CN1168830C

CN1168830C - 一种重组人B细胞刺激因子（rhBLyS）表达载体的构建、表达、及单克隆抗体制备和应用

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Publication number: CN1168830C
Application number: CNB021151881A
Authority: CN
Inventors: 张志方
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-05-09
Filing date: 2002-05-09
Publication date: 2004-09-29
Anticipated expiration: 2022-05-09
Also published as: CN1401776A

Abstract

本发明公开了一种重组质粒载体，该载体含有人B淋巴细胞刺激因子(hBlyS)基因。本发明还公开了上述该表达载体的构建、表达及单克隆抗体制备，该单克隆抗体可以应用于制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤以及自身免疫性疾病药物，以及应用于制备人外周血细胞上BLyS表达以及血浆中BLyS浓度的检测剂。

Description

一种重组人B细胞刺激因子(rhBLyS)表达载体的构建、表达、及单克隆抗体制备和应用

(一)技术领域

本发明涉及一种表达载体，特别是一种含有人B淋巴细胞刺激因子(hBlyS)基因的表达载体。本发明还涉及该表达载体的构建、表达、及单克隆抗体制备和应用。

(二)背景技术

BLyS(B lymphocyte stimulator)是肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)家族的一个新成员，它含有285个氨基酸，是II型跨膜蛋白。BLyS主要由T淋巴细胞和树突状细胞合成，其受体仅位于B淋巴细胞膜表面。

BLyS被不同的研究小组分别命名为THANK(TNF homologue that activatesapoptosis，nuclear factor κB，and c-jun NH2-terminal kinase)、TALL-1(TNF andapoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1)、zTNF4、TNFRSF19、BAFF(Bcell activating factor belonging to the TNF family)等。BLyS对保持生发中心B淋巴细胞的增生和延长成熟B淋巴细胞的存活发挥重要作用。BLyS转基因小鼠表现出外周血B淋巴细胞数量增加、B淋巴细胞存活时间延长以及血浆IgM、IgG、IgA、IgE、IgD显著增加等表现，5个月小鼠出现免疫复合物沉积在肾脏和蛋白尿现象。但是BLyS的过度表达可以导致自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)，而用抗鼠的BLyS抗体可以阻断BLyS分子与其受体的结合，减轻模型鼠SLE的症状。

采用抗hBLyS单克隆抗体研究BLyS与人类自身免疫性疾病的关系，以及探讨阻断BLyS与B淋巴细胞膜上受体结合从而达到抑制B淋巴细胞活化的目的等方面的研究越来越受到人们重视，并且将成为治疗自身免疫性疾病新途径研究的热点。BLyS分子主要存在于激活的T淋巴细胞膜上，要想直接从人血细胞得到纯化的抗原免疫动物研制抗体十分困难。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种重组质粒载体，该载体含有人B淋巴细胞刺激因子(hBlyS)基因。

本发明的另一目的在于上述载体表达的蛋白在制备抗hBLyS的单克隆抗体的应用。

本发明的另一目的在于上述单克隆抗体在制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤以及自身免疫性疾病药物和在制备人外周血细胞上BLyS表达以及血浆中BLyS浓度的检测剂的应用。

本发明构建含全长hBLyS基因的原核表达质粒，在大肠杆菌中表达谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase，GST)-hBLyS融合蛋白，并以此为基础制备hBLyS单克隆抗体，为研究BLyS与自身免疫性疾病的关系及研发新的特异性抑制B淋巴细胞功能的免疫抑制剂创造条件

本发明全长hBLyS基因的获得是分离健康人外周血淋巴细胞，提取总RNA，再根据全长hBLyS基因序列，设计合成一对引物，以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，然后进行常规PCR扩增。

本发明采用的pGEX-4T-1为表达GST融合蛋白的原核高效表达载体，带有强的tac启动子。构建的质粒中，pGEX-4T-1的多克隆酶切位点位于GST基因之后；采用分子克隆方法将全长hBLyS目的基因插入后，接在GST基因下游；重组质粒DNA序列测定结果证实了含有目的基因。将含有pGEX-4T-1/hBLyS质粒载体的菌株放入含氨苄青霉素的培养基中进行培养，诱导表达后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。当基因进行表达时，表达产物为GST和目的基因表达蛋白的融合体。目的基因预期表达蛋白相对分子质量为32 000，GST蛋白相对分子质量为26 000，融合蛋白相对分子质量为58 000(26 000+32 000)。本发明用此GST-hBLyS融合蛋白作为抗原，既增加了抗原的免疫原性，又方便筛选。采取两种方法进行下一步筛选阳性克隆：①用hBLyS蛋白筛选：将表达的GST-hBLyS融合蛋白通过谷胱甘肽-agarose柱进行亲和层析，再用凝血酶将其GST切除，从而获得目的蛋白，选择与目的蛋白反应的特异性杂交瘤细胞株为阳性细胞株；②用融合蛋白筛选：选择与GST-hBLyS融合蛋白反应而与GST不反应的特异性杂交瘤细胞株为阳性细胞株；最后再用激活的人T淋巴细胞鉴定，即可得到特异性抗hBLyS蛋白的单克隆抗体。该单克隆抗体具有阻断BLyS的作用，因此该单克隆抗体可以应用于制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤以及自身免疫性疾病药物，以及应用于制备人外周血细胞上BLyS表达以及血浆中BLyS浓度的检测剂。

(四)附图说明

图1为pGEX-4T-1/hBLyS重组质粒中hBLyS的核苷酸和氨基酸序列；

图2为hBLyS cDNAPCR产物凝胶电泳；

图3为pGEX-4T-1/hBLyS重组质粒构建示意图；

图4为重组质粒pGEX-4T-1/hBLyS的酶切鉴定；

图5为重组表达质粒pGEX-4T-1/hBLyS部分序列测定结果；

图6为pGEX-4T-1/hBLyS表达产物的SDS-PAGE分析；

图7为抗体特异性的Western blot分析；

图8为单克隆抗体与人外周血淋细胞结合的FACS结果；

图9为单克隆抗体与CD3⁺和CD8⁺细胞结合的FACS。

图2中PCR产物的电泳结果表明，所扩增的目的基因片段与预期的一致，为876bp(含保护碱基和酶切位点)。

图3中hBLyS基因的PCR扩增产物经EcoR I和Sal I双酶切后，插入pGEX-4T-1的EcoR I和Sal I双酶切窗口，得到含GST-hBLyS融合蛋白基因的重组质粒。

图4中用重组质粒转化大肠杆菌BL21，然后把大肠杆菌BL21铺于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜，次日观察到pGEX-4T-1/hBLyS质粒转化菌较稀疏地均匀分布在平板上，分别取pGEX-4T-1/hBLyS和pGEX-4T-1质粒转化菌进行扩增后，抽提质粒DNA进行酶切鉴定，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳，可见经EcoR I和Sal I双酶切后，成为两个片段，分别为4.9kb的pGEX-4T-1和858bp的hBLyS基因片段，与理论值相符。

图5中对阅读框架分析，证明该重组质粒已正向插入了目的基因，肯定了该重组表达质粒能正确表达GST-hBLyS融合蛋白。

图6中含重组质粒pGEX-4T-1/hBLyS的菌株和含质粒pGEX-4T-1的菌株经IPTG诱导后，进行10％SDS-PAGE分析，结果表明，分别在相对分子质量约为58 000(融合蛋白)和26 000(GST蛋白)处有明显的蛋白质表达条带，而未经诱导的pGEX-4T-1/hBLyS在58 000处无条带产生。说明pGEX-4T-1/hBLyS在宿主菌BL21中表达了重组GST-hBLyS融合蛋白。

(五)具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1、hBLyS cDNA的获得

分离健康人外周血淋巴细胞，加入植物凝集素(phytohamagglutinin，PHA)1μg/ml和佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)10ng/ml激活，37℃培养8h后，收集培养细胞，按异硫氢酸胍一步法提取总RNA，紫外分光光度计定量。再根据全长hBLyS基因序列，设计合成一对引物，

P1 5`GTCGAATTCATGGATGACTCCACAG3`，

P2 5`CACGTCGACTCACAGCAGTTTCAATG3`，

其中5`端引物含有EcoR I酶切位点和起始密码，3`端引物含有Sal I酶切位点和终止密码。以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，然后进行常规PCR扩增，扩增条件：95℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸90s，循环35次。取PCR产物5ul在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，用紫外分析仪检测电泳结果。

实施例2、pGEX-4T-1/hBLyS重组质粒的构建及大肠杆菌转化

hBLyS基因的PCR扩增产物经EcoR I和Sal I双酶切后，插入pGEX-4T-1的EcoR I和Sal I双酶切窗口，得到含GST-hBLyS融合蛋白基因的重组质粒，构建过程如图2所示。用重组质粒转化大肠杆菌BL21，然后把大肠杆菌BL21铺于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜，次日观察到pGEX-4T-1/hBLyS质粒转化菌较稀疏地均匀分布在平板上，分别取pGEX-4T-1/hBLyS和pGEX-4T-1质粒转化菌进行扩增后，抽提质粒DNA进行酶切鉴定，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳，可见经EcoR I和Sal I双酶切后，成为两个片段，分别为约4.9kb的pGEX-4T-1和约858bp的hBLyS基因片段，与理论值相符。经DNA序列测定结果正确。

实施例3、GST-hBLyS融合蛋白的诱导表达

分别将含有pGEX-4T-1/hBLyS质粒和pGEX-4T-1空载体的菌株放入含氨苄青霉素的2×YTG培养基中37℃过夜摇菌培养，次日按1∶100稀释培养过夜的菌液转种，培养至菌液OD600＝0.4～0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)至终浓度为0.2mmol/L，未加IPTG诱导的菌液作为对照，继续培养4h后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。选择阳性菌株大量诱导和纯化GST-hBLyS融合蛋白。

结果表明，相对分子质量Mr＝58 000(融合蛋白)处有明显的蛋白质表达条带；未经IPTG诱导的重组质粒pGEX-4T-1/hBLyS在Mr＝58 000处无条带显示；空质粒pGEX-4T-1经IPTG诱导后，在Mr＝26 000(GST蛋白)处有明显的蛋白质表达条带(图3)。说明pGEX-4T-1/hBLyS在宿主菌BL21中表达了重组GST-hBLyS融合蛋白。

实施例4、抗人BLyS单克隆抗体的制备

(1)免疫动物将GST-hBLyS融合蛋白0.5mL(2g/L)作为抗原与等量的完全福氏佐剂混合乳化，取3只6～7周龄的雌性健康BALB/c小鼠同时用GST-hBLyS融合蛋白进行免疫。细胞融合前第3天，用GST-hBLyS融合蛋白100μL进行加强免疫。

(2)细胞融合取SP2/0细胞和加强冲击免疫后的鼠脾细胞悬液于50mL离心管中，按常规方法进行细胞融合后，加入含HAT的RPMI-1640完全培养基，分配入铺有饲养层细胞的24孔细胞培养板，每孔1mL，在5％CO₂、37℃条件下培养。在融合后的第10天，检测培养上清中的特异性抗体。

(3)阳性克隆的筛选及克隆化分别包被GST-hBLyS融合蛋白和GST蛋白作为抗原，然后加入杂交瘤细胞的培养上清(含杂交瘤细胞分泌的抗体)，用ELISA法筛选阳性克隆。选择与GST-hBLyS融合蛋白呈阳性反应，而与GST蛋白呈阴性反应的杂交瘤细胞作为阳性细胞克隆，然后采用显微操作进行连续3次亚克隆培养，直至达到单克隆化。

(4)抗体的特异性鉴定

①ELISA：按常规ELISA方法。②免疫印迹(Western blot)：按常规免疫印迹方法。③流式细胞技术(flow cytometry，FACS)：从人外周血分离单个核细胞，经人IFN-γ激活3天后，实验组加单克隆后的杂交瘤细胞的培养上清，对照组加含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，4℃孵育1小时，用常规FACS方法测定所制备的抗体(FITC标记)与淋巴细胞、CD3⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞的结合情况。④抗体效价测定：包被GST-hBLyS融合蛋白做抗原，用ELISA测定培养上清和腹水的效价：用0.01mol/L PBS倍比稀释培养上清和腹水，同时设立阴性对照孔(只加PBS)和阳性对照孔(只加免疫鼠的血清)。所检测的培养上清为单克隆化杂交瘤细胞的培养上清，所检测的腹水为BALB/c鼠腹腔注射单克隆杂交瘤细胞后诱导生成的腹水。

(5)试验结果：

通过以下方法对抗hBLyS单克隆抗体的特异性举行鉴定：

①ELISA杂交瘤细胞株的培养上清与GST-hBLyS融合蛋白反应，与GST蛋白不反应。说明单克隆抗体是针对hBLyS蛋白的单克隆抗体。

②Western blot分别用GST-hBLyS融合蛋白和GST蛋白作抗原，经Westernbolt鉴定，结果在相对分子质量为58 000处有一条抗原-抗体结合的条带，而在Mr＝26 000处无特异性条带。进一步证明杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体可以结合GST-hBLyS融合蛋白，但不与GST蛋白反应，是特异性结合hBLyS的单克隆抗体。③用IFN-γ激活的人外周血单个核细胞作抗原，与杂交瘤细胞的培养上清孵育1小时后，做FACS单标的结果显示，细胞株分泌的单抗能与激活的人外周血单个核细胞结合，结合率为6.7％(对照组为1.9％)。④用IFN-γ激活的人外周血单个核细胞作抗原，FACS双标结果显示，细胞株分泌的单抗能与激活的人外周血CD3⁺T细胞结合，并且大部分结合在CD3⁺CD8^-T细胞上。说明细胞株分泌的抗体是特异性针对T细胞表面hBLyS分子的细胞外段，可用于制备人外周血细胞上BLyS表达以及血浆中BLyS浓度的检测剂，和制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤以及自身免疫性疾病药物。

序列表

<110>张志方张春艳

<120>一种重组人B细胞刺激因子(rhBLyS)表达载体的构建、表达及单克隆抗体制备和应用

<130>

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>912

<212>DNA

<213>健康人外周血淋巴细胞

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(912)

<400>1

tcc tcc aaa tcg gat ctg gtt ccg cgt gga tcc ccg gaa ttc atg gat 48

Ser Ser Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Met Asp

1 5 10 15

gac tcc aca gaa agg gag cag tca cgc ctt act tct tgc ctt aag aaa 96

Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu Lys Lys

20 25 30

aga gaa gaa atg aaa ctg aag gag tgt gtt tcc atc ctc cca cgg aag 144

Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro Arg Lys

35 40 45

gaa agc ccc tct gtc cga tcc tcc aaa gac gga aag ctg ctg gct gca 192

Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala

50 55 60

acc ttg ctg ctg gca ctg ctg tct tgc tgc ctc acg gtg gtg tct ttc 240

Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val Ser Phe

65 70 75 80

tac cag gtg gcc gcc ctg caa ggg gac ctg gcc agc ctc cgg gca gag 288

Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu

85 90 95

ctg cag ggc cac cac gcg gag aag ctg cca gca gga gca gga gcc ccc 336

Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro

100 105 110

aag gcc ggc ctg gag gaa gct cca gct gtc acc gcg gga ctg aaa atc 384

Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile

115 120 125

ttt gsa cca cca gct cca gga gsa ggc aac tcc agt cag aac agc aga 432

Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg

130 135 140

aat aag cgt gcc gtt cag ggt cca gaa gaa aca gtc act caa gac tgc 480

Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys

145 150 155 160

ttg caa ctg att gca gac agt gaa aca cca act ata caa aaa gga tct 528

Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser

165 170 175

tac aca ttt gtt cca tgg ctt ctc agc ttt aaa ggg gga agt gcc cta 576

Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Gly Gly Ser Ala Leu

180 185 190

gaa gaa aaa gag aat aaa ata ttg gtc aaa gaa act ggt tac ttt ttt 624

Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe

195 200 205

ata tat ggt cag gtt tta tat act gat aag acc tac gcc atg gga cat 672

Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His

210 215 220

cta att cag agg aag aag gtc cat gtc ttt ggg gat gaa ttg agt ctg 720

Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu

225 230 235 240

gtg att ttg ttt cga tgt att caa aat atg cct gaa aca ctg ccc aat 768

Val Ile Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn

245 250 255

aat tcc tgc tat tca gct ggc att gca aaa ctg gaa gaa gga gat gaa 816

Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu

260 265 270

ctc caa ctt gca ata cca aga gga aat gca caa ata tca ctg gat gga 864

Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Gly Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly

275 280 285

gat gtc aca ttt ttt ggt gca ttg aaa ctg ctg tga gtc gac tcg agc 912

Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu Val Asp Ser Ser

290 295 300

<210>2

<211>299

<212>PRT