CN104045713B

CN104045713B - 一种抗Blys的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物

Info

Publication number: CN104045713B
Application number: CN201310080394.1A
Authority: CN
Inventors: 苏云鹏; 庄伟亮
Original assignee: Shandong Nuomaibo Biological Medicine Technology Co ltd; Jiangsu Novomab Biopharmaceutical Inc
Current assignee: JIANGSU NOVOMAB BIOPHARMACEUTICAL INC.; Shandong Nuomaibo Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: WO2014139425A1; CN104045713A

Abstract

本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及与B淋巴细胞刺激因子Blys特异性结合的基因工程抗体以及含有该抗体的药物组合物和试剂盒。所述基因工程抗体，其重链可变区含有SEQ ID NO.1，SEQ ID N0.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或其轻链可变区含有SEQID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。本发明还提供一种抗Blys的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.7352的细胞株产生。本发明所述抗体可与Blys有很强的结合亲和力,可抑制Blys与IM9细胞表面受体，抑制Blys诱导的鼠脾细胞增殖，可用于治疗Blys相关性疾病。本发明所述抗体活性强、特异性好、易于制备，具有广阔的临床应用和实验应用前景。

Description

一种抗Blys的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物

技术领域

本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及与B淋巴细胞刺激因子Blys特异性结合的基因工程抗体以及含有该抗体的药物组合物和试剂盒。

背景技术

Blys(B淋巴细胞刺激因子)，又称BAFF，是1999年发现的一种新的细胞因子，属于肿瘤坏死因子超家族成员(TNFSF)。主要由巨噬细胞和中性粒细胞分泌产生，在活化的T细胞和树突状细胞中也有少量表达。人BAFF基因定位于染色体13q32-q34，由6个外显子和5个内含子组成。

Blys分子由285个氨基酸组成，，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，单体成楔形样的“三明治”结构，缺少N-糖基化位点。跨膜区在47-73位氨基酸。133-285位氨基酸为其发挥功能的主要区域。可溶型Blys(soluble Blys，s Blys)是由膜型Blys在第132或133位氨基酸残基发生酶解脱落而形成，两者的生物学活性基本一致。Blys以同源三聚体的形式发挥生物学作用。Blys的受体共有三种，即TACI、BCMA和BR3，通过与受体结合调节着机体免疫平衡。

Blys分子在B细胞发育、功能调节和自身免疫性疾病的发病中发挥重要作用，其缺陷或过量表达均可引起机体免疫失衡，从而诱发多种疾病，可能与某些自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AD)的发生有关。在SLE、SS和RA等疾病患者血清中Blys水平明显升高，进一步证实BAFF过表达密切参与了这些疾病的发生和发展。

自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AD)是一类机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害的疾病。常见的全身性自身免疫性疾病有SLE、干燥综合征(Sjsngren syndrome，SS)和类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等。目前，对AD的治疗手段仍处于研究和探索中，主要是依赖免疫抑制剂等药物治疗，但疗程较长，发生药物不良反应较多见。结合基因工程和蛋白质工程技术的靶向抗体药物治疗正成为新兴的研究领域，有望为AD治疗提供新的策略。抗体与其靶点的结合是特异性的，能够起到介导免疫效应机制的作用，并且在血清中具有较长的半衰期。这些特性使抗体具有很强的治疗应用。

目前，FDA于2011年3月9日批准抗Blys单克隆抗体Belimumab的上市，用于治疗SLE，成为50年来首个获准的用于治疗SLE的药物，预计至2015年，其销售总额将会高达30亿美元。但是由于独家生产，病人需要花费高额的费用，目前一个病人用药一年的费用约在3万美元左右。所以，研发新的抗Blys单克隆抗体，从而减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种对Blys抑制活性更高的单克隆抗体。

本发明的另一目的在于提供一种含有该抗体的药物组合物或试剂、试剂盒或芯片。

本发明的目的还在于提供抗Blys抗体用于制备治疗相关疾病的药物中的用途。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

本发明所述抗Blys单克隆抗体，其重链可变区含有SEQ ID NO.1，SEQ ID N0.2和SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列，和/或其轻链可变区含有SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的氨基酸序列。

本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb或Fd，或者双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A-0120694和EP.A-0125023中有所描述。

本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A-184187、GB2188638A或EP.A-239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。

本发明所述单克隆抗体除了重链和轻链中的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3和连接序列外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影响的条件下被其他序列置换，抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，这些区域是与抗原结合的关键部位。为维持优选的结合特性，CDR的序列应尽可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改变使结合特性最优化，本领域的技术人员可以用标准做法来达到此目的。

一个实施方案中，抗体包含如下序列的可变区：一个包含了如SEQ ID NO.7所示的重链可变区，其含有CDR1(SEQ ID NO.1)，CDR2(SEQ ID NO.2)和CDR3(SEQ ID NO.3)所示的氨基酸序列；和一个包含了如SEQ ID NO.8所示的轻链可变区，其含有CDR1(SEQ ID NO.4)，CDR2(SEQ ID NO.5)，和CDR3(SEQ ID NO.6)所示的氨基酸序列。

可变区CDR的变体与上述CDR区除了有至多6个氨基酸取代的不同外基本上是一致的（例如，1、2、3、4或5个氨基酸取代），在具有CDR变体的单克隆抗体中，CDR区变体具有与Blys结合活性。

另一个实施方案中，抗体可包含：a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ IDNO.7所示序列相比有至多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个氨基酸取代；和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示序列相比有至多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个氨基酸取代。目标抗体可能包含这些取代中的任何一个或其组合。

拥有这些取代位置中任一个取代位置的抗体和拥有所有取代位置的抗体同样具有结合Blys的活性。氨基酸取代可同时存在于框架区和CDR区，或单独出现在框架区或CDR区。因此，在某些优选例中，重链可变区的框架区的氨基酸序列与SEQ ID NO.7所示序列相比可能有最多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个取代，和轻链可变区的框架区的氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示序列相比可能有最多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个取代。

在一些抗体中，氨基酸取代可能分布在多个CDR区。因此，重链可变区的多个CDR区的氨基酸序列与SEQ ID NO.7所示序列相比可能有至多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个取代，和轻链可变区的多个CDR区的氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示序列相比可能有至多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个取代。

另一个实施方案中，抗体可能包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ IDNO.7所示序列至少有95%的一致性和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示序列至少有95%的一致性。因此，目标抗体可能包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQID NO.7所示序列至少有约95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示序列至少有约95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。

另一个实施方案中，抗体可能包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ IDNO.7所示序列一致和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示序列一致。

另一个实施方案中，抗体进一步包括免疫球蛋白的Fc区，优选地免疫球蛋白为IgG，进一步优选地免疫球蛋白为人的IgG。

另一个实施方案中，抗体可能包含a)一个重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.9所示序列至少有95%的一致性和b)一个轻链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.10所示序列至少有95%的一致性。因此，目标抗体可能包含a)一个重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.9所示序列至少有约95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性和b)一个轻链，其氨基酸序列与SEQ IDNO.10所示序列至少有约95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。

除了上面所描述的氨基酸取代，目标抗体可能在重链或轻链的两端有附加的氨基酸。例如，目标抗体在重链和/或轻链的C或N末端分别可能包含至少1、2、3、4、5或6或更多的附加氨基酸。在某些实施例中，目标抗体可能比这里所描述的示范性氨基酸短，其主要区别为在重链和轻链的两端分别比示范性氨基酸少1、2、3、4、5或6个氨基酸。

另一个实施方案中，抗体可能包含a)一个重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.9所示序列一致和b)一个轻链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.10所示序列一致。

在本发明的实施例中，所述的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.7352的细胞株产生，其重链氨基酸系列如SEQ ID NO.9所示，轻链如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了一种细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.7352。其产生一种单克隆抗体，所述抗体重链氨基酸序列如SEQID NO.9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，在本发明的实施例中，命名为H1104-30-CA，受体结合活性试验证明，H1104-30-CA具有抑制Blys与其受体结合的活性。

本发明提供了一种药用组合物，该组合物含有有效量的抗Blys单克隆抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明还涉及了试剂、试剂盒或芯片，包含上述的单克隆抗体。

本发明所提供的抗Blys单克隆抗体的抑制Blys与受体结合活性（见实施例2），与现有技术产物Belimumab的活性相似，但是所述的抗Blys单克隆抗体抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖的活性优于现有技术产物Belimumab，本发明的单克隆抗体的IC₅₀值为0.0057ug/ml，Belimumab的IC₅₀值为0.0078ug/ml，表明本发明对Blys有更强的抑制作用。

本发明还提供所述的单克隆抗体在制备用于治疗Blys相关性疾病药物中的用途。所述Blys相关性疾病包括自身免疫性疾病（例如全身性自身免疫性疾病有SLE、干燥综合征SS和类风湿关节炎RA），以及感染性疾病（例如AIDS）和增殖性疾病（例如白血病，癌症和淋巴瘤）。该目标抗体还可以用于与Blys相关的科学研究，如发育生物学、细胞生物学、代谢、结构生物学、功能基因组学等多个领域的科学研究、或肿瘤、全身性自身免疫性疾病有SLE、类风湿关节炎等医学和药学的应用研究。

本发明还提供了使用目标抗体来抑制Blys活性的方法，以及使用目标抗体用于治疗Blys相关性疾病或使用含有该抗体的试剂盒进行Blys相关诊断与检测。

用于本发明的单克隆抗体也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。

一旦制得本发明的抗体分子，就可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法（例如，离子交换色谱，亲和色谱，特别是通过蛋白A对特异性抗原的亲和色谱和其它柱色谱）、离心、利用溶解度差异，或通过任何其它纯化蛋白质的标准技术。在许多实施方案中，抗体从细胞分泌到培养基中，通过收集培养基并进行纯化得到抗体。

附图说明

图1显示单克隆抗体与Blys的直接结合活性，H1104-30的EC₅₀=0.05857nM。

图2显示单克隆抗体的结合特异性。

图3显示单克隆抗体竞争性抑制Blys与IM9细胞表面受体结合的活性，H1104-30的IC₅₀=0.4479nM，Belimumab的IC₅₀=0.4763nM。

图4显示单克隆抗体的抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖的活性，H1104-30的IC₅₀=0.0057ug/ml，Belimumab的IC₅₀=0.0078ug/ml。

图5显示嵌合抗体H1104-30-CA竞争性抑制Blys与IM9细胞表面受体结合的活性。

生物材料保藏说明

保藏编号为CGMCC No.7352的细胞株于2013年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为小鼠杂交瘤细胞。

定义

本发明中提到的参考著作、专利、专利申请及科学文献，构成本领域技术人员的已有知识，作为整体在此引入作为参考，与这些文献专门单个引入作为参考时的范围相同。在本申请所引入文献与本说明书特定含义之间如有任何抵触，都应该以后者为准。另外，本领域对词汇和短语定义的已有理解与本说明书中对该词汇或短语的专门解释而下的定义之间如有抵触，都以后者为准。

在进一步阐述本发明之前,我们有必要认识到，本发明并不局限于描述的特定的实施方案，也就是说，在具体形式上可能存在着变化。还有一点需要提醒的是，由于本发明的范围受附加的权利要求书的限制，因此，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本发明的目的。

氨基酸残基的缩写是本领域中所使用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母或1字母代码。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。

术语“单克隆抗体（MAbs）”和“单抗”在本文中可以互换使用，是指对于特定抗原的抗体的同类群体并且该抗体仅包含一种类型的抗原结合位点并且只结合抗原决定簇上的一个表位。通过本领域技术人员所公知的方法可以获得对于特定抗原的单克隆抗体。例如单克隆抗体可以通过杂交瘤法，或重组DNA法制备。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。这些术语均为本领域技术人员所熟知的术语，具体是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。

目前已知的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”（大约25kDa或大约214个氨基酸）包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”（大约50kDa或大约446个氨基酸），同样包含一个可变区（大约116个氨基酸），以及重链恒定区之一，例如γ（大约330个氨基酸）。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。该术语还包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能与抗原特异性结合的抗体片段和单克隆抗体。

抗体还可以以多种形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab')2，以及双功能杂合抗体（例如，Lanzavecchia等,Eur.J.Immunol.，1987；17,105)以及以单链形式(例如，Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988；85,5879和Bird等,Science,1988；242,423,在此引用作为参考）存在。免疫球蛋白的重链或轻链可变区由三个超变区（也称为“互补决定区”或CDR）组成，这些超变区被框架区（FR）间隔。框架区和互补决定区的范围已被精确定义（参见"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"E.Kabat等,U.S.Departmentof Health and Human Services,1991)。此处所讨论的所有抗体氨基酸序列的排序都参照Kabat系统。同一物种不同的轻链和重链框架区序列相对保守。抗体的框架区用于定位和校准CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。

“嵌合抗体”是其重链和轻链基因经过构建的抗体，特别是利用基因工程改造的属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因。例如，可以将鼠单克隆抗体基因的可变区片段连接到人抗体恒定区片段如γ1和γ3。当然，嵌合抗体的基因来源也可以使用其它哺乳动物物种。

在某些实施方案中，抗体与其靶点之间的亲和力用KD（解离常数）来表征，它低于10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或者约10^-12M或更低。

抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。所有区域、CDR和残基编号均以序列比对、按已有的结构知识为基础进行定义。框架区和CDR残基的鉴定和编号按Chothia和他人所述(Chothia,Structural determinants in the sequences ofimmunoglobulin variable domain.J Mol Biol.1998；278,457)。

“VH”是抗体重链的可变区。“VL”是抗体轻链的可变区，它可能具有κ和λ同种型。K-1抗体具有κ-1同种型而K-2抗体具有κ-2同种型，“Vλ”是可变的λ轻链。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，它们都是指任何长度的聚合形式的氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、通过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有修饰肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列，带有或不带有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；带有免疫标签的蛋白；带有可检测融合伴侣的融合蛋白，例如包括荧光蛋白质、β-半乳糖苷酶、荧光素等等作为融合伴侣的融合蛋白等等。多肽可以具有任何大小，术语“肽”是指长度为8-50个残基（如8-20个残基）的多肽。

“相应的氨基酸”，是指当两个或多个氨基酸序列比对时，位于相同位置（也就是它们彼此对应）的氨基酸残基。抗体序列比对和编号的方法在Chothia，见上，Kabat，见上和其他中得到详尽阐述。本领域普通技术人员已知（参见如Kabat 1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest,DHHS,Washington,DC)，有时可以在抗体的一个或两个氨基酸中制造一个、两个或三个缺口和/或插入1、2、3或4个残基或者至多约15个残基（特别是在L3和H3CDR中），从而完成一次比对。

“可取代位置”，指的是抗体的一个特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不会使抗体的结合活性显著降低。鉴定可取代位置的方法和它们可以被如何取代在下面将进行更加详细的描述。可取代位置也可以称为“变异耐受位置”。

“亲本”抗体是指作为氨基酸取代的靶抗体。在某些实施方案中，“供体”抗体会将氨基酸“赠捐”给亲本抗体以生成改变的抗体。

“相关抗体”是指具有相似序列并且由具有共同B细胞祖先的细胞产生的抗体。这种B细胞祖先含有具有重排轻链VJC区和重排重链VDJC区基因组，并且产生还未经历亲和力成熟的抗体。存在于脾脏组织中的“纯真”或“原始”B细胞是B细胞的共同祖先。相关抗体与相同的抗原表位结合通常在序列上极为相似，特别是它们的L3和H3CDR。相关抗体的H3和L3CDR都具有相同的长度和近乎一致的序列（有0-4个氨基酸残基不同）。相关抗体通过共同抗体祖先，即原初B细胞祖先产生的抗体相关联。

术语“抗Blys单克隆抗体”是与Blys以足够的亲和力以及特异性结合的抗体。

术语“有效量”指可有效治疗哺乳动物中的疾病或病症的药物量。

术语“药效上可接受的载体”指一种或多种有机或无机成分，它可以是天然的或合成的，与抗体组合后可促进其应用。可接受的载体包括无菌的生理盐水或是其它药学上可获得的且为本领域所熟知的水或非水的等渗溶液或灭菌混悬剂。

具体实施方式

本发明公开了一种抗Blys抗体及含有该抗体的组合物，和其用于制备治疗Blys相关疾病的药物中的用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：制备表达抗人Blys单抗的杂交瘤细胞

通过杂交瘤细胞技术制备鼠源单克隆抗体。有关实验方案参见文献（Ed Harlow,David Lane.Antibody:A laboratory manual.1988）。

首先通过重组技术制备Blys-His(含6×his标签)融合蛋白。将Blys-his的DNA序列克隆入PCDNA3.1（Invitrogen）,转染该质粒进入CHO-K1（ATCC No.CCL-60）细胞株，经过G418（GIBCO）加压筛选，获得Blys-His稳定表达细胞株，无血清培养基培养细胞，收集培养上清液，用NI柱（QIAGEN）纯化表达的Blys-His融合蛋白。

用纯化的Blys-His（作为抗原组分）与完全弗氏佐剂（Sigma）混合进行腹腔注射，对BALB/c小鼠进行首次免疫，此后，分别在第14d和第35d，用纯化蛋白和不完全弗氏佐剂混合后腹腔注射对小鼠进行加强免疫，第56d用纯化的Blys-His(PBS稀释)对BALB/c小鼠静脉注射进行最终免疫，4天后取脾脏进行融合。

将鼠脾细胞与SP2/0细胞（ATCC No.CRL-1581）按5：1比例融合，在96孔板（Corning）中以HAT（GBICO）培养基培养，然后进行杂交瘤细胞筛选，所得细胞克隆进行结合筛选。

鉴定筛选过程分为两个步骤：①将Blys-His固定化于96孔酶联免疫吸附板（Costar）上，加入克隆表达上清孵育1h后，用PBST洗涤3次，使用羊抗鼠IgG抗体-HRP（Jackson Immuno）鉴定具有Blys结合活性细胞克隆上清，从而获得可与Blys直接结合的阳性克隆。②随后将步骤①中的阳性克隆转移入24孔板（Corning）培养，以获得更多的表达产物。将IM9细胞（ATCC No.CCL-159）（Blys受体过表达）固定于Poly-lysine96孔板（NUNC）上，加入生物素化的Blys和克隆表达产物共同孵育1h，再用PBS洗涤3次，使用EU标记的链亲和素（Perkin Elmer）检测生物素化的Blys的含量，以鉴定克隆对Blys受体结合活性的抑制作用，从而鉴别出能够阻断Blys与其受体结合的阳性克隆。

实施例2：抗人Blys的鼠源单克隆抗体的制备及鉴定

用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收集培养上清液，用Protein G柱（金斯瑞）纯化鼠源单克隆抗体，获得单克隆抗体称为H1104-30。抗体鉴定项目如下：

A：抗体结合活性

将Blys-His包被于96孔酶联免疫吸附板（Costar）上，然后将1:4系列稀释单克隆抗体加入包被Blys-His板的孔中，加入羊抗鼠IgG抗体-HRP（Jackson Immuno），显色进行检测。结果显示所筛选的单克隆抗体直接Binding EC₅₀达10-100pM水平（见图1）。

B:抗体的结合特异性

将等量的Blys-His，TNF其它家族成员，包括TNFα（R&D），TNFβ（R&D），April（R&D）,，Light（R&D），Fas Ligand（R&D），Trial（R&D），以及鼠BLYS（R&D）和猴BLYS，分别包被于96孔酶联免疫吸附板（Costar）上，然后将单克隆抗体加入包被孔中，加入羊抗鼠IgG抗体-HRP（Jackson Immuno），显色进行检测。结果显示所筛选的单克隆抗体与其它TNF家族成员没有结合反应（见图2），所述单克隆抗体与猴Blys有交叉结合，与鼠Blys结合较弱。

C:抗体的亲和力测定

采用Fortebio测定单克隆抗体与Blys的亲合常数KD。单克隆抗体被固定在MAC探针（Fortebio）上，用SD BUFFER PBS+0.1%BSA平衡探针，接着与Blys-His结合5min，然后探针再孵育SD BUFFER进行解离，KD为kd/ka，表1中显示单克隆抗体与Blys的亲合常数KD。H1104-30的亲合常数KD为0.3023NM。

表1单克隆抗体的亲和力测定

	kd(1/s)	ka(1/Ms)	KD(M)
				H1104‐30	1.792e‐5	5.928e4	3.023e‐10

实施例3：单克隆抗体的体外活性测定

Blys抗体通过结合Blys从而阻断其与受体的结合，来抑制Blys信号通路。体外活性包括，抗体抑制Blys与受体结合和抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖。

A：抗体抑制Blys与受体结合活性

将IM9细胞（ATCC No.CCL-159）（Blys受体过表达）固定于Poly-lysine96孔板（NUNC）上，1:3系列稀释的抗体和生物素化的Blys共同孵育1h，再用PBS洗涤3次，使用荧光标记的链亲和素（Perkin Elmer）检测（参考Kevin P.Baker,1BryanM.Edwards.Generation and Characterization of LymphoStat-B,a Human MonoclonalAntibody That Antagonizes the Bioactivities of B LymphocyteStimulator.ARTHRITIS&RHEUMATISM.Vol.48,No.11,November2003,pp3253–3265）。结果显示所筛选的单克隆抗体可以阻断Blys与IM9细胞的结合（见图3）。

参照上述实验方法，测定单克隆抗体H1104-30和Belimumab的IC₅₀值即半数抑制浓度，结果表明（见图3），H1104-30和Belimumab有相似的竞争抑制活力。

B:抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖

将1:2系列稀释的不同抗体和Blys（终浓度3ng/ml）共同孵育2.5h，加入到含5000个鼠脾细胞的96孔板（corning）中，加入LPS（sigma）（终浓度5μg/ml）进行刺激，在培养箱培养72小时，用CellTiter-Glo（promega）检测细胞活性。采用Graph pad进行四参数非线性回归拟合，计算IC₅₀。结果显示所筛选的单克隆抗体可以抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖（见图4），而且单克隆抗体H1104-30的抑制活性优于Belimumab的活性，H1104-30的IC₅₀值即半数抑制浓度为0.0057ug/ml，Belimumab的IC₅₀值为0.0078ug/ml。

实施例4：嵌合抗体的制备及鉴定

将所筛选的阳性克隆的杂交瘤细胞裂解，提取mRNA后逆转录得cDNA。以此cDNA为模板，采用PCR方法分别扩增出鼠IgG抗体的轻链和重链可变区核酸序列，将序列构建到T载体中，进行测序，对重链可变区、轻链可变区进行分析，其编码的重链可变区为SEQ IDNO.7，其中包含SEQ ID NO.1的亲本序列（SFSMS），SEQ ID N0.2的亲本序列（YIGNGGVSTYYPDTVKG）和SEQ ID NO.3的亲本序列（HGDPLLRLYGFDV）,其编码的轻链可变区为SEQ ID NO.8，其中含有SEQ ID NO.4的亲本序列（LASQTIGTWLA），SEQ IDNO.5的亲本序列（AATRLAD）和SEQ ID NO.6的亲本序列（QQLYSSPYT）。

然后，通过序列末端互补的方法，拼接测序正确的重链可变区或轻链可变区与其对应的人源抗体的恒定区序列，将全长的嵌合抗体的重链和轻链片段，均包含信号肽，克隆入PCDNA3.1（Invitrogen）质粒。共转染轻、重链质粒至293C18细胞株（ATCC No.CRL-10852），培养7天后，用Protein A（GE）纯化上清，最终获得重组表达的抗人Blys的嵌合抗体，称为H1104-30-CA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的重链和SEQ ID NO.10所示的轻链。采用上述抑制Blys与受体结合的活性检测方法，对表达的重组嵌合抗体进行活性确认。结果显示（图5），嵌合抗体具有抑制Blys与其受体结合的活性。

本文所述表达单克隆抗体H1104-30的杂交瘤细胞（同样命名为H1104-30），于2013年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.7352。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

〈110〉江苏先声药业有限公司、江苏先声药物研究有限公司

〈120〉一种抗Blys的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物

〈160〉10

〈170〉PatentIn version3.3

〈210〉1

〈211〉5

〈212〉PRT

〈213〉重链可变区CDR1

〈400〉1

Ser Phe Ser Met Ser

1 5

〈210〉2

〈211〉17

〈212〉PRT

〈213〉重链可变区CDR2

〈400〉2

Tyr Ile Gly Asn Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly

1 5 10 15

〈210〉3

〈211〉13

〈212〉PRT

〈213〉重链可变区CDR3

〈400〉3

His Gly Asp Pro Leu Leu Arg Leu Tyr Gly Phe Asp Val

1 5 10

〈210〉4

〈211〉11

〈212〉PRT

〈213〉轻链可变区CDR1

〈400〉4

Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala

1 5 10

〈210〉5

〈211〉7

〈212〉PRT

〈213〉轻链可变区CDR2

〈400〉5

Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp

1 5

〈210〉6

〈211〉9

〈212〉PRT

〈213〉轻链可变区CDR3

〈400〉6

Gln Gln Leu Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

〈210〉7

〈211〉122

〈212〉PRT

〈213〉重链可变区

〈400〉7

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Thr Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Gly Asp Pro Leu Leu Arg Leu Tyr Gly Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

〈210〉8

〈211〉108

〈212〉PRT

〈213〉轻链可变区

〈400〉8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Ser Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

〈210〉9

〈211〉472

〈212〉PRT

〈213〉重链

〈400〉9

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Thr Leu Val

20 25 30

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Phe Glu Lys Arg

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys

85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Pro Leu Leu Arg Leu Tyr Gly

115 120 125

Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly The Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Lys Lys Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

〈210〉10

〈211〉234

〈212〉PRT

〈213〉轻链

〈400〉10

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr

35 40 45

Ile Gly Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln GLn Lys Pro Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr

100 105 110

Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

Claims

1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.7352的细胞株产生，其特征在于，其重链可变区含有SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，和/或其轻链可变区含有SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

2.一种细胞株，其特征在于，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.7352。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于治疗Blys相关性疾病药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述Blys相关性疾病包括自身免疫性疾病，以及感染性疾病和增殖性疾病。

5.一种药物组合物，其特征在于，含有有效量的权利要求1所述的单克隆抗体及药学上可接受的载体。

6.一种试剂、试剂盒或芯片，包含权利要求1所述的单克隆抗体。