分别为SEQ ID NO：5和6。
11.一种表达载体，所述载体包含编码权利要求1-6任一项所述单克隆抗体的多核苷酸序列，所述的载体是pCDNA3.1。
12.一种宿主细胞，所述宿主细胞转染权利要求11所述的载体，所述的宿主细胞是293细胞。
13.权利要求1-6中任一项的单克隆抗体用于制备治疗由表达IL-17A的细胞介导的自身免疫系统疾病中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫系统疾病为银屑病、类风湿性关节炎或强直性脊柱炎。
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Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105504062A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-04-20 | 百泰生物药业有限公司 | 一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体及应用 |
| WO2016082193A1 (zh) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 中国医学科学院药物研究所 | 全人源抗人白介素17a单链抗体 |
| CN107073110A (zh) * | 2014-09-10 | 2017-08-18 | 诺华股份有限公司 | 使用il‑17拮抗剂抑制银屑病关节炎患者的结构损伤进展 |
| CN107236041A (zh) * | 2016-03-29 | 2017-10-10 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | Il‑17抗体 |
| EP3181587A4 (en) * | 2015-03-05 | 2017-12-06 | Beijing Bettermab Biotechnology Co., Ltd | Anti-human il-17 monoclonal antibody and use thereof |
| CN110655579A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-07 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 一种新型抗ctla-4单克隆抗体及其应用 |
| WO2020024931A1 (en) * | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Shen Weiqun | Anti-il-17a antibodies and use thereof |
| CN111848795A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-10-30 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种抗il-17ra单克隆抗体及其应用 |
| CN112891531A (zh) * | 2020-06-19 | 2021-06-04 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种抗il-17ra单克隆抗体的注射制剂 |
| CN113150149A (zh) * | 2020-06-19 | 2021-07-23 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法 |
| CN113166239A (zh) * | 2018-12-12 | 2021-07-23 | 上海君实生物医药科技股份有限公司 | 抗il-17a抗体及其应用 |
| WO2022144023A1 (zh) * | 2021-01-04 | 2022-07-07 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗il-17抗体治疗自身免疫性疾病和炎症的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102905727A (zh) * | 2009-10-30 | 2013-01-30 | 詹森生物科技公司 | Il-17a拮抗剂 |
-
2014
- 2014-04-30 CN CN201410178841.1A patent/CN103936854B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102905727A (zh) * | 2009-10-30 | 2013-01-30 | 詹森生物科技公司 | Il-17a拮抗剂 |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107073110A (zh) * | 2014-09-10 | 2017-08-18 | 诺华股份有限公司 | 使用il‑17拮抗剂抑制银屑病关节炎患者的结构损伤进展 |
| WO2016082193A1 (zh) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 中国医学科学院药物研究所 | 全人源抗人白介素17a单链抗体 |
| EP3181587A4 (en) * | 2015-03-05 | 2017-12-06 | Beijing Bettermab Biotechnology Co., Ltd | Anti-human il-17 monoclonal antibody and use thereof |
| US10392436B2 (en) | 2015-03-05 | 2019-08-27 | Beijing Bettermab Biotechnology Co., Ltd | Anti-human IL-17 monoclonal antibodies and use thereof |
| CN105504062A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-04-20 | 百泰生物药业有限公司 | 一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体及应用 |
| CN105504062B (zh) * | 2015-12-25 | 2019-06-04 | 百泰生物药业有限公司 | 一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体及应用 |
| CN107236041A (zh) * | 2016-03-29 | 2017-10-10 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | Il‑17抗体 |
| CN107236041B (zh) * | 2016-03-29 | 2020-07-24 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | Il-17抗体 |
| WO2020024931A1 (en) * | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Shen Weiqun | Anti-il-17a antibodies and use thereof |
| CN113166239A (zh) * | 2018-12-12 | 2021-07-23 | 上海君实生物医药科技股份有限公司 | 抗il-17a抗体及其应用 |
| CN110655579A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-07 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 一种新型抗ctla-4单克隆抗体及其应用 |
| CN111848795A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-10-30 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种抗il-17ra单克隆抗体及其应用 |
| CN111848795B (zh) * | 2020-06-19 | 2021-03-12 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种抗il-17ra单克隆抗体及其应用 |
| CN112891531A (zh) * | 2020-06-19 | 2021-06-04 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种抗il-17ra单克隆抗体的注射制剂 |
| CN113150149A (zh) * | 2020-06-19 | 2021-07-23 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法 |
| WO2022144023A1 (zh) * | 2021-01-04 | 2022-07-07 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗il-17抗体治疗自身免疫性疾病和炎症的方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103936854B (zh) | 2016-08-17 |
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